CN108486054A - 一种体外扩增i型天然细胞毒性淋巴细胞icl1/nk的方法 - Google Patents

一种体外扩增i型天然细胞毒性淋巴细胞icl1/nk的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ICL1/NK的方法。本发明提供了一种体外扩增ICL1/NK细胞的方法，为用破骨细胞作为滋养层，联合使用抗CD16抗体和白介素‑2扩增ICL1/NK细胞。本发明的实验证明，本发明的方法活化扩增的ICL1/NK细胞同时具有很强的分泌干扰素γ和裂解杀伤肿瘤干细胞的功能，其裂解杀伤肿瘤干细胞例如MiaPaCa‑2的能力比不使用滋养层法、使用辐射的外周血单核细胞(PBMC)方法扩增获得的ICL1/NK细胞、以及癌细胞系NK92细胞(ATCC，CRL‑2407)等的能力平均高18倍左右。

Description

一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ICL1/NK的方法
技术领域
本发明属于免疫生物技术领域，具体是指使用非瘤细胞即破骨细胞和白介素-2在体外扩增活化I型天然细胞毒性淋巴细胞(ICL1/NK)的方法，称为Pingan APD法；具体涉及一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ICL1/NK的方法。
背景技术
CD3-CD56+I型天然毒性淋巴细胞(ICL1/NK，Nicholson等Molecular Immunology(2017),https://doi.org/10.1016/j.molimm.2017.12.002)是循环血中的一种淋巴细胞，不需要病原激活直接识别变异细胞/肿瘤细胞和病原感染的细胞进行裂解杀伤，也具有连续杀伤的能力，因此又称为天然免疫连环杀手。在体内执行巡逻的ICL1/NK细胞不断地与其他细胞接触，是否杀伤被接触到细胞则取决于ICL1/NK自身表面的活化型抗体和抑制型抗体的动态平衡。活化型抗体识别表达在肿瘤细胞和被病原感染细胞表面的分子从而被激活；抑制型抗体则是监控ICL1/NK细胞杀伤行为的。大多数健康的细胞表面表达MHC I抗原标记“自体”。抑制型抗体识别表示“自体”的标示MHCI来抑制ICL1/NK对“自体”实施杀伤。病原感染的细胞和肿瘤细胞通常缺少“自体”标示的MHC I，被ICL1/NK识别后释放包含穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒导致靶细胞被裂解杀死。因此，ICL1/NK细胞是对抗病原感染和消除肿瘤细胞的重要免疫细胞。肿瘤细胞的表面的MHC 1表达降低甚至消失，ICL1/NK细胞与其接触就会被活化；或者肿瘤细胞表面的抗原与ICL1/NK细胞的活化型受体结合，活化ICL1/NK的信号超过了抑制信号从而激活ICL1/NK细胞。另外，ICL1/NK细胞表面的FcyRIII又称CD16可与肿瘤抗原特异性抗体Fc片段结合，介导其ILCs-1细胞识别并杀伤表达这种Fc的肿瘤细胞，这种杀伤作用又被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。同时，ICL1/NK细胞还可以产生大量的细胞因子，来调节活化其他免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞来增强免疫应答。总之，ICL1/NK细胞的裂解杀伤作用主要包括：(1)释放穿孔素和颗粒酶并激活caspase通路诱导靶细胞凋亡；(2)通过Fas/CD95的配体和肿瘤坏死因子相关性配体TRAIL通路的级联反应诱导靶细胞凋亡；(3)细胞因子如活化ICL1/NK细胞分泌大量的干扰素、肿瘤坏死因子、白介素15、白介素8等介导的细胞毒杀伤；(4)ADCC杀伤作用。
活化的ICL1/NK细胞的肿瘤靶细胞是未分化的肿瘤细胞，又称肿瘤干细胞。化疗药物和靶向药物等手段对分化的肿瘤细胞敏感，对肿瘤干细胞耐受。虽然靶向药物在确认突变靶点匹配时在初期对肿瘤的抑制非常有效，由于肿瘤细胞突变的几率很高，靶向药物会很快对肿瘤耐受而失效。手术治疗固然可以将癌灶切除，但是，残留的肿瘤干细胞在一定时期内会引起大多数的癌症患者复发肿瘤。
