CN110167608A - 3d可打印生物凝胶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了胶原质组合物、制备该胶原质组合物的方法、以及由该胶原质组合物形成的3D结构。特别地，本发明提供了分离具有增强的凝胶化率的胶原质的方法、该胶原质组合物以及由该胶原质组合物形成的3D结构。

Description

3D可打印生物凝胶及其使用方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2016年5月26日提交的美国临时申请No.62/341,960的优先权，该申请通过引用全文并入本文。

技术领域

本发明主要涉及3D可打印生物凝胶，更具体地，本发明涉及用于制造其三维结构的含胶原质3D可打印生物凝胶的方法和组合物。

背景技术

鉴于胶原质基材料广泛的应用，其可以证明是用于3D打印技术的有利基材。胶原质(collagen)的结构、功能与性质使其成为无数组织工程目的重要材料。目前可用的胶原质体现了其功能多样性；然而现有的胶原质制备工艺会产生性质(例如，凝胶化速率、强度、弹性和流变学)不佳的制剂。某些3D制造工艺，例如添加剂制备，需要具有快速凝胶特性的生物材料，这在生物基材料中具有挑战性。

本发明旨在克服这些以及其他缺陷。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种获得胶原质的方法。该方法包括对胶原质基生物材料(collagen-based biomaterial)进行加工来获得生物材料颗粒(biomaterialparticles)。在一些实施例中，该胶原质基生物材料是衍生自哺乳动物的I型胶原质。在一些实施例中，该方法包括将生物材料颗粒与弱酸溶液接触以获得含胶原质的溶液。在一些实施例中，该方法包括分离该含胶原质的溶液。在一些实施例中，分离包括离心。在一些实施例中，该方法包括将含胶原质的溶液与盐溶液接触以获得胶原质沉淀物。在一些实施例中，该方法包括重新悬浮该胶原质沉淀物以获得再悬浮胶原质溶液。在一些实施例中，该方法任选地包括对该再悬浮胶原质溶液进行病毒和朊病毒的灭活。在一些实施例中，该方法包括对该再悬浮胶原质溶液进行脱盐。在某些实施例中，该方法包括干燥该再悬浮胶原质溶液以获得胶原质材料。在一些实施例中，该方法包括对该胶原质材料进行灭菌。

在另一方面，本发明提供了一种生物凝胶组合物。所述生物凝胶组合物包括上述所得到的胶原质材料。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括弱酸溶液中的胶原质材料。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可使用适量的胶原质材料制备得到。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括大于5mg/mL的该胶原质材料。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可在室温或更高温度下进行快速凝胶化。在一些实施例中，本发明的该生物凝胶组合物在凝胶化前在15～100Pa的剪切应力下也可以是液体，并且在凝胶化过程中在约30～120Pa的静水压力下保持固体状态。在一些实施例中，该生物凝胶组合物包括载体和非天然添加剂，例如交联剂。

另一方面，本发明提供了一种由本申请描述的该生物凝胶组合物制备三维结构的方法。在一些实施例中，该方法包括向模块化制造系统提供生物凝胶组合物。在一些实施例中，模块化制造系统是3D打印设备。在一些实施例中，该方法包括将该生物凝胶组合物的温度维持在约0～12℃。在一些实施例中，该方法包括沉积该生物凝胶组合物以形成三维结构，其中三维结构经历凝胶化。在一些实施例中，该方法包括固化三维结构。

另一方面，本发明还提供了一种用于三维结构制造的生物凝胶组合物的制备方法。在一些实施例中，该方法包括提供在弱酸性溶液中具有胶原质材料的第一容器，其中使用本申请描述的方法获得胶原质材料。在一些实施例中，该方法包括提供具有载体的第二容器。在一些实施例中，该方法还可包括提供一个具有活细胞的第三容器。在一些实施例中，该方法包括使第一容器的弱酸溶液中的胶原质材料与第二容器的载体接触，以获得具有约50％～99.9％同质性的生物凝胶组合物。

附图说明

图1是描述本发明用于制备胶原质的示例性方法流程图。

图2是描绘从本发明的生物凝胶组合物制备三维结构的示例性方法流程图。

图3是描述本发明用于三维结构制造的生物凝胶组合物的制备的示例性方法流程图。

图4是本发明未固化的生物凝胶组合物的非牛顿流体行为测量图。

图5是本发明的生物凝胶组合物在热固化期间的储能和损耗模量分布图。

图6A是本发明与商业胶原质生物凝胶的生物凝胶组合物的储能模量增加的对比图。

图6B是本发明固化的生物凝胶组合物与商业胶原质生物凝胶的三维结构对比图。

图7是通过无侧限压缩试验测定过酸灭菌对胶原质样品模量的影响图。

图8是本发明的生物凝胶组合物的固化三维结构的抗压强度图。

图9是具有交联剂和不含交联剂的生物凝胶组合物的固化三维结构图。

图10是本发明的生物凝胶组合物的固化三维结构和商业胶原质生物凝胶组合物的抗压强度对比图。

具体实施方式

下文描述了各种实施例。应当注意的是，具体实施例并非旨在作为详尽的描述或作为对本文讨论的更广泛方面的限制。结合具体实施例描述的一个方面不一定限于该实施例，并且可以与任何其他实施例一起实践。

以下术语贯穿始终，定义如下。

如本文中以及在所附权利要求中所使用的，在描述元素的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，诸如“a”和“an”和“the”等单数冠词和类似指代词应被解释为同时包括单数和复数，除非另有指示语境或明显矛盾的语境。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作对属于该范围内的每个单独值进行单独裁判的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文相矛盾的，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明实施例，并且不限制本发明的范围。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未声明的元素是必不可少的。

在没有任何单个元素或多个元素、单个限制或多个限制的情况下，可以适当地实践本文中未具体公开的示例性描述的实施例。因此，例如，术语“包括”，“包括”，“含有”等应当被扩展性地阅读且不受限制。另外，这里使用的术语和表达已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达时无意排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到在所要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。另外，短语“基本上由......组成”将被理解为包括具体叙述的那些元素以及那些不会实质上影响所述技术的基本特征和新颖特征的附加元素。短语“由...组成”排除了未指定的任何元素。“包含”表示“包括但不限于”。因此，可以存在其他未提及的物质、添加剂、载体或步骤。除非另有说明，否则“一”或“一个”表示“一个或多个”。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示性能、参数、条件等数量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附的权利要求书中提出的数值参数是近似值。每个数值参数至少应根据报告的有效数字并通过应用普通的舍入技术来解释。当在数字标记例如温度、时间、量和包括范围的浓度之前使用术语“约”时，表示可以变化(+)或(-)10％，5％或1％的近似值。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文中公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并且使相同的范围被分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性示例，这里讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，诸如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言都包括所叙述的数字，并且涉及随后可被分解为如上所述的子区域的范围。最后，正如本领域技术人员所理解的，范围包括每个个体成员。

在一些实施例中，术语“凝胶”包括但不限于非牛顿流体和宾汉塑性流体。

本文所用的术语“剪切应力”或“剪切稀化”是指与流体状或非流体状行为和流动相关材料的流变粘弹性。剪切应力和剪切稀化包括与宾汉塑性流体、塑性流动、假塑性、扩张性、触变性、流变性等有关的特性或粘性材料的其他应力和/或应变特性。此外，“剪切稀化”是指表观粘度(剪切应力与剪切速率之比)随着增加(假塑性)、时间依赖性(触变性)或与屈服应力相关而降低，定义为在流动开始之前必须超过的应力(宾汉塑性流体和广义的宾汉塑性流体)。通常参见Harris,J.,&Wilkinson,W.L.,“Non-Newtonian Fluid,”pp.856-858in Parker,S.P.,ed.,McGraw-Hill Encyclopedia of Physics,Second Edition,McGraw-Hill,New York,1993。本发明的合适粘度范围包括但不限于作为静止固体的约10,000～30,000cps，或作为液体的约3,000～10,000cps。

本文所说的术语“粘度”是指通过材料的剪切应力或拉伸应力对逐渐变形的抵抗力。

本文所说的术语“过酸”是指其中羧基或无机含氧酸的OH部分被OOH部分取代的酸。这种过羧酸的实例包括但不限于过甲酸和过乙酸。

本文所说的术语“胶原质”是指结缔组织的主要蛋白质，具有高拉伸强度并且已在大多数多细胞生物中发现。胶原质是一种主要的纤维蛋白，也是基底膜中的非纤维状蛋白质。它含有丰富的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸。胶原质遍布全身，至少有12种类型(I-XII型)。

术语“生物材料”是指衍生自天然或合成的材料。

本文所说的术语“容器”是指能够接收和容纳用于制备和使用本文所述的本发明任何材料的标准系统。材料包括但不限于胶原材料、弱酸溶液、载体、添加剂、溶剂、活细胞、细胞培养基等或其组合。例如，合适的容器包括但不限于注射器、漏斗、烧杯、混合器、滚筒、瓶子、小瓶及其类似物等。

胶原基材料是用于制备3D结构的生物凝胶的有利基材。在各个方面，本发明还提供了用于生物凝胶组合物的胶原质的获得方法、生物凝胶组合物、使用生物凝胶组合物制备3D结构的方法、以及制备用于3D打印系统的生物凝胶组合物的方法。

一方面，本文公开了一种获得胶原质的方法，其中该方法包括处理于胶原质基生物材料以得到生物材料颗粒；使该生物材料颗粒与弱酸溶液接触以得到含胶原质的溶液；分离含胶原质的溶液；使该含胶原质的溶液与盐溶液接触以得到胶原质沉淀物；重新悬浮该胶原沉淀物以获得再悬浮胶原质溶液；并任选地对该再悬浮胶原质溶液进行病毒和朊病毒的灭活；将该再悬浮胶原质溶液脱盐；干燥该再悬浮胶原质溶液以得到胶原质材料；并对该胶原质材料进行灭菌。

胶原质基生物材料可来自诸如脊椎动物的胶原质源。在一些实施例中，该脊椎动物胶原质源包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类等。在一些实施例中，所述来源是哺乳动物，包括但不限于马、犬、猪、牛、猫、山羊、绵羊、鼠或人。在某些实施例中，哺乳动物来源是猪、牛、鼠或其组合。

在本发明的另一实施例中，胶原质基生物材料来自人造原料。在某些实施例中，该人造原料包括但不限于来自细胞培养物中的重组表达蛋白的胶原、工程细胞、细菌细胞培养物、哺乳动物细胞培养物等或其组合。在一些实施例中，该人造原料是工程细胞来源。合适的工程细胞来源包括但不限于酵母细胞、昆虫分泌细胞等或其组合。

