JP7485385B2 - 適応型の表現型を示すｎｋ細胞ならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents

Description

継続的出願データ
本出願は、２０１５年９月１４日に出願された米国仮出願第６２／２１８，３６６号および２０１６年２月１６日に出願された米国仮出願第６２／２９５，７０８号の利益を主張し、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとして援用する。

政府の資金提供
本発明は、国立衛生研究所から与えられた認可第ＣＡ１１１４１２号、第ＣＡ６５４９３号、第ＣＡ１９７２９２号、および第ＨＬ１２２２１６号の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

本開示は、適応型の表現型を示すＮＫ細胞、適応型ＮＫ細胞を含む組成物、単離された適応型ＮＫ細胞集団、ならびに前記組成物および前記単離された集団の製造方法および使用方法を記載する。適応型ＮＫ細胞は、普通型ＮＫ細胞と比較して機能的に異なる能力を有するため、適応型ＮＫ細胞は、普通型ＮＫ細胞と比較してさらなる抗腫瘍能または抗ウイルス能を与えることが可能であるので、記載された組成物、集団、ならびに前記組成物および前記集団の製造方法および使用方法は、癌、前癌状態、またはウイルス感染の治療または予防に使用され得る。

一態様において、本開示は、適応型ＮＫ細胞を含む組成物を記載する。適応型ＮＫ細胞は、普通型ＮＫ細胞と比較して機能的に異なる能力を有し、普通型ＮＫ細胞と比較して、さらなる抗腫瘍能または抗ウイルス能を与えることができる。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋であり、ＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は長命である。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの２つ以上である。例えば、適応型ＮＫ細胞はＣＤ５７^＋およびＮＫＧ２Ｃ^＋であり得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの３つ以上である。例えば、適応型ＮＫ細胞はＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、およびＥＡＴ－２であり得る。

いくつかの実施形態において、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）転写因子の発現は、普通型ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において減少する。例えば、ＰＬＺＦ発現は９０％以上減少され得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、転写因子前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）を発現しない。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は抗腫瘍活性を示す。腫瘍は、造血組織および/またはリンパ組織の腫瘍を含み得る。腫瘍は固形腫瘍であり得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、もしくはＩＦＮ－βのうちの１つ以上を含んでなる培地で培養された細胞；ラパマイシンを含んでなる培地で培養された細胞；Ｎｏｔｃｈリガンドを含んでなる培地で培養された細胞；および／またはＮＫＧ２Ｃ受容体アゴニストを含んでなる培地で培養された細胞に由来する。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞をインビボで製造する。いくつかの実施形態において、製造には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを対象に投与すること、不活性化サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を対象に投与すること、サイトカインを対象に投与すること、および／またはＮｏｔｃｈリガンドを対象に投与することが含まれる。サイトカインには、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＧＭ－ＣＳＦのうちの少なくとも１つ以上が含まれ得る。いくつかの実施形態において、サイトカインまたは組み合わせまたはサイトカインは、高用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、製造は、対象においてＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導することを含んでなる。いくつかの実施形態において、対象はＣＭＶ血清陽性である。

本開示はまた、対象における癌、前癌状態、またはウイルスを治療または予防する方法であって、適応型ＮＫ細胞を含んでなる組成物を対象に投与することを含む前記方法を記載する。いくつかの実施形態において、癌には、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊髄癌、胃癌、子宮癌、造血器癌、またはリンパ系癌が含まれる。いくつかの実施形態において、癌は転移性癌である。

また、本開示によって、対象における腫瘍の増殖を阻害する方法が記載される。方法は、適応型ＮＫを含んでなる組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍を含んでなる。いくつかの実施形態において、ウイルスはレンチウイルスまたはヘルペスウイルスを含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、薬剤的に許容できる担体をさらに含む。

本開示はまた、対象における癌または前癌状態を治療または予防する方法であって、適応型ＮＫ細胞のインビボでの製造を含む前記方法を記載する。いくつかの実施形態において、癌には、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊髄癌、胃癌、子宮癌、造血器癌、またはリンパ系癌が含まれる。いくつかの実施形態において、癌は転移性癌である。

本開示はまた、対象における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、適応型ＮＫ細胞のインビボでの製造を含む前記方法を記載する。いくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、方法は、治療剤を含んでなる組成物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、自然に発生しないものであることができ、かつ/または自然に発生しない量で投与することができる。治療剤は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、治療用抗体、アジュバント、抗酸化剤、または化学療法剤のうちの１つ以上を含み得る。

本開示は、適応型ＮＫ細胞の製造方法をさらに記載する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞をインビトロで製造する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ナイーブ源由来の細胞、血液から単離された細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血から単離された細胞、および／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。

他の態様において、本開示は、適応型ＮＫ細胞を得る方法を記載する。方法は、対象から血液サンプルを得ることと、血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養することとを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団を、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＮｏｔｃｈリガンドのうちの１つ以上を含む培地で培養する。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団を、ＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞と共に培養する。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団を、自家単球およびＩＬ－１５と共に培養する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^ｄｉｍであり、ＮＫＧ２Ｃ^＋およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載の方法によって得られる適応型ＮＫ細胞を含む組成物を記載する。他の態様において、本開示は、本明細書に記載の方法によって得られる適応型ＮＫ細胞について富化されているＮＫ細胞集団を含む組成物を記載する。

別の態様において、本開示は、単離されたＮＫ細胞集団であって、前記細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ならびにＮＫＧ２Ｃ^＋、ＣＤ５７^＋、およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、前記単離されたＮＫ細胞集団を記載する。他の態様において、本開示は、単離されたＮＫ細胞集団であって、ＣＤ５６^ｄｉｍおよびＮＫＧ２Ｃ^＋であるＮＫ細胞について富化されている、前記単離された集団を記載する。本開示はまた、本明細書に記載の単離された集団を含む組成物を記載する。

用語「好ましい」および「好ましくは」は、特定の状況下で一定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況の下で、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用ではないことを意味せず、他の実施形態を本発明の範囲から排除することを意図しない。

用語「含んでなる」およびその変形は、これらの用語が明細書および特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有しない。

別段の定めがない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「１つ以上（at least one）」は交換可能に使用され、１つまたは複数を意味する。

また、本明細書において、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１～５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

別個のステップを含む本明細書に開示されている方法では、ステップは任意の可能な順序で実施され得る。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に行い得る。

本発明の上記概要は、本発明の各開示された実施形態または全ての実施形態を説明することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。出願書類全体のいくつかの箇所では、様々な組み合わせで使用できる例のリストによってガイダンスが与えられている。それぞれの例において、列挙されたリストは代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈すべきではない。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）再活性化が、骨髄機能廃絶（ＭＡ）造血幹細胞（ＨＣＴ）レシピエントではなく、強度軽減前治療（ＲＩＣ）レシピエントにおける再発リスクの減少および無病生存率の向上と関連することを示す。ＲＩＣレシピエントにおけるＣＭＶ状態によって階層化された、再発率（図１Ａ）および無病生存率（ＤＦＳ）のカプラン－マイヤー曲線（図１Ｂ）。ＭＡレシピエントにおけるＣＭＶ状態によって階層化された再発率（図１Ｃ）およびＤＦＳ（図１Ｄ）。破線は、ＣＭＶ血清陰性レシピエントについて算出された傾向を表す。点線は、ウイルス再活性化を経験しなかったＣＭＶ血清陽性レシピエントについて算出された傾向を表す。実線は、ウイルス再活性化を経験したＣＭＶ血清陽性レシピエントについて算出された傾向を表す。各プロットで示されたｐ値を傾向について計算した。

ＣＭＶ再活性化を経験するＲＩＣ ＨＣＴレシピエントにおけるＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋適応型ＮＫ細胞の優先的な増殖を示す。適応型ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋表現型のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の平均パーセンテージ（図２Ａ）および絶対数（細胞／血液μｌ）（図２Ｂ）が示されている。移植後１００日目（ＲＩＣ ｎ＝４４、ＭＡ ｎ＝３２）、６ヶ月目（ＲＩＣ ｎ＝３５、ＭＡ ｎ＝２３）、および１年目（ＲＩＣ＝３１、ＭＡ＝２１）でのＣＭＶ血清陰性レシピエントの値は、左パネルに示されている。移植後１００日目（ＲＩＣ ｎ＝２２、ＭＡ ｎ＝１２）、６ヶ月目（ＲＩＣ＝１３、ＭＡ＝１４）、および１年目（ＲＩＣ＝１１、ＭＡ＝８）でのＣＭＶ再活性化を伴わないＣＭＶ血清陽性レシピエントの値は、中央パネルに示されている。ウイルス診断時（ＲＩＣ ｎ＝２８、ＭＡ ｎ＝１８）、診断後２週間（ＲＩＣ ｎ＝２６、ＭＡ ｎ＝１４）、診断後４週間（ＲＩＣ ｎ＝２９、ＭＡ ｎ＝２３）、診断後８週間（ＲＩＣ ｎ＝２４、ＭＡ ｎ＝１５）、移植後６ヶ月（ＲＩＣ ｎ＝２９、ＭＡ ｎ＝１７）、および移植後１年（ＲＩＣ ｎ＝２６、ＭＡ ｎ＝１０）でのＣＭＶを再活性化したＣＭＶ血清陽性レシピエントの値は、右パネルに示されている。＊＝ＲＩＣとＭＡとを比較するｐ≦０．０５。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞増殖と関連するＣＭＶ再活性化時の絶対単球数を示す。ウイルス再活性化時の２８のＣＭＶ血清陽性レシピエントからの絶対単球数を、６ヶ月または１年のいずれかでのこれらのレシピエントからの末梢血サンプル中のＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数（図３Ａ）またはパーセンテージ（図３Ｂ）のいずれかに対してプロットした。同じレシピエントからのウイルス診断時の絶対リンパ球数も、６ヶ月または１年のいずれかでの末梢血試料中のＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数（図３Ｃ）またはパーセンテージ（図３Ｄ）のいずれかに対してプロットした。 同上。

ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞が、他のＮＫ細胞サブセットと比較して高頻度でＴＮＦおよびＩＦＮ－γを産生することを示す。ＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｋ５６２標的細胞有りまたは無しで２：１の比で培養し、機能的反応をＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞のサブセットで分析した。図４Ａ．代表的なドナーについて単独で培養したエフェクター細胞（網掛けの灰色の線）と比較した、Ｋ５６２標的で培養したＮＫ細胞におけるＴＮＦ発現（白抜きの黒色の線）および細胞内ＩＦＮ－γ発現（白抜きの黒色の線）のヒストグラム。図４Ｂ．５人のドナーからのＫ５６２標的で培養したＮＫ細胞における累積ＴＮＦおよびＩＦＮ－γ発現データ。２つの独立した実験を行った。＊＝ｐ≦０．０５，＊＊＝ｐ≦０．００５。有意性を判定するために、両側の対応のあるｔ検定を使用した。エラーバーはＳＥＭを表す。 同上。

高用量ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達が、最終分化ＣＤ５７^＋適応型ＮＫ細胞およびＳＹＫ^－適応型ＮＫ細胞の増殖を支持することを示す。臍帯血から単離した単核細胞を、ＣＤ３／ＣＤ１６を欠失させ、天然またはＤＬ１形質導入ＯＰ９間質細胞上の示されたサイトカインと共に１４日間培養した。図５Ａ．代表的なドナーからの各培養条件における７日目および１４日目のＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞によるＣＤ５７およびＳＹＫ発現の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロット。培養後１４日目に６人の臍帯血ドナーからの表面ＣＤ５７を発現する（図５Ｂ）および細胞内ＳＹＫを欠く（図５Ｃ）ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞のパーセンテージの累積データも示す。２つの独立した実験を行った。エラーバーはＳＥＭを表す。 同上。

ＩＬ－２１と共に培養されたＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞において、転写因子前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）がダウンレギュレートされることを示す。図６Ａ．示された培養条件下で１４日後、代表的なドナーからの臍帯血由来ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞における細胞内ＰＬＺＦ発現のＦＡＣＳプロット。図６Ｂ．６人のドナーからの各培養条件での１４日後のＰＬＺＦ^－ＮＫ細胞のパーセンテージを示す累積データ。２つの独立した実験を行った。エラーバーはＳＥＭを表す。 同上。

ラパマイシンが適応型ＮＫ細胞分化を促進し、ＮＫ細胞機能を増強することを示す。健常なＣＭＶ血清陽性ドナーからのＣＤ３／ＣＤ１９欠失ＰＢＭＣを、ＤＭＳＯまたは１０マイクロモル（μＭ）ラパマイシンと共に４日間培養した。図７Ａ．代表的なドナーからのＣＤ５７およびＮＫＧ２Ｃ発現のＦＡＣＳプロット。図７Ｂ．単離直後および培養後の４人のドナーからのＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋適応型ＮＫ細胞のパーセンテージを示す累積データ。上記の条件下で培養された細胞を、ＦＡＣＳにより、ＣＤ１６刺激有りまたは無しで、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）およびＴＮＦ産生について分析した。図７Ｃ．代表的なドナーからのＦＡＣＳプロット。図７Ｄ．４人のドナーからの累積脱顆粒データ。＊＝ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ≦０．０１。 同上。

成人ＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血由来の適応型ＮＫ細胞が、高用量のＩＬ－１５、ＩＬ－２、およびＣＤ１６刺激によりインビトロで増殖され得ることを示す。図８Ａ．代表的なＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＣＤ５７対ＮＫＧ２Ｃ、ＳＹＫ、およびCellTraceのＦＡＣＳプロット。４人のＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞のパーセンテージ（図８Ｂ）およびＳＹＫを欠くＮＫ細胞のパーセンテージ（図８Ｃ）の累積データ。＊＝ｐ＜０．０５。 同上。

Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖およびＮＫ細胞の機能を抑制する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を示す。図９Ａ．健常な給血者由来の精製Ｔ細胞およびＮＫ細胞をCellTrace Violetで標識し、Ｔ細胞についてはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（４０ビーズ／１×１０^５細胞）およびＩＬ－１５（１ナノグラム毎ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ））の存在下で、ＮＫ細胞についてはＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）のみ存在下で、様々な比率でサイトカイン誘導性自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と共培養した。３日目または４日目に増殖を評価し、６つの独立した実験の代表的なデータを示す。図９Ｂ．精製ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、単球またはＭＤＳＣと２：１の比で共培養した。細胞をアゴニスト性ＣＤ１６（抗ＣＤ１６；１マイクログラム毎ミリリットル（μｇ／ｍＬ））で６時間刺激し、その後、染色し、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）およびＩＦＮ－γ産生について評価した。１つの代表的な等高線図および累積（ｎ＝８）データを平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントのｔ検定を統計解析に使用した。 同上。

適応型ＮＫ細胞がＭＤＳＣ抑制に抵抗することを示す。健常な給血者由来の精製ＮＫ細胞を、細胞接触（図１０Ａ）または可溶性因子交換のみを可能にするトランスウェル（図１０Ｂ）で、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と共培養した。細胞を、染色の６時間前に抗ＣＤ１６で刺激し、脱顆粒、ＩＦＮ－γ（図１０Ａ、図１０Ｂ）、およびＴＮＦ－産生（図１０Ａ）、および増殖（Ｋｉ６７）（図１０Ａ）をそれぞれフローサイトメトリーによって評価した。普通型（Ｃｏｎｖ）ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^－として、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＦｃεＲγ^－として同定される。５～７回の独立した実験のプールされたデータを平均±ＳＥＭとして示し、統計解析をスチューデントのｔ検定を用いて行った。 同上。

普通型ＮＫ細胞が、適応型ＮＫ細胞と比較してより高いＴＩＧＩＴを発現することを示す。図１１Ａ．健常な供血者由来の精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）単独の存在下もしくは非存在下で、または１８時間のＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１８（１００ｎｇ／ｍＬ）の追加刺激とともに、または６時間の抗ＣＤ１６（１μｇ／ｍＬ）の刺激とともに、染色前に培養した。４つの独立した実験のうちの１つが示されている。ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比率で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と共に培養した。細胞を、分析の６時間前に抗ＣＤ１６で刺激した。ＤＮＡＭ－１（図１１Ｂ）およびＴＩＧＩＴ発現（図１１Ｃ）の代表的なヒストグラムならびにＴＩＧＩＴ発現の集計データ（ｎ＝８）を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＥＭとして示す。統計解析には２元ＡＮＯＶＡを用いた。図１１Ｄ．単球またはＭＤＳＣとの共培養の前後のＮＫ細胞を、ＤＮＡＭ－１およびＴＩＧＩＴの共発現について分析した。３つの独立した実験および７つの反復の代表的なデータを示す。 同上。 同上。

普通型ＮＫ細胞ＭＤＳＣのＴＩＧＩＴ依存性抑制を示す。図１２Ａ．単球、ＭＤＳＣ、およびＮＫ細胞を、CellTracker Blueで標識し、一晩スライド上で共培養した後、抗ＣＤ１６で刺激し、その後、抗ＣＤ１５５（緑色）および抗ＴＩＧＩＴ（赤色）で染色し、次いで共焦点顕微鏡法を行った。共培養したときの個々の細胞型が上部パネルまたは下部パネルに示されている。２つの独立した実験および６人のドナーの代表的なデータが示されている。ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５およびＩｇＧ対照（１０μｇ／ｍｌ）、またはＴＩＧＩＴに対する遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、単球またはＭＤＳＣと共に培養した。脱顆粒（ｎ＝９）およびＩＦＮ－γ産生（ｎ＝８）を、ポリクローナルＮＫ細胞（図１２Ｂ）、普通型ＮＫ細胞（ｎ＝８）（図１２Ｃ）、および適応型ＮＫ細胞（ｎ＝９）（図１２Ｄ）で評価した。図１２Ｅ．あるいは、細胞を抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＤＮＡＭ－１（１０μｇ／ｍｌ）によって同時遮断した（ｎ＝６）。プールされたデータを、反復数ｎの平均±ＳＥＭとして示し、統計解析のために２元および１元ＡＮＯＶＡを使用した。 同上。 同上。

