ES2218994T3

ES2218994T3 - Linea celular inmunomoduladora universal que expresa citocinas y composiciones relacionadas y procedimientos de fabricacion y uso.

Info

Publication number: ES2218994T3
Application number: ES99905651T
Authority: ES
Inventors: Hyam I. Levitsky; Ivan Borrello
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: ATE264911T1; CA2318372A1; US20110287058A1; US20080260758A1; US6464973B1; CA2318372C; US7390483B2; DE69916581T2; US8012469B2; US20060140922A1; AU2576499A; KR20010074426A; DE69916581D1; WO1999038954A1; EP1053301B1; US20020037282A1; JP2002501741A; JP4303887B2; AU741602B2; EP1053301A1

Abstract

Una línea celular espectadora universal, que: (i) es una línea celular humana, (ii) carece naturalmente de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) y de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) o se modifica de tal forma que carezca de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II, y (iii) está modificada mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) operativamente unido a un promotor. en la que dicha línea celular espectadora universal expresa al menos 500 ng de GM-CSF/106 células/24 horas.

Description

Línea celular inmunomoduladora universal que expresa citocinas y composiciones relacionadas y procedimientos de fabricación y uso.

Esta solicitud reivindica la prioridad sobre la solicitud de patente provisional de EE.UU. en trámite nº. de serie 60/073,405, que se presentó el 2 de febrero de 1998.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a una línea celular espectadora inmunomoduladora universal que expresa citocinas, a una composición que comprende tal línea celular y un antígeno de cáncer y a un procedimiento para usar tal composición.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia del cáncer es un tratamiento terapéutico del cáncer. Se basa en la premisa de que la incapacidad del sistema inmune para rechazar los tumores que surgen espontáneamente está relacionada con la incapacidad del sistema inmune para responder apropiadamente a los antígenos de los tumores. En un sistema inmune que funciona, los antígenos de los tumores se procesan y se expresan en la superficie celular en el contexto de las moléculas de clase I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), a las que, en los humanos, también se hace referencia como moléculas "asociadas a leucocitos humanos" (HLA). Cuando se acomplejan con los antígenos, las moléculas MHC de clase I y II son reconocidas por las células T CD8^{+} y CD4^{+} respectivamente. Este reconocimiento genera un conjunto de señales celulares secundarias y la liberación de paracrina de citocinas específicas o los denominados "modificadores de la respuesta biológica" solubles que median interacciones entre células y estimulan las defensas del huésped para combatir la enfermedad. La liberación de citocinas da como resultado entonces la proliferación de células T específicas de antígeno.

La inmunoterapia activa implica la inyección de células cancerosas o tumorales para generar o bien una respuesta inmune sistémica nueva o potenciada. Las células tumorales empleadas pueden ser autólogas, es decir, obtenidas del huésped que se va a tratar, o alogeneicas, es decir, obtenidas de un huésped diferente al que se va a tratar. Se hace referencia a tal estrategia como una "vacuna", queriendo decir el uso de una fuente de antígenos, como una célula tumoral o cancerosa intacta, para estimular una respuesta inmune frente al cáncer metastásico establecido, no la inmunización profiláctica.

El uso de células tumorales autólogas como "vacunas" para aumentar la inmunidad antitumoral se ha investigado extensamente (Oettgen y col., en Biologic Therapy of Cancer, DeVita y col., eds. (Lippincott, Philadelphia, PA), págs. 87-119 (1991)). Aunque parece que unos pocos pacientes se han beneficiado de las vacunas de cáncer autólogas, su uso ha dado solo resultados parciales y que han durado poco. Así, se han hecho numerosos intentos para mejorar la eficacia de las vacunas de cáncer. Dichos intentos incluyen la radiación y/o la modificación química, la infección de células tumorales autólogas con virus antes de la reinyección en un paciente, y la transfección/transducción de las células tumorales con genes que codifican moléculas relevantes inmunológicamente, como citocinas o moléculas coestimuladoras de células T. Estos intentos, que se han explorado inicialmente en modelos de tumores murinos, han demostrado la capacidad de cebar respuestas inmunes sistémicas capaces de mediar el rechazo de tumores micrometastáticos en sitios lejanos. El análisis de los mecanismos de las respuestas inmunes antitumorales generadas mediante tal vacunación ha subrayado la importancia de la rama de células T del sistema inmune en el rechazo de tumores. Se han usado también inmunoestimulantes no específicos, aunque se ha obtenido poca mejora.

En el nivel clínico, la transfección/transducción de células tumorales con genes que codifican moléculas inmunológicamente relevantes, implica la cirugía del tumor, el cultivo de células aisladas del tumor, la transfección/transducción de las células tumorales cultivadas con un gen que codifica una molécula inmunológicamente relevante, como una citocina, por ejemplo, GM-CSF, la irradiación de las células tumorales transfectadas/transducidas, y la administración de las células tumorales irradiadas al paciente. Se ha mostrado que las células tumorales que se han modificado genéticamente para expresar diferentes factores, como IL-4, IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, G-CSF, JE, IL-7 e IL-6, conducen al rechazo de las células modificadas genéticamente en huéspedes singeneicos (Tepper y col., Cell 57: 503-512 (1989); Li y col., Mol. Immunol. 27: 1331-1331 (1990); Golumbek y col., Science 254: 713-176 (1991); Fearon y col., Cell 60: 397-403 (1990); Gansbacher y col., J. Exp. Med. 172: 1217-1224 (1990); Gansbacher y col., Cancer Res. 50: 7820-7825 (1990); Watanabe y col., PNAS USA 86: 9456-9460 (1989); Asher y col., J.Immunol. 146: 3227-3234 (1991); Blankestein y col., J. Exp. Med. 173: 1047-1052 (1991); Teng y col., PNAS USA 88: 3535-3539 (1991); Colombo y col., J. Exp. Med. 173:889-897 (1991); Rollins y col., Mol. Cell. Biol. 11:3125-3131 (1991); Hock y col., J. Exp. Med. 174:1291-1298 (1991); Aoki y col., PNAS USA 89: 3850-3854 (1992); Porgador y col., Cancer Res. 52:3679-3686 (1992)). Se ha demostrado que la inmunidad sistémica aumenta con las células que expresan IL-4, IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-7 o IL-6 (Golumbek y col. (1991), supra; Porgador y col. (1992), supra).