胶原质基生物材料中的胶原质可来自于各种原料，包括但不限于肌腱、皮肤、韧带、骨、牙齿、软骨、结缔组织、椎间盘、角膜等，以及它们的组合。在一些实施例中，胶原质基生物材料是皮肤、骨、肌腱或其组合。在某些实施方案中，皮肤、骨骼或肌腱可以源自哺乳动物，包括但不限于包含牛、猪、鼠或其组合。当来源是肌腱时，它可以包括但不限于普通指伸肌腱、侧伸肌腱、深屈肌腱等或其组合。

胶原质基生物材料可以原样使用或可以进行质量鉴别。可以使用本领域已知的各种技术来执行这种鉴别，包括但不限于手动视觉检查以识别包括非白色表面特性的区域或使用计算机视觉技术，其中读取像素值的颜色和强度以及区域拒绝阈值。这些阈值可包括偏离1:1:1比率约1％、约5％、约10％、约20％、约50％或约80％的RGB值；各个通道值可以是约99％、约95％、约90％、约80％、约50％或约30％。在一些实施例中，所述鉴别包括选择具有少于约5％的浸润物的胶原质基生物材料。

胶原质基生物材料中的胶原质可以是任何类型的。在一些实施例中，该胶原质基生物材料可包括I型胶原质，它是生物体中最丰富的胶原质类型，可在大多数结缔组织中找到，存在于肌腱、真皮和骨骼中。体内超过90％的胶原质是I型。在一些实施例中，I型胶原质包括不溶性胶原质、胶原质纤维、可溶性胶原质和酸溶性胶原质。在某些实施例中，I型胶原质是可溶性胶原质、酸溶性胶原质或其组合。在一些实施方案中，I型胶原质不包括端胶原质。

在一些实施例中，本方法包括使用机械作用处理该胶原质基生物材料以获得该生物材料颗粒。合适的机械作用包括但不限于冷冻、切片、切碎、剁碎、铣削、研磨及其组合。在某些实施例中，该方法可包括将该胶原质基生物材料切成细股，以获得合适尺寸的生物材料颗粒。在一个实施例中，可以纵向切片胶原质基生物材料。在另一个实施例中，切片可以是横纵向。在又一个实施例中，切片是纵向或横纵向。在一些实施例中，该切片可在进行切片前不冷冻该胶原质基生物材料。在其他实施例中，可以冷冻该胶原质基生物材料以促进切片。在某些实施例中，将该胶原质基生物材料机械加工成尺寸为约100μm～1cm的生物材料颗粒。合适的生物材料粒度包括但不限于约100μm～50mm、约100μm～1mm、约100μm～500μm、约100μm～250μm，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，该胶原质基生物材料还包括在机械作用之前浸泡在溶剂中。合适的溶剂包括但不限于去离子水、醇或其组合。合适的醇类包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等或其组合。在一些实施例中，该工艺还包括洗涤该生物材料。洗涤包括将该生物材料颗粒加入至缓冲溶液中。合适的缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、氯化钠溶液、磷酸盐溶液、水和磷酸盐缓冲溶液。

在本发明的一些实施例中，为进一步得到该生物材料颗粒，本方法包括使该生物材料颗粒与弱酸溶液接触以获得含胶原质的溶液。

在一些实施例中，该弱酸溶液含有约0.01％～20.0％的弱酸。该弱酸溶液中弱酸的量包括但不限于约0.01％～20％、约0.01％～10％、约0.01％～3％、约0.1％～3％、约0.3％～8％、约0.5％～5％、约1％～3％，以及在这些数值中的任何两个值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的弱酸溶液中弱酸的含量为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约12.5％、约15.0％、约20％以及这些值中的任何两个之间或小于这些值中的任何一个的范围。

在本发明的某些实施例中，与该生物材料颗粒接触的弱酸溶液的量包括但不限于每克生物材料颗粒约25mL～250mL的弱酸溶液。与生物材料颗粒接触的合适的弱酸溶液的量可包括但不限于约25～250mL/g、约25～200mL/g、约25～150mL/g、约25～100mL/g、约25～75mL/g、约25～50mL/g。或者可以为约50～250mL/g、约100～250mL/g、约150～250mL/g、或约200～250mg/g。与该生物材料颗粒接触的弱酸的量可包括但不限于约100mL/g、约150mL/g、约200mL/g、约250mg/mL，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些值中的任何一个的范围。

可以使用合适的方法将该生物材料颗粒与该弱酸溶液接触，以确保该生物材料颗粒在该酸溶液中的最大溶解或分散。在一些实施例中，该接触可包括但不限于将该生物材料颗粒与该弱酸溶液在一起混合或搅拌以获得该含胶原质的溶液。在特定实施例中，该接触可包括将该生物材料颗粒和该弱酸溶液混合。合适的接触可包括手动混合或使用合适的混合设备例如振荡器(例如轨道振动器)、旋转器、转筒、大罐混合器、顶置式搅拌器等混合。在一些实施例中，用轨道振荡器进行接触。在一个实施例中，使用轨道振动器进行接触可包括至少约100～250RPM、约120～230RPM、约150～220RPM、约100～200RPM、约150～200RPM的速度，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，使用轨道振动器进行接触可包括至少约100RPM、约110RPM、约120RPM、约130RPM、约140RPM、约150RPM、约160RPM、约170RPM、约180RPM、约190RPM、约200RPM、约210RPM，约220RPM、约230RPM、约240RPM、约250RPM，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，轨道振动器速度为约100～200RPM。在另一个实施例中，轨道振荡器速度为约100～150RPM。在又一个实施例中，轨道振荡器速度为约150～200RPM。

在一些实施例中，该接触可包括用该弱酸溶液搅拌生物材料颗粒。合适的搅拌可包括手动搅拌、顶置式搅拌器和磁力搅拌器。在一些实施例中，使生物材料颗粒与弱酸溶液接触可包括约24h～2周的时间。合适的时间可包括但不限于约24h～10天、约24h～7天、约24h～5天、约48h～14天、约72h～9天、约5天～14天、约5天～7天，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。该时间可包括但不限于至少约24h、约36h、约48h、约60h、约72h、约84h、约96h、约5天、约6天、约7天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，使该生物材料颗粒与该弱酸溶液接触包括约2天～14天的时间。在另一个实施例中，该接触包括约3天～9天的时间。在另一个实施例中，该接触包括约5天～7天的时间。

合适的弱酸溶液可包括但不限于适于将pH缓冲液保持在约2.8～4.0之间的弱酸溶液。在一些实施例中，该弱酸溶液保持pH为约2.8～4、约2.8～3.5、约2.8～3.3、约3.0～4.0、约3.3～4.0，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，合适的弱酸溶液可包括但不限于pKa为约3～7的溶液。合适的pKa值包括约3～7、约3～6、约3～5、约3.5～7、约4～7、约4.5～7，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些值中的任何一个的范围。合适的弱酸溶液包括但不限于甲酸、丙酸、乙酸、柠檬酸、丁酸、水杨酸、葡萄糖酸、庚酸、碳酸、氢氟酸、亚硝酸、次氯酸、盐酸等或其组合。

一旦获得该生物材料颗粒的酸溶液，即可对其进行适当处理以分离得到纯化的胶原质。在本发明的一些实施例中，从含胶原质的溶液中分离提取的胶原质可包括但不限于离心、尺寸排阻过滤、筛网过滤等或其组合。在某些实施例中，含胶原质的溶液的离心可包括以约5,000～25,000G的力离心。在某些实施例中，该离心可在约5,000G～20,000G、约5,000G～15,000G、约5,000G～12,000G和约5,000G～10,000G的力下进行离心。在其他实施例中，该离心可包括以至少约5,000G、约6,000G、约7,000G、约8,000G、约9,000G、约10,000G、约11,000G、约12,000G、约15,000G、约20,000G、约25,000G的力离心，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该离心可包括以约9,000～12000G的力离心。

在某些实施例中，该离心可包括但不限于在约10～120min的时间内离心。在某些实施例中，该时间可包括但不限于10～120min、约30～110min、约60～100min，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。合适的离心时间可包括约10min、约30min、约60min、约90min、约100min、约110min、约120min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该分离可包括在约10～90min或约80～110min的时间内离心该含胶原质的溶液。在一些实施例中，该分离可包括在离心后收集所得的上清液。

然后可适当地处理含有提取的胶原质的上清液，以从该溶液中分离该胶原质材料。在本发明的一些实施例中，在分离该含胶原质的溶液后，使提取的胶原质溶液与盐溶液接触可包括重复直至获得至少约95％～99.9％的纯胶原质沉淀物。在一些实施例中，该接触可包括浓度为约0.55～5M的盐溶液。在某些实施例中，该盐溶液浓度可包括但不限于约0.55～4M、约0.55～3M、约0.55～2M、约1～4M、约1～2.5M、约1～l.5M、约l.5～2.5M、约1～1.5M，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的盐溶液浓度可包括约0.55M，约0.75M、约1M、约1.5M、约2M、约2.5M、约3M、约3.5M、约4M、约4.5M、约5M，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，使提取的胶原质溶液与盐溶液接触可包括浓度为约0.55～3M的盐溶液。在另一个实施例中，该盐溶液浓度可包括约0.55～2M的浓度。在另一个实施例中，该盐溶液浓度可包括约0.55～1.5M的浓度。在特定的实施例中，该盐溶液浓度可包括小于约1.5M的浓度。

可以合适的速率将该盐溶液加入至该上清液(即提取的胶原质溶液)中，以确保胶原质材料的最大沉淀。在一些实施例中，该方法可包括以至少约10～20mL/min的速率加入该盐溶液。在某些实施例中，该速率包括但不限于10～22mL/min、约10～18mL/min、约10～15mL/min、约12～25mL/min、约15～22mL/min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。加入该盐溶液的合适速率可包括但不限于，至少约10mL/min、约12mL/min、约15mL/min、约18mL/min、约20mL/min、约22mL/min、约25mL/min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，可以盐溶液与含胶原质的溶液重量比为约1:1～2:1的比例加入该盐溶液。

在某些实施例中，该盐溶液处理后将所得溶液在30min～1周的时间内温育。在一些实施例中，温育时间是大约30min～6天、约30min～5天、约1h～4天、约2h～1天、约3h～12h，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的温育时间可包括至少30min、约45min、约1h、约2h、约6h、约12h、约1天、约3天、约4天、约5天、约1周，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在某些实施例中，温育之后将得到的胶原质沉淀混合物离心。该离心可包括以约5,000～25,000G的力离心该温育溶液。合适的离心力可包括但不限于5,000～20,000G，约5,000～15,000G，约5,000～12,000G，和约5,000～10,000G。在某些实施例中，该离心可以包括在约5～60min的时间内离心。合适的离心时间可以包括但不限于，约5～60min，约10～50min，约15～40min，约20～40min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。或者，合适的离心时间可包括但不限于约5min、约10min、约20min、约30min、约40min、约50min、约60min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该离心可包括在约10～30min的时间内离心。在一些实施例中，该离心可在该盐溶液处理后直接进行而不需要温育。