反応性酸素種（ＲＯＳ）がＭＤＳＣ上でＣＤ１５５発現を誘導することを示す。ＭＤＳＣは、７日間ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を受けた健常な給血者ＰＢＭＣから誘導され、ＨＬＡ－ＤＲについてビーズ欠失（bead-depleted）を受け、ＣＤ３３について富化された。図１３Ａ．示された抗原について、ＭＤＳＣおよび新鮮な単離単球を染色した。１０の独立した実験からの１つの代表的な例が示されている。図１３Ｂ．誘導されたＭＤＳＣを、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、２００ＩＵ／ｍＬ）、アルギナーゼ阻害剤（ａ－ＡＲＧ、アルギナーゼ阻害剤Ｎ（ω）－ヒドロキシ－ノル－Ｌ－アルギニン、５００μＭ）、ＲＯＳスカベンジャー（カタラーゼ、２００国際単位毎ミリリットル（ＩＵ／ｍＬ））、ＴＧＦ－βに対する遮断抗体（１０μ／ｍＬ）、ｉＮＯＳ阻害剤（ａｉＮＯＳ、ＮＧ－モノメチル－ｌ－アルギニン、５００マイクロモル（μＭ））を用いて一夜処理後、または未処理のまま、ＣＤ１５５で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。プールされた（ｎ＝４）データを平均±ＳＥＭとして示し、統計解析をスチューデントのｔ検定を用いて行った。図１３Ｃ．非刺激単球およびＭＤＳＣを全ＲＯＳについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１３Ｄ．非刺激またはＨ_２Ｏ_２（２５０μＭ）単球および非刺激ＭＤＳＣを全ＲＯＳ、ＣＤ１１２、およびＣＤ１５５について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＲＯＳおよびＣＤ１１２またはＣＤ１５５に対して二重陽性の細胞が示されている。６人のうちの代表的なドナー１名が示されている。個々の対照が条件間で類似していたので、簡略化のために、１つの代表的なアイソタイプ対照が、全ての群について示されている。

ＴＩＧＩＴの関与が、ｐＺＡＰ７０／ＳｙｋおよびｐＥＲＫ１／２を阻害し、ＮＫ細胞の細胞障害性の阻害をもたらすことを示す。健常な供血者由来の精製ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、ＴＩＧＩＴに対する遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）またはカタラーゼ（２００ＩＵ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と２：１の比率で共培養した。次いで、細胞を洗浄し、４時間休止させ、抗ＣＤ１６で１０分間および３０分間刺激し、ｐＺＡＰ／ＳｙｋまたはｐＥＲＫ１／２についてそれぞれ染色した。代表的（図１４Ａ）または累積的（図１４Ｂ）データが、３つの独立した実験から平均±ＳＥＭとして示されている。統計解析をスチューデントのｔ検定を用いて行った。図１４Ｃ．抗ＴＩＧＩＴまたはカタラーゼの存在下または非存在下での単球およびＭＤＳＣ共培養からのＮＫ細胞を洗浄し、^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２と４時間インキュベートして、ＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。３回の独立した実験からの代表的なデータが平均±ＳＥＭとして示されている。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）ＭＤＳＣによる普通型ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ依存性抑制を示す。図１５Ａ．ＭＤＳ患者および健常なドナー（ｎ＝６）からのＰＢＭＣ（ｎ＝１５）を一晩休止させ、染色し、ＭＤＳＣ頻度をフローサイトメトリーによって測定した。単球型ＭＤＳＣ（ｍＭＤＳＣ）をＣＤ４５^＋Ｌｉｎ^－ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＨＬＡ－ＤＲ^{－／ｌｏｗ}ＣＤ１４^＋として、顆粒球型ＭＤＳＣ（ｇＭＤＳＣ）をＣＤ４５^＋Ｌｉｎ^－ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ１５^＋として定義した。図１５Ｂ．ＭＤＳ－ＰＢＭＣをＣＤ１５５について染色し、ｍＭＤＳＣおよび単球をゲーティングした。代表的なヒストグラムが１５で示されている。図１５Ｃ．ＭＤＳ患者由来のＰＢＭＣ（ｎ＝１０）を一晩休止させ、フローサイトメトリーによりＴＩＧＩＴ発現について評価した。図１５Ｄ．健常なドナー（ＨＤ、ｎ＝６）またはＭＤＳ患者（ｎ＝１３）からのＰＢＭＣを、ＩｇＧ対照または抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＣＤ１６（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激し、ＮＫ細胞脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生について評価した。図１５Ｅ．健常な給血者由来の精製ＮＫ細胞（ｎ＝６）を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比で、自家単球またはＭＤＳ患者の血液から濃縮された同種異系ＭＤＳＣと共培養した。抗ＣＤ１６による６時間の刺激の後、脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生を、フローサイトメトリーによって普通型および適応型ＮＫ細胞で評価した。図１５Ｆ．健常な供血者由来の精製ＮＫ細胞（ｎ＝６）を、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、および抗ＴＩＧＩＴ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、ＭＤＳ患者の血液から濃縮された同種異系ＭＤＳＣと２：１の比率で５日間共培養した。染色の６時間前に、細胞を抗ＣＤ１６で刺激し、脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生を、フローサイトメトリーによって、普通型および適応型ＮＫ細胞において評価した。代表的なデータを平均±ＳＤとして示し、プールされたデータに対し、（図１５Ａ）、（図１５Ｃ）、（図１５Ｄ）ではスチューデントのｔ検定を用いて、（図１５Ｅ）および（図１５Ｆ）ではマンホイットニー検定を用いて、統計解析を行った。 同上。 同上。

図１６Ａはインビトロで誘導されたＭＤＳＣおよび新鮮な単離単球の代表的な表現型。図１６ＢはＮＫ細胞をＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で５日間培養し、代表的なヒストグラムは、普通型対適応型ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の発現を示している。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている。図１６ＣはＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比率で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と共に培養した。染色の６時間前に、細胞を抗ＣＤ１６で刺激し、細胞をフローサイトメトリーで分析した。代表的なヒストグラムが平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示されている。図１６Ｄは健常な給血者由来の精製ＮＫ細胞（ｎ＝６）を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比で、自家単球またはＭＤＳ患者の血液から濃縮された同種異系ＭＤＳＣと共培養した。抗ＣＤ１６による６時間の刺激の後、ＩＦＮ－γ産生を、フローサイトメトリーによって普通型および適応型ＮＫ細胞で評価した。代表的および累積的データが、８つの独立した実験から平均±ＳＥＭとして示されている。統計解析をスチューデントのｔ検定を用いて行った。

実施例７で使用されたゲーティング法を示す。図１７Ａ．健常な供血者における適応型および普通型ＮＫ細胞に対するゲーティング法。図１７Ｂ．ＭＤＳ患者における適応型および普通型ＮＫ細胞に対するゲーティング法。プロットに表された細胞パーセンテージは、全ＮＫ細胞の普通型および適応型ＮＫ細胞の頻度を表す。

ＮＫ細胞機能が抗ＴＩＧＩＴの存在下では影響を受けなかったことを示す。図１８Ａ．健常ドナーポリクローナル－ＮＫ（ｎ＝４）細胞の細胞傷害性を、抗ＴＩＧＩＴ（１０μｇ／ｍｌ）またはアゴニスト性抗ＣＤ１５８ｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ｐ８１５に対する^５１Ｃｒ放出アッセイ（４時間）によって分析した。累積データを平均±ＳＤとして示し、統計解析をマンホイットニー検定を用いてプールされたデータに対して行った。図１８Ｂ．ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５およびＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）またはＴＩＧＩＴに対する遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で単球またはＭＤＳＣと共に５日間培養するか、あるいは、細胞を抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＤＮＡＭ－１（１０μｇ／ｍｌ）で同時遮断した（ｎ＝６）。プールされたデータを、平均±ＳＥＭとして示し、統計解析のために１元ＡＮＯＶＡを使用した。図１８Ｃ．健常な給血者由来の精製ＮＫ細胞（ｎ＝６）を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２：１の比で、自家単球またはＭＤＳ患者の血液から濃縮された同種異系ＭＤＳＣと共培養した。抗ＣＤ１６による６時間の刺激の後、ＴＦＮ－α産生を、フローサイトメトリーによって普通型および適応型ＮＫ細胞で評価した。代表的データを平均±ＳＤとして示し、統計解析をマンホイットニー検定を用いてプールされたデータに対して行った。

成熟樹状細胞のＣＭＶペプチドのプールによるパルス化が、適応型ＮＫ細胞の増殖を誘導することを示す。健常なＣＭＶ血清陽性ドナーからの末梢血単核細胞から、ＮＫ細胞、未分画の単球、未成熟樹状細胞（ｉｍＤＣ）、および成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を単離した。次いで、ＮＫ細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５で培養するか、または示された自家細胞型および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と共培養した。選択した成熟樹状細胞培養物に、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプールまたはＨＩＶ ＰＴＥ Ｇａｇペプチドプールをさらに補充した。細胞を１２～１４日後に採取し、ＦＡＣＳを用いて、各培養条件での適応型ＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＣＤ５７^＋ＦｃεＲ１γ^－として定義される）の頻度（左パネル）および活発に増殖する適応型ＮＫ細胞のパーセンテージ（右パネル）を求めた。１つの実験からの５人のドナーの累積的データが示されている。

自家単球およびＩＬ－１５の存在下で培養した場合、ＣＭＶ血清陽性ドナーからのＮＫ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋表現型に偏っていることを示す。類別された健常なＣＭＶ血清陰性および血清陽性ドナー由来のＣＤ３／ＣＤ１９欠失末梢血単核細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５で培養した。７日後、細胞を採取し、ＦＡＣＳにより分析した。示されているのは、１人のＣＭＶ血清陽性ドナーおよび１人のＣＭＶ血清陰性ドナーからの培養の前後の両方における代表的な表現型である（上）。５人のＣＭＶ血清陰性ドナーおよび８人のＣＭＶ血清陽性ドナー由来の培養前および培養後のＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋ＮＫ細胞のパーセンテージを示す累積データが示されている（下）。データは、２つの独立した実験の代表例である。対応のあるスチューデントのｔ検定を用いて群内の統計的有意性を決定し、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて群（ＣＭＶ血清陽性およびＣＭＶ血清陰性）間の統計的有意性を決定した。＊ｐ≦０．０５，＊＊ｐ≦０．０１，＊＊＊ｐ≦０．００１。

適応型ＮＫ細胞がＴｒｅｇ媒介性抑制に抵抗性であることを示す。１２人のＣＭＶ血清陽性ドナー由来のCellTrace標識ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を、単独で培養するか、または示された比率でＴｒｅｇと６日間共培養した。図２１Ａ．ＦＡＣＳを用いて、普通型（ＣＤ５６^＋ＣＤ５７^＋ＦｃεＲγ^＋ＮＫＧ２Ｃ^－）および適応型（ＣＤ５６^＋ＣＤ５７^＋ＦｃεＲγ^－ＮＫＧ２Ｃ^＋）ＮＫ細胞サブセットの増殖を分析した。示されているのは、各培養条件においてCellTrace色素希釈を示したＮＫ細胞のパーセンテージである。図２１Ｂ．抗ＣＤ１６アゴニスト抗体、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８で刺激した後の培養ＮＫ細胞に関する脱顆粒（ＣＤ１０７ａ発現によって測定）およびＩＦＮ－γ産生をＦＡＣＳによって測定した。図２１Ｃ．ＦＡＣＳを用いて培養ＮＫ細胞のＰＤ１およびＴＩＭ－３の発現を測定した。結果は２つの独立した実験からのものである。ｐ値は対応のあるスチューデントのｔ検定から生成した。 同上。

本開示は、適応表現型を示すＮＫ細胞、適応型ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の単離集団；適応型ＮＫ細胞を含む組成物；適応型ＮＫ細胞、適応型ＮＫ細胞集団、または適応型ＮＫ細胞を含む組成物のインビトロおよび／またはインビボでの製造または産生方法；ならびに適応型ＮＫ細胞、適応型ＮＫ細胞集団、または適応型ＮＫ細胞を含む組成物の使用方法を与える。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ウイルス感染、癌、および／または腫瘍を治療するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造には、細胞または細胞集団の単離が含まれる。いくつかの実施形態において、製造には、細胞の分化および/または増殖が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」は、ＣＤ５６^＋およびＣＤ３^－の両方である細胞を指す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染および腫瘍に対する免疫において必須の役割を果たすサイトカイン産生細胞傷害性リンパ球である。本明細書で使用される場合、「普通型ＮＫ細胞」とも呼ばれる「標準ＮＫ細胞」は、ＳＹＫ^＋、ＥＡＴ－２^＋、ＦｃεＲγ^＋、ＰＬＺＦ^＋であるＮＫ細胞を指す。いくつかの実施形態において、普通型ＮＫ細胞はＮＫＧ２Ｃ^－である。いくつかの実施形態において、普通型ＮＫ細胞はＣＤ５７^－である。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫは、ＳＹＫ、ＥＡＴ－２、ＦｃεＲγ、およびＰＬＺＦのうちの１つ以上の発現低下または発現欠失を示すＮＫ細胞であり得る。

適応型ＮＫ細胞は、普通型ＮＫ細胞と比較して機能的に異なる能力を有する。これらの機能の差異は、適応型ＮＫ細胞が普通型ＮＫ細胞と比較して、さらなる抗腫瘍能または抗ウイルス能を与えることを可能にする。適応型ＮＫ細胞は、普通型ＮＫ細胞とは区別されるいくつかの特有のサブセットのうちの１つに属し得る。以下にさらに記載するように、適応型ＮＫ細胞は、例えば、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞上の最終分化のマーカーであるＣＤ５７を発現し得る；普通型ＮＫ細胞によって発現されるＰＬＺＦのレベルと比較して、転写因子前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）をコードする遺伝子の転写サイレンシングを示し得る；低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６によって誘発された場合に機能の増強を示し得る；ＳＹＫ、ＥＡＴ－２、およびＦｃεＲγをコードする１つ以上の遺伝子の転写サイレンシングを示し得る；ＮＫＧ２Ｃ^＋を発現し得る：ＣＤ４５ＲＯを発現し得る；ＣＤ４５ＲＡの発現低下または発現欠失を示し得る；長命であり得る；記憶細胞表現型を示し得る；普通型ＮＫ細胞と比較して抗腫瘍活性の増強を示し得る；かつ／または普通型ＮＫ細胞と比較して抗ウイルス活性の増強を示し得る。

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞および／または適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞であり得る。末梢血から単離されたＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５刺激の際に急速に増殖し、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８刺激に応答して高レベルのインターフェロン（ＩＦＮ）－γを産生し、高レベルの抑制性受容体ＮＫＧ２Ａを発現し、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６およびキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現を欠く。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、非常に低いレベルのパーフォリンおよびグランザイムを発現するので、細胞傷害性が限られている。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、全末梢血ＮＫ細胞のわずかな部分しか構成しないが、ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞に分化する場所と推定される二次リンパ組織において顕著に多く含まれている。

他の実施形態において、ＮＫ細胞および／または適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞であり得る。標準ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、非常に高レベルのパーフォリンおよびグランザイムを発現し、ウイルス感染細胞、新生細胞、および自家活性化免疫細胞に応答して容易に脱顆粒する、表現型が多様なＮＫ細胞のサブセットを表す。標準ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、ＣＤ１６発現レベルが高いため、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の強力なメディエーターであり、ＫＩＲを活性化することによって容易に刺激され得る。標準ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞による脱顆粒は、自己ＭＨＣクラスＩ分子を認識する教育抑制性ＫＩＲの発現によって促進される。したがって、標準ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、活性化されたリンパ球の細胞傷害性免疫調整および感染細胞または形質転換細胞の早期免疫監視を効率的に媒介することができる。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞と比較して、標準ＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８に応答してより少ないＩＦＮ－γを産生する。

ＣＭＶ血清陽性および再活性化
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、一般に生後間もなくに獲得され、永続的で生涯にわたる感染を確立するβヘルペスウイルスである。ＣＭＶ血清陽性率は米国成人の約５０％であり、健常人のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞によってよく制御されるため、感染症は通常無症候性である。ＣＭＶ血清陽性は、ヘテロ二量体活性化受容体ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞の割合の増加、および健常成人におけるＮＫＧ２Ｃ^ｈｉｇｈＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増加と関連する（Lopez-Verges et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(36):14725-14732）。ＣＭＶに曝露されていない個体はＣＭＶ「ナイーブ」である。

一次感染後、ＣＭＶは通常は根絶されないが、その宿主で生涯にわたる感染を確立する。ＣＭＶは、分散され、複数の末端器官で休眠状態になるが、後に、免疫抑制および炎症などを含む多くの様々な刺激によって再活性化され得る。

実施例１および図１に示されるように、ＣＭＶ再活性化は、強度軽減前治療（ＲＩＣ）および造血幹細胞移植（ＨＣＴ）（３０～４０％の再発率につながることが知られているレジメン）で治療された血液悪性腫瘍を有する患者における白血病再発の減少および無病生存率の改善と関連する。実施例１および図２は、特にＲＩＣを受けている患者において、インビボでのＣＭＶ再活性化と適応型ＮＫ細胞増殖との間の新規な関係を確証する。

適応型ＮＫ細胞
本明細書で使用される場合、「適応型ＮＫ細胞」は、単一の適応型ＮＫ細胞、複数の適応型ＮＫ細胞、および／または適応型ＮＫ細胞を含む単離細胞集団を含む。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞はＣＤ５７^＋である。平均して、成人由来のＣＤ５６^ｄｉｍＮＫ細胞の４０％がＣＤ５７を発現し、個人間の有意な差は、５％～７０％に亘る。パーフォリンを発現するＮＫ細胞の大部分はＣＤ５７^＋である。機能的には、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫ細胞は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５に応答してＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＮＫ細胞と比較して増殖が不十分であり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８による刺激に対して応答性が低い（Bjorkstrom et al., Blood.2010; 116(19):3853-3864）。しかし、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫ細胞は、より多くのＩＦＮ－γを産生し、ＣＤ１６により刺激した場合により強力な溶解活性を示す（Lopez-Verges et al., Blood.2010;116(19):3865-3874）。本明細書に記載されているように、ＣＤ５７は、活性化受容体を介した誘発に応答してロバストな細胞障害性および炎症性サイトカイン産生を示す最終分化標準ＮＫ細胞のマーカーであり得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞はＮＫＧ２Ｃ^＋である。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ４５ＲＡ^－、および／またはＴＩＧＩＴ^ｌｏｗである。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞はＴＩＧＩＴ^－である。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの２つ以上である。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は長命である。例えば、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５７^＋およびＮＫＧ２Ｃ^＋またはＣＤ５６^ｄｉｍおよびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗまたはＣＤ５６^ｄｉｍおよびＮＫＧ２Ｃ^＋であり得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの３つ以上である。例えば、適応型ＮＫ細胞は、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、およびＥＡＴ－２^－、またはＣＤ５６^ｄｉｍ、ＮＫＧ２Ｃ^＋、およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗであり得る。

いくつかの実施形態において、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）転写因子の発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において減少する。いくつかの実施形態において、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）転写因子の発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上減少している。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞はＰＬＺＦを発現しない。いくつかの実施形態において、マーカーまたはタンパク質を発現しないことは、ＦＡＣＳを用いて検出可能でないマーカーまたはタンパク質の発現レベルを有することとして定義されることが好ましく、マーカーもしくはタンパク質に対して陽性であること、またはマーカーもしくはタンパク質を発現することは、ＦＡＣＳを用いて検出可能であるマーカーまたはタンパク質の発現レベルを有することとして定義される。