Diferentes estudios que comparan células tumorales autólogas, transducidas con citocinas, irradiadas, han demostrado que las células tumorales autólogas transducidas con GM-CSF son los inductores más potentes de inmunidad tumoral específica duradera (Dranoff y col., PNAS USA 90:3539-3543 (1993); véase también, Asher y col., J. Immunol. 146: 3327-3334 (1990); Sanda y col., J. Of Urology 151:622-628 (1994); Simons y col., Cancer Research 57:1537-1546 (1997)). Se ha demostrado la eficacia de las vacunas transducidas con GM-CSF en modelos preclínicos de melanoma, linfoma, y cánceres de pulmón, colon, riñón y próstata (Dranoff y col. (1990), supra; Golumbek y col. (1991), supra; Sanda y col. (1994), supra; Jaffee y col., J. Immunother. 18:1-9 (1995), Caducci y col., Cancer (Phila.) 75: 2013-2020 (1995); Vieweg y col., Cancer Res. 54: 1760-1765 (1994); Jaffee y col., J. Immunother. 19:1-8 (1996); Levitsky y col., J. Immunol. 156:3858-3865 (1996)). En el sitio de la vacunación, el GSM-CSF activa localmente (paracrina) las células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo las células dendríticas y los macrófagos. Las APC ceban posteriormente las células-T CD4^{+} y CD8^{+}, que reconocen antígenos asociados a tumores en sitios metastáticos, mediando por ello la inmunidad antitumoral sistémica.

Han tenido lugar varias pruebas clínicas de fase I en pacientes con cáncer metastático. En la Johns Hopkins University, se trataron pacientes con carcinoma de células renales metastático o bien con células tumorales autólogas irradiadas no modificadas o con células tumorales autólogas irradiadas transducidas para secretar GM-CSF. Los parámetros de inmunidad medidos fueron análogos a los que se habían visto en los modelos de ratón y la randomización permitió una clara demostración del papel del GM-CSF como adyuvante molecular. Una prueba posterior en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata metastático con células tumorales transducidas con GSM-CSF autólogas amplió estas observaciones. Hay una prueba en curso en el Dana Farber Cancer Institute en la que los pacientes con melanoma metastático se están tratando con células tumorales autólogas transducidas con GM-CSF.

Los estudios piloto en la Johns Hopkins University y en el Dana Farber Cancer Institute y en otros sitios han prestado apoyo al uso de vacunas de tumores autólogas transducidas con citocinas como procedimiento terapéutico de tratamiento. Para muchas malignidades, se obtienen fácilmente grandes cantidades de células tumorales autólogas en la presentación anterior a la cirugía o a la remisión inducida por quimioterapia. Para enfermedades como las leucemias agudas o crónicas, el linfoma, y el carcinoma colónico, se pueden obtener bien sobre 5 x 10^{9} células tumorales y almacenarse con metodologías actualmente en uso en la mayoría de los centros de tratamiento de cáncer. Sin embargo, la necesidad del cultivo in vitro para permitir la transferencia de genes y la incapacidad para obtener reproduciblemente y uniformemente niveles altos de producción de GM-CSF mediante dichos procedimientos, limita este enfoque terapéutico.

Para sortear este problema, varios investigadores están llevando a cabo estudios de inmunización con líneas celulares de tumores alogeneicas transfectadas con GM-CSF, como en el tratamiento de cáncer de próstata y pancreático. La razón para este enfoque es que el/los antígeno(s) tumoral(es) relevante(s) pueden compartirse entre la línea celular tumoral alogeneica inmunizante y el tumor del paciente que se está inmunizando. Dado que los antígenos tumorales relevantes no se han definido en la mayoría de estos sistemas, esta suposición queda todavía como no probada.

En vista de lo anterior, serían muy deseables los materiales y procedimientos que obviaran la necesidad del cultivo in vitro con fines de transferencia de genes a células tumorales autólogas y que permitieran la producción de citocinas inmunomoduladoras reproducible y uniforme, por ej, GM-CSF. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar tales materiales y procedimientos. Este y otros objetos y ventajas se verán gracias a la descripción detallada proporcionada en la presente memoria descriptiva.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona una línea celular espectadora inmunomoduladora universal que expresa citocinas. La línea celular espectadora universal es una línea celular humana, que o bien carece naturalmente de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase I(MHC-I) y de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) o está modificada de tal forma que carece de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II. Además, la línea celular espectadora universal está modificada por la introducción de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor. Preferentemente, la citocina inmunomoduladora es el factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF). La línea celular espectadora universal expresa preferentemente al menos aproximadamente 500 ng, más preferentemente al menos aproximadamente 1000 ng de GM-CSF/ 10^{6} células/ 24 horas. Alternativamente y también preferentemente, la citocina inmunomoduladora es interleucina 2 (IL-2). Preferentemente, la línea celular humana está caracterizada por la ausencia de marcadores de linfocitos B de inmunoglobulina, un genoma de virus de Epstein-Barr (EBV) y un antígeno nuclear asociado, y receptores para EBV. Una línea celular humana preferida es la que se obtiene de una crisis blástica de leucemia mieloide crónica. Un ejemplo de una línea celular preferida es la K562. Preferentemente, la línea celular espectadora universal crece en medio definido, es decir, exento de suero. El promotor al que se une operativamente la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora es preferentemente un promotor de citomegalovirus. Preferentemente, la línea celular espectadora universal comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la resistencia a higromicina operativamente unida a un promotor y se selecciona mediante el crecimiento en medio de cultivo que comprende al menos 400 \mug/ml de higromicina, preferentemente seguido por el crecimiento en medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 1000 \mug/ml de higromicina.