上述获得胶原质沉淀物的步骤可以适当地重复以获得该胶原质沉淀物的最大回收率。在某些实施例中，该方法可包括重复接触、盐处理、温育和分离过程中的一个或多个，直到获得至少约95％的纯胶原质沉淀物。合适的纯度包括但不限于，约95％～99.9％、约96％～99.9％、约97％～99.9％、约98％～99.9％、约99％～99.9％、约99.5％～99.9％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该胶原质材料纯度至少约50％～99.9％、约60％～99.9％、约75％～99.9％、约80％～99.9％、约90％～99.9％、约95％～99.9％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，该胶原沉淀物纯度至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、约99.9％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，重复一个或多个步骤直至获得纯度至少约95％的该胶原质沉淀物。在另一个实施例中，重复一个或多个步骤直至获得纯度至少约99.9％的该胶原质沉淀物。该胶原质沉淀物的纯度可通过标准方法测定。

任何合适的盐可用于上述方法。示例性的盐包括但不限于氯化钠、硫酸铵等或其组合。盐溶液可包含含水的盐溶液。

将该胶原质沉淀物重新悬浮在溶液中以获得再悬浮胶原质溶液。在一些实施例中，该再悬浮可包括将该胶原质沉淀物与弱酸溶液接触。合适的弱酸溶液包括但不限于将pH缓冲液保持在pH值约2.8～4之间的溶液。合适的pH值包括但不限于以上在任何实施方案中所公开。在一些实施例中，该弱酸溶液包含pKa为约3～7的溶液。该弱酸溶液的合适pKa值包括但不限于以上在任何实施方案中所公开。在一些实施例中，该弱酸的量包括但不限于约0.01％～20.0％的弱酸溶液。合适的弱酸包括以上任何实施方案中所公开。

根据所需的应用，可以对该再悬浮胶原质溶液进一步处理以提高纯度或减少有害物质。在本发明的一些实施例中，该方法包括任选地进行病毒和朊病毒的灭活步骤。该病毒和朊病毒的灭活可以使用各种方法进行，包括但不限于在碱性溶液中温育、γ辐射、UV辐射、环氧乙烷处理、CO₂处理或其组合。在一些实施例中，该病毒和朊病毒的灭活包括在碱性溶液中温育。合适的碱性溶液包括但不限于金属或铵的氢氧化物、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、硫酸盐及其组合。在一些实施例中，该金属包括但不限于碱金属和碱土金属。合适的碱金属和碱土金属的碱性溶液包括但不限于氢氧化钠、钾、钙和镁、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、硫酸盐及其组合。

在一些实施例中，该温育可包括将该再悬浮胶原质溶液在碱性溶液中温育适当的时间，包括但不限于约5min、约10min、约20min、约30min、约40min、约50min、约60min，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。或者，合适的时间包括约5min～1h、约10min～1h、约30min～1h、约45min～1h，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该氢氧化钠温育时间可包括约15～45min的暴露时间。在另一个实施例中，该时间可包括约30min～1h的暴露时间。

在一些实施例中，该温育可包括高达约4M的碱溶液。适当的浓度包括但不限于约0.01～4M、约0.1～2M、约0.25～1.5M、约0.5～1M，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该病毒和朊病毒的灭活可进一步包括用弱酸将该再悬浮胶原质溶液的pH调节到约2.8～4。在某些实施例中，将pH调整到约2.8～3、约3～4、约3.2～4、约3.5～4，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该方法可包括在温育后用约0.01％～20％的弱酸溶液将该再悬浮胶原质溶液的pH调节到约2.8～4。

由于盐溶液处理的结果，该再悬浮胶原质溶液可能含有残余盐，可使用适当的脱盐方法除去残余盐。合适的脱盐方法包括但不限于缓冲交换过滤器浓度、透析、切向流过滤、离子交换膜工艺等或其组合。在一个实施例中，该再悬浮胶原质溶液的脱盐可包括透析。所述透析可包括将该再悬浮胶原质溶液使用酸溶液透析。用于透析的适当酸可包括但不限于任何实施例中公开的弱酸。在某些实施例中，所述透析可包括将该再悬浮胶原质溶液使用约0.01％～20％的弱酸溶液透析。在某些实施例中，所述透析的时间长达约2周。透析时间可包括但不限于，约12h～2周、约18h～12天、约1天～1周，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的时间可包括但不限于约2h、约6h、约12h、约18h、约1天、约3天、约5天、约7天、约9天、约12天、约14天，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在透析期间可以使用合适的缓冲溶液以维持溶液的pH，若使用了，缓冲液可以在透析过程中与新鲜缓冲溶液交换。在一个实施例中，在大约12h～5天的时间内，使用约0.01％～20％的弱酸溶液进行透析，并且可包括在约24h之后更换透析缓冲液。

在一些实施例中，脱盐后，该再悬浮胶原质溶液可通过干燥以得到胶原质材料。合适的干燥方法可包括但不限于超临界流体干燥、喷雾干燥、循环压力干燥、惰性介质干燥、流化床干燥、冻干、脱水等，或它们的组合。

在一些实施例中，该方法还包括对胶原质材料进行灭菌。用于对胶原质材料进行灭菌的适当方法可包括但不限于γ射线辐射、与过酸的温育、超临界流体处理等或其组合。在一些实施例中，所述灭菌包括γ射线辐射。在一些实施例中，该方法可包括将该胶原质材料暴露于约0.01～5Mrad之间的γ辐射中。合适的γ辐射量包括约0.01～5Mrad、约0.1～4.5Mrad、约0.5～3.5Mrad、约1～3Mrad，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。γ辐射过程还可包括在辐射之前将附加添加剂或矿物质与该胶原质材料结合。

在一些实施例中，所述灭菌包括与过酸一起温育。在一些实施例中，通过蒸气进行过酸温育。在一些实施例中，过酸的量约0.01％～5％。合适的量包括但不限于约0.01％～5％、约0.01％～3％、约0.01％～1％、约0.05％～3％、约0.05％～1％、约0.05％～0.5％、约0.1％～1％、约0.5％～1％、约0.5％～3％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该蒸气温育以约20～120L/min的流速进行。合适的流速包括但不限于约20～100L/min，约40～90L/min，或约80～90L/min。在一些实施例中，该蒸汽温育进行约15s～1h的时间。合适的蒸气温育时间包括但不限于约30s～45min、约1～30min、约5～15min、约10～25min，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，所述灭菌包括超临界流体处理(SCF)。在一些实施例中，所述超临界流体包括但不限于超临界二氧化碳、一氧化氮、水、醇、丙酮等或其组合。在一些实施例中，所述超临界处理在约27～55℃的温度下进行。合适的温度包括约27～55℃、约30～45℃、约35～40℃，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，所述超临界流体处理在约75～525bar、约100～475bar、约250～400bar、约300～375bar的压力下进行，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。如图7所示，与未灭菌的胶原质材料相比，灭菌的胶原质材料(例如过酸灭菌)在用于生物凝胶组合物中时没有表现出功能降解。

本发明的胶原材料可包括将灭菌的胶原质材料溶解在弱酸溶液中，如本文所述。在一些实施例中，该弱酸溶液是约0.01％～3％弱酸溶液。该灭菌的胶原质材料可在任何浓度的弱酸溶液中溶解。合适的浓度包括但不限于，约5～200mg/mL、约5～60mg/mL、约20～150mg/mL、约40～100mg/mL、或约60～90mg/mL。

在本发明的一些实施例中，该方法可包括在高达约22℃的温度下进行该方法的一个或多个步骤。在一些实施例中，所述温度可包括但不限于约0～22℃、约0～20℃、约0～12℃、约0～6℃、约2～6℃，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在本发明的一些实施例中，该方法可包括按照例如美国食品和药物管理局颁布的无菌制剂或无菌加工的良好制造实践(GMP)指导方针进行该方法的一个或多个步骤。在一个实施例中，灭菌的胶原质材料符合GMP指南。在至少一个实施例中，本发明的方法是根据图1所示的步骤进行的。

在一些实施例中，本发明的方法包括处理胶原基生物材料以得到约100μM～1cm的生物材料颗粒，以及任选地将胶原质基生物材料浸泡在乙醇中并在缓冲溶液中洗涤生物材料颗粒；用约0.01％～20％的弱酸溶液接触该生物材料颗粒以得到含胶原质的溶液；分离该含胶原质的溶液以得到纯化的胶原质溶液；将该纯化的胶原质溶液与盐溶液接触直到获得纯度至少约95％的胶原质沉淀物，将该胶原质沉淀物再悬浮于约0.01％～20％的弱酸溶液中，得到再悬浮胶原质溶液；任选地，对该再悬浮胶原质溶液进行病毒和朊病毒的灭活；对该再悬浮胶原质溶液脱盐；干燥该再悬浮胶原质溶液以获得胶原质材料；用过酸蒸气温育对该胶原质材料进行灭菌，以及任选地将灭菌的胶原质材料悬浮在约0.01％～3％的弱酸溶液中。

在本发明的另一方面，提供了一种生物凝胶组合物，其中所述组合物包括使用本发明的获得胶原质的方法获得的胶原质材料。

在本发明的另一个方面，提供了一种生物凝胶组合物，其中所述组合物包括在任何实施例中如上所述的胶原材料。该生物凝胶组合物可包括在弱酸溶液中的胶原质材料。可使用适量的胶原质材料制备该生物凝胶组合物。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括大于5mg/mL的胶原质材料。生物凝胶组合物中合适的胶原质材料的量可包括但不限于约5～200mg/mL。该生物凝胶组合物可以在室温下快速凝胶化。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可在约25～37℃的温度下，在小于约10min、约8min、约5min、约3min、约2min、约1min、或约30s的时间、以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的时间范围内进行凝胶化。本发明的生物凝胶组合物也可在凝胶化前在15～100Pa的剪切应力下保持液态，并在凝胶化过程中在约30～120Pa的静水压力下保持固态。

在一些实施方案中，该生物凝胶组合物中的胶原质材料可包括来自哺乳动物的胶原质。合适的哺乳动物可包括但不限于马、犬、猪、牛、猫、山羊、绵羊、鼠或人。在某些实施例中，哺乳动物是猪、牛或它们的组合。胶原质材料中的胶原质可以是任何类型，并且可从各种来源获得，包括但不限于肌腱、皮肤、韧带、骨、牙齿、软骨、结缔组织、椎间盘、角膜等，以及它们的组合。在一些实施例中，该胶原质材料选自肌腱、皮肤、骨头或其组合。在某些实施例中，该胶原质材料可来源于哺乳动物，包括但不限于牛、猪、鼠或其组合。当来源是肌腱时，其可包括但不限于普通指伸肌腱、侧伸肌腱、深屈肌腱或其组合。在本发明的一些实施例中，胶原质材料可包括I型胶原质。在一些实施例中，该I型胶原可包括不溶性胶原质、胶原质纤维、可溶性胶原质和酸溶性胶原质。在某些实施例中，该I型胶原质是可溶性胶原质、酸溶性胶原质或其组合。在一些实施例中，该I型胶原质不包括端胶原质。