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１の発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞で減少している。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１の発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上減少している。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１（抑制性受容体）のレベル低下は、適応型ＮＫ細胞が多くの腫瘍細胞が発現するＰＤＬ１に抵抗することを可能にする。

いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴの発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞で減少している。いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴの発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上減少している。

いくつかの実施形態において、ＰＬＺＦ、ＰＤ－１、およびＴＩＧＩＴの発現は、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞で減少している。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は抗腫瘍活性を有する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、造血組織および/またはリンパ組織の腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、細胞傷害性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、および／またはキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は抑制性受容体ＮＫＧ２Ａの発現を欠失している。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、高レベルのグランザイムおよび／またはパーフォリンを発現し、ウイルス感染細胞、新生細胞、および／または自家活性化免疫細胞に応答して脱顆粒する能力を示す。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は長命ＮＫ細胞であり、かつ／または記憶ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、長命ＮＫ細胞は、感染後２１日以上、３０日以上、６０日以上、８０日以上、または１００日以上持続する。これと比較して、標準ＮＫ細胞は、通常７～１４日未満のより低い持続性を示す。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、標準ＮＫ細胞と比較して抗腫瘍免疫活性が増強している。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、標準ＮＫ細胞と比較して、免疫応答のＭＤＳＣ誘導性抑制を克服する能力が強化されている。いくつかの実施形態において、ＭＤＳＣの存在下で、適応型ＮＫ細胞が、ＭＤＳＣの存在下の標準ＮＫと比較して増殖の増強を示すとき、適応型ＮＫ細胞は、ＭＤＳＣ誘導性抑制を克服する能力の強化を示す。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、標準ＮＫ細胞と比較して、免疫応答の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導性抑制を克服する能力が強化されている。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇの存在下で、適応型ＮＫ細胞が、Ｔｒｅｇの存在下でのＮＫ標準ＮＫと比較して、（例えば、ＣＤ１０７ａ発現によって測定される）脱顆粒および／またはＩＦＮ－γ産生の増強を示す場合、適応型ＮＫ細胞は、Ｔｒｅｇ誘発性抑制を克服する能力の強化を示す。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、単離細胞集団および／またはＮＫ細胞集団などを含む細胞集団に含まれ得る。いくつかの実施形態において、細胞集団が、１０％以上の適応型ＮＫ細胞、２０％以上の適応型ＮＫ細胞、３０％以上の適応型ＮＫ細胞、４０％以上の適応型ＮＫ細胞、５０％以上の適応型ＮＫ細胞、６０％以上の適応型ＮＫ細胞、７０％以上の適応型ＮＫ細胞、８０％以上の適応型ＮＫ細胞、９０％以上の適応型ＮＫ細胞、または９５％以上の適応型ＮＫ細胞を含む場合、細胞の集団は、適応型ＮＫ細胞について「富化されている」と考えられる。

適応型ＮＫ細胞のインビトロ製造
いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の産生および／または製造をインビトロで行う。インビトロでの製造には、細胞分化、増殖、濃縮、および/または単離が含まれ得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞を、対象からの血液サンプル、または血液サンプルから単離された細胞集団から製造し得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造および／または産生方法は、対象から血液サンプルを得ることと、血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養することとを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団を培養する前に、血液サンプルからのＮＫ細胞集団を単離する。いくつかの実施形態において、血液サンプルのＮＫ細胞集団を、培地中で培養すること；成熟樹状細胞、ＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞、もしくはその両方などを含む樹状細胞と培養すること；および／または単球と培養することができる。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ナイーブおよび／またはＣＭＶ血清陰性源から製造し得る。例えば、適応型ＮＫ細胞を、ＣＭＶ血清陰性ドナーの血液から単離した細胞から製造し得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞を、ＣＭＶ血清陽性源から製造し得る。例えば、適応型ＮＫ細胞を、ＣＭＶ血清陽性ドナーの血液から単離した細胞から、またはＣＭＶ血清陽性ドナーの血液から単離した細胞集団から製造し得る。いくつかの実施形態において、対象から血液サンプルを得ることを含む適応型ＮＫ細胞の製造および／または産生方法は、対象にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを投与することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から、胚性幹細胞から、臍帯血から単離された細胞から、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、造血性内皮から、造血幹細胞または前駆細胞から、ｉＰＳＣ由来の造血幹細胞から、分化転換による造血幹細胞から、標準ＮＫ細胞から、および／またはＮＫ細胞前駆体から製造し得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造および／または産生方法は、細胞または細胞集団、例えば、ＮＫ細胞集団を培地で培養することを含む。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、培地で培養された細胞に由来する。

いくつかの実施形態において、培地は、１種以上のサイトカインを含む。培地は、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、またはＩＦＮ－β、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、サイトカインは、例えば、Denman et al., PLOS One.2012 7(1):e.30264に記載されているように、膜結合型であり得る。いくつかの実施形態において、培地は、Ｎｏｔｃｈリガンドを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ラパマイシンを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、フィーダーを含まない。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ＣＤ１６シグナル伝達の活性化因子、例えば、抗ＣＤ１６抗体、Ｆｃ受容体のリガンド、ＣＤ１６のリガンド、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、および／または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を含む。

いくつかの実施形態において、培地は、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＴＩＧＩＴブロッカー、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＴＩＧＩＴリガンドブロッカー、および／またはＴＩＧＩＴリガンドアンタゴニストを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴ阻害剤は、ＴＩＧＩＴに対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴリガンドは、例えば、ＣＤ１５５またはＣＤ１１２を含み得る。いくつかの実施形態において、ブロッカーまたはアンタゴニストは、例えば、遮断抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、培地は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生の阻害剤、例えば、カタラーゼなどを含み得る。実施例７に示すように、ＴＩＧＩＴの遮断またはＲＯＳの阻害は、ＮＫ細胞の細胞障害性を活性化するシグナル伝達カスケードを増加させることができる。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造方法は、血液サンプルのＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤、ＰＬＺＦ阻害剤、および／またはＰＤ－１阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴ阻害剤は、ＴＩＧＩＴに対する抗体を含む。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造方法は、血液サンプルのＮＫ細胞または適応型ＮＫ細胞においてＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、および／またはＰＤ－１の発現を抑制することを含む。いくつかの実施形態において、発現を、ＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、および／またはＰＤ－１をコードする核酸の遺伝子ノックダウンによって抑制し得る。いくつかの実施形態において、発現を、ｓｉＲＮＡの使用によって抑制し得る。

いくつかの実施形態において、例えば、適応型ＮＫ細胞の製造および／または産生方法が、対象から血液サンプルを得ることと、血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養することとを含む場合、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して、特徴または機能が変化していることがある。例えば、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して増強した抗腫瘍免疫活性を有し得る。抗腫瘍免疫活性の増強は、細胞傷害性の増加、サイトカイン産生の増加、およびＴ調節（Ｔｒｅｇ）細胞に対する抵抗性の増加のうちの１つ以上などを含み得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して、細胞傷害性の増加；サイトカイン産生の増加；インビボおよび／またはインビトロでの持続性の増加；ならびにＴ調節細胞に対する抵抗性の増加のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して、ＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、および／またはＰＤ－１の発現が減少し得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して、免疫応答のＭＤＳＣ誘導性抑制を克服する能力が強化されていることがあり得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＳＣの存在下で、適応型ＮＫ細胞が、ＭＤＳＣの存在下の培養前のＮＫ細胞集団のＮＫ細胞と比較して増殖の増強を示すとき、適応型ＮＫ細胞は、ＭＤＳＣ誘導性抑制を克服する能力の強化を示す。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、培養前のＮＫ細胞集団と比較して、免疫応答の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導性抑制を克服する能力が強化されている。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇの存在下で、適応型ＮＫ細胞が、Ｔｒｅｇの存在下での培養前のＮＫ細胞集団のＮＫ細胞と比較して、（例えば、ＣＤ１０７ａ発現によって測定される）脱顆粒および／またはＩＦＮ－γ産生の増強を示す場合、適応型ＮＫ細胞は、Ｔｒｅｇ誘導性抑制を克服する能力の強化を示す。

いくつかの実施形態において、例えば、適応型ＮＫ細胞の製造または産生方法が、対象から血液サンプルを得ることと、血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養することとを含む場合、方法は細胞増殖を含み得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造または産生方法は、適応型ＮＫ細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞を、１つ以上の表面マーカーの発現または発現の欠如を用いて単離し得る。有用な表面マーカーとして、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ４５ＲＡを挙げ得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造または産生方法により、適応型ＮＫ細胞について富化されているＮＫ細胞集団が得られる。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団が、１０％以上の適応型ＮＫ細胞、２０％以上の適応型ＮＫ細胞、３０％以上の適応型ＮＫ細胞、４０％以上の適応型ＮＫ細胞、５０％以上の適応型ＮＫ細胞、６０％以上の適応型ＮＫ細胞、７０％以上の適応型ＮＫ細胞、８０％以上の適応型ＮＫ細胞、９０％以上の適応型ＮＫ細胞、または９５％以上の適応型ＮＫ細胞を含む場合、ＮＫ細胞集団は、適応型ＮＫ細胞について「富化されている」と考えられる。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団から適応型ＮＫ細胞を製造または産生する方法により、当該方法を実施した後のＮＫ細胞集団が、当該方法を実施する前に見られたＮＫ細胞の割合よりも高い割合の適応型ＮＫ細胞を含む場合に、適応型ＮＫ細胞について「富化されている」集団が得られる。いくつかの実施形態において、対象から血液サンプルを得ることと、血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養することとを含む適応型ＮＫ細胞を製造または産生する方法により、当該方法を実施した後のＮＫ細胞集団が、血液サンプルのＮＫ細胞集団で見られたＮＫ細胞の割合よりも高い割合の適応型ＮＫ細胞を含む場合に、適応型ＮＫ細胞について「富化されている」集団が得られる。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、フィーダー細胞と共培養した細胞に由来する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、フィーダーのない細胞培養培地で培養した細胞に由来する。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は付着細胞である。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は照射細胞である。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は間質細胞である。いくつかの実施形態において、間質細胞はＯＰ９細胞であり得る。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、適応型ＮＫ細胞を刺激および／または分化させるリガンド、例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド、例えばデルタ様１（ＤＬ－１）；膜結合型サイトカイン；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子（古典的または非古典的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡ－Ｅなど）；またはそれらの組み合わせを発現し得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、単球と共培養した細胞に由来する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造および／または産生方法は、細胞または細胞集団、例えば、ＮＫ細胞集団を単球と培養することを含む。いくつかの実施形態において、単球には、ＣＤ１４^＋単球、マクロファージ；樹状細胞、例えば成熟樹状細胞；抗原提示細胞；および／または別の骨髄系細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、単球は、抗原、例えば、ＣＭＶ由来の抗原などを提示し得る。いくつかの実施形態において、抗原はＣＭＶペプチドであることが好ましい。いくつかの実施形態において、培地は、抗原提示細胞および／または単球を刺激するサイトカイン、例えば、炎症性サイトカインもしくはＧＭ－ＣＳＦ、またはその両方を含み得る。いくつかの実施形態において、培地は、単球の成熟を誘導するサイトカイン、例えばＩＬ－１５などを含み得る。いくつかの実施形態において、単球は、自家単球であり得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、１つ以上の活性化受容体、例えば、限定されるものではないが、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ－１、および２Ｂ４のアゴニストを含んでなる培地で培養された細胞に由来する。いくつかの実施形態において、アゴニストは、１つ以上の活性化受容体を刺激する単一のモノクローナル抗体またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、アゴニストは受容体の天然リガンドであり得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、活性化受容体の刺激因子、例えばＮＫＧ２Ｃ受容体の天然リガンドであるＨＬＡ－Ｅと共に培養された細胞に由来する。いくつかの実施形態では、適応型ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞を得るための国際公開第２０１４／０３７４２２号に記載の培養方法に従って培養され得る。

実施例２に示すように、高用量ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いるＯＰ９デルタ様１（ＤＬ１）間質細胞系での臍帯血由来ＮＫ細胞のインビトロ培養は、ＣＤ５７を発現する最終分化細胞の分化および増殖を促進する。さらに、これらの培養条件は、臍帯血由来ＣＤ５６^＋ＳＹＫ^－ＰＬＺＦ^－適応型ＮＫ細胞の増殖を支持する。したがって、本明細書に記載の培養系を用いて、癌および／またはウイルス感染を有する対象への養子移入のための生体外でのＮＫ細胞の高度に機能的なサブセットの成熟および増殖を促進することができる。実施例１に示すように、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖は、ＨＣＴ強度の減少後の白血病再発の減少と関連し、最終ＮＫ細胞成熟および適応型ＮＫ細胞増殖がインビボでの抗腫瘍効果と関連するという考えを支持する。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴの発現をダウンレギュレートするため、またはＴＩＧＩＴを発現しないため、選択された細胞に由来する。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞を含む細胞集団は、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗおよび／またはＴＩＧＩＴ^－細胞についてさらに富化され得る。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、樹状細胞と共に培養した細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、樹状細胞は成熟樹状細胞であり得る。いくつかの実施形態において、樹状細胞をＣＭＶペプチドと共に培養し得る。いくつかの実施形態において、ＣＭＶペプチドには、複数のＣＭＶペプチドおよび／またはＣＭＶペプチドのプールが含まれ得る。例えば、実施例８に示すように、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞およびＣＤ１４^＋単球をＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞と共にインキュベートすることにより、適応型ＮＫ細胞の増殖を誘導することができる。

いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、単球と共に培養した細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、単球は、自家単球であり得る。いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５の存在下で単球と共に培養された細胞に由来し得る。例えば、実施例９に示すように、自家単球およびＩＬ－１５の存在下で培養した場合、ＣＭＶ血清陽性ドナーからのＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋表現型に偏っている。

適応型ＮＫ細胞のインビボでの製造
いくつかの実施形態において、適応型ＮＫ細胞の製造をインビボで行う。インビボで製造した適応型ＮＫ細胞を、それを製造した同じ対象において、または異なる対象において、例えば適応型ＮＫ細胞製剤の同種異系適用で使用し得る。いくつかの実施形態において、インビボで製造した適応型ＮＫ細胞を、対象から取り出し、その後対象に再投与し得る。

いくつかの実施形態において、製造には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチン、例えば弱毒化ＣＭＶワクチン、組換えＣＭＶワクチン、および／または不活性化ＣＭＶを対象に投与することが含まれ得る。いくつかの実施形態において、対象はワクチンおよび／または不活性化ＣＭＶの投与前にＣＭＶ血清陽性である。

いくつかの実施形態において、製造には、対象にサイトカイン、例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、サイトカインは膜結合型であり得る。いくつかの実施形態において、製造には、対象にＮｏｔｃｈリガンドを投与すること、および／または対象においてＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導することが含まれる。いくつかの実施形態において、製造には、ラパマイシンを投与することがさらに含まれる。

実施例１に示すように、ＣＭＶ血清陽性強度軽減前治療（ＲＩＣ）レシピエントは、骨髄機能廃絶（ＭＡ）前治療レシピエントと比較して、ウイルス再活性化時にやや高い絶対単球数（ＡＭＣ）を有した。さらに、ウイルス診断時のＡＭＣは、その後のＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞増殖と相関した。単球が適応型ＮＫ細胞の分化および増殖を促進する可能性のある１つの方法は、ＩＬ－１２の産生によるものである。単球由来樹状細胞によって産生されるＩＬ－１８ならびにＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β）などの他の炎症性サイトカインは、ＮＫ細胞機能を増強することができ、適応型ＮＫ細胞の分化または成熟に寄与し得る。いくつかの実施形態において、単球には、ＣＤ１４^＋単球、マクロファージ；樹状細胞、例えば成熟樹状細胞；抗原提示細胞；および／または別の骨髄系細胞が含まれる。

ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖はＣＭＶ感染または移植後の再活性化に関連するが、細胞はＣＭＶ抗原に対して厳密な特異性を有するようには見えない。実際、インビトロ実験は、他のＮＫ細胞サブセットと比較して、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞が、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞に応答して、ＴＮＦおよびＩＦＮ－γ産生の著しい上昇を示すことを実証した。ウイルス感染細胞と同様に、癌細胞は、ＨＬＡ－Ｅの発現を保持しながら、古典的クラスＩ ＨＬＡ分子をダウンレギュレートすることができる。主に阻害性ＮＫＧ２Ａから活性化ＮＫＧ２ＣへのＨＬＡ－Ｅ認識のための受容体の使用の切り替えは、適応型ＮＫ細胞が移植片対白血病効果を媒介するメカニズムであり得る。

造血細胞移植（ＨＣＴ）を受ける白血病患者では、ＣＭＶの再活性化は、ＮＫＧ２Ｃ^ｈｉｇｈＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖と関連している。これらの細胞は、移植後１年以上の間は高頻度で持続し、教育抑制性ＫＩＲの発現について富化され、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞による刺激に応答して高頻度でインターフェロン（ＩＦＮ）－γを産生した（Foley et al., Blood.2011;118(10):2784-2792; Foley et al., J Immunol.2012;189(10):5082-5088）。

投与
インビトロまたはインビボで製造した適応型ＮＫ細胞を、対象に単独で、または追加の活性剤および/または薬剤的に許容できる担体を含有する医薬組成物で投与し得る。適応型ＮＫ細胞を、所望の効果を生じさせるのに有効な量で、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与し得る。適応型ＮＫ細胞を、様々な経路により、例えば、静脈内、腫瘍内、動脈内、経皮的、カテーテルまたはステントによる局所送達により、腫瘍内投与用の針または他の装置により、皮下などにより投与し得る。適応型ＮＫ細胞を１回または複数回投与し得る。当該技術分野の通常の技術を有する医師は、適応型ＮＫ細胞、場合によっては、必要とされる医薬組成物の有効量および投与量を決定および処方することができる。

いくつかの実施形態において、組成物を対象に投与し得る。いくつかの実施形態において、組成物は、適応型ＮＫ細胞または適応型ＮＫ細胞を含む単離されたＮＫ細胞集団を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、反応性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害剤、例えば、カタラーゼ；ＣＤ１５５阻害剤；および／またはＴＩＧＩＴ阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＯＳ産生阻害剤および／またはＣＤ１５５阻害剤は、インビボおよび／またはインビトロでＭＤＳＣ上のＣＤ１５５の発現を低下させるのに十分な量で存在する。

治療方法
一態様において、適応型ＮＫ細胞を使用して、対象の癌、前癌状態、またはウイルスを治療または予防し得る。別の態様において、癌、前癌状態、またはウイルスを治療するために、癌、前癌状態、またはウイルスに罹患している対象において適応型ＮＫ細胞をインビボで製造し得る。