La presente invención también proporciona una composición que comprende la línea celular espectadora universal y un antígeno de cáncer. También proporciona un procedimiento para preparar una línea celular espectadora inmunomoduladora universal que expresa citocinas, así como un procedimiento de estimulación de una respuesta inmune frente a un cáncer en un paciente humano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica estadística de los ng de GM- CSF/10^{6} células /24 horas frente a la línea celular.

La Figura 2A es una gráfica de las cuentas frente a la fluorescencia relativa para la expresión del antígeno MHC-I.

La Figura 2B es una gráfica de las cuentas frente a la fluorescencia relativa para la expresión del antígeno MHC-II.

La Figura 3 es una gráfica del porcentaje (%) de células viables (azul trypan negativas) frente a los días post-irradiación.

La Figura 4 es una gráfica del % de supervivencia libre de tumor frente a los días de desafío post-tumor.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la observación de que, en el contexto de una vacuna para el cáncer, la célula cancerosa, no necesita directamente producir una citocina inmunomoduladora, como GM-CSF, para estimular una respuesta inmune contra la célula cancerosa. La presente invención, se basa adicionalmente en el sorprendente e inesperado descubrimiento de que se puede hacer una línea celular espectadora universal, que puede producir localmente una citocina inmunomoduladora, como GM-CSF, a altos niveles sin precedentes. La presente invención es ventajosa en cuanto a que mediante la administración a un paciente de una composición que comprende la célula espectadora universal y un antígeno de cáncer autólogo, por ejemplo, una célula tumoral autóloga, se consiguen la producción paracrina de una citocina inmunomoduladora, como GM-CSF, el reclutamiento adecuado de APC, y el cebado con éxito contra los antígenos cancerosos, obviando por ello la necesidad de cultivar y transducir células tumorales autólogas para todos y cada uno de los pacientes y de enfrentarse a eficiencias de transducción variables y a menudo ineficaces.

En vista de los anterior, la presente invención proporciona una línea celular espectadora inmunomoduladora, universal, productora de citocinas. La línea celular es una línea celular de mamífero, preferentemente humano, que carece naturalmente de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) y de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) o está modificada de tal manera que carece de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II. Teóricamente, se puede usar cualquier línea celular de mamífero, preferentemente humano, que sea capaz de dar lugar a la producción paracrina de una citocina inmunomoduladora. La línea celular humana preferentemente está caracterizada por la ausencia de marcadores de linfocitos B de inmunoglobulina, un genoma de virus de Epstein-Barr (EBV) y un antígeno nuclear asociado, y receptores para EBV. Una línea celular humana preferida es la que se obtiene de una crisis blástica de leucemia mieloide crónica. Un ejemplo de línea celular humana preferida es la K562 (ATCC CCL-243; Lozzio y col., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein y col., Int. J. Cancer 18:421-431 (1976)). La línea celular espectadora preferentemente crece en medio definido, es decir, exento de suero. Además, la línea celular espectadora universal preferentemente crece como suspensión.

Las células que carecen de los antígenos MHC-I pueden conseguirse interfiriendo con la expresión y/o transporte de la cadena \alpha. Las células que carecen de los antígenos MHC-II se pueden conseguir interfiriendo con la expresión y/o transporte de las cadenas \alpha y \beta. La inactivación de los antígenos MHC-I y MHC-II se puede conseguir de una variedad de formas (véase por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5,574,205). Por ejemplo, se puede crear un "dominante negativo". Se puede sobreexpresar un único gen de microglobulina \beta2 modificado, cuya proteína producto se acompleja eficazmente con moléculas de MHC-I y actúa como reclamo, previniendo por tanto la inserción de antígenos de MHC-I en la membrana. Un enfoque similar se puede usar con respecto a los antígenos MHC-II sobreexpresando genes modificados que codifican subunidades \alpha o \beta defectuosas que se acomplejan con las subunidades de las células huésped haciéndolas no funcionales. Se pueden usar la transfección, la infección retroviral o la recombinación homóloga para conseguir la expresión de genes de microglobulina \beta_{2} o MHC modificados o la inactivación de los genes.

Los niveles del antígeno MHC-I en la superficie celular se pueden reducir introduciendo en las células mediante transfección o infección retroviral una secuencia que codifica la proteína E19 adenoviral. La proteína forma complejos específicamente con los antígenos MHC-I en el retículo endoplásmico rugoso evitando el transporte normal de las moléculas MHC-I a la membrana plasmática (Andersson y col., Cell 43: 215-222 (1985); Pabo y col., Advances in Cancer Research 42: 151-163 (1989)).

Además de carecer de los antígenos MHC-I y MHC-II o de modificarse para carecer de los antígenos MHC-I y MHC-II, la línea celular de mamífero, preferentemente humano, se modifica mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor.

Por "modificado" se entiende la proporción a la línea celular espectadora universal de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo vector, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina que o no se expresa en la línea celular, o como resultado de la proporción de la molécula de ácido nucleico, se expresa ahora a un nivel mayor. Un "vector" abarca una molécula de ADN, como un plásmido, virus u otro vehículo, que contiene uno o más secuencias de ADN recombinante o heterólogo, por ejemplo, un gen de citocina o secuencia codificante de citocina de interés, bajo el control de un promotor funcional y posiblemente también un potenciador, y que es capaz de funcionar como vector como es entendido el término por aquellos con conocimiento habitual de la técnica.

Se puede emplear cualquier vector adecuado que sea apropiado para la introducción de ácidos nucleicos en células eucarióticas, o más particularmente células animales, como células de mamífero, por ejemplo, humano. Preferentemente, el vector es compatible con la célula, por ejemplo, es capaz de conferir la expresión del gen de citocina o secuencia codificante, y se mantiene establemente o se mantiene relativamente establemente en la célula. Deseablemente, el vector comprende un origen de replicación. Cuando una secuencia codificante de citocina se transfiere (es decir, opuesta a un gen de citocina que tiene su propio promotor), óptimamente, el vector también contiene un promotor que es capaz de conducir la expresión de la secuencia codificante y que está operativamente ligado a la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "operativamente ligada" a un promotor (por ejemplo, cuando tanto la secuencia codificante como el promotor juntos constituyen un gen de citocina nativo o recombinante) cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de la secuencia codificante.

