CN104031845B - 一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，特点是该菌保藏编号为CCTCC M 2014087，其发酵过程为1）将海洋青霉菌接种在PDA上在25 ℃培养箱中培养2 d后，挑取单菌落再接种到PDA培养基上于25 ℃培养2 d后备用；2）将活化菌种接种于PDB中，在25 ℃、150 rpm的条件下培养1 d得到种子液；3）取种子液按体积分数5%的接种量接种于发酵培养基中，于25 ℃，150 rpm的条件下培养12d；4）将发酵液过滤取上清液乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶得到进样液；5）采用高速逆流色谱法对进样液进行分离纯化得到产品，优点是制备速度快，产物纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺。
背景技术
Flufuran由Gabriela M. Cabrera等人于2002年首次从Polyporus ciliatus中分离得到(Gabriela M.; Robertia M.; Jorge E.; Alicia M. Phytochem.2002,61,189-193.)。Antonio Evidente等人于2009年从Aspergillus flavus中再次得到，并发现该化合物具有显著的抗疫霉菌活性(Antonio E.; Gennaro C.; Biancavaleria P.; Anna A.;Antonino T.; Dominique M. Chem. Biodivers.2009,6,328-334.)。此外，该化合物的类似物如2-四氢呋喃甲酸等被大量用于医药中间体。
上述文献中，Flufuran的发酵产量是0.625 mg/L和43.7 mg/L，且分别需要培养15d和14 d。因此，低产量是该化合物进行全面活性评价以及开发应用的限制因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，该方法可快速、高效制备高纯度的Flufuran。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋青霉菌，该菌分类命名为Penicillium dipodomyicola，于2014年3月保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014087。
该菌落在培养初期呈现淡黄色，随着培养时间延长，菌落颜色不断加深至褐色，分生孢子较松散的分布在菌体上，在培养后期可见孢子脱落。
一种海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保藏在-80℃冰箱中的保藏编号为CCTCC M 2014087的海洋青霉菌接种在马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基（PDA）上，在25 ℃培养箱中培养2 d后，挑取单菌落再次接种到PDA培养基上，再于25 ℃培养箱中培养2 d后备用；
（2）种子培养
将步骤（1）活化得到的海洋青霉菌接种于装液量为40%的马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基（PDB）中，在25 ℃、150 rpm的条件下培养1 d，得到种子液；
（3）发酵培养
取种子液按体积分数5%的接种量接种于装液量为40%的发酵培养基中，于25 ℃，150 rpm的条件下培养12d，得到发酵液；
（4）发酵液体处理
将步骤（3）得到的发酵液过滤取上清液，乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶，得到进样液；
（5）Flufuran的制备
采用高速逆流色谱（HSCCC）法对进样液进行分离纯化，得到海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。
步骤（5）具体为：
A.取正丁醇、醋酸和纯水按4：9：0.1的比例混合后作为HSCCC的两相体系；
B.将两相体系中以正丁醇为主的上相作为流动相，以醋酸和纯水为主的下相作为固定相，将流动相按10 mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至高速逆流色谱仪转速达到900转/min后，将固定相按5 mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至流动相和固定相达到平衡后进样；
C.启动检测器开始监测，收集含Flufuran的出峰时间为70min到90min部分的洗脱液，减压浓缩后得到纯度达90%的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。
所述的发酵培养基的配制如下：将马铃薯浸出液10 g，可溶性淀粉20 g，溶于1 L海水中即可，其中海水由1 L纯水加入35 g海水晶配制而成。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，该发酵方法使Flufuran的产量大幅度提高，并缩短了发酵时间。此外，HSCCC制备该化合物具有进样量大、流速快的特点，尤其能够避免利用HPLC制备时酸性物质峰拖尾现象造成的样品浪费现象。该海洋青霉菌产Flufuran的量可达到1.91g/L。
上述假海洋青霉菌（Penicillium dipodomyicola），该菌为DJ008菌株，保藏编号为CCTCC M 2014087，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为处理后的发酵液的HPLC谱图；
图2为Flufuran 进样液的HSCCC谱图；（图中深色部分为含Flufuran特征峰的洗脱液）；
图3为经HSCCC纯化后得到的Flufuran单体的HPLC谱图；