いくつかの実施形態において、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、対象において、例えば、対象の血液中に見られ得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＳＣのレベルは、癌、前癌状態、またはウイルスのない対象におけるＭＤＳＣのレベルと比較して上昇し得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３を発現し、ＨＬＡ－ＤＲは低いかまたは全く発現しない。いくつかの実施形態において、ＭＤＳＣは、ＣＤ１４＋（単球性ＭＤＳＣ［ｍＭＤＳＣ］）またはＣＤ１５＋ＣＤ６６ｂ＋（顆粒球性ＭＤＳＣ［ｇＭＤＳＣ］）のいずれかである（Marvel et al.The Journal of Clinical Investigation.2015;125(9):3356-64参照）。

癌には、例えば、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊髄癌、胃癌、子宮癌、造血器癌、および／またはリンパ系癌が含まれ得る。造血器癌および/またはリンパ系癌には、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキン病、および／または多発性骨髄腫が含まれ得る。癌は転移性癌であり得る。

ウイルスには、例えば、ヘルペスウイルス、例えばＣＭＶ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）もしくはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；またはレンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が含まれ得る。

他の態様において、適応型ＮＫ細胞を対象に投与して、または対象において製造して、対象における腫瘍の増殖を阻害し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍を含み得る。

適応型ＮＫ細胞を、他の処置の前、最中、および／または後に、対象に投与または対象において製造し得る。このような併用療法は、治療剤、抗癌剤、および／または抗ウイルス剤の使用前、使用中、および／または使用後の適応型ＮＫ細胞の投与または製造を含み得る。他の治療剤、抗癌剤、および抗ウイルス剤には、例えば、サイトカイン；ケモカイン；治療用抗体、例えば、高親和性抗ＣＭＶ ＩｇＧ抗体；ＮＫ細胞受容体リガンド、例えばＢｉＫＥもしくはＴＲｉＫＥ；アジュバント；抗酸化剤；化学療法剤；および／または放射線が含まれ得る。投与または製造は、他の抗癌剤および／または抗ウイルス剤の投与から数時間、数日、または数週間、時間的に分離され得る。追加的に、または代替的に、投与または製造を、他の生物学的に活性な薬剤または様式、例えば、限定されるものではないが、抗悪性腫瘍剤、および非薬物療法、例えば、限定されるものではないが、手術と組み合わせ得る。

いくつかの実施形態において、本開示は、抗腫瘍免疫応答を増強するための方法を与える。いくつかの実施形態において、方法は、適応型ＮＫ細胞または適応型ＮＫ細胞を含む単離細胞集団の使用を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、抑制性受容体、例えば、ＴＩＧＩＴまたはＰＤ－１の制御を改変することをさらに含み得る。

他の態様において、本開示は、普通型ＮＫ細胞を調節する方法を与える。いくつかの実施形態において、方法は、普通型ＮＫ細胞の機能的低反応性を救済または逆転させるためのＭＤＳＣの抑制能力の遮断を含む。いくつかの実施形態において、調節方法は、ＴＩＧＩＴ発現の阻害を含む。いくつかの実施形態において、方法は、反応性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害剤、例えば、カタラーゼ；ＣＤ１５５阻害剤；および／またはＴＩＧＩＴ阻害剤を含有する組成物の投与を含み得る。

いくつかの実施形態において、ＲＯＳ産生阻害剤および／またはＣＤ１５５阻害剤は、ＭＤＳＣ上のＣＤ１５５の発現を低下させるのに十分な量で存在する。
例示的な実施形態

実施形態１．適応型ＮＫ細胞を含んでなる組成物。

実施形態２．前記適応型ＮＫ細胞がＣＤ３^－およびＣＤ５６^＋である、実施形態１に記載の組成物。

実施形態３．前記適応型ＮＫ細胞がＣＤ５７^＋である、実施形態１または２のいずれかに記載の組成物。

実施形態４．前記適応型ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ^＋である、実施形態１～３のいずれかに記載の組成物。

実施形態５．前記適応型ＮＫ細胞がＳＹＫ^－である、実施形態１～４のいずれかに記載の組成物。

実施形態６．前記適応型ＮＫ細胞がＦｃεＲγ^－である、実施形態１～５のいずれかに記載の組成物。

実施形態７．前記適応型ＮＫ細胞がＥＡＴ－２^－である、実施形態１～６のいずれかに記載の組成物。

実施形態８．前記適応型ＮＫ細胞がＣＤ５６^ｄｉｍである、実施形態１～７のいずれかに記載の組成物。

実施形態９．前記適応型ＮＫ細胞がＴＩＧＩＴ^ｌｏｗである、実施形態１～８のいずれかに記載の組成物。

実施形態１０．前記適応型ＮＫ細胞がＣＤ４５ＲＯ^＋である、実施形態１～９のいずれかに記載の組成物。

実施形態１１．前記適応型ＮＫ細胞がＣＤ４５ＲＡ^－である、実施形態１～１０のいずれかに記載の組成物。

実施形態１２．前記適応型ＮＫ細胞が長命である、実施形態１～１１のいずれかに記載の組成物。

実施形態１３．ＰＤ－１の発現または前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）転写因子の発現が、標準ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において減少する、実施形態１～１２のいずれかに記載の組成物。

実施形態１４．ＰＬＺＦの発現が９０％以上減少する、実施形態１３に記載の組成物。

実施形態１５．前記適応型ＮＫ細胞が、転写因子前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）を発現しない、実施形態１～１４のいずれかに記載の組成物。

実施形態１６．前記適応型ＮＫ細胞が抗腫瘍活性を示す、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

実施形態１７．腫瘍が、造血組織および／またはリンパ組織の腫瘍を含んでなる、実施形態１６に記載の組成物。

実施形態１８．腫瘍が固形腫瘍である、実施形態１６に記載の組成物。

実施形態１９．前記組成物が薬剤的に許容できる担体を含んでなる、実施形態１～１８のいずれかに記載の組成物。

実施形態２０．実施形態１～１８のいずれかに記載の適応型ＮＫ細胞を製造する方法。

実施形態２１．前記適応型ＮＫ細胞をインビトロで製造する、実施形態２０に記載の方法。

実施形態２２．前記適応型ＮＫ細胞が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ナイーブ源由来の細胞に由来する、実施形態２０または２１のいずれかに記載の方法。

実施形態２３．前記適応型ＮＫ細胞が、血液から単離された細胞に由来する、実施形態２０～２２のいずれかに記載の方法。

実施形態２４．前記適応型ＮＫ細胞が、多能性幹細胞に由来する、実施形態２０～２３のいずれかに記載の方法。

実施形態２５．前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、実施形態２４に記載の方法。

実施形態２６．前記適応型ＮＫ細胞が、胚性幹細胞に由来する、実施形態２０～２５のいずれかに記載の方法。

実施形態２７．前記適応型ＮＫ細胞が、臍帯血から単離された細胞に由来する、実施形態２０～２６のいずれかに記載の方法。

実施形態２８．前記適応型ＮＫ細胞が、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、またはＩＦＮ－βのうちの１つ以上を含んでなる培地で培養された細胞に由来する、実施形態２０～２７のいずれかに記載の方法。

実施形態２９．前記適応型ＮＫ細胞が、ラパマイシンを含んでなる培地で培養された細胞に由来する、実施形態２０～２８のいずれかに記載の方法。

実施形態３０．前記適応型ＮＫ細胞が、Ｎｏｔｃｈリガンドを含んでなる培地で培養された細胞に由来する、実施形態２０～２９のいずれかに記載の方法。

実施形態３１．前記適応型ＮＫ細胞が、ＮＫＧ２Ｃ受容体アゴニストを含んでなる培地で培養された細胞に由来する、実施形態２０～３０のいずれかに記載の方法。

実施形態３２．前記適応型ＮＫ細胞が、抗原提示細胞と共培養された細胞に由来する、実施形態２０～３１のいずれかに記載の方法。

実施形態３３．前記抗原提示細胞が樹状細胞を含んでなる、実施形態３２に記載の方法。

実施形態３４．前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＭＶペプチドを含んでなる培地で培養された細胞、または抗原提示細胞と共培養された細胞に由来し、前記抗原提示細胞が、ＣＭＶペプチドを含む培地で培養される、実施形態２０～３３のいずれかに記載の方法。

実施形態３５．前記適応型ＮＫ細胞をインビボで製造する、実施形態２０に記載の方法。

実施形態３６．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを対象に投与することを含んでなる、実施形態３５に記載の方法。

実施形態３７．不活性化サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を対象に投与することを含んでなる、実施形態３５または実施形態３６のいずれかに記載の方法。

実施形態３８．サイトカインを対象に投与することを含んでなる、実施形態３５～３７のいずれかに記載の方法。

実施形態３９．前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含んでなる、実施形態３８に記載の方法。

実施形態４０．Ｎｏｔｃｈリガンドを対象に投与することを含んでなる、実施形態３５～３９のいずれかに記載の方法。

実施形態４１．対象においてＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導することを含んでなる、実施形態３５～４０のいずれかに記載の方法。

実施形態４２．前記対象がＣＭＶ血清陽性である、実施形態３５～４１のいずれかに記載の方法。

実施形態４３．対象における癌、前癌状態、またはウイルスを治療または予防するための方法であって、
実施形態１～１８のいずれかに記載の適応型ＮＫ細胞を前記対象に投与すること、
を含んでなる前記方法。

実施形態４４．前記癌が、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊髄癌、胃癌、子宮癌、造血器癌、またはリンパ系癌を含んでなる、実施形態４３に記載の方法。

実施形態４５．前記癌が転移性癌である、実施形態４３または４４のいずれかに記載の方法。

実施形態４６．対象における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、実施形態１～１８のいずれかに記載の適応型ＮＫ細胞を含んでなる組成物を前記対象に投与することを含んでなる、前記方法。

実施形態４７．前記腫瘍が固形腫瘍を含んでなる、実施形態４６に記載の方法。

実施形態４８．前記ウイルスがレンチウイルスまたはヘルペスウイルスを含んでなる、実施形態４３に記載の方法。

実施形態４９．対象における癌または前癌状態を治療または予防するための方法であって、実施形態３５～４２のいずれかに記載のインビボ調製物を前記対象に投与することを含んでなる、前記方法。

実施形態５０．前記癌が、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊髄癌、胃癌、子宮癌、造血器癌、またはリンパ系癌を含んでなる、実施形態４９に記載の方法。

実施形態５１．前記癌が転移性癌である、実施形態４９または５０のいずれかに記載の方法。

実施形態５２．対象における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、実施形態３５～４２のインビボでの製造を含んでなる、前記方法。

実施形態５３．前記腫瘍が固形腫瘍を含んでなる、実施形態５２に記載の方法。

実施形態５４．治療剤を含んでなる組成物を投与することをさらに含んでなる、実施形態４３～５３のいずれかに記載の方法。

実施形態５５．前記治療剤が、サイトカイン、ケモカイン、治療用抗体、アジュバント、抗酸化剤、または化学療法剤のうちの１つ以上を含んでなる、実施形態５４に記載の方法。

実施形態５６．前記対象が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含んでなる、実施形態４３～５５のいずれかに記載の方法。

実施形態５７．前記対象が造血細胞移植を受けている、実施形態４３～５６のいずれかに記載の方法。

実施形態５８．対象における癌、前癌状態、またはウイルスを治療または予防するための方法であって、前記対象において適応型ＮＫ細胞を製造することを含んでなる、前記方法。

実施形態５９．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを対象に投与することを含んでなる、実施形態５８に記載の方法。

実施形態６０．不活性化サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を対象に投与することを含んでなる、実施形態５８または実施形態５９のいずれかに記載の方法。

実施形態６１．サイトカインを対象に投与することを含んでなる、実施形態５８～６０のいずれかに記載の方法。

実施形態６２．前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含んでなる、実施形態６１に記載の方法。

実施形態６３．Ｎｏｔｃｈリガンドを対象に投与することを含んでなる、実施形態５８～６２のいずれかに記載の方法。

実施形態６４．対象においてＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導することを含んでなる、実施形態５８～６３のいずれかに記載の方法。

実施形態６５．前記対象がＣＭＶ血清陽性である、実施形態５８～６４のいずれかに記載の方法。

実施形態６６．前記対象が造血細胞移植を受けている、実施形態５８～６５のいずれかに記載の方法。

実施形態６７．前記対象が白血病と診断されている、実施形態５８～６６のいずれかに記載の方法。

実施形態６８．前記対象が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含んでなる、実施形態５８～６７のいずれかに記載の方法。

実施形態６９．
（ａ）対象から血液サンプルを得ることと、
（ｂ）ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＮｏｔｃｈリガンドのうちの１つ以上を含んでなる培地中で血液サンプルのＮＫ細胞集団を培養して適応型ＮＫ細胞を得ることと、
を含んでなる方法であって、
前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍであり、ＮＫＧ２Ｃ^＋およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、前記方法。

実施形態７０．ステップ（ｂ）の前記培地が、ラパマイシンおよびＣＤ１６シグナル伝達の活性化因子のうちの１つ以上をさらに含んでなる、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７１．
（ａ）対象から血液サンプルを得ることと、
（ｂ）前記血液サンプルのＮＫ細胞集団をＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞と共に培養して適応型ＮＫ細胞を得ることと、
を含んでなる方法であって、
前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍであり、ＮＫＧ２Ｃ^＋およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、前記方法。

実施形態７２．
（ａ）対象から血液サンプルを得ることであって、前記対象がＣＭＶ血清陽性であることと、
（ｂ）前記血液サンプルのＮＫ細胞集団を自家単球およびＩＬ－１５と共に培養して適応型ＮＫ細胞を得ることと、
を含んでなる方法であって、
前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍであり、ＮＫＧ２Ｃ^＋およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、前記方法。

実施形態７３．ステップ（ｂ）が、前記血液サンプルの前記ＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤と接触させることをさらに含んでなる、実施形態６９～７２のいずれかに記載の方法。

実施形態７４．前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、ＴＩＧＩＴに対する抗体を含んでなる、実施形態７３に記載の方法。

実施形態７５．ステップ（ｂ）が、前記血液サンプルの前記ＮＫ細胞をＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、またはＰＤ－１のうちの１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含んでなる、実施形態６９～７４のいずれかに記載の方法。

実施形態７６．前記血液サンプルの前記ＮＫ細胞もしくは前記適応型ＮＫ細胞またはその両方においてＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、またはＰＤ－１のうちの１つ以上を遺伝子ノックダウンすることをさらに含んでなる、実施形態６９～７５のいずれかに記載の方法。

実施形態７７．前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５７^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの１つ以上である、実施形態６９～７６のいずれかに記載の方法。

実施形態７８．前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞集団と比較してＰＬＺＦの発現の減少を示す、実施形態６９～７７のいずれかに記載の方法。

実施形態７９．前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞集団と比較して抗腫瘍免疫活性の増強を示す、実施形態６９～７８のいずれかに記載の方法。

実施形態８０．前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞集団と比較して、細胞傷害性の増加、サイトカイン産生の増加、持続性の増加、およびＴ調節細胞に対する抵抗性の増加のうちの１つ以上を示す、実施形態６９～７９のいずれかに記載の方法。

実施形態８１．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを前記対象に投与することをさらに含んでなる、実施形態６９～８０のいずれかに記載の方法。

実施形態８２．前記ＮＫ細胞集団を培養することが、細胞増殖もしくは細胞表現型スキューイングまたはそれらの両方を含んでなる、実施形態６９～８１のいずれかに記載の方法。

実施形態８３．
（ｃ）適応型ＮＫ細胞を単離すること
をさらに含んでなる、実施形態６９～８２のいずれかに記載の方法。

実施形態８４．実施形態６９～８３のいずれかに記載の方法によって得られた適応型ＮＫ細胞を含んでなる組成物。

実施形態８５．ＮＫ細胞集団を含んでなる組成物であって、前記ＮＫ細胞集団が、実施形態６９～８３のいずれかに記載の方法によって得られる適応型ＮＫ細胞について富化されている、前記組成物。

実施形態８６．単離されたＮＫ細胞集団であって、前記細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ならびにＮＫＧ２Ｃ^＋、ＣＤ５７^＋、およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、前記単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態８７．前記細胞が、標準ＮＫ細胞と比較して、ＰＬＺＦおよびＰＤ－１のうちの１つ以上の発現の減少を示す、実施形態８６に記載の単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態８８．ＣＤ５６^ｄｉｍおよびＮＫＧ２Ｃ^＋であるＮＫ細胞について富化されている、単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態８９．前記単離された集団が、標準ＮＫ細胞と比較してＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ－１のうちの１つ以上の発現の減少を示すＮＫ細胞について富化されている、実施形態８８に記載の単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態９０．前記ＮＫ細胞集団が、標準ＮＫ細胞と比較して抗腫瘍免疫活性の増強を示す、実施形態８６～８９のいずれかに記載の単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態９１．前記ＮＫ細胞集団が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が誘発する免疫応答の抑制を克服することができる、実施形態８６～９０のいずれかに記載の単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態９２．前記ＮＫ細胞集団が、Ｔｒｅｇが誘発する免疫応答の抑制を克服することができる、実施形態８６～９１のいずれかに記載の単離されたＮＫ細胞集団。

実施形態９３．実施形態８６～９２のいずれかに記載の単離されたＮＫ細胞集団を含んでなる組成物。

実施形態９４．ＣＤ１５５阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、および反応性酸素種（ＲＯＳ）産生阻害剤のうちの１つ以上をさらに含んでなる、実施形態９３に記載の組成物。

実施形態９５．前記ＲＯＳ産生阻害剤がカタラーゼを含んでなる、実施形態９４に記載の組成物。

実施形態９６．前記ＲＯＳ産生阻害剤またはＣＤ１５５阻害剤が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上のＣＤ１５５の発現を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態９４または９５のいずれかに記載の組成物。

本発明を以下の実施例により説明する。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に記載された本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。

実施例１
ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖は、強度軽減ＨＣＴ後の白血病再発の減少と関連する。
前書き
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、造血細胞移植（ＨＣＴ）後に早期に再構成し、ＨＣＴ後の転帰に影響を及ぼす可能性がある主要リンパ球集団である。しかし、ＮＫ細胞の移植片対白血病（ＧｖＬ）活性は、ＨＣＴ後の最初の１年を通してＮＫ細胞の機能的成熟が遅延されることによって制限される。再構成ドナーＮＫ細胞の未成熟表現型は、生体外での腫瘍細胞株および原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球に応答したＮＫ細胞媒介性細胞障害性およびインターフェロン（ＩＦＮ）－γ産生における有意な障害に関連する。全体的に見て、ＨＣＴ後早期に再構成するドナーＮＫ細胞の表現型および機能の未熟性は、それらの臨床的有用性を制限する。