在本发明的一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括约5～200mg/mL的弱酸溶液中的胶原质材料。在某些实施例中，该生物凝胶组合物中的胶原值材料的量可包括但不限于约5～200mg/mL、约10～100mg/mL、约15～80mg/mL、约20～70mg/mL、约25～50mg/mL、约5～60mg/mL、约5～40mg/mL，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在其他实施例中，该生物凝胶组合物中的胶原质材料的量可包括约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约70mg/mL、约80mg/mL、约90mg/mL、约100mg/mL，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在本发明的一些实施例中，该胶原材料溶解在弱酸溶液中。该弱酸溶液可包括约0.01％～20.0％的弱酸。该弱酸溶液中弱酸的量可包括但不限于约0.01％～20％、约0.01％～10％、约0.01％～3％、约0.1％～3％、约0.3％～8％、约0.5％～5％、约1％～3％，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的弱酸溶液含有的弱酸约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％。、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约12.5％、约15.0％、约20％，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该弱酸溶液是约0.01％～3％的弱酸溶液。合适的弱酸可包括但不限于本文任何实施例中所述的弱酸溶液。

该生物凝胶组合物可适当地包含载体或非天然添加剂。合适的载体包括但不限于水、含水离子盐溶液(例如氢氧化钠)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、细胞培养基、胎牛血清(FBS)、Dulbecco的最小必需培养基(DMEM)、成纤维细胞生长因子(bFGF)等或其组合。合适的非天然添加剂包括但不限于交联剂。合适的交联剂包括但不限于核黄素、核糖、聚乙二醇(PEG)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐、京尼平、壳聚糖等或其组合。在一个实施例中，该生物凝胶组合物包含核糖。在另一个实施例中，该生物凝胶组合物包含核黄素。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包含约0.01％～5％(w/v)的核心蛋白聚糖。核心蛋白聚糖的合适的量包括但不限于约0.01％～3％(w/v)、约0.01％～2％(w/v)、约0.1％～5％(w/v)、约0.1％～3％(w/v)、约0.1％～2％(w/v)、约0.3％～5％(w/v)、0.3％～3％(w/v)、约0.3％～2％(w/v)，以及在任意两个数值之间的或小于这些数值中的任何一个的范围。核心蛋白聚糖是一种小细胞或细胞周期基质蛋白多糖，平均分子量约为90～140kDa。核心蛋白聚糖的糖胺聚糖链含有硫酸软骨素或硫酸皮肤素。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物还包括活细胞。在一些实施例中，该活细胞包括但不限于表皮细胞、软骨细胞和其他形成软骨的细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、真皮细胞、肌肉细胞、毛囊、成纤维细胞、器官细胞、成骨细胞、骨细胞和其他骨骼的细胞、内皮细胞、粘膜细胞、胸膜细胞、耳道细胞、鼓膜细胞、腹膜细胞、施万细胞、角膜上皮细胞、牙龈细胞、中枢神经系统神经干细胞或气管上皮细胞。在一个实施例中，该生物凝胶组合物包括软骨细胞。在一些实施例中，该生物凝胶组合物包含活细胞并维持生理pH。在一些实施例中，该生物凝胶组合物的pH约7.4。

在本发明的一些实施例中，该生物凝胶组合物可进一步包括在凝胶化前将所述组合物保持在约0～12℃的温度。该温度可包括但不限于约0～12℃、约0～10℃、约2～10℃、约2～6℃、约3～8℃、约3～6℃，以及这些数值中的任意两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，维持的温度可包括但不限于约0℃、约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃的温度，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物在剪切应力大于约15Pa时可为液体。在某些实施例中，该生物凝胶组合物在剪切应力约15～100Pa下变为液体。合适的剪切应力量包括但不限于约15～100Pa、约20～100Pa、约25～90Pa、约30～90Pa，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该生物凝胶组合物在约15Pa、约20Pa、约25Pa、约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa的剪切应力下变为液体。

本发明的所述生物凝胶组合物凝胶化过程中，在静止和没有剪切应力的情况下，以及在自身重量下保持固态。在一些实施例中，该生物凝胶组合物在约30～120Pa的流体静压下保持固态。合适的流体静压力包括但不限于约30～120Pa、约50～120Pa、约60～120Pa、约80～120Pa、约30～90Pa、约30～80Pa、约30～60Pa，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

该生物凝胶组合物可适当地成形或形成二维或三维结构。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可在凝胶化前保持三维结构的形状。在一些实施例中，可以使用模块化制造系统来成形或形成三维结构。合适的模块化制造系统可包括但不限于注塑、旋转模塑、正模具、阴模、减成制造、铣削和机加工以及3D打印设备。

在一个实施例中，该模块化制造系统是3D打印设备。合适的3D打印设备可包括但不限于能够进行非无菌或无菌三维结构制造的3D打印设备。在某些实施例中，该3D打印设备是符合GMP指南的无菌3D打印设备。在一些实施例中，3D结构可使用本文描述的3D打印系统中的生物凝胶制造，正如2017年5月25日提交的名称为“ASEPTIC PRINTERSYSTEMINCLUDING DUAL-ARM MECHANISM”的美国专利申请序列号62/511,292中所述，代理人案卷号113066-0105，其全部内容在此引入作为参考，用于所述的背景技术和方法。

在本发明的一些实施例中，该生物凝胶组合物在约25～37℃的温度下在小于约10min内经历凝胶化。在某些实施例中，该生物凝胶组合物可在小于约30s～10min、约1min～5min、约30s～3min、约30s～2min、以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围内进行凝胶化。在一个实施例中，该生物凝胶组合物可以在小于约50s、40s，或约30s的条件下进行凝胶化。在另一个实施例中，凝胶化发生在小于约30s、约60s、约70s、约80s、约90s、100s、约110s、约120s、约130s、约140s、约150s、约180s，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围内。在一个实施例中，该生物凝胶组合物在小于30s内进行凝胶化。

在本发明的一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括在约25～37℃的温度下进行凝胶化。在某些实施例中，凝胶化温度可包括但不限于约25～37℃、约27～35℃、约30～33℃，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的凝胶化温度可包括但不限于约25℃、约27℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该生物凝胶组合物在约30～37℃的温度下进行凝胶化。在一个实施例中，该生物凝胶组合物在约25～37℃的温度下在小于30s内进行凝胶化。

在本发明的一些实施例中，生物凝胶组合物也可通过暴露于引发剂而发生交联。合适的交联引发剂包括但不限于紫外(UV)辐射，γ辐射和脱水热处理(DHT)。在一些实施例中，该交联引发剂是UV辐射。在一些实施例中，引发剂在没有交联剂的情况下诱导如本文所述的生物凝胶组合物的交联。在一些实施例中，引发剂诱导生物凝胶组合物中交联剂的交联。在一些实施例中，交联剂包括但不限于如本文所述的交联剂。在一些实施例中，该交联剂是核黄素，核糖等或其组合。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物可形成三维结构，其在凝胶化后在重力下保持固态和/或保持其形状。与其他标准的生物凝胶材料相比，本发明的生物凝胶组合物形成的结构表现出降低的下垂和增加的弹性。在某些实施例中，包含生物凝胶的三维结构在重力下下垂小于其高度约1％～30％。该三维结构在重力作用下可下垂小于其高度约1％～30％、约2％～25％、约3％～20％、约4％～15％、约5％～10％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，该三维结构在重力作用下下降小于约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，三维结构中的该生物凝胶组合物在一段时间内(例如约60～120s)下垂小于其高度的约1％～30％。时间包括但不限于约5～120s、约20～100s、约30～80s、约45～60s、约60～120s，以及在任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在适当的时间段内结构的初始高度下降小于约1％～30％，该时间段可包括但不限于约5s、约10s、约20s、约30s、约40s、约50s、约60s、约120s，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，三维结构中的该生物凝胶组合物在60s的时间内在重力作用下下垂小于其高度的约30％。

本发明的生物凝胶组合物具有更好的储能模量。在本发明的一些实施例中，该生物凝胶组合物可在凝胶化后将其储能模量增加至约5000％。储能模量可增加至约10％～5000％、约50％～5000％、约100％～5000％、约500％～5000％、约1000％～5000％、约2500％～5000％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，该生物凝胶组合物可包括但不限于在凝胶化后将其储能模量提高至高达约100％、约500％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约5000％，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

本发明的生物凝胶组合物具有更高的抗压强度。在一些实施例中，该生物凝胶组合物在凝胶化后表现出大于1kPa的应力/应变比。该应力/应变比可为约1～100kPa、约1～60kPa、约5～50kPa、约5～40kPa，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，该生物凝胶组合物在凝胶化后可表现出约1kPa，约5kPa、约7kPa、约8kPa、约9kPa、约10kPa、约11kPa、约12kPa、约14kPa、约16kPa、约18kPa、约20kPa、约25kPa、约30kPa、约35kPa、约40kPa、约50kPa、约60kPa、约70kPa、约80kPa、约90kPa、约100kPa以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围的应力/应变比。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包含在任何实施例中如本文所述获得的I型胶原质材料。该I型胶原质材料可包括约5mg/mL或更高的量。该生物凝胶组合物可包括在弱酸溶液中约0.01～3％的胶原质材料。本发明的该生物凝胶组合物可在约25～37℃的温度下，在小于约30s内进行凝胶化。该生物凝胶组合物可进一步包括约0.01～5％(w/v)的核心蛋白聚糖。任选地，该生物凝胶组合物可进一步包括活细胞。该生物凝胶组合物可在约15～100Pa的剪切应力下变成液体。在一些实施例中，该生物凝胶组合物在凝胶化期间在约30～120Pa的流体静压下保持固态。该生物凝胶组合物可以用3D打印机形成为三维结构。该生物凝胶组合物可包括在该生物凝胶组合物进行凝胶化后在重力下维持固体三维结构形状。在一些实施例中，该三维结构在重力作用下在约60s的时间内下垂小于其高度约30％。该生物凝胶组合物可包括在凝胶化后将其储能模量增至约5000％。

在一个实施例中，该生物凝胶组合物包括约5～200mg/mL的胶原质材料，其使用本文所述的任何实施例中的方法获得，在约0.01～3％的弱酸溶液中；0.1～5％(w/v)核心蛋白聚糖和任选的活细胞；其中该生物凝胶可以在约25～37℃的温度下在小于约30s内进行凝胶化；其中在凝胶化前该生物凝胶组合物在约15～100Pa的剪切应力下为液体，在凝胶化期间在约30～120Pa的流体静压下保持固态；进一步地其中，在凝胶化之后该生物凝胶组合物的储能模量可具有高达约5000％的增加，并保持三维形状，其中所述的生物凝胶组合物在重力作用下的超过60s时下垂低于其高度约1～30％。