图4为经HSCCC纯化后得到的Flufuran单体的NMR 1H 谱图；
图5为经HSCCC纯化后得到的Flufuran单体的13C NMR 谱图；
图6为经HSCCC纯化后得到的Flufuran单体的MS谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种海洋青霉菌，该菌分类命名为Penicillium dipodomyicola，于2014年3月保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014087。该菌落在培养初期呈现淡黄色，随着培养时间延长，菌落颜色不断加深至褐色，分生孢子较松散的分布在菌体上，在培养后期可见孢子脱落。利用该海洋青霉菌发酵生产次级代谢产物Flufuran的具体步骤如下：
（1）菌种活化
将保藏在-80℃冰箱中的保藏编号为CCTCC M 2014087的海洋青霉菌接种在马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基（PDA）上，在25 ℃培养箱中培养2 d后，挑取单菌落再次接种到PDA培养基上，再于25 ℃培养箱中培养2 d后备用；
（2）种子培养
将步骤（1）活化得到的海洋青霉菌接种于装液量为40%的马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基（PDB）中，在25 ℃、150 rpm的条件下培养1 d，得到种子液；
（3）发酵培养
取种子液按体积分数5%的接种量接种于装有400 mL发酵培养基的1L锥形瓶，于25℃，150 rpm的条件下培养12d，得到发酵液，其中发酵培养基的配制如下：马铃薯浸出液10g，可溶性淀粉20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）；
（4）发酵液体处理
取发酵液过滤取上清液，乙酸乙酯萃取3次，利用旋转蒸发仪去除有机相得到浸膏，再用甲醇复溶该浸膏，13000 rpm离心15 min后得到得到进样液，HPLC检测结果如图1所示；说明Flufuran是处理后发酵液中的主要成分，此外还有一些杂质；
（5）Flufuran的制备
采用高速逆流色谱（HSCCC）法对Flufuran进行分离纯化，得到海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体，具体过程为：
A.取正丁醇、醋酸和纯水按4：9：0.1的比例混合后作为HSCCC的两相体系；
B.将两相体系中以正丁醇为主的上相作为流动相，以醋酸和纯水为主的下相作为固定相，将流动相按10 mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至高速逆流色谱仪转速达到900转/min后，将固定相按5 mL/min泵入高速逆流色谱仪直至流动相和固定相达到平衡后（观察到有部分流动相被推出后，认为两相体系达到稳定）进样；
C.启动检测器开始监测，收集含Flufuran的出峰时间为70min到90min部分的洗脱液，（参照图2深色部分，图2中深色部分是高纯度Flufuran，深色部分前面有一部分和杂质重叠出峰），减压浓缩后得到纯度达90%的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。
将得到的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体进行HPLC检测，结果如图3所示，由图3可知，经过图2所示的HSCCC纯化后得到是单一的Flufuran色谱峰，其化学结构由核磁共振光谱法（图4和图5）确定，而图4和图5中没有杂峰也说明了分离得到的Flufuran纯度高。
Flufuran产量计算：用甲醇溶解步骤（5）得到的Flufuran单体，配制浓度分别为0.08mg/ml、0.4mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和10mg/ml的Flufuran溶液，进行HPLC检测，对Flufuran的特征峰积分，计算峰面积。将峰面积与浓度进行线性拟合，得出计算公式Y=3.4*107*x-6.6*106（其中Y是色谱峰面积，X为样品浓度），根据该公式计算进样液中Flufuran的浓度，从而计算得到flufuran 单体为0.764 g，进一步计算得到的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体纯度可达90%，该海洋青霉菌产Flufuran的量可达到1.91 g/L（培养的过程中用1L锥形瓶装液量400mL，共得到flufuran 0.764 g，因此，flufuran的产量是1.91 g/L）。
具体实施例二
1、培养基配方优化
将培养基中马铃薯浸出粉作为整体，并以此为基础按照1:2的比例改变碳源，包括可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖以及果糖，具体如下配制6种不同配方的培养基：
配方1：马铃薯浸出液10 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）；
配方2：马铃薯浸出液10 g，可溶性淀粉20 g，1 L海水（1L纯水加入35 g海水晶）；
配方3：马铃薯浸出液10 g，葡萄糖20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）；
配方4：马铃薯浸出液10 g，麦芽糖20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）；
配方5：马铃薯浸出液10 g，蔗糖20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）；
配方6：马铃薯浸出液10 g，果糖20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）。