Los vectores virales apropiados incluyen, pero no se limitan al virus 40 de simio, el virus de papiloma bovino, el virus de Epstein-Barr, el adenovirus, el herpes virus, el virus vaccinia, el virus de leucemia murina Moloney, el virus de sarcoma murino Harvey, el virus del tumor mamario murino, y el virus del sarcoma de Rous. Cualquier plásmido adecuado para uso en un eucariota, en particular un mamífero, por ejemplo un humano, se puede usar en el contexto de la presente invención. Deseablemente, el plásmido comprende un promotor, como el promotor de citomegalovirus, un origen de replicación, como el origen de replicación de SV40, un marcador seleccionable, como la resistencia a antibiótico, y proporciona ARNm con colas poli A. Un ejemplo preferido de plásmido es el pCEP4 (Véase Ejemplo I).

La referencia a un vector u otras secuencias de ADN como "recombinantes" simplemente admite la unión de secuencias de ADN que no están típicamente unidas cuando se aislan de la naturaleza. Un "gen" es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína o una molécula de ARNm naciente. Mientras que un gen comprende secuencias codificantes y secuencias no codificantes (por ejemplo reguladoras), una "secuencia codificante" no incluye ningún ADN no codificante. Un "promotor" es una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y por lo tanto promueve la síntesis de ARN. Los "potenciadores" son elementos de ADN que actúan en cis que estimulan o inhiben la transcripción de genes adyacentes. Un potenciador que inhibe la transcripción también se denomina "silenciador". Los potenciadores difieren de los sitios de unión a ADN para proteínas de unión a ADN específicas de secuencia encontradas solo en el promotor (que también se llaman "elementos promotores") en que los potenciadores pueden operar en cualquier orientación, y sobre distancias de hasta varios pares de kilobases (kb), incluso desde una posición cadena abajo de una región transcrita.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el "gen" o la "secuencia codificante" de citocina incluye secuencias de ADN o genómicas de citocina, secuencias mayores y menores y mutaciones de éstas, o bien aisladas de la naturaleza o sintetizadas en su totalidad o en parte, siempre que el gen o la secuencia codificante pueda expresar una proteína que tenga la función característica de la citocina, es decir, la capacidad para estimular la respuesta inmune del huésped. Los medios para modificar genes o secuencias codificantes son bien conocidos en la técnica, y pueden ser llevados a cabo por medio de kits disponibles comercialmente (por ejemplo, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). El gen o secuencia codificante de citocina puede ser de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, una especie mamífera como un humano. Preferentemente sin embargo, el gen o secuencia codificante de citocina comprende una secuencia de GM-CSF, particularmente un gen o secuencia codificante de GM-CSF humano, que incluye una secuencia de ADNc de GM-CSF (por ejemplo, como describe Cantrell y col., PNAS USA 82: 6250-6254 (1985)).

Preferentemente, todas las señales de transcripción, traducción y procesamiento adecuadas (por ejemplo, señales de ayuste y poliadenilación) se disponen correctamente en el vector de tal forma que el gen o secuencia codificante de la citocina se transcribirá y se traducirá apropiadamente en la célula en la que se introduce. La manipulación de dichas señales para asegurar la expresión apropiada en las células huésped es buena dentro del conocimiento y la experiencia del experto en la materia. Mientras que el gen de citocina está controlado por (es decir, operativamente unido a) su propio promotor, otro promotor, incluyendo un promotor constitutivo, como por ejemplo el promotor mayor tardío (MLP) adenoviral de tipo 2 (Ad2) o de tipo 5 (Ad5) y líder tripartito, el promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV-LTR), y otros, se puede emplear para ordenar la expresión de la secuencia codificante de citocina. El promotor de CMV es un promotor preferido.

Alternativamente, se puede usar en el vector un promotor específico de tejido (es decir, un promotor que es preferencialmente activado en un tejido dado y da como resultado la expresión de un producto génico en el tejido donde se activa). Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, la región de control del gen I de la elastasa, que es activa en las células acinares pancreáticas como describen Swift y col., Cell 38: 639-646 (1984) y MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987); la región de control del gen de la insulina, que es activa en las células beta pancreáticas como describe Hanahan, Nature 315: 115-122 (1985); el promotor específico de hepatocito para albúmina o \alpha1-antitripsina descrita por Frain y col., Mol. Cell. Biol.. 10:991-999 (1990), y Ciliberto y col., Cell 41: 531-540 (1985); y las regiones de control de los genes de albúmina y alfa-antitripsina, que son ambas activas en el hígado como describen Pinkert y col., Genes and Devel. 1: 268-276 (1987), y Kelsey y col., Genes y Devel. 1: 161-171 (1987).

De forma similar, se puede usar en el vector un promotor específico de tumor, como el antígeno carcinoembriónico para el carcinoma de colon descrito por Schrewe y col., Mol. Cell. Biol.. 10: 2738-2748 (1990). En las mismas líneas, los promotores que se activan selectivamente en diferentes etapas del desarrollo (por ejemplo los genes de globina se transcriben diferencialmente en embriones y adultos) se pueden emplear para terapia génica de ciertos tipos de cáncer.

Otra opción es usar un promotor inducible, como el promotor de IL-8, que responde ante el TNF, o el promotor de 6-16, que responde ante interferones, o usar promotores similares que responden a otras citocinas u otros factores presentes en un huésped o que se puedan administrar exógenamente. El uso de un promotor inducible por citocina tiene la ventaja añadida de permitir la expresión autoinducible de un gen de citocina. Según la invención, cualquier promotor puede ser alterado por mutagénesis, mientras tenga la capacidad de unión y fuerza del promotor deseadas.