目前，癌症治疗领域仍在寻找有效的治疗癌症、消除癌症转移、复发的方案。众所周知，肿瘤干细胞的存在以及对化疗药物、靶向药物和放疗的不敏感是癌症复发、转移的主要因素。急需开发一种具有高效杀伤分化的或未分化的肿瘤细胞的新型生物免疫疗法。
临床试验表明，健康异体ICL1/NK细胞不仅对肿瘤患者有治疗作用而且输入后是安全的(Ilopoulou等，Cancer Immunol Immunother,2010；59(12):1781-9；Geller等,Immunotherapy,2011.3(12):145-59)。另外，Arai等(Cytotherapy,2008；10(6):625-32)利用癌细胞系NK-92细胞进行四期肾癌和和色素瘤的一期临床试验；Tonn等人(Cytotherapy,2013；15(12):1563-70)年利用癌细胞系NK-92细胞对各种实体瘤和血液瘤患者进行了一期临床试验。
由于ICL1/NK细胞的生命周期比较短暂，无论是自体还是异体的ICL1/NK细胞都会在循环中被很快清除掉，不需要自杀性基因的转染，没有CAR-T相关的副作用。而且，肿瘤干细胞可以被ICL1/NK细胞识别，是ICL1/NK细胞裂解杀伤的靶细胞。因此，活化的、有功能性的ICL1/NK细胞可能是一个有效地消除癌症的治疗、扩散和复发的免疫细胞治疗方案。
破骨细胞(OC)是从髓系造血干细胞中分化而来的一种多核性细胞(Chambers等,Press Med,1985；14(40):2061；Suda等,Endocr Rev；1992；13(2):191)，具有独特的降解骨组织功能来启动和调节骨组织的修复过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外扩增ICL1/NK细胞的方法。
本发明提供的方法，为用破骨细胞作为滋养层，联合使用抗CD16抗体和白介素-2扩增ICL1/NK细胞。
在本发明中，成熟的OC被用于滋养层细胞。
上述方法中，所述破骨细胞为成熟破骨细胞；
或所述ICL1/NK细胞来源于外周血、脐带血或其附属产品(附属产品可以为去除外周血中的红细胞的产品)；
或所述外周血为健康人外周血；
或所述抗CD16抗体为抗人源CD16抗体。
上述方法包括如下步骤：
1)先将所述ICL1/NK细胞和所述抗CD16抗体在细胞培养基中一次孵育；再向一次孵育体系中添加白介素-2，再次孵育，得到孵育后的ICL1/NK细胞；
2)将所述孵育后的ICL1/NK细胞和破骨细胞共培养(破骨细胞作为滋养层)，实现扩增ICL1/NK细胞。
上述方法中，
步骤1)中，所述ICL1/NK细胞加入密度为1-50百万个/毫升，所述抗CD16抗体的加入浓度为0.5-4微克/毫升，所述白介素-2的加入浓度为20-1000IU/毫升；其中毫升指添加时体系体积。
或，步骤2)中，所述孵育后的ICL1/NK细胞和所述破骨细胞的数量比为1:1-5:1。
上述方法中，
步骤1)中，所述细胞培养基为含有体积百分含量2.5-20％血浆的细胞培养基；
或，步骤2)中，所述共培养的方式为：每三天更换含有体积百分含量2.5％血浆的细胞培养基，且每次更换均添加终浓度为20-1000IU/毫升白介素-2。
上述细胞培养基为SCGM培养基或其他任何适用于培养NK细胞的培养液或培养基。
上述方法中，
步骤1)中，每次所述孵育时间均为2-10min；
步骤2)中，所述共培养的时间为大于等于18天。
由上述方法扩增得到的ICL1/NK细胞也是本发明保护的范围。
上述的方法扩增得到的ICL1/NK细胞在制备具有如下1)-6)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)治疗动物或人实体瘤；
2)提高患实体瘤的动物或人体内IFN-γ含量；
3)提高或恢复患实体瘤的动物或人的ICL1/NK细胞对实体瘤细胞的裂解杀伤能力；
4)提高实体瘤对化疗药物敏感性；
5)抑制实体瘤细胞的生长和转移；
6)延长患实体瘤的动物或人的生存期。
上述应用中，
所述实体瘤为低分化实体瘤；
或所述低分化实体瘤为胰腺癌；
或所述实体瘤细胞为低分化实体瘤细胞；
或所述低分化实体瘤细胞为胰腺癌干细胞。
上述应用中，
所述产品为试剂盒。
