CN101519645A - 一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法。其包括以下步骤：(1)获取强致病力菌株；(2)黑暗培养；(3)冰箱黑暗诱导；(4)获取赤星病菌孢子接种体。其中，赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物，接种时每点以孢子接种体为主；赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导，诱导前病菌菌丝已充分生长。赤星病菌孢子接种体，每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1～1.0亿个/ml的孢子悬浮液20～25ml，孢子萌发率90％以上。本发明制备的孢子量是常规的50～100倍，可减少50～100倍制备孢子接种体的工作量。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术，更具体地说，本发明涉及一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法。
背景技术
烟草赤星病(Tobacco Brown Spot Disease)是烟叶成熟后期常见的叶部病害，在各烟区普遍发生，是我国烟草的主要病害，病原是链格孢菌(Alternaria alternata)。目前，人工接种赤星病用的病菌接种体，以病菌孢子液为主。在实验室、温室一般采用平板菌丝培养、自然产孢后制备烟草赤星病菌孢子接种体，仅见个别的研究通过紫外光诱导产孢。由于人工接种用烟草赤星病菌为较强致病力，其产生孢子的效率往往比较低。仅依靠传统的培养产孢，只能满足离体叶片接种用；要满足大田人工接种，仅设置诱发行接种也需要花费较大的劳动来制备较大量的接种体。用紫外光诱导产孢，紫外剂量与时间控制不当，容易造成变异，也容易导致培养物污染。因此，如何更为有效的制备烟草赤星病菌接种体，就成为烟草育种、植保工作中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种经济有效的烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明提供了一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法，所述的方法关键在于采用改进的诱导产孢方法，分离、筛选得到的强致病力菌株4～6点点接于CA平板，黑暗培养5～7天，封皿置6～10℃冰箱黑暗诱导产孢3～5天，1％葡萄糖溶液洗下孢子，脱脂棉过滤，即可获得赤星病菌孢子接种体。
本发明的方法，具体采用以下步骤：
(1)从发病田块中采集病叶，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，将菌种保存于CA斜面，置于4℃条件下恒温保存，备用。
(2)将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝4～10点点接到CA平板培养基上，在25±1℃下恒温培养5～7天，选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用于诱导产孢。所述的赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物，接种时每点以孢子接种体为主。
(3)密封培养好的平板，置6～10℃冰箱黑暗诱导产孢3～5天。所述的赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导，诱导前病菌菌丝已充分生长。
(4)1％葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝，脱脂棉过滤除菌丝，滤液即为赤星病菌孢子接种体。通常每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1～1.0亿个/ml的孢子悬浮液20～25ml，孢子萌发率90％以上。
本发明与现有技术相比，具有以下突出优点：
1.赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物，接种时每点以孢子接种体为主，其菌丝体很少或不能继续生长，这种移植方法类似于涂孢子悬浮液，只是接种位点相对少而已，但与涂孢子悬浮液一样，由于接种点相对较多，培养物能够较快占据整个平板表面，因此可较快耗尽营养，促进培养物的大量产生孢子。点接与孢子涂布相比，可显著减少后继培养物的杂菌污染。
2.赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导。病菌在前期的适温培养时，菌丝已充分生长。密封平板置6～10℃黑暗冰箱中，为潜在的产孢菌丝创造了一个高湿、低温、黑暗的环境，这种环境可刺激菌丝大量产生孢子。
3.制备的赤星病菌孢子接种体，每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1～1.0亿个/ml的孢子悬浮液20～25ml，孢子萌发率90％以上。这种方法制备的孢子量是常规的50～100倍，可减少50～100倍制备孢子接种体的工作量。
4.获得的孢子生活力强，如不加1％葡萄糖溶液洗皿，在6～10℃黑暗冰箱内平板可保存3～6月，尽管孢子萌发率略有降低，但孢子总量增加，有效接种体基本维持不变。
具体实施方式
通过下面给出的实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明保护范围的限定。
实施例
制备烟草赤星病菌接种体，首先需要通过分离、培养、致病力测定获得强致病力病菌。通常可采用孢子悬滴法接种离体叶片，测定发病情况，发病严重的菌株致病力强一些，以保证接种的有效性、可比性。然后培养制备接种体，点接、黑暗培养，低温、高湿、黑暗诱导产孢，洗孢子，即可获得赤星病菌孢子接种体。本例采用孢子悬滴法接种离体叶片筛选获得的强致病力菌株97Aa003实施，具体如下：
(1)将保存的强致病力菌株97Aa003，4～5点点接到CA平板培养基，选择生产较快的菌落，再转接到CA平板培养基，在25±1℃下恒温培养至大量产生孢子，作为扩大培养的菌种，备用。
