WO2002060476A2 - Tumorvakzine - Google Patents

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WO2002060476A2
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Ingo Schmidt-Wolf
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Definitions

  • the invention relates to a vaccine for the therapeutic treatment of tumor diseases, and to a method for producing such a vaccine.
  • Tumor diseases are one of the main causes of death in the industrialized world.
  • the basic idea of the immunological approaches is to present the tumor as an aberrant cell to the immune system, and, based on the expectation that it is the natural task of the immune system to recognize and destroy such aberrant cells, to initiate these mechanisms also against the tumor cell population that is the reason for the disease ,
  • immunological cell system is under equilibrium between cell degradation and cell build-up under physiological conditions.
  • the proliferation, differentiation, function and regulation, the cell-cell contact and the The formation of immunological recognition structures is controlled by cytokines.
  • cytokines control the growth and differentiation of leukocytes, the initial phase of the immune response, and they stimulate and suppress effector functions of the immune system.
  • interleukin 1 a lymphocyte-activating factor
  • interleukin 2 a T cell growth factor
  • interleukin 3 a mast cell growth factor
  • interleukin 4 a B cell stimulating factor
  • interleukin 7 and other interleukins as well as the granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • TNF Tumor Factor
  • US 5,589,466 discloses immunizing mammals by injecting DNA or RNA, the DNA or RNA molecules being transported in constructs. It is described that the constructs used are free of viral particles.
  • IL-2 expression levels can be determined.
  • the viral vectors used as the expression vector can be regarded as less advantageous. Due to the instability of the attenuated vaccine strain, a conversion back into a virulent strain cannot be ruled out.
  • the viral components themselves can have an immunogenic effect, which leads to a reduction in their effectiveness by the patient's immune system. These risks are widely used as ten leads. These risks are largely opposed to widespread use as a gene therapy vector.
  • the inventors of the present application were able to show that the transfer of expression plasmids for human interleukin 7 (IL-7) in tumor cells leads to an increased sensitivity to effector cells of the immune system, especially with autologous transfer (Finke et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 260-268).
  • IL-7 human interleukin 7
  • Plasmids are used as expression vectors. This document shows a concept for treating tumor diseases by immunotherapy. Meaningful in vivo or in vitro data or clinical results that prove the effectiveness of the claimed vaccine are not shown. It should be noted that these plasmid-based vectors are not suitable for use in human gene therapy without reservation, since they carry, in addition to the therapeutic sequences, genetic functional units which they require for their replication. In addition, they have antibiotic resistance genes that are essential for their selection. So there is a permanent expression of therapeutically undesirable mammals - or bacterial proteins.
  • the object of the invention is to provide a vaccine as a medicament for the treatment of diseases related to cytokines, such as cancer, which can be used specifically and efficiently and in particular leads to the induction of tumor-specific immune responses.
  • a corresponding method for producing such a vaccine is also to be provided.
  • the present invention solves this technical problem by providing a vaccine for the treatment of patients with defined tumor diseases, consisting of tumor cells from a patient, these tumor cells previously ex-vivo with code for interleukin-7 (IL-7) and macrophage-activating factor GM-CSF - Rende expression constructs were transfected. Under transfection, the bringing nucleic acid sequences are understood by means of biological, chemical or physical methods, as a result of which there is a sustained or temporary expression of proteins encoded by these sequences.
  • IL-7 interleukin-7
  • GM-CSF - Rende expression constructs were transfected.
  • immunostimulatory nucleic acid sequences were used as adjuvants.
  • the CpG motifs of the ISS cause an increase in the activity of NK cells and macrophages and a strong stimulation of the cellular TH1 immune response.
  • Covalently closed ISSs with a length of 30 bp are preferably used, as described in WO 01/07055.
  • the constructs according to the invention are referred to below as d-SLIM (double stem-loop immunomodulating oligodeoxyribonucleotides).
  • nucleic acids which code for a macrophage activating factor and an interleukin in a cell in which these nucleic acids are expressed leads to effective and specific vaccine protection being able to be achieved.
  • Plasmids can be used as DNA expression constructs; according to the invention, minimalistic immunologically defined gene expression constructs are preferably used. These are linear, covalently closed expression cassettes which consist only of the CMV promoter, an intron, the corresponding gene sequence and a polyadenylation sequence. These covalently closed minimalistic DNA constructs are referred to below as MIDGE ® vectors (MIDGE ® : MINIMALISTIC jMMUNO-LOGICALLY DEFINED GENE EXPRESSION VECTORS); see. EP 0 941 318 B1.
  • the MIDGE constructs have the advantage that they can be used without structures that are not essential for the therapeutic effect, which ultimately avoids the disadvantages of gene transports of viral origin.
  • the invention thus relates to the combination of at least two expressible nucleic acids, selected from the group of nucleic acids which code for at least one interleukin and at least one macrophage activating factor?
  • the two nucleic acids can be introduced in one or more (preferably two) expression constructs.