本发明的实验证明，本发明的方法活化扩增的ICL1/NK细胞同时具有很强的分泌干扰素γ和裂解杀伤肿瘤干细胞的功能，其裂解杀伤肿瘤干细胞例如MiaPaCa-2的能力比不使用滋养层法、使用辐射的外周血单核细胞(PBMC)方法扩增获得的ICL1/NK细胞、以及癌细胞系NK92细胞(ATCC，CRL-2407)等的能力平均高18倍左右；本发明扩增获得的细胞的内含ICL1/NK细胞纯度在96％左右，而使用辐照后外周血单核细胞(PBMC)方法扩增获得的细胞内含ICL1/NK细胞的纯度只有35％左右。
人源化动物实验结果表明，本发明获得的ICL1/NK细胞可以显著地抑制低分化癌例如由干细胞样胰腺癌细胞系MiaPaCa-2(ATCC，CRL-1420)生成的低分化嫁接瘤的生长。通过输入本发明扩增活化的ICL1/NK细胞，可以显著地提高荷瘤鼠外周血中的IFN-γ的水平来对抗癌症；提高荷瘤鼠体内的ICL1/NK细胞的裂解杀伤干细胞样胰腺癌细胞系MiaPaCa-2的能力。本发明获得ICL1/NK细胞分泌的细胞因子可以将干细胞样胰腺癌细胞系MiaPaCa-2的细胞诱导分化，失去在人源化鼠体内的转移性。
附图说明
图1为本发明培养18天获得的ICL1/NK细胞的流式细胞仪纯度检测结果。
图2为本发明使用的Pingan APD法与无共培养法、使用辐照后的外周血单核细胞PBMCs共培养扩增ICL1/NK细胞的比较。
图3为本发明使用的Pingan PAD法获得的ICL1/NK细胞与NK92细胞杀伤力的比较。
图4为健康成熟OC细胞的表面抗原检测结果。
图5为本发明使用的Pingan APD法获得的ICL1/NK细胞分泌的细胞因子或产物可以使低分化肿瘤细胞或肿瘤样干细胞MiaPaCa-2对化疗药物顺铂更敏感。
图6为ICL1/NK细胞对在人源化小鼠脾脏原位接种低分化胰腺癌细胞MiaPaca-2生长以及外周血中IFN-γ产量的影响。
图7为比较干细胞样胰腺癌MiaPaCa-2细胞和经本发明Pingan APD法扩增培养的ICL1/NK细胞上清液诱导后的MiaPaCa-2细胞在人源化鼠胰腺原位注射后12周内癌灶在重要内脏器官的转移分布比较。
图8为使用本发明获得的ICL1/NK细胞对可荷低分化胰腺癌MicPaCa-2及其诱导瘤鼠的生存率的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞
一、ICL1/NK细胞的分离纯化
1.外周血制备PBMC：使用肝素管(BD，367874)从无甲肝、乙肝、爱滋病等传染病的健康成人抽取50毫升的外周静脉血。使用aMEM(Gibco，12571063)将收集的血液按照1:1的体积比稀释。在50毫升的离心管中(Eppendorf，0030122178)添加15毫升的Lymphoprep(Stem Cell Technology，07851)，然后将稀释后的血液35毫升慢慢地加在Lymphoprep层上，使用离心机(Eppendorf，022628157)离心25分钟，转速850g。离心结束后，将上层的血浆收集后，在56℃水浴中孵育30分钟。将中间层的白膜曾收集到一个新的50毫升的离心管中，计数后离心10分钟，转速为1700转/分钟，弃上清液获得PBMC。
2.制备单核细胞和淋巴细胞：将PBMC细胞沉淀用添加有2.5％血浆的aMEM悬浮为1x106细胞/毫升，添加在T-25培养瓶中(Eppendorf，0030710126)，5毫升/瓶。在细胞培养箱(Eppendorf，CO1721015)中孵育30分钟，5％二氧化碳，37℃。将培养瓶中的液体转移到一个新的培养瓶中，原来的培养瓶中添加10毫升新的含有2.5％血浆的aMEM，放置在细胞培养箱中1个小时。收集所有的上清液到50毫升的离心管中，离心10分钟，转速为1700转/分钟，弃去上清液，获得淋巴细胞。
在培养瓶中贴壁的细胞消化脱壁后用来纯化获得单核细胞。
