CN115634290A - 一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具光热‑光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法，属于生物材料领域，本发明所述具有光热‑光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜是木糖驹形氏杆菌静置发酵后产生的细菌纤维素经过聚多巴胺和硫化铜修饰得到的。本发明所述其特征是包括如下步骤：（1）细菌纤维素的制备（2）细菌纤维素聚多巴胺复合膜的制备（3）细菌纤维素/聚多巴胺/硫化铜复合膜的制备。该方法具有操作简单、无毒无害等优点。本发明提供一种具有光热性能的细菌纤维素/聚多巴胺复合膜，通过在复合膜上原位修饰硫化铜纳米颗粒，进一步实现其功能化，从而制备得到具有光热‑光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法。
背景技术
细菌感染严重危害了人们的生命安全，据估计，每年有一千五百万人死于细菌感染。抗生素被认为是治疗细菌感染的有效药物，但是由于抗生素的滥用和不断使用，促进了细菌的进化，导致“超级细菌”的产生，这使得抗生素的疗效大大降低，抗生素难以满足治疗细菌感染的需要。
细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一种具有独特的3D网络结构的水凝胶。BC水凝胶具有高比表面积、高持水能力、优异的机械性能、生物可降解性、良好的生物相容性和无毒性等特点。它已经广泛应用于从食品制造到生物医学领域的应用，如伤口愈合过程、组织工程支架、药物释放等。但是，BC本身不具有抗菌特性，不能防止伤口的感染，影响伤口的痊愈和愈后质量。
光热疗法（phototermal treatment，PTT）是利用具有较高光热转换效率的材料，并在外部光源（一般是近红外光）的照射下将光能转化为热能来杀死微生物的一种治疗方法，具有高选择性、微创性、低副作用等优势。但是光热杀菌过程会在局部产生高温，从而对邻近的健康组织造成损伤，降低治疗温度又达不到根除细菌感染的目的，因此，PTT常与其他疗法联用。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种由光激发的疗法，光敏剂在光照射下触发产生活性氧（ROS），从而杀灭微生物。由于具有杀菌效率高，光治疗毒性低，副作用小，且不会导致耐药菌的形成，PTT和PDT协同治疗被认为是一种安全且应对细菌感染的有效策略。聚多巴胺（PDA）是一种良好的光热剂（PTA），有研究表明PDA在808 nm 近红外光照射下具有较高的光吸收和光热转换效率。此外，PDA具有邻苯二酚等功能基团，多巴胺自聚合后可在基底表面产生涂层，从而黏附金属纳米颗粒等。CuS纳米颗粒具有优异的生物相容性，并且在808 nm近红外光照射下可有效产生热和ROS。因此，将PDA和CuS纳米颗粒负载于BC膜，可赋予BC膜光热-光动力协同抗菌活性，有效促进伤口愈合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法。
本发明所采用的技术方案得以实现：
步骤1：菌种的活化
从甘油管中取出，分别在HS培养基斜面上划线，置于30 ℃培养箱中培养直至出现单菌落
步骤2：发酵种子液的制备
挑起木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)的单菌落于HS培养基中，加入纤维素酶，于摇床中振荡培养；
步骤3：BC的制备与纯化
将K. xylinus种子液分装在无菌离心管中，离心收集菌体，倒掉上清液，用生理盐水洗菌体，洗好的菌体用0.9%生理盐水重悬，并在分光光度计下调节OD600=0.5，将调好的菌悬液接种在装有无菌液体HS培养基的锥形瓶中，将培养基放入30 ℃恒温恒湿培养箱中培养，发酵结束后，将上层BC膜取出并浸入氢氧化钠溶液中，等待细BC薄膜浸泡至白色后，将薄膜转移至蒸馏水中，直至浸泡至中性，备用。
步骤4：BC/PDA复合膜的制备
将BC切成3×3 cm的小片，浸入盐酸多巴胺溶液中，在摇床中避光浸渍复合12h，反应结束后，将浸渍后的BC使用去离子水冲洗，之后将BC转移至装有pH=8.5 Tris-HCl溶液的锥形瓶中，在摇床中氧化自聚合18 h，得到BC/PDA复合膜，使用蒸馏水冲洗以去除未反应物后，置于4 ℃冰箱中备用；
步骤5：BC/PDA/CuS复合膜的制备
