CN112553118A - 一种利用益生元富集有益菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用益生元富集有益菌的方法，属于生物领域。本发明的利用益生元富集有益菌的方法包括如下步骤：在小鼠粪便匀浆中加入培养液或益生元，过滤，培养8‑24h，将有益菌分离，即得，其中，培养液为MRS培养液。因为本发明通过在小鼠粪便匀浆中，添加低聚果糖和/或胰蛋白胨，得出添加低聚果糖和胰蛋白胨可以促进小鼠粪菌中促进粪菌中乳杆菌属Lactobacillus生长的作用，所以本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法操作简单，效果明显，为今后富集其他有益菌提供了良好的参考价值。

Description

一种利用益生元富集有益菌的方法
技术领域
本发明涉及一种生物领域，具体涉及一种利用益生元富集有益菌的方法。
背景技术
益生元对宿主机能具有诸多益处，其能够选择性刺激宿主结肠部位的肠道菌，有力的调节肠道菌的活性，影响肠道菌的定殖及活性，达到促进肠道益生菌生长、抑制腐败菌等效果，从而对宿主产生有益作用。
在益生菌的研究中，对乳酸菌的临床使用量和机制研究尤为深入，乳酸菌是一类无芽孢的革兰氏阳性菌，能利用碳水化合物发酵产酸。具有安全高效，易获取的优势，在食品、医疗及动物生产方面运用广泛。乳酸菌在肠道内定殖需要一定的营养物质，其中益生元常被用于促进宿主肠道乳酸菌生长。这使人们意识到益生元、益生菌在调节并维持肠道微生态方面的巨大作用。在添加益生元的同时也需要全面考虑宿主肠道中原始菌群的特征，达到个性化干预肠道菌的效果。
不同的益生菌具有菌株特异性，对益生元的利用情况也不尽相同，目前的现有技术缺乏小鼠粪便微生物对不同益生元利用的研究以及对粪便微生物的干预情况和多样性影响的研究。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种利用益生元富集有益菌的方法。
本发明提供了一种利用益生元富集有益菌的方法，具有这样的特征，包括如下步骤：在小鼠粪便匀浆中加入培养液或益生元，过滤，培养8-24h，将有益菌分离，即得，其中，培养液为MRS培养液。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，MRS培养液与小鼠粪便匀浆的体积比为0.8-1.2％。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，MRS培养液包括：葡萄糖9-11g、酪蛋白胨9-11g、牛肉浸出粉9-11g、无水乙酸钠8.0-8.5g、酵母浸出粉4.5-5.2g、柠檬酸二胺1.8-2.2g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水合硫酸镁0.55-060g、硫酸锰0.20-0.30g、失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.8-1.2mL、去离子水900-1100mL。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，益生元为低聚果糖和/或胰蛋白胨。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，低聚果糖与小鼠粪便匀浆的质量体积比为0.8-1.2％。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，胰蛋白胨与小鼠粪便匀浆的质量体积比为0.8-1.2％。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，有益菌为约氏乳杆菌、鼠乳杆菌、加氏乳杆菌或罗伊氏乳杆菌中的任意一种或多种。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，小鼠粪便匀浆的制备方法包括如下步骤：取小鼠粪便，一定时间内，在无菌超净台中，按质量体积比用无菌水将小鼠粪便溶解成0.5-0.7％液体粪便匀浆，优选为0.6％。
在本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法中，还具有这样的特征：其中，一定时间为0.4-1h，优选为0.5h。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种利用益生元富集有益菌的方法，包括如下步骤：在小鼠粪便匀浆中加入培养液或益生元，过滤，培养8-24h，将有益菌分离，即得，其中，培养液为MRS培养液。因为本发明通过在小鼠粪便匀浆中，添加低聚果糖和胰蛋白胨，得出添加低聚果糖和/或胰蛋白胨可以促进小鼠粪菌中促进粪菌中乳杆菌属Lactobacillus生长的作用，所以本发明提供的利用益生元富集有益菌的方法操作简单，效果明显，为今后富集其他有益菌提供了良好的参考价值。
附图说明
图1是本发明的实施例中粪便微生物在不同C源、N源添加组中的生长状况图；
图2是本发明的实施例中小鼠粪便样品在门水平的群落组成图；
图3是本发明的实施例中小鼠粪便样品在属水平的群落组成图；
图4是本发明的实施例中小鼠粪便微生物样品的主坐标分析图；以及
图5是本发明的实施例中小鼠粪便样品的OTU数目图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