3.纯化ICL1/NK细胞：淋巴细胞用添加1mM EDTA和1％血浆的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4，将细胞沉淀在10毫升的10离心管(BD，3565551)悬浮为5x107细胞/毫升。添加30微升的第一抗体(Stem Cell Technology，19055)孵育10分钟后添加第二抗体(Stem CellTechnology，19055)孵育10分钟，然后，放置在磁柱内(StemCell Technology，18001)3分钟。不拿出离心管的同时将其中的液体倾倒在一个新的50毫升离心管中。然后，将磁柱中的离心管拿出后添加与上次等同体积的1mMEDTA和1％血浆的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4，放置在磁柱内3分钟后将液体与第一次的液体合并后计数后离心10分钟，转速为1700转/分钟。弃上清液，沉淀为纯化ICL1/NK细胞。
二、Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞
1、成熟破骨细胞OC的获得
1)将上述一的2中在培养瓶中用aMEM培养的贴壁细胞被用来纯化获得单核细胞从而进一步诱导分化获得OC，具体方法为：
使用PBS，pH值为7.4，冲洗培养瓶后添加适量的胰蛋白酶消化液(Thermo Fisher,25200072)孵育3-10分钟，以80％的细胞脱壁时可以添加500微升的冷血浆终止消化。收集细胞后离心，1700rpm，10分钟。弃上清液，使用用添加1mMEDTA和1％血浆的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4，将细胞沉淀在10毫升的10离心管(BD，3565551)悬浮为1x108细胞/毫升。添加50微升的第一抗体(Stem Cell Technology，19058)，孵育10分钟，然后添加第二抗体(Stem Cell Technology，19058)孵育10分钟，然后，放置在磁柱内3分钟。不拿出离心管的同时将其中的液体倾倒在一个新的50毫升离心管中。然后，将磁柱中的离心管拿出后添加与上次等同体积的1mMEDTA和1％血浆的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4，放置在磁柱内3分钟后将液体与第一次的液体合并后计数后离心10分钟，转速为1700转/分钟。弃上清液，获得纯化的单核细胞。将单核细胞使用添加2.5％的aMEM培养液悬浮为0.3x106细胞/毫升，添加M-CSF(PerproTECH，AF-300-25-100UG)25ng/毫升，添加5毫升到T25的培养瓶中培养，每三天更换一次培养液。第三天时，更换培养液的同时补加同样浓度的M-CSF。第7天-21天，培养液中同时补加M-CSF和RANKL(PeproTECH，AF-310-01-100UG)均为25ng/毫升，第21天时，大多数细胞是具有多核的OC，此时，可以用作ICL1/NK细胞的滋养层。
2)OC的成熟度检测
移除上述1)第21天时OC的培养液，使用适量的PBS洗涮一次，然后添加适量的胰蛋白酶-EDTA消化10-20分钟，每5分钟在显微镜下观察细胞脱壁的情况以免过度消化。当有80％的细胞脱壁时，收集脱壁的细胞离心200g，10分钟，收集沉淀即为待检测OC细胞，流式仪检测OC表面抗原，所需抗体购自Biolegend，IgG1-PE(400113)/IgG2a-PE(400211)、CD54-PE(353105)、MHC1-PE(311405)、KIR2-PE(339505)、KIR3-PE(312707)、KLRG1-PE(368609)、MICA/B-PE(320906)。
结果如图4所示，可以看出，得到成熟OC细胞。
2、Pingan APD法活化扩增ICL1/NK细胞
使用添加2.5％(体积百分含量)血浆的SCGM培养液(Cellgenix，0020802-0500)悬浮上述一得到的纯化ICL1/NK细胞(密度为10million/毫升)，再添加1微克/毫升的抗人CD16的抗体(Stem Cell Technology，60041)孵育10分钟，再添加白介素-2(PeproTECH，AF-200-02-1MG)500单位/毫升，孵育10分钟，得到孵育后的ICL1/NK细胞；再将孵育后的ICL1/NK细胞与上述1得到的成熟OC细胞(第21天)按照数量比2:1的比例共培养，每三天更换培养液SCGM+2.5％血浆，添加500单位/毫升白介素-2，得到扩增后ICL1/NK细胞。
每18天重复使用抗体和白介素-2孵育ICL1/NK细胞，然后与OC共培养。
三、检测
1、检测扩增后ICL1/NK细胞纯度