将步骤4中的得到的BC/PDA复合膜，放入分别装有100 ml CuCl2·2H2O和柠檬酸钠混合溶液的锥形瓶中震荡反应，冲洗后，将复合膜转移至Na2S·9H2O溶液中震荡反应，反应结束后，BC/PDA/CuS复合膜在去离子水中过夜浸泡，制备好的复合膜于4 ℃保存。
步骤6：光热性能的测试
将复合膜切成1×1 cm的方块，而后放置于玻璃平皿上，使用808 nm近红外激光照射，分别在0 min、1 min、3 min、5 min、10 min使用热成像仪记录复合膜的温度变化。
步骤7：抗菌活性的测试
挑起金黄色葡萄球菌和大肠杆菌单菌落于新鲜无菌LB培养基中过夜培养，培养好的菌液离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤两次，后调节菌悬液OD600=0.5，每孔加入2 ml菌液，对照组不加样品不加光照，实验组使用808 nm激光照射10 min，菌液与样品共培养3 h后，每孔吸取100 μl菌液，依次进行稀释涂布。
步骤8：ROS的检测
复合膜（1×1 cm）浸入装有2 ml PBS缓冲液的24孔板中，避光的条件下加入DCFH-DA荧光探针，使用808 nm近红外激光照射10 min后，使用酶标仪测定荧光强度。
上述步骤2的培养条件：纤维素酶的添加量为1‰，培养温度为30 ℃，转速为180rpm；
上述步骤3的菌液OD600=0.5，接种量为6%；
上述步骤4的盐酸多巴胺溶液的浓度为1 g/L，Tris-HCl溶液浓度为100 mM；
上述步骤5中，BC/PDA复合膜与CuCl2·2H2O和柠檬酸钠的反应时间为12 h，与Na2S·9H2O的反应时间为6 h；
上述步骤6中激光照射复合膜的时间均为10 min；
上述步骤7和8中激光器的激光功率为1.4 w，激光功率密度为0.8 w/cm2，光斑直径为1.5 cm。
本发明的有益效果在于：相比于普通抑菌材料，本发明通过单一近红外光激发样品的光热性能和光动力性能，可以针对性的治疗细菌感染，直达感染部位，抑菌效果更佳，毒性更小。
附图说明
图1为本发明制备的BC/PDA/CuS复合膜的光热性能图
图2为本发明制备的BC/PDA/CuS复合膜的ROS释放图。
图3为本发明本发明制备的BC/PDA/CuS复合膜对金黄色葡萄球菌存活率统计图
图4为本发明本发明制备的BC/PDA/CuS复合膜对大肠杆菌存活率统计图。
具体实施方式
下面结合优选实施例进行详细阐述，以使发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：
本发明的一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法，该复合膜由木糖驹形氏杆菌发酵而来，纯化后的产物经过原位修饰，使得复合膜具备具有光热-光动力协同抗菌活性。
本优选实施例中，一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法包括如下步骤：
步骤1：菌种的活化
将保存在甘油管中的木糖驹形氏杆菌用无菌接种环取出，于HS培养基上划线，并在30 ℃培养箱中培养48-36 h，直至出现单菌落。
步骤2：发酵种子液的制备
挑起木糖驹形氏杆菌单菌落于新鲜HS培养基中，并加入1‰的纤维素酶，在摇床中震荡培养24 h。培养温度为30 ℃，转速150-180 rpm。
步骤3：BC的制备
将培养好的木醋杆菌种子液，转移至离心管中，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗两次菌体后，使用分光光度计调节菌液OD600=0.5，接种量为6％，与培养基混匀后，放入30℃培养箱培养48 h，发酵结束将BC取出，浸泡在0.1 M NaOH溶液中，等膜变白后，放于蒸馏水中，直至变成中性。
步骤4：BC/PDA复合膜的制备
将BC切成3×3 cm的小片，浸入装有100 ml的1 g/L的盐酸多巴胺溶液中，在30℃、150 rpm的摇床中避光震荡复合12 h，反应结束后，将浸渍后的BC使用去离子水冲洗2-3次，之后将BC转移至装有100 ml pH=8.5的Tris-HCl溶液的锥形瓶中，在摇床中震荡氧化自聚合18 h，得到BC/PDA复合膜使用蒸馏水冲洗以去除未反应物后，置于4 ℃冰箱中备用；
步骤5：BC/PDA/CuS复合膜的制备
将步骤4中的得到的BC/PDA复合膜，放入分别装有100 ml CuCl2·2H2O和柠檬酸钠混合溶液的锥形瓶，CuCl2·2H2O的添加量分别为17.8 mg、89 mg和178 mg，柠檬酸钠的添加量22.8 mg、114.0 mg和228.0 mg，超声处理1 h后转移至30 ℃、150 rpm的摇床中反应11h，冲洗后，将复合膜转移至1 mM、5mM和10 mM Na2S·9H2O溶液中，超声1 h而后震荡反应5h，反应结束后，BC/PDA/CuS复合膜过夜浸泡在去离子水中以去除未反应的离子等，复合膜于4 ℃保存。