下述实施例中使用的MRS培养液自制得到。
液体培养基的配方：葡萄糖10.0g、酪蛋白胨10.0g、牛肉浸出粉10.0g、无水乙酸钠8.3g、酵母浸出粉5.0g、柠檬酸二胺2.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水合硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、Tween-80(失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚)1mL、去离子水1000mL。
固体培养基的配方：MRS液体培养基的配方基础上添加2％琼脂粉。
<实施例1>
一种利用益生元富集有益菌的方法
利用益生元富集有益菌的方法如下：
步骤1，取小鼠粪便，于0.5h内，在无菌超净台中，按质量体积比用无菌水将小鼠粪便溶解成0.6％液体粪便匀浆，一共分为五组；
步骤2，取步骤1中的一组液体粪便匀浆，并加入与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液，用过滤器过滤，并使过滤器保持无菌状态；
步骤3，将添加了与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液的粪便培养液放置于37℃恒温培养箱，分别培养8小时和24小时。用0.86％生理盐水稀释至适宜的浓度，取100μL稀释液于固体MRS培养基上涂布，放置在低氧厌氧培养工作站中，37℃条件下培养36小时取出，进行单菌落计数，分离得到有益菌。
<实施例2>
一种利用益生元富集有益菌的方法
利用益生元富集有益菌的方法与实施例1类似，区别仅在于将实施例1中的与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液替换与小鼠液体粪便匀浆的质量体积比为1％的胰蛋白胨和与小鼠液体粪便匀浆的质量体积比为1％的低聚果糖。
<实施例3>
一种利用益生元富集有益菌的方法
利用益生元富集有益菌的方法与实施例1类似，区别仅在于将实施例1中的与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液替换为与小鼠液体粪便匀浆的质量体积比为1％的胰蛋白胨。
<实施例4>
一种利用益生元富集有益菌的方法
利用益生元富集有益菌的方法与实施例1类似，区别仅在于将实施例1中的与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液替换为与小鼠液体粪便匀浆的质量体积比为1％的低聚果糖。
<对照例1>
一种利用益生元富集有益菌的方法
利用益生元富集有益菌的方法与实施例1类似，区别仅在于将实施例1中的与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的MRS培养液替换为与小鼠液体粪便匀浆的体积比为1％的固体MRS培养基。
<对照例2>
一种富集有益菌的方法
富集方法与实施例1类似，区别仅在于在粪便培养液中不加任何益生元。
<测试例1>
测定OD(光密度)值
测试方法：使用生长曲线仪测定实施例4-7及对照例1在600nm处菌株的光密度值。
测试结果如图1所示。从图1可知，对照例1及添加1％低聚果糖组结果显示粪便微生物无生长；添加1％胰蛋白胨组粪菌持续缓慢富集；添加1％胰蛋白胨低聚果糖组在第3h进入对数生长期，约15h进入稳定期，OD值介于添加1％胰蛋白胨组和添加1％MRS组之间；添加1％MRS组：无明显迟滞期，迅速进入对数生长期，6h后进入稳定期，对粪菌的生长促进作用最明显。这说明小鼠粪便自身物质不能提供足够的营养使粪菌生长；单独添加碳源，粪便微生物无生长，单独添加氮源粪便微生物生长明显，说明氮源是粪菌的生长限制性因子；同时添加碳源氮源组和添加1％MRS组生长相似，说明MRS中的其他营养物质不是重要的限制因素，或者其他营养物质可以依赖粪便本身提供。
<测试例2>
16S rRNA序列分析鉴定测试
测试方法：在固体MRS培养基上分四区划线纯化培养，挑去纯化分离出的单菌落，接种于1mLMRS液体培养基(灭菌后)中，37℃恒温培养12h取出：离心机离心(5000g，15min)收集菌体。通用引物27F和1492R进行PCR扩增，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物寄送至生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI数据库中进行局部序列比对检索，如表1所示。
表1粪便微生物体外培养鉴定结果
Figure BDA0002857875600000071
Figure BDA0002857875600000081
从表1可知，在体外培养肠道微生物工作中，增加碳源和氮源也能满足微生物生长的需要。在粪便微生物乳杆菌的筛选工作中，液体MRS富集之后，乳杆菌的筛选结果明显优于直接固体MRS体外培养，其中鼠乳杆菌和罗伊氏乳杆菌数量明显上升。通过对比1％胰蛋白胨低聚果糖组和1％MRS组，我们可以发现培养8h时，两组的乳杆菌数量和种类相似，培养24h时，MRS富集过后，除了加氏乳杆菌的数量为零，约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌数量增加明显。
<测试例3>
粪便微生物的多样性测试
测试方法：根据E.Z.N.A.