将上述二的共培养18天的扩增后ICL1/NK细胞离心，200g，10分钟，使用细胞计数仪(Thermo Fisher,AMQA1000)计数后，取出1x106个细胞，使用200微升的添加0.1％BSA(Thermo Fisher，B14)的PBS悬浮，将悬浮液分为2份，分别加入10微升抗CD3-FITC(Biolegend，300305)/CD16-PE(Biolegend，302007)、CD56-PE(Biolegend，981202)(抗体和IgG1-PE(Biolegend，400113)和IgG2a-FITC(Biolegend，407107)在室温下孵育30分钟。离心1000rpm，10分钟后弃上清，添加含0.1％BSA的PBS悬浮为500微升，使用流式细胞仪检测(BD，FACSMelody)。
检测结果见图1，培养18天后的ICL1/NK细胞的纯度为96％，CD3+CD16C56+的NKT细胞非常少，CD3+的T细胞更少。这样制备的ICL1/NK细胞不用纯化就可以达到输入用的质量。
2、比较ICL1/NK细胞扩增的数量及其分泌IFN-γ的水平
为了比较本发明Pingan APD法活化扩增ICL1/NK细胞的效率和功能，比较了常用的无共培养法(因子法)、辐射的PBMC法和本发明的Pingan APD法：
Pingan APD法：上述二的方法；
无共培养法(因子法)(Dewan等，Breast Cancer Res Treat,2007；104:267-275)：将上述一得到的纯化ICL1/NK细胞用无共培养法进行扩增；
辐射的PBMC法Lee等，Nature，2017；DOI:10.1038/s41598-017-09259-1)：将上述一得到的纯化ICL1/NK细胞用辐射的PBMC法进行扩增；
a、检测各种培养方法扩增18天后获得的ICL1/NK细胞数量(方法同上述1)；
b、检测IFN-γ在扩增18天后ICL1/NK细胞的培养液中的含量(除了特别标记外，
此检测方法中使用的试剂盒，不包括在试剂盒中的试剂和耗材会特别标记出来，
Invitrogen，88-7316)，方法如下：
1)离心3000rpm，10分钟离心收集各方法扩增后的ICL1/NK细胞上清液待用；
2)将捕获抗体使用1X的包被液按照1:250的比例稀释后，在酶联免疫96孔板(NUNC，44-2404)添加100微升/孔后使用Parafilm(Bemis，PM992)封口后在冰箱中冷藏过夜；
3)移除包被液，使用清洗液(Thermo Fisher，00-0400)250微升/孔清洗三次，每次停留至少1分钟。清洗后，将96孔板倒置在吸水纸上控干水分；
4)将1份5XELISA/ELISPOT Diluent添加4份蒸馏水稀释后添加到包被清洗后的96孔板中，200微升/孔，室温下孵育1小时；
5)添加蒸馏水把标准品溶解为500pg/毫升，轻轻弹动并静置15分钟后在进一步稀释；
6)使用1XELISA/ELISPOT Diluent将上述标准品在96孔板中的第一排添加最高浓度的500pg/ml，100微升/孔，每一个浓度为3个空。然后，倍比稀释，达到8个浓度；
7)然后，将血清样本使用PBS稀释1倍后(培养上清液样本不用稀释)，按照100微升/孔添加到其余孔中。最少有2个孔为只添加100微升/孔的1XELISA/ELISPOT Diluent，作为空白对照。使用Parafilm密封后，室温下孵育2小时；
8)像步骤2)一样清洗孵育后的板子，可以重复3-5次；
9)将检测抗体使用1XELISA/ELISPOT Diluent按照1:250的比例稀释后，添加100微升/孔。使用Parafilm密封后，在室温下孵育1小时；
10)像步骤2)一样清洗孵育后的板子，可以重复3-5次；
11)将Avidin-HRP按照1:250的比例使用1XELISA/ELISPOT Diluent稀释后，添加100微升/孔。使用Parafilm密封后，在室温下孵育30分钟；
12)像步骤2)一样清洗孵育后的板子，每一次至少让清洗液浸泡1-2分钟，重复5-7次；
13)添加1XTMB，100微升/孔。在室温下孵育15分钟；
14)添加终止液，50微升/孔。
15)使用分光光度仪在450nm吸收光进行检测分析(Tecan，Infinite 200Pro)。