步骤6：光热性能的的测试
将复合膜切成1×1 cm的方块，而后放置于玻璃平皿上，使用0.4 w/cm2的808nm的近红外光依次照射BC、BC/PDA、BC/PDA/CuS复合膜，并使用热成像仪分别在照射第1 min、3min、5 min、10 min和15min时计录实时温度变化。
步骤7：抗菌性能的测定
本实验采用CFU记数法来测定复合膜的抑菌性能，干燥后的样品被切成1×1 cm的小片，然后小片剪碎后放入24孔板中，并使用紫外灭菌1 h。挑起金葡和大肠杆菌单菌落于新鲜无菌LB培养基中过夜培养，培养好的菌液离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤两次，后调节菌悬液OD600=0.5，每孔加入2 ml菌液，对照组不加样品不加光照，实验组使用0.8 w/cm2的808 nm激光照射10 min，所有实验组照射完成后，放入37 ℃、150 rpm摇床共培养3 h后，每孔吸取100 μl菌液于装有900 μL PBS缓冲液的1.5 ml离心管中，使用移液枪吹洗混匀，依次进行稀释涂布至10-4、10-5倍。
步骤8：ROS的检测
复合膜（1×1 cm）浸入装有2 ml PBS缓冲液的24孔板中，避光的条件下加入DCFH-DA荧光探针，使用808 nm近红外激光照射10 min后，使用酶标仪测定荧光强度，激发波长为488 nm。发射波长为515 nm。
上述HS培养基的配制：蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉7.5 g/L、十二水磷酸氢二钠 10g/L，加蒸馏水定容至1L，搅拌均匀后使用冰乙酸调节pH=6.0。
上述PBS缓冲液的配置：氯化钠8 g/L、氯化钾0.2 g/L、十二水磷酸氢二钠3.58 g/L、磷酸二氢钾0.27 g/L，加蒸馏水定容至1 L，115 ℃灭菌30 min后待用。
上述LB液体培养基与2％LB固体培养基的配置：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、加蒸馏水定容至1 L，称取2 g琼脂粉于500 ml锥形瓶中，并加入100 ml混匀的LB液体培养基，于121 ℃条件下灭菌20 min，待用。
上述木糖驹形氏杆菌为CGMCC No. 2955、金黄色葡萄球菌为ATCC29213、大肠杆菌为大肠杆菌ATCC25922。
BC经过PDA、CuS修饰合成BC/PDA/CuS后，赋予了复合膜光热性能。由图1可知，照射15 min后，BC水凝胶由25.1 ℃升至26.7 ℃、BC/PDA复合膜由25.0 ℃升至41.0 ℃、BC/PDA/CuS1由26.9 ℃升至43.0 ℃、BC/PDA/CuS5由25.7 ℃升至48.6 ℃、BC/PDA/CuS10由24.8 ℃升至54.0 ℃。BC/PDA/CuS复合膜还具有一定的光动力性能。由图2可知，BC、BC/PDA在光照前后均没有ROS产生，BC/PDA/CuS组在808 nm激光照射后，荧光强度明显增加，表示在近红外光的照射下复合膜释放了ROS。由图3和4可知，BC近红外光照前后均不具有抑菌效果，BC/PDA未加光照处理前，也不具有抑菌性能，BC/PDA/CuS1、BC/PDA/CuS5、BC/PDA/CuS10样品在近红外光照后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌体存活率均有显著下降，BC/PDA/CuS1、BC/PDA/CuS5、BC/PDA/CuS10复合膜经过近红外光照后，大肠杆菌存活率分别由87.2％降至62.5％，47.1％降至22.0％，3.5％降至0.4％ 金黄色葡萄球菌存活率分别由74.4％降至64.9％，10.0％降至0.2％，0.8％降至0.001％。实验结果表明，合成的BC/PDA/CuS复合膜具有光热-光动力协同抗菌活性，并且有潜力作为敷料治疗伤口细菌感染。
Claims (10)
1.一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法，其特征在于，包括细菌纤维素的制备与纯化、细菌纤维素/聚多巴胺复合膜的制备和细菌纤维素/聚多巴胺/硫化铜复合膜的制备等步骤。
2.根据权利要求1所述的一种具有光热-光动力协同抗菌活性的细菌纤维素复合膜及其制备方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）菌体活化：木糖驹形氏杆菌从甘油管中取出，在HS培养基斜面上划线，置于30 ℃培养箱中培养直至出现单菌落；