在另一个实施例中，所述生物凝胶组合物包括约5～60mg/mL的I型胶原质材料，其从如本文所述的牛、猪和/或鼠中获得，在约0.01～3％弱酸溶液中；0.1～5％(w/v)核心蛋白聚糖、载体和选自核黄素、核糖或其组合的交联剂以及任选的pH7.4的活细胞；其中该生物凝胶可在约35℃的温度下在小于30s的时间内发生凝胶化；其中在凝胶化前该生物凝胶组合物在约15～100Pa的剪切应力下为液体，在凝胶化期间在约30～120Pa的流体静压下保持固态；其中在凝胶化后该生物凝胶组合物的储能模量可具有高达约5000％的增加，并保持三维形状，其中该生物凝胶组合物在重力作用下的超过60s时下垂低于其高度约1～30％；该生物凝胶组合物在凝胶化后表现出大于1kPa的应力/应变比。

在本发明的另一个方面，提供了一种由本发明的生物凝胶组合物制备三维结构的方法，其中该方法包括将生物凝胶组合物提供给模块化制造系统，将该生物凝胶组合物维持在温度为约0～12℃，沉积该生物凝胶组合物以形成三维结构，其中该三维结构进行凝胶化；并固化该三维结构。用于制备该三维结构的方法中的该生物凝胶组合物可包括本发明的胶原质材料的量在弱酸溶液中大于5mg/mL。

在本发明的一些实施例中，该方法包括将如上文在任何实施例中所述的生物凝胶组合物提供给模块化制造系统。合适的模块化制造系统可包括但不限于本文在任何实施例中描述的系统。在一些实施例中，该模块化制造系统可包括3D打印装置。在一些实施例中，该3D打印设备可以是非无菌或无菌设备。在一个实施例中，该3D打印设备是如本申请中所描述的无菌3D打印设备。

该方法包括提供如本申请中所述的生物凝胶组合物。在本发明的一些实施例中，该方法包括提供在弱酸溶液中含有5mg/mL或更大量的胶原质材料的生物凝胶组合物。在一些实施例中，该胶原质材料可以源自哺乳动物，包括但不限于牛、猪和/或鼠源。在一些实施例中，该胶原质材料可包括I型胶原质。在本发明的一些实施例中，该胶原材料在弱酸溶液中，例如约0.01～3％的弱酸溶液。在本发明的一些实施例中，该方法包括提供可进一步包含如约0.01～5％(w/v)核心蛋白聚糖的交联剂的生物凝胶组合物，在一些实施例中，该生物凝胶组合物包括如本文任何实施例中所述的载体和非天然添加剂。在一些实施方案中，该生物凝胶组合物可以包括活细胞。在本发明的一些实施例中，该方法包括提供在约15～100Pa的剪切应力下可以是液体的生物凝胶组合物。在一些实施例中，在凝胶化过程中，该生物凝胶组合物在约30～120Pa的静水压下保持固态。

该方法包括在将该生物凝胶组合物提供给模块化制造系统后将其保持在合适的温度。在本发明的一些实施例中，该方法包括在凝胶化之前将该生物凝胶组合物保持在约0～12℃的温度。所述温度可包括但不限于约0～12℃、约0～10℃、约2～10℃、约2～6℃、约3～8℃、约3～6℃、以及在这些值中的任何两个之间或小于这些值中的任何一个的范围。在某些实施例中，维持的温度可以包括但不限于约0℃、约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃，以及任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

该生物凝胶组合物在合适的维持温度下沉积成二维或三维结构。在一些实施例中，所述沉积可包括以约30～80mm³/s的挤出速率沉积该生物凝胶组合物。合适的挤出速率包括但不限于约30～80mm³/s、约40～80mm³/s、约50～80mm³/s、约60～80mm³/s，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。

作为生物凝胶沉积步骤的一部分，三维结构也可以进行凝胶化。在一些实施例中，将该生物凝胶组合物沉积到三维结构中还包括在约25～37℃的温度下在小于约10min内进行凝胶化。在某些实施例中，三维结构可在小于约30s～10min、约1min～5min、约30s～3min、约30s～2min以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围内进行凝胶化。在一个实施例中，该生物凝胶组合物可以在小于约50s、约40s或约30s内进行凝胶化。在另一个实施例中，凝胶化发生在小于约30s、约60s、约70s、约80s、约90s、100s、约110s、约120s、约130s、约140s、约150s、约180s，以及在上述任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围内。在一个实施例中，该生物凝胶组合物在小于30s内进行凝胶化。

在本发明的一些实施例中，该三维结构可包括在约25～37℃的温度下进行凝胶化。在某些实施例中，凝胶化温度可包括但不限于约25～37℃、约27～5℃、约30～33℃，以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。合适的凝胶化温度可包括但不限于约25℃、约27℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃，并且在任何两个数值之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，三维结构可以在约30～37℃的温度下进行凝胶化。在一个实施例中，该生物凝胶组合物在约25～37℃的温度下在小于30s内进行凝胶化。

在本发明的一些实施例中，沉积可以顺序地、同时地或分别地包括三维结构的凝胶化以形成该三维结构。在某些实施例中，沉积生物凝胶组合物可包括在形成三维结构后立即对生物凝胶组合物进行连续凝胶化。在另一个实施例中，沉积可包括在形成三维结构时同时凝胶化(即同时或交叉)生物凝胶组合物。在又一个实施例中，沉积可以与沉积生物凝胶组合物分别形成凝胶化以形成三维结构，其可以包括在形成三维结构后约5min～24h的时间后凝胶化。

在一些实施例中，该生物凝胶组合物可形成三维结构，其在凝胶化后在重力下保持固态和/或保持其形状。与本领域已知的其他生物凝胶材料相比，由本发明的生物凝胶组合物形成的结构表现出降低的下垂和增加的弹性。在某些实施例中，包含生物凝胶的三维结构在重力下下垂小于其高度约1％～30％。三维结构在重力下可下垂小于其约1％～30％、约2％～25％、约3％～20％、约4％～15％、约5～10％，以及这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，三维结构在重力作用下下垂小于其高度的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，三维结构在一段时间内下垂小于其高度的约1％～30％，例如约60s～120s。该时间包括但不限于约5s～120s、约20s～100s、约30s～80s、约45s～60s、约60s～120s，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在适当的时间段内该结构的初始高度下降小于1％～30％，所述时间可包括但不限于约5s、约10s、约20s、约30s、约40s、约50s、约60s、约120s，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该三维结构在60s的时间内在重力作用下下垂小于其高度的约30％。

在本发明的一些实施例中，该三维结构的储能模量在凝胶化后可增加至高达约5000％。该储能模量可增加至约10％～5000％、约50％～5000％、约100％～5000％、约500％～5000％、约1000％～5000％、约2500％～5000％，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，该生物凝胶组合物可包括但不限于在凝胶化后将其储能模量增加至约100％、约500％、约1000％、约2000％、约3000％、约4000％、约5000％，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一个实施例中，该生物凝胶组合物可包括将其储能模量增加至5000％。在一些实施例中，该生物凝胶组合物可包括在约1～5min内增加其储能模量。合适的时间包括约1～5min、约1～3min、约1～2min，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该三维结构在凝胶化后表现出大于1kPa的应力/应变比。该应力/应变比可以为约1～100kPa、约1～60kPa、约5～50kPa、约5～40kPa，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。

由生物凝胶组合物沉积的三维结构，在凝胶化后进行固化步骤。在一些实施例中，该方法包括在约34～37℃的温度下固化该三维结构。合适的固化温度可包括但不限于约34～37℃、约35～37℃、约36～37℃，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。该三维结构也可以在固化步骤期间被放置在缓冲溶液中。在一些实施例中，合适的缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、氯化钠溶液、磷酸盐和磷酸盐缓冲溶液。在一些实施例中，该方法还包括在缓冲溶液和细胞培养基中固化三维结构。合适的细胞培养基可包括但不限于血清、无血清培养基、HEPES、DMEM、bFGF、FBS等或其组合。

在一些实施例中，本发明的方法可进一步包括通过暴露于如本文所述的交联引发剂来固化由生物凝胶组合物形成的三维结构。在一些实施例中，所述固化还包括将三维结构暴露于UV辐射。UV辐射的持续时间没有特别限制，而是根据各种因素来确定，包括但不限于三维结构的尺寸、形状、高度、厚度和UV光源的距离等。在一些实施例中，由生物凝胶形成的三维结构包括如本文任何实施例中所述的交联剂。在某些实施例中，该交联剂包括核糖、核黄素或其组合

在本发明的一些实施例中，该方法包括向3D打印装置提供生物凝胶组合物，其包括衍生自牛、猪、鼠源的I型胶原质材料。该生物凝胶组合物包括在约0.01％～3％弱酸溶液中的胶原质材料，并含有约0.01％～5％(w/v)核心蛋白聚糖。该生物凝胶组合物可进一步包括交联剂或活细胞，且其pH约7.4。该生物凝胶组合物在约15～100Pa的剪切应力下是液体，并且在凝胶化期间在约30～120Pa的流体静压下保持固态。该方法包括将该生物凝胶组合物保持在约0～12℃温度下。在将该生物凝胶组合物保持在约0～12℃的同时，该方法包括沉积该生物凝胶组合物以形成三维结构。该方法包括沉积该生物凝胶组合物以形成三维结构，同时在约25～37℃的温度下小于约30s内凝胶化。三维结构可在重力作用下保持固态，以使得三维结构在凝胶化后约60s的时间内下垂小于其高度的约1％～30％。凝胶化后的三维结构可包括高达约5000％的储能模量的增加。在一些实施例中，该三维结构在凝胶化后表现出大于1kPa的应力/应变比。该方法包括在缓冲溶液中在约34℃～37℃的温度下固化三维结构。在至少一个实施例中，本发明的方法是根据图2中所示的步骤进行的。

在本发明的一个实施例中，该方法包括向无菌3D打印机提供如本文所述的生物凝胶组合物，其包含来自牛、猪和/或鼠源的I型胶原质材料，在约0.01％～3％的弱酸溶液中，并可进一步包含0.1％至约5％(w/v)的核心蛋白聚糖，以及任选的交联剂和活细胞；将生物凝胶组合物保持在约0～12℃的温度；以约30～80mm³/s的挤出速率沉积生物凝胶组合物以形成三维结构，其中三维结构在约25～37℃下在小于约30s内进行凝胶化。在磷酸盐缓冲溶液中在约34～37℃下固化三维结构。

另一方面，一种制备用于三维结构制造的生物凝胶组合物的方法，其中该方法包括提供具有在弱酸溶液中的胶原质材料的第一容器；提供具有载体的第二容器；使第一容器的弱酸溶液中的胶原质材料与第二容器的载体接触，以得到均质性为约50％～99.9％的生物凝胶组合物。