c、检测各种方法获得的扩增18天后ICL1/NK细胞溶解杀死肿瘤干细胞MiaPaca-2的能力
ICL1/NK细胞细胞毒性实验使用细胞毒性检测试剂盒(Molecular Probes，L7010)检测ICL1/NK细胞的裂解杀伤肿瘤干细胞MiaPaCa-2(靶细胞，T)，具体如下：
1)准备靶细胞(T)：a)将染色成分Component A(DiOC18(3))与细胞培养液(RPMI1640+5％血浆)(Gibco，11875-119)按照1:250的比例稀释为染色工作液；b)将处于指数生长期的靶细胞使用上述染色工作液液悬浮为1x105/毫升的，在培养箱中孵育过夜；c)将孵育过夜的细胞离心1000rpm，10分钟，除去细胞中的培养液。然后，用PBS洗涤一次；d)将细胞悬浮在上述细胞培养液中，悬浮的密度为1x104/毫升作为靶细胞待用。
2)准备ICL1/NK细胞杀伤细胞效应细胞(E)：将上述各种方法扩增得到的的ICL1/NK细胞按照2x104/毫升和1x105/毫升悬浮在上述细胞培养液中；
3)将T和E两种细胞悬液各取0.5毫升按照等体积混合，制备成E:T＝2:1和E:T＝5:1的细胞混合液，每一个比例为3个重复。相对应的MP-2细胞数量添加等体积的细胞培养液作为本底对照组。然后，将细胞在细胞培养箱中孵育4小时；
4)离心1000rpm，10分钟，弃上清液；
5)将细胞核染色液Component B(PI)用PBS稀释500倍为复染工作液；
6)将离心后的细胞沉淀体检50微升的复染工作液，在室温下孵育5分钟；
7)每个样品取5微升的细胞悬液在显微镜(Nikon，A1R)下进行照相分析
8)计算杀伤的公式如下。其中，G代表有绿色细胞质的细胞；R代表有红色细胞核的细胞；G+R代表具有绿色细胞质和红色细胞核的细胞。
上述各个检测结果如图2所示，(A)各种培养方法获得的ICL1/NK细胞数量，(B)IFN-γ在ICL1/NK细胞的培养液中的含量，(C)各种方法获得的ICL1/NK细胞溶解杀死肿瘤干细胞MiaPaca-2的能力；通过比较，本发明获得的ICL1/NK细胞是辐照后PBMCs和无滋养层细胞因子两种方法的90倍左右(图2A)；IFN-γ在ICL1/NK细胞的培养液中含量是无共培养的29.5倍，是辐照后PBMCs法的34.7倍(图2B)；Pingan APD法获得的ICL1/NK细胞溶解杀死肿瘤干细胞MiaPaca-2的能力，是无共培养的20倍左右，是辐照后PBMCs的17倍左右(图2C)。
3、Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞与其他细胞与裂解杀伤肿瘤样干细胞MiaPaCa-2的能力的比较
检测方法同上述2的c，以NK92细胞替换上述4的Pingan PAD法扩增得到的ICL1/NK细胞作为对照。
结果如图3所示，可以看出，本发明使用的Pingan PAD法获得的ICL1/NK细胞与NK92细胞杀伤力的比较。Pingan APD法杀死OCSCS细胞的能力是上述2得到的ICL1/NK的15倍左右，是癌细胞系NK92的33倍左右。
实施例2、Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞培养上清液孵育5天肿瘤样干细胞MiaPaCa-2提高其对化疗药物顺铂的敏感性
收集实施例1的二的2中Pingan APD法活化扩增第18天的ICL1/NK细胞培养上清液用来替换MiaPaCa-2的培养液对其进行诱导孵育，每48小时更换一次。5天后，将细胞收集。同时收集对照无ICL1/NK细胞培养上清液诱导孵育的细胞。
采用ICL1/NK细胞细胞毒性实验使用细胞毒性检测试剂盒(方法同上)来检测诱导孵育5天的MiaPaCa-2与无孵育细胞的细胞对卡铂的敏感性，只是将混合E和T的步骤中将E更换为顺铂(齐鲁制药有限公司，6A001A88)，浓度为50ug/毫升。其他步骤一致。
结果见图5，可以看到，用Pingan APD法培养扩增ICL1/NK细胞的上清液孵育MiaPaCa-2可以使其更容易被化疗药物顺铂杀死，表明Pingan APD法培养扩增ICL1/NK细胞可以促进化疗药物杀伤肿瘤样干细胞MiaPaCa-2。
实施例3、Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞治疗低分化胰腺癌