（2）发酵种子液的制备：挑起木糖驹形氏杆菌的单菌落于HS培养基中，加入纤维素酶，于30 ℃摇床中振荡培养；
（3）细菌纤维素的制备与纯化：将木醋杆菌种子液分装在无菌离心管中，离心收集菌体，倒掉上清液，加入生理盐水重悬菌体，并在分光光度计下将菌悬液OD600调至0.5，将调好的菌悬液接种在无菌HS培养基中，将培养基放入30 ℃恒温恒湿培养箱中培养，发酵结束后，将上层细菌纤维素固体取出并浸入氢氧化钠溶液中以去除细胞残骸和培养基，待细菌纤维素薄膜浸泡至白色后，将薄膜转移至蒸馏水中浸泡至中性，备用；
（4）细菌纤维素/聚多巴胺复合膜（BC/PDA）的制备：将BC切成3×3 cm的小片，浸入盐酸多巴胺溶液中，在摇床中避光复合12h，反应结束后，将浸渍盐酸多巴胺后的BC使用去离子水冲洗，之后将BC转移至装有pH=8.5的Tris-HCl溶液的锥形瓶中，在摇床中震荡氧化自聚合18 h，得到BC/PDA复合膜，使用蒸馏水冲洗以去除未反应物后，置于4 ℃冰箱中备用；
（5）细菌纤维素/聚多巴胺/硫化铜复合膜（BC/PDA/CuS）的制备:将BC/PDA复合膜放入分别装有CuCl2•2H2O和柠檬酸钠混合溶液的锥形瓶震荡反应，冲洗后，将复合膜转移至Na2S•9H2O溶液震荡反应，反应结束后，BC/PDA/CuS复合膜过夜浸泡在去离子水中以去除未反应的离子等，复合膜于4 ℃保存；
（7）光热性能的的测试：将复合膜切成1×1 cm的方块，放置于玻璃平皿上，使用808 nm近红外激光照射，分别在0 min、1 min、3 min、5 min、10 min使用热成像仪记录复合膜的温度变化；
（8）抗菌活性的测试：挑起金黄色葡萄球菌和大肠杆菌单菌落于新鲜无菌LB培养基中过夜培养，培养好的菌液离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗两次，后调节菌悬液OD600=0.5，每孔加入2 ml菌液，对照组不加样品不加光照，实验组使用808 nm激光照射10 min，菌液与样品共培养3 h后，每孔吸取100 μl菌液，依次进行稀释涂布；
（9）复合膜（1×1 cm）浸入装有2 ml PBS缓冲液的24孔板中，避光的条件下加入DCFH-DA荧光探针，使用808 nm近红外激光照射10 min后，使用酶标仪测定荧光强度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，细菌纤维素生产菌株为木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus, K. xylinus) CGMCC 2955。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基选自HS培养基，培养温度为30 ℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，BC浸入的盐酸多巴胺溶液的浓度为1 g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，盐酸多巴胺聚合时使用的是100 mM、pH=8.5 Tris-HCl溶液，反应温度为30 ℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备BC/PDA/CuS复合膜时，先与CuCl2•2H2O和柠檬酸钠反应时间为12 h，后与Na2S•9H2O反应时间为6 h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备BC/PDA/CuS复合膜时，反应条件为30 ℃、150 rpm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗菌实验中，使用的近红外光波长为808 nm、激光功率密度为0.8 w/cm2、照射时间为10 min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗菌实验中，所选用的是金黄色葡萄为球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus) ATCC 29213和大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli) ATCC 25922。
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