CN111100830A - 一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用，属于微生物制剂领域。所述制剂中包含解淀粉芽孢杆菌JL‑B05，解淀粉芽孢杆菌JL‑B06，枯草芽孢杆菌LYN‑1，地衣芽孢杆菌LYN‑3，质量比为（3~6）:（3~8）:（2~5）:（2~6）。本发明水产养殖水体净化复合微生态制剂对养殖水体中有害物质耐受性强，降解能力高、速度快，对水体的净化有效果显著，同时能够提高养殖水产的成活率和产量，是新一代的绿色环保产品，对于保护水产养殖水体环境和促进水生态系统良性循环具有非常重要的作用。

Description

一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用，属于微生物制剂领域。
背景技术
随着水产养殖产业的迅猛发展和集约化经营的不断提高，许多养殖池中有害藻类及病原菌大量繁殖，使养殖生态环境遭到严重破坏，导致养殖病害频发。此外，在水产养殖中抗生素的大量使用也导致了动物中的药物残留和水体环境的生态失衡等问题。因此，如何减少抗生素使用和水体污染，控制水体中氨氮、亚硝酸盐的含量是水产养殖生产中迫切需要解决的问题。
微生态制剂作为一种新型的绿色、环保产品，在调节动物机体微生态平衡、预防疾病、提高饲料转化率、促进动物健康和保护生态环境等方面有着不可替代的作用。目前微生态制剂作为绿色饲料添加剂在国内已被接受，在畜禽和水产养殖中得到了广泛的应用。市面上最广泛应用的微生态制剂中就是以酵母、乳酸菌、芽孢杆菌类的益生菌制剂，具有拮抗肠道病原细菌、维持和调节肠道微生态平衡的作用，在宿主体内可为宿主合成维生素，产生多种消化酶，提供营养和阻止致病菌的入侵，益生菌还能在促进生长、转化饲料、提高机体免疫力等方面起到重要的作用。芽孢杆菌类产品主要应用于水产养殖上。芽孢杆菌可用于净化水质，降低水体中氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而改善水质，同时还有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且增强有益菌群，而达到防治水产疾病的目的。但单一的芽孢杆菌在水产养殖中的降解效果并不能达到很好的净化作用，它可降解水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化物，但未能达到较好的净化效果，而多种菌株协同作用的复合微生态制剂能有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨氮与亚硝酸氮、硫化物浓度降低，从而有效地改善水质。目前市场上复配的微生态产品基本上是盲目混合而成，缺乏对菌株间协同性能和菌株特性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，包括解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3。
所述复合微生态制剂中解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的质量比为（3~6）:（3~8）:（2~5）:（2~6）；
所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为（2~5）×109cfu/ml或（2~5）×109cfu/g；
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌JL-B05，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JL-B05，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18998，保藏地址：中国北京。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌JL-B06，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JL-B06，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18999，保藏地址：中国北京。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌LYN-1（公开于CN106234769A），其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）LYN-1，已于2012年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6265，保藏地址：中国北京。
本发明所提供的地衣芽孢杆菌LYN-3（公开于CN103275906A），其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LYN-3，已于2013年03月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7349，保藏地址：中国北京。
所述复合微生态制剂为液体制剂或固体制剂。
当所述复合微生态制剂为固体制剂时，所述复合微生态制剂中还包括载体。
所述载体为麸皮，珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为（80~100）:（10~20）:（1~5）。
本发明提供了所述的复合微生态制剂在水产养殖水体净化中的应用。
本发明提供了所述的复合微生态制剂在提高养殖水产成活率和产量中的应用。