  • a number of general terms are understood below as follows:
  • treatment means the prophylactic and / or therapeutic effect of a medicinal substance.
  • macrophage-activating factor and / or interleukin relates both to naturally occurring macrophage-activating factors and / or interleukins and to all modifications, mutants or derivatives of the macrophage-activating factors and / or interleukins, macropage-activating factors produced by recombination techniques and / or interleukins which contain amino acid modifications such as inversions, deletions, insertions, additions, etc., provided that at least some of the essential functions of the wild-type macrophage activating factors and / or interleukins are present.
  • macrophage activating factors and / or interleukins can also include unusual amino acids and / or modifications such as alkylation, oxidation, thiol modification, denaturation and oligomerization and the like.
  • macrophage activating factors and / or interleukins can in particular be proteins, peptides and / or fusion peptides which, in addition to other proteins, peptides or parts thereof, contain macrophage activating factors and / or interleukins in whole or in part.
  • the macrophage activating factors and / or interleukins are shortened forms of the naturally occurring macrophage activating factors and / or interleukins.
  • a tumor cell comprises at least one nucleic acid molecule which codes together for a macrophage activating factor (preferably GM-CSF) and an interleukin (preferably interleukin-7).
  • a macrophage activating factor preferably GM-CSF
  • an interleukin preferably interleukin-7
  • These tumor cells come from patients with a defined tumor disease, such as, for example, preferably renal carcinoma, malignant melanoma and / or colon carcinoma.
  • the DNA expression constructs which lead to expression in the cells are introduced into these cells by means of biological, chemical and / or physical transfection methods.
  • the transfected cells serve as vaccines and are applied to patients with the same clinical picture, to them themselves or the cells were previously taken from other patients with the same clinical picture.
  • the body of the cell extraction can be the body to be treated with the drug; however, the body of the cell extraction cannot be the body to be treated with the drug.
  • the cells to be treated can come from a single body or can be pooled from several bodies with the same clinical picture.
  • the vaccine can comprise at least one immunomodulating oligodeoxyribonucleotide.
  • the immunomodulating oligodeoxyribonucleotide comprises a circular strand of deoxyribonucleic acid with a partially complementary, antiparallel base sequence.
  • the immunomodulating oligodeoxyribonucleotide is dumbbell-shaped.
  • the immunostimulatory nucleic acid sequences are only a few bases long and do not act via the expression of proteins encoded on them.
  • Most known immunomodifying short oligodeoxyribonucleotide sequences contain an unmethylated cytosine guanosine motif.
  • double-stranded molecules with the relevant immunostimulatory sequence in the double-strand region exert a noteworthy stimulatory effect.
  • the short deoxyribonucleic acid molecules consist in particular of a ring-shaped, closed sequence of nucleoside residues.
  • Such ring-shaped closed deoxyribonucleic acid molecules can advantageously be obtained from open-chain deoxyribonucleic acid molecules which have a partially self-complementary sequence and which can form an intermediate stable hybrid with one another or with a second molecule.
  • the molecule can also advantageously be obtained by intramolecular ligation of a molecule which has at least two self-complementary regions which are separated by only one gap in the phosphate backbone. The molecules obtained in this way have no free 5 'or 3' ends and are therefore not accessible to exonucleases.
  • the immunomodulating oligodeoxyribonucleotide can preferably comprise a sequence with the base sequence N 1 N 2 CGN 3 N 4 , where N 1 N 2 is an element selected from the group comprising GT, GG, GA, AT or AA, N 3 N 4 is an element out- is selected from the group comprising CT or TT, and C is deoxycytosine, G deoxyguanosine, A deoxyadenosine and T deoxythymidine.
  • the sequence with the base sequence N 1 N 2 CGN 3 N 4 is preferably positioned in the single-stranded region of the oligodeoxyribonucleotide.
  • the oligodeoxyribonucleotide advantageously comprises 20 to 200 nucleotides.
  • An advantage of the invention is that the selected and used nucleic acid sequences (d-SLIM) additionally have an enormous immunostimulatory effect.
  • These immunostimulatory nucleic acids have their effect according to the invention, for example in the vaccines, in particular via a secondary stimulation of the release of co-stimulatory factors.
  • the transfection into a cell preferably takes place.
  • the cells are expediently an allogeneic cell, a heterotopic cell, a syngeneic cell, a xenogeneic cell, an autologous cell, a virus-infected cell, a degenerate cell, a transformed cell, an antibody-loaded cell and / or an undifferentiated cell.
  • the cells are preferably mammalian cells, especially human cells.
  • the nucleic acid molecule is a DNA, in particular a cDNA or a genomic DNA.
  • the nucleic acid molecule can also be advantageous for the nucleic acid molecule to be an RNA.
  • transfection for example transfection by means of ballistic transfer, polycation transfection, calcium phosphate precipitation, microinjection, protoplast fusion, liposome fusion, viral transfection systems, lipofection and / or Electroporation in vivo and / or in vitro.
  • the transfection takes place by means of ballistic transfer.