由于用于治疗胰腺癌的临床药物的有限性，目前胰腺癌的5年生存率仍只有5％(Burris HA等，Journal of Clinical Oncology,1997,15(6):2403-13；Philip PA等，Journal of Clinical Oncology,2010,28(22):3605-10；Von Hoff等，NEJM,2013,369(18):1691-703)。
胰腺肿瘤细胞系MiaPaCa-2细胞为CD44+CD24+ESA+以及CD44+/CD133+/EpCAP+阳性的肿瘤干细胞样细胞系(Li C等,Cancer Research,2007,67(3):1030-7；Li C等，Methods in Molecular Biology,2009,568:161-73；Bao B等,JBC,2014,289(21):14520-33)，具有生长迅速、转移迅速、容易形成单克隆、自我增值快的特点，而且对化疗药物耐受，并且其嫁接瘤内的细胞仍然保持高比例上述阳性标记细胞，属于低分化胰腺癌(Du Z等,Digestive Diseases and Sciences,2011,56(3):741-50；Shah AN等,Annals ofSurgical Oncology,2007,14(12):3629-37)。
将胰腺肿瘤细胞系MiaPaCa-2在体外培养到指数生长期，收集、计数后悬浮在Matrigel(Corning,354248)中，悬浮密度为1x108细胞/毫升，得到Matrigel-细胞悬液。使用1毫升的无菌注射器(BD，300841)在健康huBLT小鼠(Jackson Lab)的胰腺原位注射10微升的Matrigel-细胞悬液到胰腺组织中，得到荷瘤小鼠。
注射后14天，将荷瘤小鼠随机分为3组，每组5只：
ICL1/NK细胞治疗组：给每只小鼠(0.1kg)经尾静脉输入100ul含有150万的实施例1的二的2中Pingan APD法活化扩增的ICL1/NK细胞和5％(体积百分比)人血清白蛋白(Sigma-Aldrich，70024-90-7)的生理盐水，实验治疗周期的4周中只输入一次；
荷瘤未治疗组：给每只小鼠(0.1kg)经尾静脉输入含5％人血清白蛋白的生理盐水。实验周期的4周中只输入一次。
健康非荷瘤小鼠组：健康huBLT小鼠不进行任何处理。
大约4周时间，待荷瘤未治疗组小鼠的瘤体达到2厘米直径时，所有小鼠按照实验动物保护条例实施二氧化碳窒息处死并采集所有小鼠的胰腺癌灶和外周血。
测量各组小鼠的胰腺癌灶质量，结果见图6A，可以看出，ICL1/NK细胞治疗组癌灶质量比荷瘤未治疗组明显缩小，使用ICL1/NK细胞可以显著地抑制胰腺癌，癌灶重量。
检测各组小鼠外周血中的IFN-γ浓度，方法同前，结果如图6B所示，ICL1/NK细胞治疗组小鼠外周血中的IFN-γ含量比荷瘤未治疗组水平显著提高，甚至高于健康非荷瘤鼠的水平。因此，使用ICL1/NK细胞可以显著地提高荷瘤鼠血液中IFN-γ含量，提高其对抗肿瘤的能力。外周血中的IFN-γ的产量在输入ICL1/NK细胞后显著提高。
检测各组人源化小鼠外周血中ICL-NK细胞对MiaPaCa-2的裂解杀伤结果，方法同前，结果如图6C所示，可以看出，由外周血中纯化获得的PBMC对干细胞样肿瘤细胞MiaPaCa-2的裂解杀伤作用也由于ICL1/NK细胞二恢复到正常水平，荷瘤非治疗组的则非常低下，ICL-NK细胞提高对MiaPaCa-2的杀伤力。
实施例4、MiaPaCa-2细胞被Pingan APD法扩增ICL1/NK细胞培养上清液诱导孵育5天后嫁接瘤
荷诱导孵育后的MiaPaCa-2瘤组+顺铂：收集第18天的实施例1的二的2中PinganAPD法活化扩增的ICL1/NK细胞养上清液用来替换MiaPaCa-2的培养液对其进行诱导孵育，每48小时更换一次，5天后，只收集孵育后的MiaPaCa-2细胞悬液，使用1毫升的无菌注射器(BD，300841)在健康huBLT小鼠(Jackson Lab)的胰腺原位注射10微升的孵育后的MiaPaCa-2细胞悬液到胰腺组织中，得到荷诱导孵育后的MiaPaCa-2荷瘤小鼠；注射后14天，对荷诱导孵育后的MiaPaCa-2荷瘤小鼠进行卡铂治疗，卡铂采用腹腔注射，注射剂量为10mg/kg体重，使用7天休息21天。该实施例总时长共12周。