该方法提供了具有通过本申请中描述的方法获得的胶原质材料的第一容器。在本发明的一些实施例中，该方法包括在弱酸溶液中含量为5mg/mL或更高的胶原质材料。在一个实施例中，该第一容器可包含约5～200mg/mL的胶原质材料。在一些实施例中，该胶原质材料可以源自天然来源的肌腱，包括但不限于牛或猪。在一些实施例中，该胶原质材料可包括I型胶原质。在本发明的一些实施例中，该胶原质材料可进一步包含约0.01％～5％(w/v)的核心蛋白聚糖。

在本发明的一些实施例中，该弱酸溶液中的弱酸含量约为弱酸溶液的约0.01％～20.0％。弱酸溶液中的弱酸量可包括但不限于约0.01％～20％、约0.01％～10％、约0.01％～3％、约0.1％～3％、约0.3％～8％、约0.5％～5％、约1％～3％、以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。合适的弱酸溶液包含一定量的弱酸，其量为约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约12.5％、约15.0％、约20％、以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施例中，该弱酸溶液是约0.01％～3％的弱酸溶液。在一些实施例中，该弱酸溶液可包括但不限于pH为约2.8～4的弱酸溶液。合适的弱酸可包括但不限于本文任何实施例中所述的弱酸溶液。

该方法还提供了具有如在任何本文实施例中描述的载体以及任选的交联剂的第二容器。合适的载体包括但不限于水、氢氧化钠水溶液、PBS、DMEM等或其组合。合适的交联剂包括但不限于核黄素、核糖等或其组合。

该方法可任选地包括提供活细胞的第三容器。合适的活细胞可包括但不限于表皮细胞、软骨细胞和形成软骨、巨噬细胞、脂肪细胞、真皮细胞、肌细胞、毛囊、成纤维细胞、器官细胞、成骨细胞、骨细胞和其他形成骨的细胞、内皮细胞、粘膜细胞、胸膜细胞、耳道细胞、鼓膜细胞、腹膜细胞、施万细胞、角膜上皮细胞，牙龈细胞、中枢神经系统神经干细胞或气管上皮细胞。在一个实施例中，该第三容器包括软骨细胞。在一些实施例中，该活细胞在细胞培养基中维持在生理pH。在一些实施例中，该第三容器中的活细胞维持在约7.4的pH。合适的细胞培养基可包括本文所述的那些。

使第一容器中的胶原质材料和第二容器中的弱酸溶液接触，以获得具有足够均匀性的生物凝胶组合物。在本发明的一些实施例中，所述接触可包括但不限于混合、搅拌、振荡等或其组合。在某些实施例中，所述接触包括振荡，例如手动或自动振荡。在一个实施例中，所述接触包括手动振荡。在另一个实施例中，所述接触包括混合，例如手动或第一，第二和任选的第三容器中的材料可以以合适的顺序依次或同时释放。在一些实施例中，接触产生具有约50％～99.9％同质性的生物凝胶组合物。合适的同质性包括但不限于约50％～99.9％、约60％～99.9％、约70％～99.9％、约80％～99.9％、约90％～99.9％、95％～99.9％、以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，同质性为约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99.9％，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在本发明的一些实施例中，该方法还任选地包括使活细胞的第三容器与胶原质材料和弱酸溶液接触，以获得具有约50％～99.9％同质性的生物凝胶组合物。同质性的评估使用标准的方法进行评估。

使胶原质材料与弱酸溶液接触后获得的生物凝胶组合物可任选地维持在合适的温度。在一些实施例中，在凝胶化之前可以保持生物凝胶组合物在约0～12℃的温度下。该温度可包括但不限于约0～12℃、约0～10℃、约2～10℃、约2～6℃、约3～8℃、约3～6℃、以及在这些数值中的任何两个之间或小于这些数值中的任何一个的范围。在某些实施例中，维持的温度可包括但不限于约0℃、约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃，以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。

可以由生物凝胶组合物制造三维结构。在一些实施例中，该方法还包括使用生物凝胶组合物制造三维结构。在一些实施例中，该制造可以顺序地、同时或分别地将胶原质材料与弱酸溶液接触以形成生物凝胶组合物。在一个实施例中，该方法可包括在接触步骤后顺序地制造三维结构，即紧接着接触步骤。在另一个实施例中，该方法可包括与接触步骤同时或交叉地制造三维结构。在又一个实施例中，该方法可包括与接触步骤分别制造三维结构，例如将所得生物凝胶组合物在约0～12℃的温度下储存约6h～2周的时间。在某些实施例中，该生物凝胶组合物可包括在约2～6℃下储存约6h～2周、约12h～1周、约24h～6天、约48h～5天、以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。

在一些实施例中，该方法包括通过将该生物凝胶组合物提供给如本文所述的模块化制造系统来制造三维结构。在一些实施例中，该模块化制造系统可包括3D打印设备。在一个实施例中，3D打印设备是无菌的并且符合GMP指南。

在一些实施例中，该方法可包括通过以30～80mm³/s沉积生物凝胶组合物来制造三维结构。合适的挤出速率包括但不限于约30～80mm³/s、约40～80mm³/s、约50～80mm³/s、约60～80mm³/s、以及在这些数值中的任何两个之间或者小于这些数值中的任何一个的范围。在一些实施方案中，如本文所述，沉积可以在约25℃～37℃的温度下在少于约3分钟内进一步包括三维结构的凝胶化。在本发明的一些实施例中，所述制造可包括沉积生物凝胶组合物，其中凝胶化顺序地、同时地或分别地发生以形成三维结构。

在本发明的一些实施例中，该方法包括制造三维结构，该三维结构在如本文所述的凝胶化之后在重力下保持固态或保持其形状。在某些实施例中，该三维结构在重力作用下在高达约60～120s的时间内下垂小于其高度的约1％～30％。在一个实施例中，该三维结构在重力作用下在约60s的时间内下垂小于其高度的约30％。如本文所述，该三维结构可以非常坚固并改善储能模量。在某些实施例中，该三维结构可在凝胶化后将其储能模量增加至约5000％。在一些实施例中，该三维结构在凝胶化后表现出大于1kPa的应力/应变比。在某些实施例中，该应力/应变比为约1～60kPa。此外，如本文所述，该方法可进一步包括固化三维结构。在某些实施例中，所述固化可以在磷酸盐缓冲溶液中在约34～37℃的温度下进行。在一些实施例中，所述固化三维结构可以在如本文所述的缓冲溶液和细胞培养基中形成。

在一些实施例中，本文在任何实施例中公开的方法和组合物符合GMP指南。在至少一个实施例中，本发明的方法是依据图3中所示的方法。

在本发明的一个实施例中，该方法包括提供在第一个容器中的在约0.01％～3％的弱酸溶液中的I型胶原质材料，其来自牛、猪和/或鼠源且其含量大于约5mg/mL；以及提供在第二容器中的载体溶液和任选的交联剂，其中该载体包括PBS、水和氢氧化钠水溶液，该交联剂包括核黄素、核糖或其组合；任选地，还提供在第三容器中具有活细胞的细胞培养基，其中该细胞培养基是DMEM；使第一容器的约0.01％～3％的弱酸中的I型胶原质材料与第二容器中的载体接触，并且任选地与第三容器的细胞培养基中的活细胞接触，以获得具有同质性大于约99％的生物凝胶组合物；任选地，使用无菌3D打印装置将该生物凝胶组合物制成三维结构。

通过参考以下实施例将更容易理解如此一般性描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不试图限制本发明。

实施例

实施例1：胶原质制备工艺

该实施例提供了来自哺乳动物(例如，来自猪、牛或鼠衍生的胶原质来源的皮肤，肌腱或骨)收获胶原质的方法，如图1所示。从胶原质基生物材料中除去细胞外基质和渗透物。将得到的胶原质基生物材料浸泡在酒精中。然后机械加工该胶原质基生物材料，直到大于95％的材料被减少到小于1mm的生物材料颗粒。

加入缓冲溶液并搅拌洗涤生物材料颗粒，然后使生物材料颗粒沉降并倒出缓冲溶液。然后将生物材料颗粒加入蒸馏水(diH₂O)中并搅拌。然后使生物材料颗粒沉降，倒出diH₂O。将生物材料颗粒加入0.01％～20％的弱酸溶液中并搅拌。离心混合物，收集上清液，同时弃去沉淀。

将上清液与0.55～5M盐溶液合并，并搅拌。将上清液/盐溶液离心，收集所得颗粒，同时弃去上清液。将沉淀的材料重新悬浮在0.1％～20％的弱酸溶液中。

将再悬浮的材料与金属氢氧化物溶液合并，并搅拌。紧接着，将混合物重新调节至酸性条件(pH为3-4)。然后将混合物用0.01％～20％的弱酸溶液透析，然后将其从透析袋中取出并干燥。通过与过酸、γ辐射、环氧乙烷或临介CO₂处理的蒸汽温育对所得胶原质材料进行消毒。将消毒的胶原质材料悬浮在0.01％～3％的弱酸溶液中至适当的浓度，储存最多3至7天。弱酸，缓冲溶液和盐溶液包括本文所述的那些。

实施例2：生物凝胶组合物的制备

如图3所示，根据实施例1使用收获的灭菌胶原质制备适合用作如本文所述的模具和3D打印装置的可印刷油墨的生物凝胶组合物。无细胞生物凝胶组合物A-J如下制备：将收获的灭菌胶原质(实施例1)在0.01-3％弱酸中的储备溶液与载体溶液混合。将混合物调节至生理pH。所得混合物产生含有5～60mg/mL来自实施例1的消毒的胶原质的生物凝胶组合物。生物凝胶组合物H，I和J说明可固化的生物凝胶组合物，其包括交联剂。

根据组合物A-J所述的方法制备对比生物凝胶组合物。市售的纯化药用级胶原质X(牛真皮衍生胶原质I型)，Y(猪组织衍生胶原质I型)和Z(牛真皮衍生胶原质I型)不是通过本文所述方法获得的，并且没有本文描述的用于本发明的特性。

细胞生物凝胶组合物K-R制备如下：通过旋塞装置将收获的无菌胶原质(实施例1)在0.01-3％弱酸溶液中的储备溶液加入到载体溶液中。将细胞培养基中的活细胞加入混合物中并调节至中性pH。所得混合物产生含有5-60mg/mL实施例1的收获的灭菌胶原质的细胞生物凝胶组合物。生物凝胶组合物Q和R说明可固化的生物凝胶组合物，其包含合适的交联剂。

实施例3：生物凝胶组合物流变性的测定

该实施例说明了如示例2中所描述的样品脱细胞生物凝胶组合物的非牛顿流体行为。使用TA仪器Discovery混合流变仪(DHR-3)，(40mm平行板，珀尔帖钢板；1mm间隙)进行流变测量。样品板保持在2-6℃之间。将生物凝胶组合物沉积并旋涂到底部样品板上，用顶部样品板覆盖样品生物凝胶。根据以下参数对沉积的样品进行屈服应力测量：