高レベルの活性化受容体ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞は、ＣＭＶ再活性化後のＨＣＴレシピエントにおいてロバストに増殖し、成熟マーカーＣＤ５７を優先的に獲得し、ＨＣＴ後１年間以上の間持続する。多くの点で、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、ネズミＣＭＶ（ＭＣＭＶ）感染の消失に関与するＬｙ４９Ｈ^＋記憶ＮＫ細胞のヒトアナログを表すようである。したがって、ＣＭＶ再活性化は、ＨＣＴレシピエントにおいて強力な効果を有し、高められたエフェクター機能を有するＮＫ細胞の成熟を促進する。ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、本明細書において適応型と称される。

いくつかの最近の研究では、ＣＭＶの再活性化とＨＣＴ後の再発リスクの低下との関連性が報告されているが、この知見に関する特異的メカニズムは記載されていない。ＣＭＶ誘導性ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、向上した機能と長期間の持続性を有し、移植レシピエントにおいて癌制圧を促進し得る。本研究では、ＣＭＶ再活性化が再発に及ぼす防止効果に影響を与える関連する移植関連変数を定義することと、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞がＨＣＴ後の臨床転帰と直接関連するかどうかを決定することとを試みた。

患者および方法
移植手順
骨髄機能廃絶（ＭＡ）前治療は、悪性血液疾患の患者３６６人に使用され、シクロホスファミド（６０ｍｇ／ｋｇ×２）および全身照射（１３．２Ｇｙ、１６５ｃＧｙ、１日２回×４日）からなった。一部の患者では、このレジメンは、フルダラビン（－８日目～－６日目に２５ｍｇ／ｍ^２／日）、およびミコフェノール酸モフェチル（－３日目～＋３０日目に１２時間ごとに１ｇ）も含んだ。全ての患者はまた、－３日目に開始し、ＨＣＴ後１８０日まで継続してシクロスポリンＡも受けた。強度軽減前治療（ＲＩＣ）は、３０８人の患者に使用され、シクロホスファミド（５０ｍｇ／ｋｇ）およびフルダラビン（２００ｍｇ／ｍ^２）および全身照射（２Ｇｙ）からなった。前治療後、骨髄、末梢血、または臍帯血由来の幹細胞（単一または二重）を注入した。表Ｉは、レシピエントＣＭＶ状態（血清陰性、再活性化を伴わない血清陽性、および再活性化を伴う血清陽性）によって層別化されたＨＣＴ患者の人口統計を記載する。

＊治療間の比較のためのｐ値。連続変数は、一般化ウィルコクソン検定によって分析した。分類変数は、カイ二乗によって分析した。

ＣＭＶスクリーニングおよび治療
前治療の前に、全てのレシピエントを、酵素結合免疫吸着法を用いる血清学的検査によってＣＭＶ曝露について評価した。ＣＭＶ ＩｇＧ抗体レベルが１０．０ ＥＬＩＳＡ単位毎ミリリットル（ＥＵ／ｍＬ）より大きい（＞）ことは血清陽性とみなした。移植後、全てのレシピエントは、移植後＋１００日まで、ｐｐ６５抗原血症（２００６年以前）または定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（２００６年以降）のいずれかにより、毎週ＣＭＶ再活性化についてのスクリーニングを受けた。ＣＭＶ予防は、１００日までの高用量のアシクロビル（静脈内へ８時間ごとに５００ｍｇ／ｍ^２［１０～１２ｍｇ／ｋｇ］、または経口で１日５回の８００ｍｇ［１８ｍｇ／ｋｇ小児］）を含んだ。ＣＭＶ再活性化は、ＣＭＶ抗原血症（≧２ ｐｐ６５陽性細胞／５０，０００）、ＤＮＡｅｍｉａ（定量的リアルタイムＰＣＲによる≧５００コピー）、または血液、体液、または組織からのＣＭＶの培養として定義され、ガンシクロビルまたはフォスカーネットで治療された。

データ収集
ミネソタ大学の血液および骨髄移植プログラムでは、患者の特性および転帰に関する全てのデータが前向きに収集された。ミネソタ大学の施設審査委員会は全てのプロトコルを承認し、全ての患者（および/またはその法定後見人）はヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを提供した。

ＨＣＴレシピエントにおけるＮＫ細胞の再構成の表現型解析
ＨＣＴレシピエント由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を末梢血サンプルから密度勾配遠心分離によって単離し、ＬＳＲ ＩＩ（カリフォルニア州サンノゼのBD Biosciences）を用いて蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により分析した。ＣＭＶを再活性化したレシピエント由来のＰＢＭＣを、ウイルス診断時、抗ウイルス療法の２週間後、４週間後、および８週間後、ならびに移植後６ヶ月および１年に収集した。ＣＭＶ血清陰性であるか、またはウイルス再活性化を伴わないＣＭＶ血清陽性であったレシピエントでは、移植後１００日目、６ヶ月目、および１年目にＰＢＭＣを収集した。表現型分析のために、以下の蛍光コンジュゲート抗体を使用した：エネルギー結合色素（Energy Coupled Dye）（ＥＣＤ）－コンジュゲート抗ＣＤ３（カリフォルニア州ブレアのBeckman Coulter, Inc.；ＩＭ２７０５Ｕ）、ＰＥＣｙ７結合コンジュゲート抗ＣＤ５６（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３１８３１８）、パシフィックブルー（Pacific Blue）コンジュゲート抗ＣＤ５７（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３２２３１６）、およびＰＥコンジュゲートＮＫＧ２Ｃ（ミネソタ州ミネアポリスのR&D Systems；ＦＡＢ１３８Ｐ－０２５）。ＲＩＣレシピエントとＭＡレシピエントの間の適応型ＮＫ細胞のパーセンテージおよび絶対計数の統計的比較のために、GraphPadを用いて計算した対応のない両側ｔ検定を用いた。エラーバーはＳＥＭを表す。GraphPadを使用して、２８人のＣＭＶ血清陽性レシピエントにおける絶対単球数およびリンパ球数と適応型ＮＫ細胞増殖との間の相関に関するＲ^２値および関連するｐ値を算出した。

ＨＣＴコホートにおける臨床的関連性の統計分析
カプラン－マイヤー曲線を用いて、ＨＣＴ後１年間の無病生存（ＤＦＳ）の確率を推定し（Kaplan et al.J. Am. Stat.Assoc.1958; 53:457-481.）、比較のためにログランク検定を用いた。調整した生存曲線を、層別コックスモデルに基づいて計算した（Chang et al.J. Chronic Dis.1982; 35:669-674）。コックス回帰を用いて因子のＤＦＳに対する独立した効果を調べ、比例ハザードをマルチンゲール残差を用いて調べた。再発の累積発生率を、非再発死亡率（ＮＲＭ）を競合リスクとして扱って評価した。ファインアンドグレイ比例ハザードモデル（The Fine and Gray proportional hazards model）（Fine et al.J. Am. Stat.Assoc.1999; 94:496-509）を使用して、再発に対するＣＭＶ再活性化の独立した効果を求め、調整再発曲線を算出した。対象の主要な共変量は、時間依存性共変量として扱ったＨＣＴ後のＣＭＶ再活性化、および前治療レジメンの強度であった。潜在的交絡因子には、ドナータイプ、診断、移植年（＜２００８年対≧２００８年）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）予防、性別、疾患リスク、および以前の自家移植が含まれた。ＨＣＴ時の疾患リスクを、ＡＳＢＭＴ ＲＦＩ ２００６リスクスコアリングスキーマ（ASBMT RFI 2006 risk scoring schema）（asbmt.orgでワールドワイドウェブで入手可能）に基づいて標準リスクまたは高リスクに分類した。分散は、比較しているグループ間で類似していた。再帰的分割を用いて、再発と関連する適応型ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞のパーセンテージおよび絶対数の最適カットポイントを決定した。全ての臨床分析は、ＳＡＳバージョン９．３（ノースカロライナ州ケーリーのSAS Institute）を使用して実施した。

ＮＫ細胞機能アッセイ
５人の健常なＣＭＶ血清陽性ドナーから収集したバフィーコートをMemorial Blood Bank（ミネソタ州ミネアポリス）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll-Paque（イギリスのバッキンガムシャーのリトル・チャルフォントのGE Healthcare）を用いて密度勾配遠心分離によって単離し、１０％ウシ胎児血清（マサチューセッツ州ウォルサムのGibco, LifeTechnologies, Thermo Fisher Scientific Inc.）を補充したＲＰＭＩ培地で５時間２：１（エフェクター：標的）比でＫ５６２細胞と共に培養した。GolgiStopおよびGolgiPlugタンパク質輸送阻害剤（カリフォルニア州サンノゼのBD Biosciences）をアッセイに１時間加えた。ＮＫ細胞サブセットの機能解析には以下の抗体を使用した：ＢＶ７８５コンジュゲート抗ＣＤ３（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３１８３１８）、ＰＥＣｙ７コンジュゲート抗ＣＤ５６（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３５９６２０）、ＰＥ－ＣＦ５９４コンジュゲート抗ＣＤ５７（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３５９６２０）、ＰＥコンジュゲートＮＫＧ２Ｃ（ミネソタ州ミネアポリスのR&D Systems；ＦＡＢ１３８Ｐ－０２５）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；３２８６１６）、およびＢＶ６０５コンジュゲートＩＦＮ－γ（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend；５０２５３６）。Ｋ５６２細胞株は、ATCC（バージニア州マナサス）から購入し、マイコプラズマ汚染について毎月スクリーニングした。実験は２回独立して行った。有意性を判定するために、GraphPadで両側の対応のあるｔ検定を使用した。エラーバーはＳＥＭを表す。

結果
ＣＭＶを再活性化するＲＩＣレシピエントでＨＣＴ後の再発リスクが低い。
２００１年から２０１３年の間にミネソタ大学で治療された急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（ｎ＝３１３）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（ｎ＝１８７）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（ｎ＝８５）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（ｎ＝４２）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（ｎ＝２８）、ホジキン病（ｎ＝１４）、および多発性骨髄腫（ｎ＝５）を有する６７４人の同種異系ＨＣＴレシピエントで１年の再発リスクおよびＤＦＳを分析した。５１６人の患者が標準リスクとして分類され、１４８人の患者が高リスクとして分類され、３６人の患者が以前の自家移植を受けていた。３７人の患者が骨髄を受け、１６６人の患者が末梢血幹細胞を受け、４７１人の患者が臍帯血移植を受けた。コホート全体を、レシピエントＣＭＶ血清状態（ＣＭＶ血清陰性［ｎ＝２７０］対再活性化を伴わないＣＭＶ血清陽性[ｎ＝２１４］対再活性化を伴うＣＭＶ血清陽性[ｎ＝１９０］）によって、および前治療レジメン（強度軽減[ｎ＝３０８］対骨髄機能廃絶［ｎ＝３６６］）によって層別化した。疾患タイプおよび治療関連変数は、ＣＭＶ血清状態によって層別化された群間でバランスがとれていた（表Ｉ）。

ＲＩＣ後（ｎ＝３０８）、ＣＭＶ再活性化は、再活性化を伴わないＣＭＶ血清陽性レシピエント（３０％［２０～４０％］）またはＣＭＶ血清陰性レシピエント（３５％［２７～４３％］）と比較して、ＨＣＴ後１年の再発リスクの低下（２６％［１７～３５％］、ｐ＝０．０５）と関連していた（図１Ａ）。同様に、ＲＩＣ移植では、ＣＭＶ再活性化は、再活性化を伴わないＣＭＶ血清陽性レシピエント（４５％［３５～５５％］）またはＣＭＶ血清陰性レシピエント（４６％［３８～５４％］）と比較して、ＤＦＳの改善（５５％［４５～６５％］、ｐ＝０．０４）と関連していた（図１Ｂ）。骨髄機能廃絶前治療後（ｎ＝３６６）、ＣＭＶ血清状態または再活性化は、ＨＣＴ後の再発またはＤＦＳのいずれにも影響しなかった（図１Ｃ、１Ｄ）。

回帰分析では、ＲＩＣレシピエントでは、再活性化を伴わない血清陽性ではなく、ＣＭＶ再活性化は、再発リスクの低下の傾向がみられ（ＲＲ＝０．６［０．４～１．０］、ｐ＝０．０６）、有意に良好なＤＦＳと関連していた（ＲＲ＝０．７［０．６～１．０］、ｐ＝０．０４）。ＲＩＣ群内の多変数モデルでは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）および年齢の再発および非再発死亡率（ＮＲＭ）に対する統計的に有意な効果はなかった（表ＩＩ）。対照的に、ＭＡコホートでは、グレードＩＩ～ＩＶの急性ＧＶＨＤおよび低年齢が、再発防止およびＮＲＭの高い割合の両方に関連していた。ＭＡコホートではＣＭＶの再活性化またはレシピエントの血清陽性は再発に影響を及ぼさなかったが、ＣＭＶ陽性であったが再活性化しなかった患者は、無病生存率が低かった。骨髄（ＡＭＬおよびＭＤＳ）および他の診断（ＡＬＬ、ＣＭＬ、ＮＨＬ、ホジキン、および多発性骨髄腫）についても回帰分析を別々に実施した。これらのデータのこのさらなるサブセット化により、検出力が低下し、それにより信頼区間が広がったが、ＣＭＶ再活性化を伴うＲＩＣレシピエントにおける再発リスクの低下に対する同様の傾向が、全ての疾患群において観察された（データは示されていない）。

遅い再発では防止効果があまり明らかでないため、ＣＭＶの再活性化の主な有益な効果は、（最も頻繁に検出される）早期に起こる。初期のＣＭＶ再活性化を有する生存者において、（１００日目以降に生じる）後期再発に対する防止は観察されなかった（ＲＲ＝１．０［０．５～１．９］、ｐ＝０．９８）。同様に、１００日を超えた生存者における以前のＣＭＶ再活性化とＤＦＳとの間に関連性はなかった。ＨＣＴ後１００日目以降のＣＭＶ再活性化は稀であり、無症状の再活性化は日常的モニタリングの範囲を越えて起こるので、検出される頻度が低いため、後期のＣＭＶの再活性化と後期の再発との関連性を充分に評価するのに充分な事象はなかった。まとめると、これらの結果は、ＨＣＴセッティングにおけるＣＭＶ再活性化の有益な効果は、移植後早期に観察され、ＲＩＣ ＨＣＴのレシピエントにおいてのみ明らかであることを示す。

検定された共変量には、ドナータイプ（同胞対ＵＣＢ）、診断（ＡＭＬ対その他）、移植年（＜２００８年対≧２００８年）、前治療（ＭＡ対ＲＩＣ）、ＧｖＨＤ予防（ＭＴＸ対ＭＭＦ対その他）、性別（男性対女性）、疾患リスク（標準対高）、年齢（＜２１歳対≧２１歳）、時間依存性変数としてのグレードＩＩ～ＩＶ ａＧｖＨＤ（あり対なし）、および以前の自家移植（あり対なし）が含まれた。

ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、ＣＭＶ再活性化後にＲＩＣ ＨＣＴレシピエントにおいて優先的に増殖する。
ＲＩＣ ＨＣＴ後のＣＭＶ再活性化、再発防止、およびＤＦＳ改善との間の関連性をさらに評価するために、ＨＣＴ後のドナー由来末梢血ＮＫ細胞の表現型を分析した。ＣＭＶ血清陰性レシピエントではなくＣＭＶ血清陽性レシピエントにおけるＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の頻度の増加は、６ヶ月および１年で観察された（図２Ａ、左パネルおよび中央パネル）。ＣＭＶを再活性化したレシピエントは、最も高い割合のＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞を示した。さらなる分析により、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の頻度が、再活性化後４週間（８．５８％対４．６４％、ｐ＝０．０２）、８週間（７．７７％対３．８４％、ｐ＝０．０２）、および６ヶ月（１４．８０％対６．２９％、ｐ＝０．０１）でＭＡレシピエントに対してＲＩＣレシピエントで有意に高かったことが明らかになった（図２Ａ、右パネル）。同様に、ＣＭＶ血清陰性レシピエントと比較してＣＭＶ血清陽性レシピエントにおけるＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数がより大きいことに対する関連性が、６ヶ月および１年で観察された（図２Ｂ、左パネルおよび中央パネル）。ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数は、ＣＭＶを再活性化したＣＭＶ血清陽性レシピエントにおいて最高であり、また、移植後６ヶ月ではＭＡレシピエントに対してＲＩＣレシピエントで有意に高かった（２２．２対１０．４４細胞／μｌ、ｐ＝０．０４）。絶対数において同様の傾向が１年目に認められた。ＲＩＣレシピエントにおいてＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞増殖率がより高かったことは、１００日目の急性ＧｖＨＤ率の差によって説明されなかった。なぜなら、これらの比率は、ＲＩＣ前処置レジメン（４３％［３８～４３％］）とＭＡ前処置レジメン（４２％［３６～４８％］）との間で有意差がなかったからである（ｐ＝０．４６）。生存者の９１％が１００日目に≧９０％のドナーキメラ現象を有し、６カ月目の生存者の９３％が≧９０％のドナーキメラ現象を有したため、１００日目以降に増殖したＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、ドナー起源の細胞から分化した可能性が高い。したがって、ＣＭＶ再活性化に応答するドナー由来ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖は、ＲＩＣレシピエントの間でのみ、再発リスクの低下およびＤＦＳの改善と相関していた。

ＨＣＴ後６ヶ月でのＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖は、２年再発率の低下と直接関連している。
ＨＣＴ後６ヶ月（ｎ＝６８）に、レシピエントにおける絶対ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞数をＣＭＶ血清状態または再活性化とは独立して分析した。この時点で、ほぼ全ての患者が、移植された９０％のドナーより大きい（＞）。ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数に対する最適カットポイントを決定するために、再帰的分割を用いた。ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞数（＞２．５細胞／μｌ、ｎ＝５４）に基づく増殖群のレシピエントは、２年再発率がより高い（４６％［１０～８２％］）非増殖群（０．１～２．５細胞／μｌ、ｎ＝１４）と比較して２年再発率が低い（１６％［６～２６％］、ｐ＝０．０６）傾向にあった。（表ＩＩＩ）。したがって、これらのデータは、移植後早期にＣＭＶ再活性化に応答して増殖するＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞が再発を防ぐことを示唆している。

再帰的分割を用いて、２年再発率と関連する移植後６ヶ月におけるＣＤ５６ｄｉｍＣＤ５７＋ＮＫＧ２Ｃ＋ＮＫ細胞の絶対数（細胞／血液のμｌ）の最適カットポイントを決定した。