荷MiaPaCa-2瘤组+顺铂：使用1毫升的无菌注射器(BD，300841)在健康huBLT小鼠(Jackson Lab)的胰腺原位注射10微升的MiaPaCa-2细胞悬液到胰腺组织中，得到荷MiaPaCa-2荷瘤小鼠；注射后14天，对荷MiaPaCa-2荷瘤小鼠进行卡铂治疗，卡铂采用腹腔注射，注射剂量为10mg/kg体重，使用7天休息21天。该实施例总时长共12周。
健康对照组：健康huBLT小鼠不进行任何处理。
对所有的动物进行内脏采集并分离胰腺、肝脏和肺来观察癌灶的转移分布情况。
结果如图7所述，可以看到，经过顺铂，诱导后MiaPaCa-2细胞形成的胰腺癌癌灶在胰腺原位较小而且在肝脏和肺脏没有发现转移灶；而MiaPaCa-2细胞在胰腺的部位形成很大的癌灶，并且转移到肝脏和肺。说明ICL1/NK细胞培养上清液诱导孵育MiaPaCa-2细胞5天提高了其对化疗药物顺铂的敏感性，并且使其形成的嫁接瘤失去的转移性。
统计各组小鼠12周内的生存率，结果如图8所示，A，荷MiaPaCa-2瘤顺铂治疗组；B，荷诱导后MiaPaCa-2瘤顺铂治疗组；C，健康对照组，可以看出，荷MiaPaCa-2细胞瘤的鼠对顺铂治疗不敏感，在第五周全部死亡；而荷诱导后MiaPaCa-2细胞瘤的鼠经过顺铂的治疗在12周内全部存活。

Claims (10)

1.一种体外扩增ICL1/NK细胞的方法，为用破骨细胞作为滋养层，联合使用抗CD16抗体和白介素-2扩增ICL1/NK细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述破骨细胞为成熟破骨细胞；
或所述ICL1/NK细胞来源于外周血、脐带血或其附属产品；
或所述抗CD16抗体为抗人源CD16抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：
1)先将所述ICL1/NK细胞和所述抗CD16抗体在细胞培养基中一次孵育；再向一次孵育体系中添加白介素-2，再次孵育，得到孵育后的ICL1/NK细胞；
2)将所述孵育后的ICL1/NK细胞和破骨细胞共培养，实现扩增ICL1/NK细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述ICL1/NK细胞加入密度为1-50百万个/毫升，所述抗CD16抗体的加入浓度为0.5-4微克/毫升，所述白介素-2的加入浓度为20-1000IU/毫升；
或，步骤2)中，所述孵育后的ICL1/NK细胞和所述破骨细胞的数量比为1:1-5:1。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述细胞培养基为含有体积百分含量2.5-20％血浆的细胞培养基；
或，步骤2)中，所述共培养的方式为：每三天更换含有体积百分含量2.5％血浆的细胞培养基，且每次更换均添加终浓度为20-1000IU/毫升白介素-2。
6.根据权利要求3-5中所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，每次所述孵育时间均为2-10min；
步骤2)中，所述共培养的时间为大于等于18天。
7.由权利要求1-6任一所述方法扩增得到的ICL1/NK细胞。
8.权利要求7所述的方法扩增得到的ICL1/NK细胞在制备具有如下1)-6)中至少一种功能的产品中的应用：
1)治疗动物或人实体瘤；
2)提高患实体瘤的动物或人体内IFN-γ含量；
3)提高或恢复患实体瘤的动物或人的ICL1/NK细胞对实体瘤细胞的裂解杀伤能力；
4)提高实体瘤对化疗药物敏感性；
5)抑制实体瘤细胞的生长和转移；
6)延长患实体瘤的动物或人的生存期。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述实体瘤为低分化实体瘤；
或所述低分化实体瘤为胰腺癌；
或所述实体瘤细胞为低分化实体瘤细胞；
或所述低分化实体瘤细胞为胰腺癌干细胞。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
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