Se pueden emplear diferentes procedimientos para administrar una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, a una célula in vitro. Por ejemplo, tales métodos incluyen la electroporación, la fusión de la membrana con liposomas, el bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN, la incubación con precipitado de fosfato de calcio-ADN, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la infección con ácidos nucleicos virales modificados, la microinyección directa en células simples, y similares. Están disponibles otros procedimientos y son conocidos por los expertos en la materia.

Si la línea celular espectadora universal se va a usar en el contexto de la inmunoterapia del cáncer, la citocina inmunomoduladora es la que estimula una respuesta inmune frente a una célula cancerosa o un antígeno de cáncer, es decir, cualquier proteína, carbohidrato u otro componente capaz de provocar una respuesta inmune. Una citocina inhibidora o una citocina que evita el cebado no se puede usar en el contexto de la inmunoterapia del cáncer. Mientras que la molécula de ácido nucleico preferentemente codifica una única citocina inmunomoduladora, la molécula de ácido nucleico puede codificar dos o más citocinas inmunomoduladoras, como citocinas que actúan sinérgicamente.

Los ejemplos de citocinas inmunomoduladoras adecuadas incluyen interferones (por ejemplo, IFN\alpha, IFN\beta e IFN\gamma), interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 e IL-12), factores de necrosis tumoral (por ejemplo TNF\alpha y TNF\beta), eritropoyetina (EPO), ligando de FLT-3, factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). La citocina inmunomoduladora más preferida es el GM-CSF, como la GM-CSF humana. Una citocina inmunomoduladora preferida alternativamente es la IL-2.

Deseablemente, la línea celular espectadora universal expresa niveles altos sin precedentes de una citocina inmunomoduladora, que preferentemente es GM-CSF. Preferentemente, la línea celular espectadora universal expresa al menos aproximadamente 500 ng de GM-CSF/10^{6} células / 24 horas. Más preferentemente, la línea celular espectadora universal expresa al menos aproximadamente 1000 ng de GM-CSF/10^{6}células/24 horas.

Para fines de identificación y selección, preferentemente la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida al promotor, comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor. Preferentemente, el marcador seleccionable es un gen de resistencia a antibióticos, como es el de resistencia a higromicina. Cuando el marcador seleccionable es de resistencia a higromicina, preferentemente la línea celular espectadora universal se selecciona mediante crecimiento en un medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 400 \mug/ml de higromicina, más preferentemente al menos aproximadamente 1000 \mug/ml de higromicina.

Además de lo anterior, la presente invención proporciona una composición que comprende la línea celular espectadora universal descrita anteriormente y un antígeno de cáncer. El antígeno de cáncer puede ser una célula cancerosa o un antígeno de superficie de célula cancerosa, como el que se ha producido recombinantemente o se ha inmunoprecipitado. Preferentemente, el antígeno de cáncer es una célula cancerosa, cuyo aislamiento y cultivo entra dentro de la experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 97/24132, en particular el Ejemplo 4). En lugar de una célula se puede usar un antígeno de superficie celular, cuando el antígeno de superficie celular se haya identificado y caracterizado y se haya determinado que induce una respuesta inmune anticáncer. A este respecto, la línea celular espectadora universal se puede modificar genéticamente para expresar un antígeno de cáncer. Por ejemplo, la célula espectadora se puede modificar genéticamente para expresar MAGE para el tratamiento de melanoma, ras para el tratamiento de cáncer pancreático, y BCR-ABL para el tratamiento de leucemia mielaginosa crónica.

Una composición o implantación apropiada para la administración in vivo, puede comprender vehículos o diluyentes apropiados, que pueden ser adicionalmente farmacéuticamente aceptables.

Las maneras de hacer tal composición o implantación han sido descritas en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., Mack, ed. (1980). En la composición se prefiere el uso de una solución de sal equilibrada, como es la solución de sal equilibrada de Hank.

En forma de dosis farmacéutica, se puede usar una composición sola o en asociación apropiada, así como en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos como se conocen en la técnica.

Una composición de la presente invención se puede proporcionar en forma de dosis unitaria, en la que cada unidad de dosis contiene una cantidad predeterminada de la composición, sola o en combinación apropiada con otros agentes activos. El término "forma de dosis unitaria" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para humanos y otros individuos mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de composición de la presente invención, sola o en combinación con otro agente activo, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, en asociación con un diluyente, o vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando sea apropiado. Las especificaciones para las formas de dosis unitarias nuevas de la presente invención dependen de la farmacodinámica particular asociada a la composición farmacéutica en el huésped particular.

La presente invención también proporciona un procedimiento para hacer una línea celular espectadora inmunomoduladora universal que expresa citocinas. En una forma de realización, el procedimiento comprende (i) obtener una línea celular de mamífero, preferentemente de humano, que no exprese los antígenos MHC-I y los antígenos MHC-II. (ii) modificar la línea celular de mamífero, preferentemente de humano, introduciendo en la línea celular de mamífero, preferentemente de humano, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor, y (iii) usar el marcador seleccionable para aislar células que produzcan al menos aproximadamente 500 ng de dicha citocina inmunomoduladora/10^{6} células/24 horas. En otra forma de realización, el procedimiento comprende (i) obtener una línea celular de mamífero, preferentemente de humano, (ii) modificar la línea celular de mamífero, preferentemente de humano de tal forma que no exprese antígenos MHC-I y antígenos MHC-II (iii), modificar adicionalmente la línea celular de mamífero, preferentemente de humano, introduciendo en la línea celular de mamífero, preferentemente de humano, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor; y (iv) usar el marcador seleccionable para aislar las células que produzcan al menos aproximadamente 500 ng de dicha citocina inmunomoduladora/10^{6} células/24 horas.

La molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor puede ser cualquier molécula de ácido nucleico adecuada para transferencia de genes como se describe anteriormente. El vector MFG retroviral, que se describe en la Patente de EE.UU. Nº. 5,637,483, permite el cribado rápido de un gran número de inmunomoduladores potenciales para los efectos inmunitarios sistémicos y el cálculo de la actividad de combinaciones complejas de moléculas. También proporciona alta concentración y expresión génica elevada. Otros vectores retrovirales que se pueden usar incluyen el pLJ, el pEm y el \alphaSGC (véase Patente de EE.UU. Nº 5,637,483 en particular el Ejemplo 12). Se puede usar cualquier citocina inmunomoduladora que estimule la respuesta inmune antitumoral (véase Patente de EE.UU. Nº 5,637,483 para ensayos). La citocina inmunomoduladora más preferida es el GM-CSF. Una citocina inmunomoduladora preferida alternativamente es la IL-2. Mientras que se puede usar cualquier marcador seleccionable, el marcador seleccionable es preferentemente un gen de resistencia a antibiótico, como resistencia a higromicina, en cuyo caso la línea celular modificada de mamífero, preferentemente de humano, se cultiva en medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 400 \mug de higromicina/ ml de medio de cultivo. Más preferentemente, la línea celular modificada de mamífero, preferentemente de humano, se cultiva posteriormente en medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 1000 \mug de higromicina/ ml de medio de cultivo. El medio de cultivo preferentemente es definido, es decir, exento de suero. Un promotor preferido para la expresión de la citocina inmunomoduladora en el procedimiento es un promotor de citomegalovirus.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento de estimulación de una respuesta inmune frente al cáncer en un paciente mamífero, preferentemente humano. Deseablemente, el procedimiento provoca una respuesta inmune sistémica, es decir, una respuesta de células T, al cáncer. El procedimiento comprende la administración al paciente de la composición descrita anteriormente, en la que la línea celular espectadora universal se obtiene de una línea celular de mamífero; preferentemente de humano, el antígeno de cáncer es un antígeno del cáncer del paciente, y la composición se hace incompetente para la proliferación, por ejemplo mediante irradiación. Se estimula una respuesta inmune al cáncer mediante la administración de la composición.

"Administración" quiere decir la introducción física real de la composición en el huésped. Se consideran según la invención cualesquiera de todos los procedimientos de introducción de la composición en el huésped; el procedimiento no depende de ningún medio particular de introducción y no va a ser así interpretado. Los medios de introducción son bien conocidos por los expertos en la materia, y se ejemplifican también en la presente memoria descriptiva.

Se puede usar cualquier vía de administración adecuada. Preferentemente, la composición se administra subcutáneamente o intratumoralmente. El experto en la materia reconocerá que, aunque se puede usar más de una vía para la administración, una vía particular, puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. La administración local o sistémica se puede llevar a cabo por medio de la administración que comprende la aplicación o instilación de la formulación en cavidades del cuerpo, la inhalación o insuflación de un aerosol, o por introducción parenteral, que comprende administración intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea, o intradérmica. En el caso de que el tumor esté en el sistema nervioso central, la composición se debe administrar intratumoralmente porque no hay cebado del sistema inmune en el sistema nervioso central.

Deseablemente, la citocina inmunomoduladora se obtiene de un humano, aunque se puede usar una citocina de una fuente no humana si es sustancialmente homóloga a la citocina humana y se ha demostrado que exhibe actividad similar. Preferentemente, el antígeno de cáncer es una célula del cáncer que se va a tratar, es decir, una célula cancerosa autóloga. Si la composición se hace incompetente para la proliferación por medio de irradiación, típicamente, las células espectadoras universales y las células cancerosas se plaquean en una placa de cultivo de tejido y se irradian a temperatura ambiente usando una fuente de ^{137}Cs. Preferentemente, las células se irradian a una tasa de dosis que va desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 rads/m, incluso más preferentemente, desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 140 rads/m. Preferentemente, las células se irradian con una dosis total suficiente para inhibir la mayoría de las células, es decir, preferentemente aproximadamente el 100% de las células, de la proliferación in vitro. Así, deseablemente las células se irradian con una dosis total que va desde aproximadamente 10000 hasta 20000 rads, óptimamente, con aproximadamente 15000 rads.

Además, el antígeno de cáncer, por ejemplo, una célula del cáncer que se va a tratar, es decir, una célula cancerosa autóloga, óptimamente se trata antes de la administración para potenciar su inmunogenicidad. Preferentemente, este tratamiento comprende, como se describe en la presente memoria descriptiva, manipulación genética adicional, como por ejemplo, la introducción de otra citocina o funciones coestimulatorias inmunes, o, por ejemplo, la mezcla con adyuvantes no específicos que incluyen pero no se limitan a adyuvante de Freund completo o incompleto, emulsiones formadas por componentes de la pared celular bacteriana y micobacteriana, y similares.

En general, la concentración de las células cancerosas autólogas debería ser suficiente para reclutar los APC en el sitio y dar como resultado una respuesta inmune mayor al cáncer que se va a tratar que la que daría como resultado de otra forma en la ausencia de dicho tratamiento. Preferentemente, se usan al menos desde aproximadamente
1 x 10^{6} hasta aproximadamente 1 x 10^{9}células cancerosas, incluso más preferentemente, desde aproximadamente
1 x 10^{7} hasta aproximadamente 5 x 10^{8} células cancerosas. Sin embargo, se pueden usar más o menos células dependiendo de la ruta de administración y de la presencia de otros agentes activos; etc.

La relación entre células espectadoras y células cancerosas autólogas en una administración dada, debería ser tal que se reportara un beneficio debido a la presencia de la célula espectadora productora de citocinas inmunomoduladora. Con respecto a las células espectadoras que producen GM-CSF, la relación entre células espectadoras y células cancerosas autólogas en una administración dada debería ser tal que al menos se produjeran 36 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas. La inmunidad anticáncer disminuye si la cantidad de GM-CSF es menor que ésta. Los niveles de citocinas por encima de esta cantidad no potencian más la eficacia. Además del umbral de GM-CSF, la relación entre células espectadoras y células cancerosas autólogas no debería ser mayor de 1:1; de otra manera, se ve afectada la eficacia total de la respuesta inmune. Las relaciones apropiadas entre células espectadoras y antígenos de cáncer aislados puede determinarse asimismo usando procedimientos de rutina en la técnica.