ウイルス診断時におけるより高い絶対単球数は、その後のＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖に関連する。
ＣＭＶ感染を模倣するインビトロ研究は、単球がＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞の増殖を促進する役割を果たすことを示している（Rolle et al.J Clin Invest.2014; 124:5305-5316）。したがって、ＲＩＣレシピエントは、ＭＡレシピエントと比較して、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の優先的増殖を説明する、ウイルス診断時におけるより高い絶対単球数（ＡＭＣ）を有し得る（図２）。ＨＣＴコホート内には、ＣＭＶの再活性化を経験した２８人のレシピエント（１６人のＲＩＣおよび１２人のＭＡ）が存在し、これらのレシピエントについて、ウイルス診断時のＡＭＣおよび絶対リンパ球数（ＡＬＣ）ならびに６ヶ月および／または１年でのＮＫ細胞表現型データが利用可能であった。ウイルス診断時では、平均ＡＭＣは、ＭＡレシピエントと比較してＲＩＣにおいてより高い傾向があった（０．７１対０．５４×１０^９細胞／Ｌ、ｐ＝０．０８）。対照的に、平均ＡＬＣは、ＲＩＣレシピエントとＭＡレシピエントとの間で類似していた（０．６５対０．６１×１０^９細胞／Ｌ、ｐ＝０．３９）。ＣＭＶ再活性化の時点でレシピエントの血液中に存在する単球の数とその後の適応型ＮＫ細胞の増殖との間に関連性が存在するかどうかを判断するために、各レシピエントのウイルス診断時におけるＡＭＣ値を、６ヶ月（１年での表現型が利用できなかった場合）または１年のいずれかでのＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数およびパーセンテージに対してプロットした。ウイルス診断時におけるＡＭＣと、６ヶ月または１年でのＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の絶対数（図３Ａ、ｐ＝０．０２）および相対パーセンテージ（図３Ｂ、ｐ＝０．０１）の両方との間の有意な正の相関が観察された。このような相関は、ウイルス診断時のＡＬＣとＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の増殖との間には観察されなかった（図３Ｃ、図Ｄ）。したがって、ＣＭＶ再活性化の時点で単球数がより大きいことは、ＲＩＣレシピエントにおけるＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞の優先的増殖を説明し得る。

ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞株に対して高度に機能的である。
ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞が、他のＮＫ細胞サブセットと比較して白血病標的に対する高められたエフェクター機能を媒介するかどうかを決定するために、健常なＣＭＶ血清陽性血液ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞と共に２：１の比で培養した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＦＮ－γ産生を、未成熟ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞、初期成熟ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＮＫＧ２Ｃ^－ＮＫ細胞、後期成熟ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^－ＮＫ細胞、および適応型ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞において分析した。分析した全ての他のサブセットと比較して、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞に応答してＴＮＦおよびＩＦＮ－γ産生の両方の頻度が高かった（図４Ａ、図４Ｂ）。ＣＤ１０７ａ表面発現によって測定されるＮＫ細胞脱顆粒については、有意な差異は観察されなかった（図示せず）。したがって、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞は、腫瘍標的の直接的な認識の際に炎症性サイトカイン産生の増強を介して直接ＨＣＴ後の再発防止に寄与する可能性が高い。

本研究以前では、ＣＭＶ再活性化と再発防止との間の関連性の根底にあるメカニズムは不明瞭なままであった。本研究では、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＮＫ細胞が、ＣＭＶ再活性化後に強度軽減レシピエントにおいて優先的に増殖し、これらの細胞の増殖は白血病再発の低下と直接的に関連するということが示されている。

実施例２
方法
ＯＰ９ネイティブおよびＯＰ９－ＤＬ１細胞
空のＭｉｇＲ１レトロウイルスベクター（ＯＰ９ネイティブ）またはデルタ様１遺伝子を含むＭｉｇＲ１レトロウイルスベクター（ＯＰ９－ＤＬ１）のいずれかを形質導入したＯＰ９間質細胞（Schmitt et al.Immunity.2002;17(6):749-756）を、ＭＥＭα培地＋２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で、２４ウェルプレート中４×１０^５細胞／ウェルの濃度で２日間培養して細胞接着させた。次いでプレートを２，０００ｃＧｙで照射して細胞増殖を停止させた。

ＯＰ９細胞での臍帯血由来ＮＫ細胞培養
単核細胞を密度勾配遠心分離によって全臍帯血から単離した。Ｔ細胞およびＢ細胞は、それぞれ抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９マイクロビーズを用いた正の磁気選別によって除去した。次いで、ＣＤ３／ＣＤ１９欠失細胞を、照射したＯＰ９細胞に５×１０^５細胞／ウェルの濃度で加え、ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ中で、１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５または１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５のいずれかを補充し、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２１有りまたは無しで、１４日間培養した。

培養前および培養後のＮＫ細胞の表現型解析
臍帯血由来ＮＫ細胞を、培養前、ならびに培養の７日後および１４日後に、以下の細胞外抗体および細胞内抗体を用いる蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析した：ＢＶ７８５コンジュゲート抗ＣＤ３（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend）、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ５６（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend）、ＢＶ６０５コンジュゲート抗ＣＤ５７（カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend）、ＡＰＣコンジュゲートＳＹＫ（カリフォルニア州サンディエゴのeBioscience）、およびＰＥコンジュゲート抗ＰＬＺＦ（カリフォルニア州サンノゼのBD Biosciences）。

結果
最終分化標準ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫ細胞および適応型ＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞の増殖を支持するインビトロ培養系の確立
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化に必須の役割を果たし、エフェクター機能の獲得を制御する（Backer et al.Nat Immunol.2014;15(12):1143-1151）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、最終分化および適応型ＮＫ細胞サブセットの分化および増殖を促進する役割を果たし得るかどうかを決定するために、ＣＤ３／ＣＤ１９欠失単核細胞を、低用量（１ｎｇ／ｍＬ）のＩＬ－１５または高用量（１０ｎｇ／ｍＬ）のＩＬ－１５の存在下で、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）有りまたは無しで、ネイティブＯＰ９間質細胞またはＮｏｔｃｈリガンドＤＬ１を安定に形質導入されたＯＰ９間質細胞上で臍帯血から培養した。細胞を７日目および１４日目に採取し、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を、ＣＤ５７およびＳＹＫの発現について蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析した。培養前に、平均２．１３％±０．４４のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞がＣＤ５７を発現した。低用量ＩＬ－１５（０．５９％±０．１９）または高用量ＩＬ－１５（０．７０％±０．２３）のいずれかでの７日目のＯＰ９ネイティブ培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。同様に、低用量ＩＬ－１５（０．２４％±０．１１）または高用量ＩＬ－１５（０．２２％±０．１０）のいずれかでの１４日目のＯＰ９ネイティブ培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。低用量ＩＬ－１５（０．９１％±０．３４）または高用量ＩＬ－１５（１．３０％±０．３１）のいずれかでの７日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。同様に、低用量ＩＬ－１５（０．９３％±０．４０）または高用量ＩＬ－１５（０．８６％±０．４４）のいずれかでの１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．７１％±０．２４）または高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（１．０５％±０．２９）のいずれかでの７日目のＯＰ９ネイティブ培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。同様に、低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．１８％±０．０６）または高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（２．７４％±１．９０）のいずれかでの１４日目のＯＰ９ネイティブ培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（２．０６％±０．６６）での７日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（５．３１％±２．１０）での７日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の中程度の増殖が観察された。低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（１．３８％±０．５６）での１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞の増殖は観察されなかった。高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（１２．６７％±５．１１）での１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＣＤ５７^＋ＮＫ細胞のロバストな増殖が観察された。

培養前に、平均３．０９％±０．９１のＣＤ５６^＋ＮＫ細胞がＳＹＫの発現を欠いていた。ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５（０．１８％±０．０６）または高用量ＩＬ－１５（０．２１％±０．０５）のいずれかでの７日目のＯＰ９ネイティブ培養物で増殖しなかった。同様に、ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５（０．０７％±０．０３）または高用量ＩＬ－１５（０．４３％±０．１５）のいずれかでの１４日目のＯＰ９ネイティブ培養物で増殖しなかった。ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５（０．２５％±０．０６）または高用量ＩＬ－１５（０．３４％±０．０４）のいずれかでの７日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物で維持されなかった。同様に、ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５（０．１７％±０．０８）または高用量ＩＬ－１５（０．４３％±０．１５）のいずれかでの１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物で増殖しなかった。ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．３９％±０．０８）または高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．３１％±０．０６）のいずれかでの７日目のＯＰ９ネイティブ培養物で増殖しなかった。同様に、ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．１６％±０．０３）または高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．６０％±０．３２）のいずれかでの１４日目のＯＰ９ネイティブ培養物で増殖しなかった。ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．７７％±０．２５）または高用量ＩＬ－１５（０．６７％±０．１０）での７日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物で増殖しなかった。ＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、低用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（０．３９％±０．１０）での１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物で増殖しなかった。高用量ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（３．３１％±１．３２）での１４日目のＯＰ９－ＤＬ１培養物でＳＹＫ^－ＮＫ細胞の増殖が観察された。まとめると、これらの結果は、インビトロでＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋およびＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞の増殖にＩＬ－２１およびＮｏｔｃｈリガンドと共に高用量ＩＬ－１５が必要であることを示す（図5）。

臍帯血由来ＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１に応答してＰＬＺＦをダウンレギュレートする。
転写因子前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）の転写サイレンシングは、ＣＭＶ感染に応答して増殖する適応型ＮＫ細胞の特徴である（Schlums et al.Immunity.2015;42(3):443-456）。単離直後の単核細胞由来およびインビトロで１４日間培養された細胞由来のＮＫ細胞において、ＰＬＺＦの細胞内染色を行った。臍帯血からの単離直後のＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞は、主にＰＬＺＦ陽性であった（９９．３％±０．１０）。高用量ＩＬ－１５を用いた培養は、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＳＹＫ^＋ＮＫ細胞（９．９３％±０．７５）、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＳＹＫ^＋ＮＫ細胞（１１．４７％±２．１８）、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＳＹＫ^－ＮＫ細胞（７．０５％±１．３１）、およびＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＳＹＫ^＋ＮＫ細胞（６．６７±１．０５）におけるＰＬＺＦ発現の中程度の低下をもたらした。しかし、ＩＬ－２１の添加は、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＳＹＫ^＋ＮＫ細胞（１４．９２％±１．８０）およびＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＳＹＫ^＋ＮＫ細胞（１２．１３％±２．４３）と比較して、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＳＹＫ^－ＮＫ細胞（３５．８２％±７．０２）およびＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＳＹＫ^－ＮＫ細胞（６６．０％±８．８６）におけるＰＬＺＦ発現の顕著な低下をもたらした。したがって、ＩＬ－２１は、ＣＤ５６^ｄｉｍＳＹＫ^－ＮＫ細胞におけるＰＬＺＦ発現を抑制し、それにより、これらの細胞は適応特性を獲得するようになる（図6）。

実施例３
実施例２に記載のように培養した臍帯血由来ＮＫ細胞は、細胞傷害性受容体２Ｂ４、低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６、およびキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現によって示されるように、細胞傷害性のコンピテントである。追加のデータ（図示せず）は、これらの細胞が、ウイルス感染細胞、新生細胞、および／または自家活性化免疫細胞に応答して脱顆粒する能力を示す、高レベルのグランザイムおよびパーフォリンを発現することを示す。

実施例４
インビトロで培養したＣＭＶ血清陽性ドナー由来ＮＫ細胞へのラパマイシンの添加は、適応型ＮＫ細胞の分化プログラムを促進した（図７Ａ、図７Ｂ）。機能アッセイにおいて、ラパマイシンで処理したＮＫ細胞は、脱顆粒および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の増強を示した（図７Ｃ、図７Ｄ）。したがって、エクスビボＮＫ細胞増殖方法へのラパマイシンの添加は、養子免疫療法の前にＮＫ細胞分化を増強し、固有の代謝特性を有する成熟ＮＫ細胞サブセットについて富化し、ＮＫ細胞の細胞障害性およびサイトカイン産生を増強する新規な戦略を示唆する。

実施例５
成人ＣＭＶ血清陽性ドナーの末梢血由来の適応型ＮＫ細胞は、高用量のＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＣＤ１６刺激によりインビトロで増殖され得る。健常なＣＭＶ血清陽性ドナーからのＣＤ３／ＣＤ１９欠失ＰＢＭＣをCellTrace色素で標識し、高用量ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）のみ、ＩＬ－１５プラスＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはＩＬ－１５プラスＩＬ－２１プラス抗ＣＤ１６抗体（１：１０００）と共に１０日間培養した。図８Ａは、代表的なＣＭＶ血清陽性ドナーからのＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＹＫ、およびCellTraceの発現を示す。図８Ｂは、ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞のパーセンテージの累積データを示す。図８Ｃは、４人のＣＭＶ血清陽性ドナーからのＳＹＫ欠失ＮＫ細胞のパーセンテージを示す。

実施例６
ＮＫＧ２Ｃ発現を誘導するために、ＮＫ細胞を、実施例２に記載のように、可溶性および／または膜結合性炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＩＦＮ－γ；膜結合性ＨＬＡ－Ｅ；および膜結合性ＨＬＡ－Ｅ提示ＣＭＶペプチドのうちの１つ以上と共に、７日間および１４日間培養する。

実施例７
ＴＩＧＩＴ発現が低い適応型ＮＫ細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞に抵抗性である。
前書き
ナチュラルキラー細胞は自然免疫系のリンパ球である。Ｔ細胞およびＢ細胞とは異なり、これらはクローン様式で生殖系列再構成抗原特異的受容体を発現しない。これらは細胞傷害性Ｔ細胞と同様の殺滅メカニズムを共有しているが、ＮＫ細胞は活性化受容体および抑制性受容体のファミリーを介して標的を認識する。これらの受容体の間のバランスは、ＮＫ細胞の最終的な機能を決定する。ＮＫ細胞が健康な細胞と形質転換された細胞または感染した細胞を区別する主なパラダイムは、「自己喪失」仮説によって説明される。損傷した細胞に対するＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーション、またはキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の抑制性サブグループと自己細胞上のそれぞれのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）リガンドとの間のミスマッチは、標的細胞をＮＫ細胞殺滅に感受性にする。ＮＫ細胞はまた、以前の抗原曝露を必要とすることなく、腫瘍細胞を認識し殺す能力を有し、これは、癌治療のためのエフェクターとしてのＮＫ細胞の開発を容易にする性質である。しかし、Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性は、腫瘍内微小環境に存在する抑制性因子によって制限され、これにより、免疫機能が弱められ、予後不良となる。新興の研究は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の抑制性受容体、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、およびＴ細胞ＩｇおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）が抗腫瘍反応を抑制できることを示す。

本研究では、適応型ＮＫ細胞と骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）との間の相互作用を調べた。ＭＤＳＣは、骨髄前駆細胞および未成熟骨髄細胞の不均一な集団である。ヒトでは、ＭＤＳＣは、通常、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３を発現し、ＨＬＡ－ＤＲの発現は低いか無く、ＣＤ１４＋（単球性ＭＤＳＣｓ［ｍＭＤＳＣ］）またはＣＤ１５＋ＣＤ６６ｂ＋（顆粒球性ＭＤＳＣ［ｇＭＤＳＣ］のいずれかである（Marvel et al.The Journal of Clinical Investigation.2015;125(9):3356-64）。これらの細胞は、腫瘍によって誘導され、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、反応性酸素種（ＲＯＳ）、およびアルギナーゼを産生することによって、先天性および適応性抗腫瘍免疫の両方の阻害に寄与する（Ostrand-Rosenberg et al.Journal of Immunology.2009;182(8):4499-506）。しかし、本明細書中に開示される方法および組成物を用いて単離および／または製造され得るＮＫ細胞のサブセット、適応型ＮＫ細胞は、癌患者由来ＭＤＳＣによる機能的抑制に対する抵抗性を示す。普通型ＮＫ細胞と比較して、適応型ＮＫ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の直接調節で知られている抑制性受容体であるＴＩＧＩＴの発現レベルが低い。

結果
ＭＤＳＣは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖およびＮＫ細胞の機能を抑制する。
ＭＤＳＣとＮＫ細胞サブセットとの間の相互作用を調べるために、健常ドナーからの末梢血単核細胞をＩＬ－６およびＧＭ－ＣＳＦと共に１週間培養し、続いてＣＤ３３^＋細胞を富化させることによってＭＤＳＣを作製した（図１６Ａ）。新鮮な単球をこれらの実験の骨髄細胞対照として用いた。精製したＴ細胞およびＮＫ細胞を、単球またはＭＤＳＣと様々な比率で共培養し、３～４日間の培養後に増殖について評価した。単球は増殖にほとんど影響しなかったが、ＭＤＳＣは、２．７±１．６倍のＴ細胞の増殖の抑制（ｐ＝０．００５）を誘導し、ＮＫ細胞に対して同様の効果（１．５±０．２７倍抑制、ｐ＝０．００６）を有した（図９Ａ）。同様に、ＣＤ１６の関与は、新鮮な単球で培養したＮＫ細胞と比較してＭＤＳＣによって有意に抑制されたＮＫ細胞脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生を刺激した（それぞれ、２．４±１．４倍の抑制、ｐ＝０．０００１、および２．６±１．５倍の抑制、ｐ＝０．００３）（図９Ｂ）。

適応型ＮＫ細胞はＭＤＳＣ抑制に抵抗する。
適応型ＮＫ細胞が普通型ＮＫ細胞と比較してＭＤＳＣ抑制に抵抗し得るかどうかを調べるために、精製ポリクローナルＮＫ細胞を単球またはＭＤＳＣと２：１の比で５日間共培養し、ＣＤ１６刺激後の脱顆粒、増殖、およびサイトカイン産生について調べた。普通型および適応型ＮＫ細胞は、同様の量のＣＤ１６を発現し（図１６Ｂ）、適応型ＮＫ細胞を、ＣＤ５７^＋ＮＫＧ２Ｃ^＋ＦｃεＲγ^－であるＣＭＶ血清陽性ドナー由来ＮＫ細胞として定義した（Schlums et al.Immunity.2015;42(3):443-56）。ＩＬ－１５の存在下で単独で、または単球との共培養で培養した場合、同様のＮＫ細胞活性が観察された（脱顆粒：４４±１４％対４９±１２，ＩＦＮγ：２８±１４．０％対２７±９．０％）（図１０Ａ）。単球対照と比較して、ＭＤＳＣは、普通型ＮＫ細胞の集団内で、ＣＤ１０７ａ（５２．４±２．４％対３３．５±３．１％、ｐ＝０．０００７）、ＩＦＮ－γ（３１．３±３．８％対１３．８±３．０％、ｐ＝０．００９）、ＴＮＦ（２９．１±２．１％対１３．６±３．３％、ｐ＝０．００７）、および増殖（４９．０±２．９％対２３．０±３．５％、ｐ＝０．００１）（Ｋｉ６７によって測定）の有意な抑制を媒介した。しかし、適応型ＮＫ細胞は、同じＭＤＳＣ集団に対して抵抗性であった（図１０Ａ）。さらに、ＭＤＳＣの存在下での普通型ＮＫ細胞の脱顆粒およびＩＦＮγは、トランスウェルによって分離されたときに完全に回復した（図１０Ｂ）。したがって、ＣＭＶ感染は、ＭＤＳＣ抑制に抵抗性である適応型ＮＫ細胞の集団を生じる。