测试方法：

扫频1-振荡幅度上升

温度：0～12℃

浸泡时间：60秒

频率：1.0Hz

线性扫描：1.0～200Pa；

扫频2-振荡幅度上升

温度：0～12℃

浸泡时间：0秒

频率：1.0Hz

线性扫描：200～1.0Pa

根据模量绘制了振荡应变图。图4示出了样品生物凝胶的储能和损耗模量的交集，其中生物凝胶表现为液体。对于振荡扫描1和2，样品生物凝胶在55Pa和47Pa的剪切应力下分别表现为液体。

实施例4：生物凝胶组合物的固化性能分析

该实施例说明了凝胶化前生物凝胶组合物(组合物A-J)的热固化性能的测量。使用TA仪器DHR-3流变仪(40mm平行板，Peltier钢板；1mm间隙高度)进行热固化测量。如实施例2所述制备样品生物凝胶组合物。将样品生物凝胶均匀涂覆到底部样品板上，并用顶部样品板覆盖涂覆的生物凝胶。

方法：

运行1振荡时间

温度：4℃

浸泡时间：0s

频率：l.0Hz

压力：150Pa

持续时间：120s

运行2振荡时间

温度：37℃

浸泡时间：0s

频率：l.0Hz

压力：10Pa

持续时间：300s

图5说明了本发明的生物凝胶组合物的快速凝胶化和固化，其中样品生物凝胶在不到3min内表现出其储能模量的16倍变化。还根据实施例2中描述的程序对使用商业胶原质制备的生物凝胶进行固化测量(图6A)。样品生物凝胶的储能模量增加超过6.5倍，而商业胶原质X和Y的生物凝胶未显示出可测量的增加，并且胶原Z显示出1倍的增加。

按照实施例2中的步骤制备包含胶原质材料(实施例1)和商业胶原质X和Y的固化和未固化的生物凝胶组合物。通过注入锥形模具将每个样品成形为3D构建体。未固化的样品生物凝胶在高达87Pa的压力下保持固态，而含有商业胶原质的未固化的3D构建体分别在高于7Pa(商业胶原质X)和41Pa(商业胶原质Y)的压力下不能保持固态。将固化的生物凝胶组合物在缓冲液中彻底固化。如图6B所示，本发明的样品生物凝胶的固化三维结构保持其形状，而使用商业胶原质X和Y的生物凝胶组合物得到的结构不能保持固体结构。

实施例5：三维结构的结构稳定性测量

该实施例说明了由实施例2中描述的生物凝胶组合物和含有商业胶原质的生物凝胶形成的固化三维结构的结构稳定性测量。使用TA Instruments DMA Q800MechanicalThermal进行所有样品的动态力学分析(DMA)。将每个样品注入圆盘模具中，其高度约为5mm，直径为10-14mm。将固化的生物凝胶样品置于DMA Q800的样品板上，并进行初始高度测量。将样品保持在33～37℃之间并使其浸泡3min。在1N/min的斜坡力下直至3N获得应力/应变图。在图8和9中提供了每种测试的示例性组合物的应力/应变图。图10提供了使用商业胶原质源(X)的样品生物凝胶组合物和生物凝胶组合物的结构稳定性测量值的比较。

通过暴露于UV光源(Henry Schein-Maxima RU1200)对组合物H，I和J进行额外的固化。暴露持续时间取决于UV光源的尺寸、构造和距离。

将组合物A-J的测量值绘制为应力(kPa)对应变的函数(图7和8，以提供表1中的应力/应变比)。在组合物A-J的热固化之后进行每次测量。观察到随着生物凝胶组合物中收获的无菌胶原质的量增加，应力/应变比也增加。图8表明，增加生物凝胶组合物中胶原质的量可改善固化的生物凝胶组合物的抗压强度。将包含核糖和核黄素(组合物H和1)的生物凝胶组合物进行UV辐射以引发交联。图9证明生物凝胶组合物H和1表现出比不含交联剂的生物凝胶组合物更高的应力/应变比(组合物E)。

组合物A表现出13.8kPa的应力/应变比，而商业胶原质(X)的生物凝胶组合物表现出约0.1kPa的应力/应变比。结果总结在下表1中：

表1：

*如上面所述，对组合物进行额外固化。

从绘制曲线的0-10％应变计算边坡。

实施例6：利用3D打印装置制备生物凝胶三维结构

该实施例说明了使用如本文所述的生物凝胶组合物利用3D打印设备来制备三维结构的方法。根据实施例2制备样品生物凝胶组合物并装入注射器，注射器外壳保持在0～12℃。注射器连接到打印装置，并且生物凝胶组合物被装载到打印装置中，其温度控制在0～12℃。将生物凝胶组合物以58m³/s的速率从印刷装置挤出，并沉积到温度保持在25～37℃之间的温度控制板上。得到三维结构。三维结构在PBS中过夜从34℃固化到37℃。

上述结果说明本技术的生物凝胶组合物允许高保真的3D结构，其在形成、处理和植入时保持其形状。此外，还说明3D结构还具有良好的压缩强度和弹性，以及期望的纹理和美学性质。

虽然已经说明和描述了某些实施例，但是在阅读前述说明书之后，本领域普通技术人员可以实现如本文所述的本发明的改进，等同替换和其他类型的改变。

本发明也不限于本文描述的特定方面，其旨在作为本发明的各个方面的单个说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和改进，除了本文列举的那些之外，根据前面的描述，本领域技术人员将清楚这些修改和改进。这些修改和改进旨在落入所附权利要求的范围内。应理解，本发明不限于特定的方法，试剂，化合物，组合物，标记的化合物或生物系统，它们当然可以改变。

应当理解，虽然已经结合上述实施例描述了本发明，但是前面的描述和示例旨在说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员来说，在本发明范围内的其他方面，改进和优化是显而易见的。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种生物凝胶组合物，其包括

含量大于5mg/mL的胶原材料；

一弱酸溶液；和

任选的活细胞；

其中所述的生物凝胶组合物，

在约25～37℃的温度下凝胶化的时间不到3min；

在15～100Pa的剪切应力下是液态的；且

在30～120Pa的静水压力下，凝胶化的过程中始终保持固体状态。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述的胶原质材料包含I型胶原质，其中所述I型胶原质是从选自牛、猪、鼠和类似动物或其组合的哺乳动物中获得。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述的胶原质材料的含量为约5mg/mL至约200mg/mL。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述的弱酸溶液中弱酸的含量约0.01％至约0.03％。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述的弱酸溶液选自甲酸、乙酸、柠檬酸、丁酸、水杨酸、葡萄糖酸、庚糖酸、碳酸、氢氟酸、亚硝酸、次氯酸、盐酸或其组合中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物进一步还包括选自表皮细胞、软骨细胞及其他软骨形成的细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、真皮细胞、肌细胞、头发毛囊、成纤维细胞、器官细胞、成骨细胞、骨细胞和其他成骨形成细胞、内皮细胞、粘膜细胞、胸膜细胞、耳上皮细胞、鼓膜细胞、腹膜细胞、施万细胞、角膜上皮细胞、牙龈细胞、中枢神经系统神经干细胞、或气管上皮细胞和类似物或其组合中的一种或多种的活细胞。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物进一步还包括选自核糖、核黄素和其类似物或其组合中的一种或多种的交联剂。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在进行凝胶化之前在约30Pa至约90Pa剪切应力下为液体。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在温度约25℃至约37℃的温度下发生凝胶化。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物进行凝胶化的时间小于约30s至约2min。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在约30Pa至约90Pa的静水压力下在凝胶化过程中保持固态。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在凝胶化后约60s至约120s内，在其重力作用下下垂至其高度的约1％至约30％。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在凝胶化后的储能模量增加到约5000％。

14.一种获得用于生物凝胶组合物的胶原质的方法，所述的方法包括，

(a)加工胶原质基生物材料以制备生物材料颗粒；

(b)将该生物材料颗粒与弱酸溶液接触，以得到含有胶原质的溶液；

(c)分离该含胶原质的溶液以得到纯化的胶原质溶液；

(d)将纯化的胶原质溶液与盐溶液接触以得到胶原质沉淀物；

(e)将该胶原质沉淀物重新悬浮于弱酸溶液中，以得到再悬浮胶原质溶液；任选地对该再悬浮胶原质溶液进行病毒和朊病毒的灭活；

(f)将该再悬浮胶原质溶液进行脱盐；

(g)干燥该再悬浮胶原质溶液以得到胶原质材料；以及

(h)对该胶原质材料进行灭菌。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述的胶原质基生物材料来源于哺乳动物，其中所述的哺乳动物选自猪、牛、鼠或其组合中的一种或多种。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述的胶原质基生物材料包含I型胶原质。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述的生物材料颗粒为约100μm至约1cm。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述的弱酸溶液含有约0.01％至约20％的弱酸。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述的方法包括将所述的生物材料颗粒与所述的弱酸溶液接触约24h至约2周的时间。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述的分离包括在约60至约120min的时间内，在约5,000G至约10,000G的力的作用下将所述含胶原质的溶液进行离心。

21.如权利要求14所述的方法，其中重复使所述的纯化的胶原质溶液与盐溶液接触，直至获得纯度至少约95％的胶原质沉淀物。

22.权利要求14所述的方法，其中所述的盐溶液的浓度小于约1.5M。

23.如权利要求14所述的方法，其中所述的盐溶液选自硫酸铵和氯化钠中的一种或两种。

24.如权利要求14所述的方法，其进一步包括对该再悬浮胶原质溶液中的病毒和朊病毒进行灭活，其中所述的病毒和朊病毒的灭活是在碱性溶液中，在γ辐射、紫外线辐射、环氧乙烷处理、CO₂处理或其组合的条件中温育。

25.如权利要求24所述的制备方法，进一步包括将所述的再悬浮胶原质溶液的pH调节到约2.8至约4.5。

26.如权利要求14所述的方法，其中所述的脱盐包括使用约0.01％至约20％的弱酸溶液进行透析。

27.如权利要求14所述的方法，其中所述的干燥该再悬浮胶原质以获得胶原质材料是通过超临界流体干燥、循环压力干燥、惰性介质干燥、喷雾干燥、流化床干燥、冻干或脱水来进行的。

28.如权利要求14所述的方法，其中对该胶原质材料进行灭菌包括γ辐射、用过酸温育或超临界流体处理。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述的方法进一步还包括将所述的胶原质材料溶解在弱酸溶液中，其中所述的胶原质材料的含量为约5mg/mL至约200mg/mL。