本发明的优点在于：
所述用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂是利用筛选出的多种功能协同的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌进行复配，从而大大提高产品净化水体性能。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种水产养殖水体净化的复合微生态制剂，制剂的组成菌种由经驯化筛选的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等多种有益微生物组成。本发明水产养殖水体净化复合微生态制剂对养殖水体中有害物质耐受性强，降解能力高、速度快，对水体的净化有效果显著，同时能够提高养殖水产的成活率和产量，是新一代的绿色环保产品，对于保护水产养殖水体环境和促进水生态系统良性循环具有非常重要的作用。
附图说明
图1养殖水体的透明度对比。
图2养殖水体中弧菌数量对比。
图3养殖水体中氨氮浓度对比。
图4养殖水体中亚硝氮浓度对比。
图5 南美白对虾成活率对比。
图6 南美白对虾体合格率检测情况对比。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
本发明提供了一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，包括解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3。所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为（2~5）×109cfu/ml或（2~5）×109cfu/g；所述所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18998；所述所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18999；所述枯草芽孢杆菌LYN-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6265；所述地衣芽孢杆菌LYN-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7349。
在本发明中，所述复合微生态制剂优选为液体制剂或固体制剂。当所述复合微生态制剂为固体制剂时，所述复合微生态制剂中包括载体。在本发明中，所述载体为麸皮、珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为（80~100）:（10~20）:（1~5）。所述载体与解淀粉芽孢杆菌JL-B05、解淀粉芽孢杆菌JL-B06、枯草芽孢杆菌LYN-1、地衣芽孢杆菌LYN-3总的质量比优选为100:（5~10）。在本发明中，当所述复合微生态制剂为固体制剂时，通过分别将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3发酵液通过喷雾干燥制备成固体菌粉后，按比例混合。在本发明中，当所述复合微生态制剂为液体制剂时，通过将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的发酵液按质量比（3~6）:（3~8）:（2~5）:（2~6）比例混合获得。
在本发明中，所述固体菌粉的制备方法包括以下步骤：将所述菌种活化后进行连续两级发酵、浓缩获得浓缩菌液，将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的浓缩菌液与轻质碳酸钙混合后经喷雾干燥获得所述固体菌粉。
在本发明中，将菌种接于NB培养基中培养15~25h获得一级种子液；所述培养温度优选为25~35℃，所述培养的转速优选为150~ 350 r·min-1。
本发明在获得一级种子液后，将所述一级种子液转接于NB液体培养基中培养10 ~20h获得二级种子液。所述一级种子液转接的接种量优选为0.5% ~ 1.0%（V/V），所述培养优选在发酵罐中进行，所述培养的过程中通入无菌空气，发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，培养的转速为200 ~ 350r·min-1，培养的时间优选为15~20h。所述二级种子液的OD600优选为0.5~0.8。
在获得所述二级种子液后，将二级种子液接入发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。所述二级种子液的接种量0.5% ~ 1.0%（V/V），所述发酵培养过程中的罐压维持在0.05MPa；培养的过程中通入无菌空气，发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，培养的转速为200 ~ 350r·min-1，培养的时间优选为25~35 h。所述二级种子液的OD600优选为0.8~1.5。
在获得发酵菌液后，将所述发酵菌液浓缩获得浓缩菌液。所述浓缩菌液的浓缩倍数为5~10倍；所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的发酵菌液通过陶瓷膜过滤获得浓缩菌液。本发明对所述浓缩设备的具体参数设置没有特殊限定，采用常规的参数设置实现上述倍数的浓缩即可。
在获得所述发酵菌液后，将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的发酵菌液通过陶瓷膜过滤获得浓缩菌液，所述浓缩菌液加入轻质碳酸钙后通过喷雾干燥获得固体菌粉，所述浓缩液与轻质碳酸钙的质量比为100:2~5，喷雾干燥过程控制指标为物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30S。