ＭＤＳＣ抑制に対する適応型ＮＫ細胞の抵抗性は、ＴＩＧＩＴの発現の低下と相関する。
健常な供血者由来の精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）単独の存在下もしくは非存在下で、またはＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１８（１００ｎｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ１６（１μｇ／ｍＬ）の追加刺激とともに、染色前に一晩培養した。ＴＩＧＩＴ発現は刺激なしでは低く、ＩＬ－１５単独ではわずかにアップレギュレートされた。抗ＣＤ１６による追加刺激は、ＴＩＧＩＴ発現をさらに増加させた。しかし、ＤＮＡＭ－１は、ベースラインの発現レベルが高いために、さらに増加させることができなかった（図１１Ａ）。これらのポリクローナル活性化ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴに対する染色パターンは、二峰性の発現を示した（図１１Ａ）。この現象をさらに調べるために、ＴＩＧＩＴおよび他の抑制性受容体の適応型および普通型ＮＫ細胞での発現を調べた。ＤＮＡＭ－１、ＣＤ９６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＰＤ－１、Ｔｉｍ３、またはＮＫＧ２Ａでは、適応型ＮＫ細胞と普通型ＮＫ細胞との間に発現の差はなかった（図１１Ｂ、図１６Ｃ）。対照的に、ＴＩＧＩＴ発現は、単球（ＴＩＧＩＴ ＭＦＩ：１５９５±４０７対２１９６±４６１、ｐ＝０．００８）またはＭＤＳＣ（ＴＩＧＩＴ ＭＦＩ：１６８０±３３６対２５５６±４０３、ｐ＝０．００８）と共培養したかどうかにかかわらず、普通型ＮＫ細胞に対して適応型ＮＫ細胞で有意に少なかった。（図１１Ｃ）。普通型および適応型ＮＫ細胞は、単球またはＭＤＳＣとの共培養の前後で同様のレベルでＴＩＧＩＴおよびＤＮＡＭ－１を共発現したが（ＮＫ単独：１８％±１０％対１４％±１１．５％、ＮＫ＋単球：８６％±８％対８３％±９％、ＮＫ＋ＭＤＳＣ：８４％±９％対８２％±６％、図１１Ｄ）、適応型ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴの発現は依然として低かった。

ＭＤＳＣによる普通型ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ依存性抑制
単球、ＭＤＳＣ、およびＮＫ細胞をCellTracker Blueで標識し、一晩チャンバースライドで共培養した。細胞を抗ＣＤ１５５（緑色）および抗ＴＩＧＩＴ（赤色）で染色し、サイズによって区別した。予想通り、ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴは、ＭＤＳＣ上のＣＤ１５５と共存した（図１２Ａ）。ＴＩＧＩＴがＮＫ細胞のＭＤＳＣ依存性調節に関与するかどうかを評価するために、健常な給血者由来のポリクローナルＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２：１の比率で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と共培養した。ＩＦＮ－γ産生を、ＣＤ１６刺激の６時間後に、低いＴＩＧＩＴ発現に対する高いＴＩＧＩＴ発現の差異に基づいて、ＭＤＳＣと共培養した普通型ＮＫ細胞において評価した。これらのデータは、低いＴＩＧＩＴ発現を有するＮＫ細胞が、高いＴＩＧＩＴ発現を有するＮＫ細胞と比較して有意により多くのＩＦＮ－γを産生することを示す（３６．２％対１９．９％、ｐ＝０．０００５、図１６Ｄ）。次に、ＴＩＧＩＴの関与がＮＫ細胞のＭＤＳＣ抑制を引き起こす原因であるかどうかを調べた。抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能を、これまでに記載されているように（Warren et al.Int Immunol.2001;13(8):1043-52）正常なＮＫ細胞を用いるＰ８１５アッセイで試験した。抗ＣＤ１５８ｂ対照の存在がＮＫ細胞の細胞障害性を阻害したが、ＮＫ細胞機能は抗ＴＩＧＩＴの存在下で影響を受けず（図１８Ａ）、アゴニスト機能の欠如を示した。

ＴＩＧＩＴに対する遮断抗体の存在下または非存在下で、ＮＫ細胞を単球またはＭＤＳＣと５日間共培養した。ポリクローナルＮＫ細胞機能のＭＤＳＣ誘導性抑制は、ＴＩＧＩＴを遮断することによって完全に抑止された（図１２Ｃ）。ＴＩＧＩＴ遮断が適応型ＮＫ細胞にほとんど影響を及ぼさないので、この効果は、大きな普通型ＮＫ細胞集団に完全に基づく（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。ＭＤＳＣと共培養した普通型ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴおよびＤＮＡＭ－１の同時遮断は、ＴＩＧＩＴ遮断の効果を逆転させ、適応型ＮＫ細胞の脱顆粒およびＩＦＮ－γを阻害し（図１２Ｅ、図１８Ｂ）、ＤＮＡＭ－１シグナル伝達のＴＩＧＩＴ依存性阻害を示した。

ＭＤＳＣの表面上のＲＯＳ誘導ＣＤ１５５発現
単球およびＭＤＳＣ単独におけるＴＩＧＩＴリガンドＣＤ１５５およびＣＤ１１２の発現をさらに調べた。ＭＤＳＣは、単球でほとんど発現しないのと比較して高レベルのＣＤ１５５を発現した（ＭＦＩ：６７５±１２４対１０７±２３、ｐ＝０．０１５）。さらに、ＣＤ１１２発現は、単球と比較してＭＤＳＣにおいて有意に高かった（ＭＦＩ：１７１４±３３１対８６５±１９６、ｐ＝０．０１５）（図１３Ａ）。ＭＤＳＣ誘導性の普通型ＮＫ細胞の抑制のメカニズムをさらに調べるために、スーパーオキシド、アルギナーゼ、ＲＯＳ、ＴＧＦ－β、およびｉＮＯＳを含むＭＤＳＣによって利用される経路を、ＭＤＳＣ生成の終わりに一晩遮断した。スーパーオキシド、アルギナーゼ、ＴＧＦ－β、またはｉＮＯＳを遮断したとき、ＣＤ１５５の発現に実質的な差は見られなかったが、カタラーゼによるＲＯＳ産生の阻害は、ＭＤＳＣ上のＣＤ１５５の発現の有意な減少をもたらした（５５％±２３減少、ｐ＝０．０３）（図１３Ｂ）。

いくつかの研究は、ＭＤＳＣにおけるＲＯＳ産生の増加がＴ細胞機能の抑制と相関することを示した。さらに、ＲＯＳ産生は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性（ＮＯＸ２）の増強により増加する（Corzo et al.Journal of Immunology.2009;182(9):5693-701）。ここで、ＭＤＳＣにおけるＲＯＳ産生レベルを、新鮮な単離単球のレベルと比較した。単球はほとんどＲＯＳを発現せず、主にＣＤ１５５陰性であった。対照的に、ＭＤＳＣは、高い基礎レベルのＲＯＳを産生し、均一にＣＤ１５５陽性であった（図１３Ｃ）。さらに、Ｈ_２Ｏ_２処理によって単球でＲＯＳ産生を誘導することにより、ＲＯＳ^＋単球におけるＣＤ１５５の発現を誘導することができた（図１３Ｄ）。

ＴＩＧＩＴの関与は、ｐＺＡＰ７０／ＳｙｋおよびｐＥＲＫ１／２を阻害し、ＮＫ細胞の細胞障害性の阻害をもたらす。
普通型ＮＫ細胞の機能および増殖に対するＴＩＧＩＴの関与の強力な抑制効果を考慮して、ＭＤＳＣと共培養したＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴとのＣＤ１６誘導性シグナル伝達相互作用を分析した。対照単球と共培養した場合と比較して、ＭＤＳＣと共培養したＮＫ細胞は、ＥＲＫ１／２（ＭＦＩ：１３５６±１４３対６９６±２０２、ｐ＝０．０３）およびＺＡＰ７０／Ｓｙｋ（ＭＦＩ：１５９±１４対１０９±１４、ｐ＝０．０３）のリン酸化の低下を示した。さらに、ＴＩＧＩＴの遮断またはＲＯＳの阻害は、ＺＡＰ７０／ＳｙｋおよびＥＲＫ１／２のリン酸化を増加させた（ｐ＝０．０３、図１４Ａ、図１４Ｂ）。ＴＩＧＩＴまたはＲＯＳを遮断することがＭＤＳＣと培養されたＮＫ細胞の機能を回復できるかどうかを細胞障害性アッセイにおいて調べるために、単球またはＭＤＳＣのいずれかと共に培養したＮＫ細胞を、ＴＩＧＩＴ遮断またはカタラーゼで前処理し、洗浄した後、^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞とインキュベートした。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、単球との共培養と比較して、ＭＤＳＣとの共培養の後に有意に減少した（図１４Ｃ）。抗ＴＩＧＩＴもカタラーゼも単独で培養したＮＫ細胞には何ら影響を及ぼさなかったが、ＴＩＧＩＴ遮断およびＲＯＳ阻害の両方は、ＭＤＳＣによって媒介される抑制効果を完全に逆転させた（図１４Ｃ）。さらに、ＮＫ細胞およびＭＤＳＣ共培養物におけるカタラーゼ処理と組み合わされたＴＩＧＩＴの遮断は、ｐＺＡＰ７０／ＳｙｋおよびｐＥＲＫ１／２またはＮＫ細胞の細胞傷害性のいずれに対しても相加効果を有しなかった。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者のＭＤＳＣによる普通型ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ依存性抑制
サイトカインによって生じたＭＤＳＣの接触を介した抑制メカニズムを同定し、このメカニズムがインビボでの生理的セッティングにおいてオペラントであったかどうかを調べた。ＣＭＶ血清陽性ＭＤＳ患者および健常ドナー（ＨＤ）からのＰＢＭＣを、適応型ＮＫ細胞およびＭＤＳＣの頻度について分析した。ＣＭＶ＋ＭＤＳ患者の血液中で適応型ＮＫ細胞の頻度が高かったが（ｎ＝１０，１７％±１５％対７％±５％）、総ＮＫ細胞頻度はＨＤと比較して有意に低かった（ｎ＝８、１．３％±１．２対８％±７％）。単球型ＭＤＳＣ（ｍＭＤＳＣ）をＣＤ４５^＋Ｌｉｎ^－ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＨＬＡ－ＤＲ^{－／ｌｏｗ}ＣＤ１４^＋として、顆粒球型ＭＤＳＣ（ｇＭＤＳＣ）をＣＤ４５^＋Ｌｉｎ^－ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ１５^＋として定義した。健常な給血者と比較して、ＭＤＳ患者の血液中で、ｍＭＤＳＣ（１．６±０．２対１１．４±９．２、ｐ＝０．０２）およびｇＭＤＳＣ（０．０２±０．０２対１．８４±１．６、ｐ＝０．０１）の両方の頻度の有意な増加が観察された（図１５Ａ）。さらに、ＭＤＳ－ＭＤＳＣは、ＭＤＳ－単球と比較してＣＤ１５５の発現を増加させた（図１５Ｂ）。ＭＤＳ患者由来のＰＢＭＣを、普通型および適応型ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴの発現について評価した。ＭＤＳ患者において、ＴＩＧＩＴの発現は、普通型ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞で有意に低かった（ＭＦＩ：３４７±１８９対６６０±３１１、ｐ＝０．００２；図１５Ｃ）。ＭＤＳ患者のＣＭＶ誘導性適応型ＮＫ細胞は、ＭＤＳ－普通型ＮＫ細胞と比較して、ＩＬ－１５およびＣＤ１６刺激による活性化後に有意により優れた機能を示した。さらに、適応型ＮＫ細胞は、健常ドナーのＮＫ細胞と同様の脱顆粒およびＩＦＮγ産生を示した（図１５Ｄ）。普通型ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断は、普通型ＮＫ細胞の機能的低反応性を救済したが、低レベルのＴＩＧＩＴ発現を有する適応型ＮＫ細胞に対しては相加的効果はほとんどなかった（図１５Ｄ）。

健常志願者からの同種異系ＮＫ細胞に対するＭＤＳ患者の血液中を循環するＭＤＳＣの抑制能力を評価した。ＩＬ－１５およびＣＤ１６刺激の存在下での５日間の共培養の後、同種異系の普通型ＮＫ細胞の機能の顕著な減少が、同じサンプル中の適応型ＮＫ細胞の機能と比較して観察された（図１５Ｅ、図１８Ｃ）。ＴＩＧＩＴ遮断は、普通型ＮＫ細胞でＭＤＳ患者からの原発性ＭＤＳＣの抑制機能を完全に逆転させたが、この抑制メカニズムに本質的に抵抗性であったＣＭＶ誘導性適応型ＮＫ細胞では影響は見られなかった（図１５Ｆ）。したがって、これらのデータは、正常ドナーからのサイトカインによって生じたＭＤＳＣで観察されたＭＤＳＣ抑制メカニズムが、ＭＤＳ患者からの原発性ＭＤＳＣのメカニズムと同一であることを明確に示している。

議論
進行中の癌を有する患者におけるＮＫ細胞およびＴ細胞免疫療法の潜在的な治療効果を記載する免疫療法の文献が急増している。この急増は、Ｔ細胞ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１および／またはＣＴＬＡ－４経路に対するチェックポイント遮断による予期しないほど強力な臨床結果によるものである。まとめると、癌治療に対する新規アプローチは、抗原特異的応答およびチェックポイント遮断に重点を置いて、戦略的変化を経ている。標的に対するＮＫ細胞応答は、活性化受容体および抑制性受容体を介したシグナルの釣り合いによって決定されるが、同様のチェックポイント遮断メカニズムはあまり理解されていない。本研究において、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５は、普通型ＮＫ細胞のＭＤＳＣ誘導性抑制の根底にある重要な軸であると同定された。ＣＭＶ誘導性適応型ＮＫ細胞は、低レベルのＴＩＧＩＴを発現し、ＭＤＳＣ抑制に感受性ではなかった。サイトカイン曝露による正常血液から生じたＭＤＳＣの機能は、癌（ＭＤＳ）患者で誘導されたＭＤＳＣの機能と同等であり、これらの知見の生理学的関連性および潜在的なトランスレーショナルな役割を強調する。本開示によって与えられるように、そして理論に拘束されることを望むものではないが、ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ誘導性免疫抑制を克服するための少なくとも２つの方法がある。第１に、普通型ＮＫ細胞のＣＤ１６シグナル伝達を正常レベルに回復させるＴＩＧＩＴ遮断である。第２に、ＣＭＶ曝露後のＴＩＧＩＴ抵抗性適応型ＮＫ細胞の増殖である。ここでは、ＮＫ細胞のサブセットを、単離して、または単離せず、増殖させ、必要に応じて調整して、ＴＩＧＩＴの発現レベルを低く維持することにより腫瘍誘導性免疫抑制に対する抵抗性を発揮し得ることが示されている。

ＭＤＳＣを含む免疫抑制性細胞型は、腫瘍の微小環境に蓄積し、ＣＴＬおよびＮＫ細胞などのエフェクター細胞に抑制的な圧力を及ぼし、腫瘍消失の能力を低下させる。サイトカイン誘導性ＭＤＳＣは、ポリクローナルＮＫ細胞の増殖、脱顆粒、およびＩＦＮ－γ産生を抑制する。しかし、予期せぬことに、ＭＤＳＣ抑制を遮断するのに適しているＮＫ細胞の亜集団を得るために適応型および普通型ＮＫ細胞を分離することによって、ＮＫ細胞がＭＤＳＣ抑制に対する抵抗性を発揮できるようになることが分かった。ＭＤＳＣ抑制に対する適応型ＮＫ細胞の抵抗性に基づいて、正常単球と比較してＭＤＳＣと共培養した場合に、普通型ＮＫ細胞に対して適応型ＮＫ細胞で顕著な表現型変化があったかどうかを調べた。ＴＩＧＩＴ発現は、普通型ＮＫ細胞と比較して適応型ＮＫ細胞において有意に低いことが分かった。

ＣＤ１１２およびＣＤ１５５は、細胞ストレスによって調節され、それぞれ低親和性および高親和性でＴＩＧＩＴに結合する。両方の受容体は、形質転換細胞上で発現が高い。本明細書で示すように、単球のＭＤＳＣへの変換は、ＣＤ１１２の増加およびＣＤ１５５の発現の誘導に関連する。ＣＤ１５５の発現は、反応性酸素種（ＲＯＳ）産生に依存し、ＭＤＳＣは高レベルのＲＯＳを産生した。

ＭＤＳＣとの共培養後のＮＫ細胞に対するＴＩＧＩＴの関与により、ＣＤ１５５^－単球と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＺＡＰ７０／ＳｙｋおよびＥＲＫ１／２のリン酸化が実質的に低下した。ＴＩＧＩＴの遮断またはＲＯＳ産生の阻害は、近位シグナル伝達におけるこの欠点を逆転させた。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書の発見は、ＮＫ細胞シグナル伝達の免疫チェックポイント調節性ＭＤＳＣ媒介性サプレッサーとしてのＴＩＧＩＴの役割を明らかにする。本明細書に示されるように、ＴＩＧＩＴの遮断、またはＲＯＳの阻害により、Ｋ５６２に対するＮＫ細胞の細胞傷害性が増強された。注目すべきことに、ＭＤＳを有する患者からの血液循環ＭＤＳＣは、抗ＴＩＧＩＴの存在下で普通型ＮＫ細胞を抑制することができなかった。これらの結果は、ＭＤＳによって誘導される表現型のＭＤＳＣが機能的に抑制性であることを示し、これは、当該疾患の臨床的進展に寄与し得る知見である。

これらのデータは、ＴＩＧＩＴの遮断が癌免疫療法においてＮＫ細胞の抗腫瘍性の役割を増強することを意味する。あるいは、癌患者における適応型ＮＫ細胞のクローン性増殖は、腫瘍微小環境の最小限の抑制により腫瘍標的化を改善することができた。このような増殖は、免疫抑制患者のＣＭＶ再活性化の後に見られ（Davis et al.Biology of Blood and Marrow Transplantation: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation.2015;21(9):1653-62; Foley et al.Journal of Immunology.2012;189(10):5082-8）、適応型ＮＫ細胞の注入によって、またはＣＭＶワクチンによって促進され得る。ＣＭＶエンベロープ糖タンパク質Ｂによる処理および樹状細胞ＣＭＶワクチンによる遺伝子免疫化は、安全かつ実行可能であることが示されている（Pass et al.The New England Journal of Medicine.2009;360(12):1191-9; Garu et al.Molecular Therapy.2015; doi:10.1038/mt.2015.215）。要約すると、これらの新規データは、ＭＤＳＣによる様々なＮＫ細胞サブセットの抑制に関する新たな見解を与える。