将种子发酵液按照5%的接种量接种在上述培养基中，在25 ℃，150 rpm的条件下培养8 d。每组实验设置3个平行。过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵液3次，蒸干后甲醇复溶，进行HPLC检测并根据公式计算产量。
实验结果分析：在该部分实验中，不同配方的培养基均能产生Flufuran，使Flufuran产量达到最大的培养基配方为马铃薯浸出液10 g，可溶性淀粉20 g，1 L海水（1 L纯水加入35 g海水晶）。
2、培养时间优化
选择优化的培养基配方，将海洋青霉菌的种子液接入该培养基（1 L锥形瓶，装液量为40%，5%接种量）中，在25 ℃，150 rpm的条件下培养15 d。每天取样10 mL，过滤取上清液，乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶进行HPLC检测并根据公式计算产量。
实验结果分析：在本部分实验中，选择优化的培养基培养该株海洋青霉菌，每天取样处理计算Flufuran的产量，在培养时间为12 d时，Flufuran的产量达到最大，可达到1.91g/L。
3、Flufuran化合物结构鉴定：
（1） 分子量（MS）测定
化合物分子量在HPLC-MS色谱仪采用直接进样测定，质谱条件：采用电喷雾电离源离子源温度100 ℃，脱溶剂温度250 ℃，脱溶剂氮气流速400 L/h，锥孔反吹氮气。四极杆扫描范围m/z 200-l200。TOF离子飞行方式采用V模式。使用亮脑啡肽作为外标物对目标离子进行精确质量锁定。采用正离子模式，毛细管电离电压2.8 kV，取样锥孔电压80 V，碰撞室能量5-80 V。得到的MS谱图如图6；
（2） NMR 测定
样品溶解于氘代甲醇，NMR[1H, 13C, homonuclear correlation spectroscopy(COSY), heteronuclear single quantum coherence spectroscopy (HSQC), 和heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (HMBC)] 用 Varian INOVA400色谱仪测定，测定1H 在400 MHz 条件下操作，测定13C在100 MHz 条件下操作，tetramethylsilane (TMS)作为内标。得到的NMR 1H和13C 谱图如图4、图5。
该Flufuran化合物为白色晶体，分子为C6H6O4，HR-ESI-MS m/z：143.06 [M+H]+，计算值为142.06。
表1 化合物I的1H和13C NMR数据（400和100MHz，CD3OD）
实验结果分析：经HPLC-MS和NMR测定，化合物Flufuran的分子量为142，化学结构式如下所示，。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种海洋青霉菌，该菌分类命名为Penicillium dipodomyicola，于2014年3月保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014087。
2.一种海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保藏在-80℃冰箱中的保藏编号为CCTCC M 2014087的海洋青霉菌接种在马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基上，在25℃培养箱中培养2d后，挑取单菌落再次接种到马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基上，再于25℃培养箱中培养2d后备用；
(2)种子培养
将步骤(1)活化得到的海洋青霉菌接种于装液量为40％的马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基中，在25℃、150rpm的条件下培养1d，得到种子液；
(3)发酵培养
取种子液按体积分数5％的接种量接种于装液量为40％的发酵培养基中，于25℃，150rpm的条件下培养12d，得到发酵液；
(4)发酵液体处理
将步骤(3)得到的发酵液过滤取上清液，乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶，得到进样液；
(5)Flufuran的制备
采用高速逆流色谱法对进样液进行分离纯化，得到海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。
3.根据权利要求2所述的一种海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其特征在于步骤(5)具体为：
A.取正丁醇、醋酸和纯水按4：9：0.1的比例混合后作为高速逆流色谱仪的两相体系；
B.将两相体系中以正丁醇为主的上相作为流动相，以醋酸和纯水为主的下相作为固定相，将流动相按10mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至高速逆流色谱仪转速达到900转/min后，将固定相按5mL/min泵入高速逆流色谱仪直至流动相和固定相达到平衡后进样；
C.启动检测器开始监测，收集含Flufuran的出峰时间为70min到90min部分的洗脱液，减压浓缩后得到纯度达90％的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。
4.根据权利要求2或3所述的一种海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其特征在于所述的发酵培养基的配制如下：将马铃薯浸出液10g，可溶性淀粉20g，溶于1L海水中，其中海水由1L纯水加入35g海水晶配制而成。
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