30.如权利要求14所述的方法，其中所述的胶原质材料用于制备入如权利要求1所述的生物凝胶组合物。

31.一种制造三维结构的方法，其包括

向模块化制造系统中提供在约0℃至约12℃的温度下的生物凝胶组合物，

其中，

所述的生物凝胶组合物包含大于5mg/mL的胶原质材料和弱酸溶液；

将所述的生物凝胶组合物保持在约0℃至约12℃的温度范围内；

沉积所述的生物凝胶组合物以形成三维结构，其中所述的三维结构进行凝胶化；以及

固化所述的三维结构。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述的模块化制造系统是无菌3D打印设备。

33.如权利要求31所述的方法，其中提供如权利要求1所述的生物凝胶组合物。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述的生物凝胶组合物含有约5mg/mL至约200mg/mL的胶原质材料。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述的生物凝胶组合物进一步还包括活细胞。

36.如权利要求31所述的方法，其中所述的沉积的挤压速率为约30mm³/s至约80mm³/s。

37.如权利要求31所述的方法，其中所述的沉积顺序地、同时地或与三维结构的凝胶化分别进行。

38.如权利要求31所述的方法，其中所述的三维结构在约25mm³/s至约37℃的温度下在小于约3min的时间内进行凝胶化。

39.如权利要求31所述的方法，其中所述的三维结构在约30Pa至约120Pa的静水压力下在凝胶化过程中保持固态。

40.如权利要求31所述的方法，其中所述的三维结构将其储能模量增加到约5000％。

41.如权利要求31所述的方法，其中所述的三维结构在约60s至约120s的时间内下垂小于其高度的约1％至约30％。

42.如权利要求34所述的方法，其中所述的固化在缓冲溶液中在约34℃至约37℃的温度下进行。

43.一种制备生物凝胶组合物的方法，其包括

提供具有在弱酸溶液中的胶原质材料的第一容器；

提供具有载体的第二容器；以及

将该第一容器的弱酸溶液中的胶原质材料与第二容器的载体接触以获得生物凝胶组合物，其中该生物凝胶组合物的同质性为约50％质至约99.9％。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述的胶原质材料包含如权利要求15所述的胶原质材料。

45.如权利要求43所述的方法，其中所述的弱酸溶液为约0.01％至约20％的弱酸溶液。

46.如权利要求43所述的方法，其中所述的载体选自水、氢氧化钠水溶液、DMEM、PBS等或其组合。

47.如权利要求43所述的方法，其中所述接触包括搅拌在弱酸溶液中的胶原质材料和载体以形成生物凝胶组合物，直到该生物凝胶组合物的同质性为约99.9％。

48.如权利要求43所述的方法，其中所述接触进一步还包括搅拌第一容器中的胶原质材料、第二容器中的弱酸和第三容器中的细胞培养基中的活细胞以获得生物凝胶组合物，直到该生物凝胶组合物的同质性为约99.9％。

49.如权利要求43所述的方法，其中该方法进一步还包括将所述生物凝胶组合物的温度保持在约0℃至约12℃。

Claims (49)

1.一种生物凝胶组合物，其包括

含量大于5mg/mL的胶原材料；

一弱酸溶液；和

任选的活细胞；

其中所述的生物凝胶组合物，

在约25～37℃的温度下凝胶化的时间不到3min；

在15～100Pa的剪切应力下是液态的；且

在30～120Pa的静水压力下，凝胶化的过程中始终保持固体状态。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述的胶原质材料包含I型胶原质，其中所述I型胶原质是从选自牛、猪、鼠和类似动物或其组合的哺乳动物中获得。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述的胶原质材料的含量为约5mg/mL至约200mg/mL。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述的弱酸溶液中弱酸的含量约0.01％至约0.03％。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述的弱酸溶液选自甲酸、乙酸、柠檬酸、丁酸、水杨酸、葡萄糖酸、庚糖酸、碳酸、氢氟酸、亚硝酸、次氯酸、盐酸或其组合中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物进一步还包括选自表皮细胞、软骨细胞及其他软骨形成的细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、真皮细胞、肌细胞、头发毛囊、成纤维细胞、器官细胞、成骨细胞、骨细胞和其他成骨形成细胞、内皮细胞、粘膜细胞、胸膜细胞、耳上皮细胞、鼓膜细胞、腹膜细胞、施万细胞、角膜上皮细胞、牙龈细胞、中枢神经系统神经干细胞、或气管上皮细胞和类似物或其组合中的一种或多种的活细胞。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物进一步还包括选自核糖、核黄素和其类似物或其组合中的一种或多种的交联剂。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在进行凝胶化之前在约30Pa至约90Pa剪切应力下为液体。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在温度约25℃至约37℃的温度下发生凝胶化。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物进行凝胶化的时间小于约30s至约2min。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在约30Pa至约90Pa的静水压力下在凝胶化过程中保持固态。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在凝胶化后约60s至约120s内，在其重力作用下下垂至其高度的约1％至约30％。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述的生物凝胶组合物在凝胶化后的储能模量增加到约5000％。

14.一种获得用于生物凝胶组合物的胶原质的方法，所述的方法包括，

(a)加工胶原质基生物材料以制备生物材料颗粒；

(b)将该生物材料颗粒与弱酸溶液接触，以得到含有胶原质的溶液；

(c)分离该含胶原质的溶液以得到纯化的胶原质溶液；

(d)将纯化的胶原质溶液与盐溶液接触以得到胶原质沉淀物；

(e)将该胶原质沉淀物重新悬浮于弱酸溶液中，以得到再悬浮胶原质溶液；任选地对该再悬浮胶原质溶液进行病毒和朊病毒的灭活；

(f)将该再悬浮胶原质溶液进行脱盐；

(g)干燥该再悬浮胶原质溶液以得到胶原质材料；以及

(h)对该胶原质材料进行灭菌。

15.如权利要求15所述的方法，其中所述的胶原质基生物材料来源于哺乳动物，其中所述的哺乳动物选自猪、牛、鼠或其组合中的一种或多种。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述的胶原质基生物材料包含I型胶原质。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述的生物材料颗粒为约100μm至约1cm。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述的弱酸溶液含有约0.01％至约20％的弱酸。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述的方法包括将所述的生物材料颗粒与所述的弱酸溶液接触约24h至约2周的时间。

20.如权利要求15所述的方法，其中所述的分离包括在约60至约120min的时间内，在约5,000G至约10,000G的力的作用下将所述含胶原质的溶液进行离心。

21.如权利要求15所述的方法，其中重复使所述的纯化的胶原质溶液与盐溶液接触，直至获得纯度至少约95％的胶原质沉淀物。

22.权利要求15所述的方法，其中所述的盐溶液的浓度小于约1.5M。

23.如权利要求15所述的方法，其中所述的盐溶液选自硫酸铵和氯化钠中的一种或两种。

24.如权利要求15所述的方法，其进一步包括对该再悬浮胶原质溶液中的病毒和朊病毒进行灭活，其中所述的病毒和朊病毒的灭活是在碱性溶液中，在γ辐射、紫外线辐射、环氧乙烷处理、CO₂处理或其组合的条件中温育。

25.如权利要求25所述的制备方法，进一步包括将所述的再悬浮胶原质溶液的pH调节到约2.8至约4.5。

26.如权利要求15所述的方法，其中所述的脱盐包括使用约0.01％至约20％的弱酸溶液进行透析。

27.如权利要求15所述的方法，其中所述的干燥该再悬浮胶原质以获得胶原质材料是通过超临界流体干燥、循环压力干燥、惰性介质干燥、喷雾干燥、流化床干燥、冻干或脱水来进行的。

28.如权利要求15所述的方法，其中对该胶原质材料进行灭菌包括γ辐射、用过酸温育或超临界流体处理。

29.如权利要求29所述的方法，其中所述的方法进一步还包括将所述的胶原质材料溶解在弱酸溶液中，其中所述的胶原质材料的含量为约5mg/mL至约200mg/mL。

30.如权利要求15所述的方法，其中所述的胶原质材料用于制备如权利要求1所述的生物凝胶组合物。

31.一种制造三维结构的方法，其包括

向模块化制造系统中提供在约0℃至约12℃的温度下的生物凝胶组合物，

其中，

所述的生物凝胶组合物包含大于5mg/mL的胶原质材料和弱酸溶液；

将所述的生物凝胶组合物保持在约0℃至约12℃的温度范围内；

沉积所述的生物凝胶组合物以形成三维结构，其中所述的三维结构进行凝胶化；以及固化所述的三维结构。

32.如权利要求32所述的方法，其中所述的模块化制造系统是无菌3D打印设备。

33.如权利要求32所述的方法，其中提供如权利要求1所述的生物凝胶组合物。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述的生物凝胶组合物含有约5mg/mL至约200mg/mL的胶原质材料。

35.如权利要求35所述的方法，其中所述的生物凝胶组合物进一步还包括活细胞。

36.如权利要求32所述的方法，其中所述的沉积的挤压速率为约30mm³/s至约80mm³/s。

37.如权利要求32所述的方法，其中所述的沉积顺序地、同时地或与三维结构的凝胶化分别进行。

38.如权利要求32所述的方法，其中所述的三维结构在约25mm³/s至约37℃的温度下在小于约3min的时间内进行凝胶化。

39.如权利要求32所述的方法，其中所述的三维结构在约30Pa至约120Pa的静水压力下在凝胶化过程中保持固态。

40.如权利要求32所述的方法，其中所述的三维结构将其储能模量增加到约5000％。

41.如权利要求32所述的方法，其中所述的三维结构在约60s至约120s的时间内下垂小于其高度的约1％至约30％。

42.如权利要求35所述的方法，其中所述的固化在缓冲溶液中在约34℃至约37℃的温度下进行。

43.一种制备生物凝胶组合物的方法，其包括

提供具有在弱酸溶液中的胶原质材料的第一容器；

提供具有载体的第二容器；以及

将该第一容器的弱酸溶液中的胶原质材料与第二容器的载体接触以获得生物凝胶组合物，其中该生物凝胶组合物的同质性为约50％至约99.9％。

44.如权利要求44所述的方法，其中所述的胶原质材料包含如权利要求15所述的胶原质材料。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述的弱酸溶液为约0.01％至约20％的弱酸溶液。

46.如权利要求44所述的方法，其中所述的载体选自水、氢氧化钠水溶液、DMEM、PBS等或其组合。

47.如权利要求44所述的方法，其中所述接触包括搅拌在弱酸溶液中的胶原质材料和载体以形成生物凝胶组合物，直到该生物凝胶组合物的同质性为约99.9％。

48.如权利要求44所述的方法，其中所述接触进一步还包括搅拌第一容器中的胶原质材料、第二容器中的弱酸和第三容器中的细胞培养基中的活细胞以获得生物凝胶组合物，直到该生物凝胶组合物的同质性为约99.9％。

49.如权利要求44所述的方法，其中该方法进一步还包括将所述生物凝胶组合物的温度保持在约0℃至约12℃。