本发明一种水产养殖水体净化的复合微生态制剂及其应用，可用在鱼、虾、蟹、海参等养殖水体。
实施例1
（1）解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌液、固体菌粉的制备：
活化解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌株，挑取单菌落，接种于150ml NB培养基中（121℃,下，灭菌30min），28 ℃，180 r·min-1 条件下振荡培养 20 h，得到一级种子液。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05二级种子液制备
将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）；培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，转速为200 ~ 350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间15~20 h。二级种子液的OD600值为0.8，此时菌种活力最强。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05发酵液制备
将解淀粉芽孢杆菌JL-B05的二级种子液，按照接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）接入无菌发酵罐中，发酵培养基的组成如下（每升）：酵母抽提浸膏：10-20克，麦芽糖浆：25-35克，氯化镁：0.2-0.5克，氯化钙：0.1-0.4克，氯化锰：0.1-0.4克，磷酸氢二钾：1.0-2.5克。培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，转速为200 ~350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间30~35h，pH回升至7.5~8.0，OD600值为1.0，下罐时间以取样镜检芽孢在90%以上成熟时，终止发酵，得到发酵成熟菌液。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌粉制备
将上述所得的发酵成熟菌液经过陶瓷膜过滤后，加入轻质碳酸钙混合均匀，所述浓缩菌液与轻质碳酸钙的质量比为100:4，得到固液混合物，喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30S。得到解淀粉芽孢杆菌JL-B05固体菌粉，菌粉含水量小于5%（W/W），活菌数为2~5×1011cfu/g。
所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3菌液、固体菌粉的制备同上。
将上述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的固体菌粉按照质量比为6:8:5:6混合均匀为固体混合菌粉。再将载体与上述固体混合菌粉以100:10的质量比混合后获得促生复合微生态制剂的固体制剂，所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为5×109cfu/g；所述载体为麸皮、珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为90:15:1。
实施例2
所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05、解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3菌液、固体菌粉的制备同实施例1的制备方法。
将上述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的固体菌粉按照质量比为3:3:2:2混合均匀为固体混合菌粉。再将载体与上述固体混合菌粉以100:5的质量比混合后获得促生复合微生态制剂的固体制剂，所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为2×109cfu/g。所述载体为麸皮、珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为80:10:3。
实施例3
所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05、解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3菌液、固体菌粉的制备同实施例1的制备方法。
将上述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的固体菌粉按照质量比为5:6:4:4混合均匀为固体混合菌粉。再将载体与上述固体混合菌粉以100:8的质量比混合后获得促生复合微生态制剂的固体制剂，所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为3×109cfu/g。所述载体为麸皮、珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为100: 20:5。
实施例4
实施例1制备的复合微生态制剂对南美白对虾养殖水体净化的应用