Un experto en la materia también está al tanto de los medios para observar una respuesta terapéutica (es decir, inmune sistémica) como resultado de la administración de una composición de la presente invención. En particular, la respuesta terapéutica se puede evaluar observando la atenuación del crecimiento del tumor y/o la regresión del tumor. La atenuación del crecimiento del tumor o la regresión del tumor en respuesta al tratamiento, se pueden seguir usando varios puntos finales conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, el número de tumores, la masa o el tamaño del tumor, o la reducción/prevención de la metástasis. Estos procedimientos descritos de ningún modo incluyen todos, y para el experto en la materia se presentarán procedimientos adicionales que se ajusten a la aplicación específica.

Cualquier tipo de cáncer se puede tratar según el presente procedimiento inventivo. El "Cáncer" como se usa en la presente invención incluye cánceres, en particular los de origen epitelial, caracterizados por la proliferación celular anormal y por la ausencia de inhibición por contacto, que puede ser evidenciada por la formación del tumor. El término abarca cáncer localizado en tumores, así como cáncer no localizado en tumores, como por ejemplo, células cancerosas que se expanden desde un tumor localmente por invasión. Así, el procedimiento tiene aplicabilidad como terapia adyuvante local para cánceres operados así como control local de crecimiento del cáncer, como carcinomas de la vejiga, pecho, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, recto y estómago, y como tratamiento de un sarcoma, por ejemplo, de fibrosarcoma o rabdosarcoma, de un tumor hematopoyético de linaje linfoide o mieloide, o de otro tumor, incluyendo pero sin limitarse a melanoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, o glioma.

El procedimiento de la presente invención se puede combinar con otros procedimientos de tratamiento de cáncer. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen la radiación, la cirugía y la quimioterapia. Además, el procedimiento de la presente invención se puede adaptar para mamíferos no humanos, por ejemplo, empleando una línea celular de mamífero no humano para generar la línea celular espectadora universal y una fuente mamífera no humana de una citocina inmunomoduladora.

La línea celular inmunomoduladora espectadora que expresa citocinas de la presente invención se puede usar también para contener la enfermedad autoinmune, por ejemplo, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple; etc. Además, la línea celular espectadora de la presente invención se puede usar para potenciar una respuesta inmune frente a una enfermedad infecciosa, como la infección por VIH, SIDA y malaria; etc., el injerto frente al rechazo del huésped, y el rechazo de injerto.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar su alcance.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la fabricación de una línea celular espectadora inmunomoduladora universal que expresa citocinas.

El gen GM-CSF humano se clonó por PCR a partir de sangre periférica humana. El producto de la PCR se clonó en los sitios de Hin dIII-Not I en el vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que utiliza el promotor de CMV humano y también codifica la resistencia a higromicina como marcador seleccionable. La porción de EBNA-1 de esta construcción se extrajo por digestión con las enzimas de restricción Cla I y Avr II.

El plásmido linealizado se usó para electroporar la línea celular humana K562. Las células resistentes a fármacos se seleccionaron inicialmente en presencia de higromicina a una concentración de 400 \mug/ml. Después de que se obtuvieran transfectantes estables, se calculó la producción de GM-CSF usando un ensayo ELISA en el cultivo a granel. El cultivo a granel que producía GM-CSF se seleccionó después en concentraciones de higromicina en aumento, hasta una dosis máxima de 1200 \mug/ml. Las células que fueron resistentes a la dosis alta de higromicina se subclonaron en presencia de 1200 \mug/ml de higromicina. Los subclones individuales se expandieron y se probó la cantidad de GM-CSF producida por ellos por millón de células en 24 horas mediante ELISA, usando el kit R&D Quantikine (R&D Minneapolis, MN). Los resultados se muestran en la Fig.1, que es una gráfica estadística de los ng de GM-CSF/10^{6}células/24 horas frente a la línea celular. Los subclones de K562 produjeron más de 1000 ng/10^{6} células/24 horas. Los subclones que produjeron las cantidades más altas de GM-CSF por célula se adaptaron posteriormente a cultivos en medio AIM-V 100% (Life Technologies/GIBCO, Gaithersburg, MD) en ausencia de cualquier suero bovino fetal. Las células continuaron produciendo GM-CSF durante al menos cuatro días después de la irradiación.

Las poblaciones celulares resultantes se caracterizaron en relación a la expresión de las moléculas HLA de Clase I y de Clase II. Las células K562 que expresaban GM-CSF y las células obtenidas de una línea celular de carcinoma de próstata humano (obtenida de un paciente e inmortalizada; Pro 22, Johns Hopkins University, Baltimore MD) se cultivaron en medio solo o en medio suplementado con IFN\gamma recombinante humano (100 unidades/ml x 24 horas). Las células se marcaron con los anticuerpos monoclonales primarios W632 (cadena pesada de clase I anti-humano), L243 (clase II antihumano), o mAb14.4.4 (I-E^{d} antirratón, un anticuerpo control irrelevante emparejado a isotipo). Las células se marcaron después con el anticuerpo secundario IgG2aFITC antirratón de cabra (Caltag, Burlingame, CA). Se recogieron diez mil eventos enjaulados en un FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA) y los datos se analizaron usando el paquete de software CellQuest. Las diferencias en la expresión de los antígenos MHC-I y MHC-2 entre las células K562 que expresaban GM-CSF y las células Pro 22 se muestran en la Fig. 2A y Fig. 2B, respectivamente, que son gráficas de cuentas frente a la fluorescencia relativa.