(2)将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝7～9点点接到CA平板培养基上，在25±1℃下恒温培养5～7天，选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用于诱导产孢。
(3)用封口膜密封培养好的平板，置6～10℃冰箱黑暗诱导产孢3～5天。
(4)1％葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝，脱脂棉过滤除菌丝，滤液即为赤星病菌孢子接种体。通常每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1～1.0亿个/ml的孢子悬浮液20～25ml，孢子萌发率90％以上。
应用实施例1
品种抗性评价
1.材料与方法
1.1 材料
供试接种病原为强致病力烟草赤星病菌97Aa003菌株。供试品种为G28、净叶黄、K326、云烟97、云烟98、NC89共6个品种。
1.2 方法
1.2.1 供试病原接种体的制备
烟草赤星病菌孢子接种体的制备：强致病力赤星病菌97Aa003菌株孢子接种体的制备按照本发明方法进行。
1.2.2 抗性测定品种的小区布置
试验处理为6个处理，待测定的6个品种，每个品种为1个处理。每处理植烟30株，4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约1.5亩。本试验在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行。
1.2.3 病菌人工接种
封顶去2片脚叶后，将制备的烟草赤星病菌孢子接种体用1％的葡萄糖稀释50～100倍，至10～100万个孢子/ml，按0.2％的质量比加入吐温80、过325目标准筛的硅藻土，搅拌均匀，喷雾每处理中下部叶，至叶片布满均匀一层细小水珠为止，接种后在试验田灌注水至半沟，保湿24～48小时。
1.2.4 病情调查
在烟草赤星病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后每7天调查一次病情。调查各处理的叶片，调查记载采用YC/T39-1996“烟草病害分级及调查方法”中烟草赤星病害的行业标准。以发病盛期时病情指数的高低，评价抗性。
2.结果与分析
品种抗性测定结果见表1，以病情指数大于70为高度感病、50≤病情指数<70为感病、30≤病情指数<50为低度抗病、20≤病情指数<30为中度抗病、小于20为高度抗病进行评价，可以看出G28高度感病，NC89感病K326、云烟97、云烟98低度抗病，净叶黄高度抗病。
表1.待测抗性品种的测定结果(病情基数为0)
应用实施例2
防治药剂筛选
1.材料与方法
1.1 材料
供试药剂见表2。
供试接种病原为强致病力烟草赤星病菌97Aa003菌株。供试品种为K326。
1.2 方法
1.2.1 供试菌株接种体的制备
烟草赤星病菌孢子接种体的制备：强致病力烟草疫霉97Aa003菌株孢子接种体按实施例进行。
1.2.2 防治药剂的小区处理
试验处理为5种药剂处理、1个空白对照共6个处理(表2)。每处理植烟30株，4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约1.5亩。本试验在云南省烟草科学研究所研和试验基地进行。
表2.供试药剂及处理设置
1.2.3 防治药剂的施用
封顶去2片脚叶后，按处理设置表中各药剂分别喷雾。
1.2.4 病菌人工接种
按照应用实施例1中的方法进行。
1.2.5 病情调查
在烟草赤星病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后每7天调查一次病情。调查各处理的叶片，调查记载采用YC/T39-1996“烟草病害分级及调查方法”中烟草赤星病害的行业标准。以第14天病情，评价药剂防治效果。
2.结果与分析
药剂的田间小区防治试验结果(表3)表明，供试的5种药剂对大田发生的赤星病都有一定的防治效果，其中，菌克防治效果最好，再次是菌核净，秀安、东旺效果较差，菌霸效果最差。
表2.药剂防治赤星病的田间小区试验结果(病情基数为0)
Claims (8)
1.一种烟草赤星病菌孢子接种体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取强致病力菌株；(2)黑暗培养；(3)冰箱黑暗诱导；(4)获取赤星病菌孢子接种体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的强致病力菌株的获取方法是从发病田块中采集病叶，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，将菌种保存于CA斜面，置于4℃条件下恒温保存，备用。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述黑暗培养的方法是将烟草赤星病菌产生孢子的菌丝4～10点点接到CA平板培养基上，在25±1℃下恒温培养5～7天，选择菌丝黑褐色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用于诱导产孢。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的冰箱黑暗诱导的方法是密封培养好的平板，置6～10℃冰箱内黑暗诱导产孢3～5天。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的获取赤星病菌孢子接种体的方法是用1％葡萄糖溶液洗下平板中的孢子和菌丝，脱脂棉过滤除菌丝，滤液即为赤星病菌孢子接种体。
6.根据权利要求3所述的赤星病菌点接物为已经大量产生孢子的培养物，接种时每点以孢子接种体为主。
7.根据权利要求4所述的赤星病菌诱导产孢方法为高湿、低温诱导，诱导前病菌菌丝已充分生长。
8.根据权利要求5所述的赤星病菌孢子接种体，每内皿直径9cm的平板可获得孢子含量为0.1～1.0亿个/ml的孢子悬浮液20～25ml，孢子萌发率90％以上。
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| CN103571912A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-12 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法 |
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