材料および方法
患者および健常ドナー
健常な対象から正常末梢血を得た。骨髄異形成症候群患者（ＭＤＳ、ｎ＝１５）からの凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、International Blood and Marrow Transplant ResearchのNational Marrow Donor Program (NMDP)/Centerから得た。全ての健常およびＭＤＳ患者ドナーは、ＣＭＶ血清陽性であった。全てのサンプルは識別を取り消され、使用はヘルシンキ宣言に従ってミネソタ大学とＮＭＤＰ施設審査委員会によって承認された。

細胞単離
Ficoll勾配遠心分離（Ficoll-Paque Plus，イギリスのリトル・チャルフォントのGE Healthcare）後に、ＭＤＳ患者および健常な給血者からのＰＢＭＣを採取した。その後、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ、ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich）、およびＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、R&D Systems）を含有するＲＰＭＩ培地中に２×１０^６／ｍＬの運命で１週間細胞を播種し、培養３日目に新しくして、ＭＤＳＣを得た（Koehn et al.Blood.2015;126(13):1621-8）。次に、ＨＬＡ－ＤＲ^＋細胞を抗ヒトＨＬＡ－ＤＲマイクロビーズ（ドイツのベルギッシュ・グラートバッハのMiltenyi Biotech）を用いて単離し、その後、抗ＣＤ３３マイクロビーズ（ドイツのベルギッシュ・グラートバッハのMiltenyi Biotech）を用いてＨＬＡ－ＤＲ^－画分からＭＤＳＣを精製した。単球のＭＤＳＣを全ての示された実験で使用した（≧８５％ＣＤ１４^＋ＨＬＡ－ＤＲ^－）。ＮＫ細胞およびＴ細胞を、負の欠失（EasySep Human NK Cell Enrichment Kit，カナダのバンクーバーのStemcell Technologies）またはＣＤ３マイクロビーズ（ドイツのベルギッシュ・グラートバッハのMiltenyi Biotech）によって一晩休止させたＰＢＭＣから単離した。対照単球を、抗ＣＤ３３マイクロビーズを用いて一晩休止させたＰＢＭＣから単離した。

増殖分析
精製単球またはサイトカイン誘導性ＭＤＳＣを、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地（ミネソタ州ミネアポリスのGibco）（以下、培地と称する）でCellTraceバイオレット色素（５μＭ、カリフォルニア州カールスバッドのInvitrogen）で標識された自家Ｔ細胞またはＮＫ細胞（１×１０^５個）と１：１～１：１６の比率で９６穴Ｕ底プレートに２連で播種した。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズ（４０ビーズ／ウェル）およびＩＬ－１５（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、またはＮＫ細胞についてはＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）単独で刺激し、３～５日間培養した。細胞をLSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）により得、データをFlowJo（オレゴン州アシュランドのTree Star）により分析した。

フローサイトメトリー分析
様々な時点について単球またはＭＤＳＣと培養され、様々な刺激を受けた精製ＮＫ細胞またはＭＤＳ ＰＢＭＣ（図１７）を染色緩衝液（０．５％ヒトＡＢ血清含有ＰＢＳ）に再懸濁し、蛍光色素結合抗体で染色した（表ＩＶ）。培養ＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ、Ｋｉ６７、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦα産生の検出は、製造業者の指示書に従ってＦｏｘｐ３／転写因子固定／浸透化キット（Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization kit）（カリフォルニア州サンディエゴのeBioscience, Inc.）を用いて行った。固定および細胞外染色の前に、ＮＫ細胞をブレフェルジンＡおよびモネンシン（GolgiPlugおよびGolgiStop；ニュージャージー州フランクリンレイクのBD Bioscience）で３７℃で６時間処理した。以下の抗原に対する抗体でＭＤＳＣを染色して、ＮＫ細胞との共培養の前の純度および表現型を決定した：ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９（ｌｉｎ－）、および固定可能死細胞マーカー（fixabale dead cell marker）（表ＩＶ）。染色前のいくつかの実験において、ＭＤＳＣを、１０μｇ／ｍＬのＴＧＦβ用中和抗体（R&D systems）、２００ＩＵ／ｍＬのＲＯＳスカベンジャーカタラーゼ（ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich）またはスーパーオキシドジスムターゼ（Sigma-Aldrich）、５００μｍｏｌ／Ｌのアルギナーゼ阻害剤Ｎ（ω）－ヒドロキシ－ノル－ｌ－アルギニン（nor-NOHA；Calbiochem）、またはｉＮＯＳ阻害剤ＮＧ－モノメチル－ｌ－アルギニン（L-NMMA；ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich）を含有する、ＭＤＳＣの様々な抑制メカニズムを標的とする試薬の存在下で一晩単独で培養し、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）について染色した。全ての細胞をLSRIIによって得、FlowJoによって分析した。適応型および普通型ＮＫ細胞をゲーティングし、図１７のゲーティング戦略に従って同定した。

トランスウェルアッセイ
健常な給血者由来の精製ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で２：１の比率で自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と５日間共培養し、２４ウェルプレートに、接触させて、またはトランスウェルインサート（０．４μｍの孔）（ニューヨーク州コーニングのCorning）で分離して可溶性因子交換のみを可能にして、播種した。細胞を抗ＣＤ１６で６時間刺激した後、脱顆粒およびＩＦＮγ産生について、上記のように染色した。

共焦点顕微鏡法
ＭＤＳＣおよび単球を、２０分間、CellTracker Blue（１４μＭ、カリフォルニア州カールスバッドのInvitrogen）で予め標識した。その後、それらをＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）で一晩予備活性化したＮＫ細胞と共に４０分間共培養した。混合した細胞をポリリシンで前処理したカバーガラス上に３０分間載せ、３％ＢＳＡでブロックし、２％パラホルムアルデヒド中で３７℃で３０分間固定した。固定後、細胞を抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＶＲ（ＣＤ１５５）で室温で２時間染色し、次いで共焦点顕微鏡法の前に蛍光標識した二次抗体で１時間染色した。

Phosflow
健常な供血者由来の精製ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、ＴＩＧＩＴに対する遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）またはカタラーゼ（２００ＩＵ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、自家ＭＤＳＣまたは新鮮な単離単球と２：１の比率で共培養した。次いで、細胞を洗浄し、４時間休止させ、抗ＣＤ１６アゴニスト抗体で１０分間および３０分間刺激した。その後、それぞれＺａｐ－７０およびＥＲＫ１／２リン酸化の分析を行った。細胞をＢＤ固定緩衝液および透過緩衝液ＩＩＩで固定して透過性にし、製造業者（ニュージャージー州フランクリンレイクのBD Bioscience）の指示書に従ってｐＺａｐ－７０（ｐＹ３１９）／Ｓｙｋ（ｐＹ３５２）およびｐＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）について染色した。

クロム放出アッセイ
ＴＩＧＩＴに対する遮断抗体（１０μｇ／ｍＬ）またはＲＯＳスカベンジャーカタラーゼ（２００ＩＵ／ｍＬ）の存在下または非存在下での単球またはＭＤＳＣとの５日間の共培養の後、ＮＫ細胞の細胞傷害性を、Ｋ５６２（バージニア州マナサスのATCC）細胞に対する５：１～２．５：１のエフェクター：標的比でのクロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイ（４時間）により分析した。^５１Ｃｒ放出をγシンチレーションカウンター（マサチューセッツ州ウォルサムのPerkin Elmer）によって測定し、特異的標的溶解を測定した。

ＭＤＳＣ抑制の生体外分析
ＭＤＳ患者および健常ドナーからのＰＢＭＣを一晩休止させ、ＭＤＳＣを上記のように単離した。ＮＫ細胞および単球を、以前に記載されているように、一晩休止させた健常なＰＢＭＣから単離した。ＮＫ細胞を、５日間、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、単球または同種異系ＭＤＳ ＭＤＳＣと２：１の比率で共培養した。抗ＣＤ１６で６時間刺激した後、ＴＩＧＩＴに対する遮断抗体の存在下または非存在下で脱顆粒、増殖、ならびにＩＦＮ－γおよびＴＮＦα産生についてＮＫ細胞を評価した。

統計解析
全てのデータを、上記のソフトウェアで最初に分析し、Prism Version 6ソフトウェア（カリフォルニア州ラホヤのGraphPad Software）によって要約した。全てのデータを最初に正規分布について検定した。その後、（図の凡例に示されているように）スチューデントのｔ検定またはノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定によって群間の差異を分析した。インビトロアッセイについては、平均およびＳＥＭとして、ＭＤＳ患者由来の細胞を用いて行った実験については、平均およびＳＤとして、データを提示した。代表的なヒストグラムまたは画像を、平均値に基づいて選択した。

実施例8
成熟樹状細胞のＣＭＶペプチドのプールによるパルス化が、適応型ＮＫ細胞の増殖を誘導する。
１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を補充したCellGro培地（２．５％ヒトＡＢ血清）中で単球（２×１０^６／ｍＬ）を培養して、未成熟樹状細胞への単球の成熟を誘導した。培養５日後、未成熟樹状細胞を回収し、スピンダウンし、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）（未成熟樹状細胞の場合）、またはＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）（２０μｇ／ｍＬ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＦＮ－γ（１０００ＩＵ／ｍＬ）（成熟樹状細胞の場合）を補充した新鮮なCellGro培地（２．５％ヒトＡＢ血清）に１×１０^６細胞／ｍＬで播種した。選択した成熟樹状細胞培養物に、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール（１０μｇ／ｍＬ）（カタログ番号１１５４９、メリーランド州ジャーマンタウンのNational Institutes of Health AIDS Reagent Program；プール中のペプチドのリストは、aidsreagent.org/pdfs/11549_TAB_002.pdfでワールドワイドウェブで入手できる）またはＨＩＶ ＰＴＥ Ｇａｇペプチドプール（１０μｇ／ｍＬ）（カタログ番号１２４３７、メリーランド州ジャーマンタウンのNational Institutes of Health AIDS Reagent Program；プール中のペプチドのリストは、aidsreagent.org/support_docs/11554_Lot21164_Solubility-MW-Purity.docxでワールドワイドウェブで入手できる）をさらに補充したか、または補充しなかった。自家ＰＢＭＣを５日目に解凍し、３７℃で１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で一晩休止させた。

６日目に、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞およびＣＤ１４^＋単球を、一晩休止させたＰＢＭＣからビーズ選別によって単離した。次いで、ＮＫ細胞、および新鮮な単球、培養未成熟樹状細胞、培養成熟樹状細胞、培養ＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞、または培養ＨＩＶペプチド補充成熟樹状細胞のいずれかを用いて、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、１：１の比率で２４穴プレートに自家共培養物を作製した。ＮＫ細胞単独の培養条件も作製した。次いで、細胞をＦＡＣＳ分析の前に１２～１４日間培養した。

結果が図１９に示されており、成熟樹状細胞のＣＭＶペプチドのプールによるパルス化が、適応型ＮＫ細胞の増殖を誘導することを示されている。

実施例９
自家単球およびＩＬ－１５の存在下で培養した場合、ＣＭＶ血清陽性ドナーからのＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋表現型に偏っている。
類別された健常なＣＭＶ血清陰性および血清陽性ドナー由来のＣＤ３／ＣＤ１９欠失末梢血単核細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と培養した。ＣＭＶ血清陰性およびＣＭＶ血清陽性ドナー由来の培養前および培養後のＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋ＮＫ細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳを使用して測定した。

図２０に示されているように、自家単球およびＩＬ－１５の存在下で培養した場合、ＣＭＶ血清陽性ドナーからのＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋表現型に偏っている。

実施例１０
適応型ＮＫ細胞はＴｒｅｇ媒介性抑制に抵抗性である。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を以下の方法を用いてインビトロで作製した：ＣＭＶ血清陽性ドナーから密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。次に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を磁気ビーズ分離によって全ＰＢＭＣから単離した。次いで、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を選別して、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏｗＴｒｅｇ集団を単離した。次いで、選別したＴｒｅｇを、照射したＫ５６２－ｍｂＩＬ－２１フィーダー株、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、および３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２と共に２１日間培養液中で増殖させた。次いで、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を補充した培地中で６日間、自家または同種異系ＮＫ細胞およびＨＬＡ－ＤＲ^＋抗原提示細胞と１：１、１：２、１：４、または１：８の比率で増殖させたＴｒｅｇを培養した。機能的実験のために、ＮＫ細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６アゴニスト抗体、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１２、および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１８で５時間刺激した。

フローサイトメトリーを用いて、普通型（ＣＤ５６^＋ＣＤ５７^＋ＦｃεＲγ^＋ＮＫＧ２Ｃ^－）および適応型（ＣＤ５６^＋ＣＤ５７^＋ＦｃεＲγ^－ＮＫＧ２Ｃ^＋）ＮＫ細胞サブセットの増殖を分析した。図２１に示されているように、適応型ＮＫ細胞はＴｒｅｇ媒介性抑制に抵抗性である。図２１Ａは、各培養条件においてCellTrace色素希釈を示したＮＫ細胞のパーセンテージを示す。図２１Ｂは、抗ＣＤ１６アゴニスト抗体、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８で刺激した後の培養ＮＫ細胞に関する脱顆粒（ＣＤ１０７ａ発現によって測定）およびＩＦＮ－γ産生を示す。図２１Ｃは、抗ＰＤ１(クローンＭＩＨ４；色：APC;カリフォルニア州サンディエゴのeBioscience Inc.)および抗ＴＩＭ３(クローン：F382E2;色: BV650,カリフォルニア州サンディエゴのBioLegend）を用いてＦＡＣＳにより測定した、培養ＮＫ細胞上のＰＤ１およびＴＩＭ－３の発現を示す。結果は２つの独立した実験からのものである。ｐ値は対応のあるスチューデントのｔ検定から得た。

本明細書に挙げられている全ての特許、特許出願、および刊行物、および電子的に利用可能な材料（例えば、GenBankおよびRefSeqなどにおける塩基配列の投稿、ならびにSwissProt、PIR、PRF、PDBなどにおけるアミノ酸配列の投稿、ならびにGenBankおよびRefSeqにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示が、本明細書の一部を構成するものとして援用される。本出願の開示と、本明細書の一部を構成するものとして援用される文献の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が適用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ示したものである。そこから不必要な制限が理解されるべきではない。本発明は、図示され説明された正確な詳細に限定されず、当業者に自明の変形が特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれる。

別段の定めがない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、別段の定めがない限り、明細書および特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、また、特許請求の範囲に均等論を限定しようとするものではないが、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効けたの数を考慮して、通常の丸め方を適用することにより、解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の実施例に示される数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、全ての数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。

全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、指定されていない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されているものではない。

Claims (12)

1. 培地中に存在する、適応型ＮＫ細胞の富化された集団または単離された集団であって、
   （ａ）前記培地が、
   （ｉ－ａ）ＩＬ－１５及びラパマイシン（さらに任意にＩＬ－２１及びＣＤ１６シグナル伝達の活性化因子の少なくとも１つを含んでいてもよい）；
   （ｉｉ－ａ）ＣＭＶペプチド補充成熟樹状細胞；又は
   （ｉｉｉ－ａ）ＮＫ細胞の集団が、ＣＭＶ血清陽性の対象の血液試料からのＮＫ細胞を含む場合、自家単球およびＩＬ－１５；
   を含み、
   （ｂ）前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５６^ｄｉｍであり、またＮＫＧ２Ｃ^＋およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、
   培地中に存在する富化された集団または単離された集団。
2. 前記培地がさらにＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１のうちの少なくとも１つの阻害剤を含む、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
3. 前記適応型ＮＫ細胞が、ＰＬＺＦ、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１のうちの少なくとも１つが遺伝的にノックダウンされたものである、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
4. ＴＩＧＩＴ阻害剤が、ＴＩＧＩＴに対する抗体を含む、請求項２記載の富化された集団または単離された集団。
5. 前記適応型ＮＫ細胞が、ＣＤ５７^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの少なくとも１つである、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
6. （ｉ）前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞の集団と比較してＰＬＺＦの発現の減少を示す、
   （ｉｉ）前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞の集団と比較して抗腫瘍免疫活性の増強を示す、または
   （ｉｉｉ）前記適応型ＮＫ細胞が、培養前の前記ＮＫ細胞の集団と比較して、細胞傷害性の増加、サイトカイン産生の増加、持続性の増加、およびＴ調節細胞に対する抵抗性の増加のうちの１つ以上を示す、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
7. 前記適応型ＮＫ細胞が、
   （ｉ）ＣＤ５６^ｄｉｍであり、またＮＫＧ２Ｃ^＋、ＣＤ５７^＋、およびＴＩＧＩＴ^ｌｏｗのうちの１つ以上である、
   （ｉｉ）ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋であり、またＣＤ５７^＋、ＮＫＧ２Ｃ^＋、ＳＹＫ^－、ＦｃεＲγ^－、ＥＡＴ－２^－、ＣＤ５６^ｄｉｍ、ＴＩＧＩＴ^ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＯ^＋、およびＣＤ４５ＲＡ^－のうちの少なくとも１つである、
   （ｉｉｉ）ＣＤ５６^ｄｉｍであり、またＮＫＧ２Ｃ^＋である、または
   （ｉｖ）標準ＮＫ細胞と比較してＰＬＺＦおよびＰＤ－１のうちの少なくとも１つの発現の減少を示す、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
8. 前記適応型ＮＫ細胞が、
   （ｉ）標準ＮＫ細胞と比較して抗腫瘍免疫活性の増強を示す、
   （ｉｉ）骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が誘発する免疫応答の抑制を克服することができる、
   （ｉｉｉ）Ｔｒｅｇが誘発する免疫応答の抑制を克服することができる、または
   （ｉｖ）標準ＮＫ細胞と比較して長命である、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
9. 前記培地が、（ｉ）ＣＤ１５５阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、および反応性酸素種（ＲＯＳ）産生阻害剤のうちの少なくとも１つ、ならびに／または（ｉｉ）薬剤的に許容できる担体、をさらに含む、請求項１記載の富化された集団または単離された集団。
10. （ｉ）ＲＯＳ産生阻害剤が、カタラーゼを含む、または（ｉｉ）ＲＯＳ産生阻害剤もしくは前記ＣＤ１５５阻害剤が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上のＣＤ１５５の発現を減少させるのに十分な量で存在する、請求項９記載の富化された集団または単離された集団。
11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の富化された集団または単離された集団を含む、癌、前癌状態またはウイルスを治療または予防するための、治療剤又は予防剤。
12. 前記対象が骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む、請求項１１記載の治療剤又は予防剤。