Figure BDA0002857875600000082
soil试剂盒使用说明书对小鼠粪便进行总DNA提取，利用NanoDrop2000对DNA浓度和纯度进行检测，DNA提取质量利用1％琼脂糖凝胶电泳检测。利用细菌基因组对V3-V4可变区域进行PCR扩增。使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库，并利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。
测试结果如图2-5所示。图2是本发明的实施例中小鼠粪便样品在门水平的群落组成图。图3是本发明的实施例中小鼠粪便样品在属水平的群落组成图。图4是本发明的实施例中小鼠粪便微生物样品的主坐标分析图。图5是本发明的实施例中小鼠粪便样品的OTU数目图。
在图2和图3中，F为正常小鼠粪便，收集小鼠粪便，不做稀释等处理，直接送测序。K为空白组，不添加任何东西，直接稀释的小鼠粪便匀浆37°放置8-24h。A为添加1％胰蛋白胨组，B为添加1％胰蛋白胨和低聚果糖组，M添加1％MRS培养液组。
在图5中，B1、B2分别为B组培养8h和24h的样品，M1和M2，分别为M组培养了8h和24h的样品。B组为添加1％胰蛋白胨和低聚果糖组，M组添加1％MRS培养液组。
如图2-5所示，不同处理方式的小鼠粪便菌的群落组成会发生改变。添加不同的碳源和氮源，对小鼠粪菌的组成及多样性影响较大，其中低聚果糖和胰蛋白胨联合使用对益生菌的富集效果与MRS相似，单独添加胰蛋白胨对益生菌的作用效果不显著，添加了碳源和氮源或者MRS后，粪菌中的乳杆菌属Lactobacillus的占比增加，说明乳杆菌属Lactobacillus生长同时需要碳源和氮源。综上可得，小鼠肠道内的乳酸菌的生长需要同时补充碳源和氮源。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的一种利用益生元富集有益菌的方法，包括如下步骤：在小鼠粪便匀浆中加入培养液或益生元，过滤，培养8-24h，将有益菌分离，即得，其中，培养液为MRS培养液。因为本实施例通过在小鼠粪便匀浆中，添加低聚果糖和胰蛋白胨，得出添加低聚果糖和/或胰蛋白胨可以促进小鼠粪菌中促进粪菌中乳杆菌属Lactobacillus生长的作用，所以本实施例提供的利用益生元富集有益菌的方法操作简单，效果明显，为今后富集其他有益菌提供了良好的参考价值。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在小鼠粪便匀浆中加入培养液或益生元，过滤，培养8-24h，将有益菌分离，即得，
其中，所述培养液为MRS培养液。
2.根据权利要求1所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述MRS培养液与所述小鼠粪便匀浆的体积比为0.8-1.2％。
3.根据权利要求1所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述MRS培养液包括：葡萄糖9-11g、酪蛋白胨9-11g、牛肉浸出粉9-11g、无水乙酸钠8.0-8.5g、酵母浸出粉4.5-5.2g、柠檬酸二胺1.8-2.2g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水合硫酸镁0.55-060g、硫酸锰0.20-0.30g、失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.8-1.2mL、去离子水900-1100mL。
4.根据权利要求1所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述益生元为低聚果糖和/或胰蛋白胨。
5.根据权利要求4所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述低聚果糖与所述小鼠粪便匀浆的质量体积比为0.8-1.2％。
6.根据权利要求4所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述胰蛋白胨与所述小鼠粪便匀浆的质量体积比为0.8-1.2％。
7.根据权利要求1所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述有益菌为约氏乳杆菌、鼠乳杆菌、加氏乳杆菌或罗伊氏乳杆菌中的任意一种或多种。
8.根据权利要求1所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述小鼠粪便匀浆的制备方法包括如下步骤：
取小鼠粪便，一定时间内，在无菌超净台中，按质量体积比用无菌水将小鼠粪便溶解成0.5-0.7％液体粪便匀浆。
9.根据权利要求8所述的利用益生元富集有益菌的方法，其特征在于：
其中，所述一定时间为0.4-1h。
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