Las poblaciones celulares resultantes se caracterizaron también para su sensibilidad a la radiación ionizante. Las células K562 que expresaban GM-CSF se irradiaron o bien con 10000 o con 15000 rads mediante un irradiador gamma de cesio y después se colocaron en cultivo en 15 ml de medio 2,5 x 10^{6}células de cada. Las células se contaron y se registró el porcentaje de células azul de tripano negativas. Los resultados se muestran en la Fig.3, que es una gráfica del % de células viables (azul de tripano negativas) frente a los días postirradiación.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la proporción entre células espectadoras universales y células tumorales autólogas que se va a usar en una composición según la presente invención.

Una composición según la presente invención debe contener un número suficiente de células espectadoras para asegurar que al menos se producen 36 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas. Además, la relación entre células espectadoras y células tumorales no debe ser mayor de 1:1; de otra forma, la eficacia total de la respuesta inmune se verá afectada.

Ratones BALB/c se inyectaron intravenosamente con 1 x 10^{5} células A20 de tipo salvaje vivas (NCI, Bethesda, MD) el día cero. Cinco días después, los ratones se inmunizaron subcutáneamente con la composición indicada en la Fig. 4, que es una gráfica del % de supervivencia libre de tumor frente a los días de desafío post-tumor. Las células espectadoras alogeneicas se obtuvieron de un linfoma C3H (H-2k) transducido con un retrovirus (MFG) que codifica el GM-CSF de ratón, que produjo 100 ng/10^{6} células/24 horas. Las células A20 se transdujeron con la misma construcción, lo que dio como resultado 130 ng GM-CSF/10^{6} células/24 horas. Las células usadas en todas las composiciones se irradiaron con 5000 rads antes de la inyección.

Como se muestra en la Fig. 4, los subclones de células K562 que producían GM-CSF produjeron más de 1000 ng/10^{6}células/24 horas. El uso de dichos subclones permite el uso de tan pocas células espectadoras como una por cada 10 células tumorales autólogas con un claro margen de seguridad por encima del umbral de GM-CSF de 36 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas, localizando 100 ng/10^{6} células/24 horas.

Claims

1. Una línea celular espectadora universal, que:

(i): es una línea celular humana,

(ii): carece naturalmente de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) y de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) o se modifica de tal forma que carezca de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II, y

(iii): está modificada mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) operativamente unido a un promotor.

en la que dicha línea celular espectadora universal expresa al menos 500 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas.

2. La línea celular espectadora universal de la reivindicación 1, en la que dicha línea celular humana se caracteriza por la ausencia de marcadores de linfocitos B de inmunoglobulina, un genoma del virus de Epstein-Barr (EBV) y un antígeno nuclear asociado, y receptores para EBV.

3. La línea celular espectadora universal de la reivindicación 1, en la que dicha línea celular humana se obtiene de una crisis blástica de leucemia mieloide humana.

4. La línea celular espectadora universal de la reivindicación 1, en la que dicha línea celular humana es la K562.

5. La línea celular espectadora universal de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que expresa al menos 1000 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas.

6. La línea celular espectadora universal de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que crece en un medio definido.

7. La línea celular espectadora universal de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho promotor es un promotor de citomegalovirus.

8. La línea celular espectadora universal de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la resistencia a higromicina, operativamente unida a un promotor y dicha línea celular espectadora universal se selecciona mediante crecimiento en un medio de cultivo que comprende al menos 400 \mug/ml de higromicina.

9. La línea celular espectadora universal de la reivindicación 8, en la que dicha línea celular espectadora universal se selecciona mediante crecimiento en un medio de cultivo que comprende al menos 1000 \mug/ml de higromicina.

10. Una composición que comprende:

(a): una línea celular espectadora universal, que

(i): es una línea celular humana, (ii) carece naturalmente de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II o está modificada de tal forma que carezca de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II, y (iii) está modificada mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una citocina inmunomoduladora operativamente unida a un promotor y

(b): un antígeno de cáncer.

11. La composición de la reivindicación 11, en la que dicha citocina inmunomoduladora es la interleucina-2 (IL-2).

12. Una composición que comprende la línea celular espectadora universal de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un antígeno de cáncer.

13. Un procedimiento para preparar una línea celular espectadora universal que expresa GM-CSF, procedimiento que comprende:

(i): obtener una línea celular humana que carezca de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II.

(ii): modificar dicha línea celular humana introduciendo en dicha línea celular humana una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF operativamente unida a un promotor y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unida a un promotor; y

(iii): usar el marcador seleccionable para aislar células que produzcan al menos 500 ng de dicho GM-CSF/10^{6} células/24 horas.

14. Un procedimiento para preparar una línea celular espectadora universal que exprese GM-CSF, procedimiento que comprende:

(i): obtener una línea celular humana;

(ii): modificar dicha línea celular humana de tal forma que carezca de los antígenos MHC-I y de los antígenos MHC-II;

(iii): modificar adicionalmente dicha línea celular humana introduciendo en dicha línea celular humana una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF operativamente unida a un promotor y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador seleccionable operativamente unido a un promotor; y

(iv): usar el marcador seleccionable para aislar células que produzcan al menos 500 ng de GM-CSF/10^{6} células/24 horas.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho marcador seleccionable es la resistencia a higromicina.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la línea celular humana modificada se cultiva en medio de cultivo que comprende al menos 400 \mug de higromicina/ ml de medio de cultivo.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la línea celular humana modificada se cultiva posteriormente en medio de cultivo que comprende al menos 1000 \mug de higromicina/ ml de medio de cultivo.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que dicho medio de cultivo es definido.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en el que el promotor al que está unido operativamente la secuencia de ácidos nucleicos que codifica GM-CSF es un promotor de citomegalovirus.

20. Uso de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para preparar un medicamento para estimular una respuesta inmune frente al cáncer en un paciente humano, en el que dicha composición comprende un antígeno de cáncer que es un antígeno de dicho cáncer de dicho paciente y en el que dicha composición está adicionalmente irradiada.

21. El uso de la reivindicación 20 en el que dicho antígeno de cáncer es una célula de dicho cáncer.