选取工厂化室内冬棚模式南美白对虾养殖池（45m2/池），养殖池内的南美白对虾为1个月左右的幼虾。试验池：施用本发明所述复合微生态制剂固体制剂；对照池1：施用与本发明复合微生态制剂固体制剂同等总活菌浓度的解淀粉芽孢杆菌JL-B05固体菌粉；对照池2：施用与本发明复合微生态制剂固体制剂同等总活菌浓度的解淀粉芽孢杆菌JL-B06固体菌粉；对照池3：施用与本发明复合微生态制剂固体制剂同等总活菌浓度的枯草芽孢杆菌LYN-1固体菌粉；对照池4：施用与本发明复合微生态制剂固体制剂同等总活菌浓度的地衣芽孢杆菌LYN-3固体菌粉；对照池5：不施用本发明所述复合微生态制剂及其他类似产品。试验池与对照池1~4：每天各施用20克，连续施用2天。所述复合微生态制剂及单菌种固体菌粉在晴天上午使用，每次施用前先进行活化：将复合微生态制剂产品及单菌种固体菌粉分别放入水桶等容器，加入养殖水体，放入曝气头或搅拌器以利于快速活化，每次活化3h。复合微生态制剂及单菌种固体菌粉活化好后在相应的试验塘与对照池1~4内均匀泼洒，泼洒完毕后开增氧机2h。定期观察水色变化，并根据水质情况降低换水比例。试验期间不添加任何影响结果的其他生物类、化学类、消毒剂类等产品。
结果表明，施用复合微生态制剂的试验池的水体透明度随时间逐步提高，在施用复合微生态制剂第2天试验池换水量由原来的30%下降为15%，后续3天总换水量减少25%。与对照池1~4在施用相应单菌种固体菌粉后，第二天换水量没有明显下降，后续3天总换水量减少量在10%-15%之间。 通过对水体的现场观察和显微镜镜检，施用复合微生态制剂的养殖水体颜色为茶褐色，表明水体中浮游微藻类有所增加。施用复合微生态制剂的试验池的对虾在褪壳正常且生长速度正常的情况下减料，表明对虾大量摄食水体中的微藻类，产生非饥饿减料现象。说明施用复合微生态制剂施用后，已培养出对虾的最适饵料，从而减少饲料的使用量，节省成本。施用单菌种固体菌粉的对照池1~4的水体颜色为浅茶褐色；对虾在褪壳正常且生长速度正常的情况下减料不明显。
实施例5
施用实施例2制备复合微生态制剂对南美白对虾养殖成活率和产量的影响
选取南美白对虾养殖塘（高位池），设置2个处理，分别为：试验塘：施用本发明所述复合微生态制剂产品；对照塘：不施用本发明所述复合微生态制剂产品。试验塘和对照塘的放苗体重平均为4.2克/尾，养殖面积0.5亩/塘，养殖天数90天。试验塘在养殖前期（放苗--养殖60天）：每7天施用一次复合微生态制剂，每次20克/亩；在养殖后期（养殖60天--捕捞）：每7天施用一次复合微生态制剂，每次40克/亩；所述复合微生态制剂在晴天上午使用，每次施用前先进行活化：将复合微生态制剂产品放入水桶等容器，加入养殖水体，放入曝气头或搅拌以利于快速活化，每次约需活化3h。复合微生态制剂活化好后在试验塘内均匀泼洒，泼洒完毕后开增氧机2h。定期观察水色变化，测定水体透明度、弧菌等指标。水体透明度采用黑白盘法测定。试验期间不添加任何影响结果的其他生物类、化学类、消毒剂类等产品。
结果如图1所示，施用复合微生态制剂的试验塘水体透明度比对照塘提高了20%。通过对水体的现场观察和显微镜镜检，施用复合微生态制剂的水体中浮游微藻类有所增加，有害菌弧菌逐步降低，试验塘水体内有害弧菌数量比对照塘降低了68%，如图2 所示。
施用复合微生态制剂的试验塘水体中的氨氮浓度明显降低，试验塘水体中氨氮浓度比对照塘降低了50%，如图3所示。施用复合微生态制剂的试验塘水体中的亚硝氮浓度明显降低，试验塘水体中亚硝氮浓度比对照塘降低了80%，如图4所示。施用所述复合微生态制剂后，南美白对虾的成活率为98%，比对照虾塘提高了17%，如图5所示。施用所述复合微生态制剂后试验塘正常虾体合格率为68%，比对照塘提高了9%，如图6所示。每亩虾塘产量提高了18%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述制剂中包含解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3。
2.根据权利要求1所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌JL-B05，解淀粉芽孢杆菌JL-B06，枯草芽孢杆菌LYN-1，地衣芽孢杆菌LYN-3的质量比为（3~6）:（3~8）:（2~5）:（2~6）。
3.根据权利要求1所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂中的总活菌浓度为（2~5）×109cfu/ml或（2~5）×109cfu/g。
4.根据权利要求1所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18998；所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18999。
5.根据权利要求1所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂为液体制剂或固体制剂。
6.根据权利要求5所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂为固体制剂时，所述复合微生态制剂中还包括载体。
7.根据权利要求6所述的一种用于水产养殖水体净化的复合微生态制剂，其特征在于，所述载体为麸皮、珊瑚沙、硅藻土，三种载体质量比为（80~100）:（10~20）:（1~5）。
8.如权利要求1所述的复合微生态制剂在水产养殖水体净化中的应用。
9.如权利要求1所述的复合微生态制剂在提高养殖水产成活率和产量中的应用。
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