  • Biological transfection methods such as receptor-mediated gene transfer are further advantageous methods.
  • a DNA sequence such as a sequence of DNA sequences.
  • Expression construct that codes for at least one macrophage activatable factor and at least one interleukin, covalently linked to an oligopeptide, which is preferably the nuclear localization signal (NLS) from Simian Virus SV-40.
  • NLS nuclear localization signal
  • the age range was 46 to 69 years. Eight patients were male, two female. One patient suffered from colon cancer, four from malignant melanoma and five patients from renal cell carcinoma. Renal cell carcinomas have very poor healing prospects. The location of the metastases is also shown.
  • Table 2 shows the transfection efficiency. After in vitro transfection with expression constructs coding for IL-7 and GM-CSF, all cells secrete the cytokines IL-7 and GM-CSF.
  • Table 3 shows the cytokine profiles of the sera of the
  • IL-7 interferon-gamma
  • TGF-ß Transforming Growth Factor-ß
  • CD3 and CD 56 positive PBL The cytotoxicity of these cells increased significantly as a result of the treatment.
  • Table 5 shows the increase in the cytotoxic activity of the
  • ten patients with metastatic solid tumors were taken from tumor material, these were transfected outside the body with expression vectors coding for IL-7 and GM-CSF and these cells were fed back to the patient after cultivation ex vivo and after the addition of immunostimulatory sequences.
  • the patients received four subcutaneous injections on the 0th, 14th, 28th and 56th day.
  • Renal cell carcinoma diseases belong to the group of those with very poor healing prospects among neoplasias. The patients were followed for 84 days. Table 1 Characteristics of the patients
  • the vaccine according to the invention made from modified tumor cells produced by the method according to the invention shows surprising effects. It is advantageous that the vaccine according to the invention induces a tumor-specific immune response.
  • the serum level of IL-7 and interferon gamma of the patients after treatment was measurably increased (see Table 3).
  • the cytotoxicity of this cell population increased significantly during the treatment from 21.5% to 25.6% (calculated from mean values on the 84th day) in all patients after completion of the treatment.
  • the increase in PBLs that expressed CD 56 was comparable from 16.3% to 27.5% (calculated from mean values on the 84th day).
  • the significance was p 0.03 (see Table 4).
  • a partial response refers to the decline in detectable tumor areas by more than 50% in the past four weeks and the suppression of new tumor areas.
  • a stable disease course SD is to be understood as the steady state. All patients tolerated the treatment well and there were no undesirable side effects.
  • kidney cancer four of the successfully treated patients came from the group with the initial diagnosis of renal cell carcinoma.
  • the success of the treatment means that there was a minimal response in one patient, a stable disease course (SD) in two patients and even a complete response (CR) in one patient.
  • SD stable disease course
  • CR complete response
  • the patient with the complete reaction showed the following initial picture: metastases up to 3 cm in size in the lungs, a 4x4x3 cm size metastasis infiltrated the neighboring rib, metastases in ribs IV and VII and a large kidney tumor. After its removal, the kidney tumor was checked for confirmation of the diagnosis of renal cell carcinoma. Part of the tumor was used for vaccine production. After four vaccinations with transfected cells, a decrease in metastases in the lungs and bones was observed. At the following initial picture: metastases up to 3 cm in size in the lungs, a 4x4x3 cm size metastasis infiltrated the neighboring rib, metastases in ribs IV and VII and a large kidney tumor. After its removal, the kidney tumor was checked for confirmation of the diagnosis of renal cell carcinoma. Part of the tumor was used for vaccine production. After four vaccinations with transfected cells, a decrease in metastases in the lungs and bones was observed. At the following initial picture: metastases up to 3 cm in size in the
  • Treatment In addition to the medical history, the following parameters were determined before the start of treatment: physical examination, hematology (hemoglobin, hematocrit, leukocytes and platelet count), chemical blood values and urine analysis. Blood was taken for immune status determination. DHT (Delayed type hypersensitivity) skin tests were carried out with the Multitest Merieux Test (Leimen, Germany). X-rays of the upper body and computed tomography of the upper body and abdomen were taken. The patients received four subcutaneous injections with at least 1x10 6 cells of their previously ex-vivo treated tumor cells. Comprehensive immunological examinations, haematological examinations and rough clinical examinations (physical examination, ultrasound examination and examination of the abdomen, if necessary) were repeated on the 14th, 28th and 56th day. A complete clinical and immunological examination, comparable to the selection examination carried out at the beginning, took place on the 84th day. Preparation of the tumor cell suspension
  • the tumor cell suspension was treated as described for primary cell cultures (Finke, et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 260-268). Tumor samples taken sterile from the patients were immediately transferred to ice-cooled suspension medium in 50 ml Falcon centrifuge tubes with screw caps. The transport of the cooled samples to the laboratory, in which the ex-vivo treatment of the patient cells took place, took between 1-3 hours.
  • Suspension medium for renal carcinoma cells undiluted L-15 medium (BioWhittaker), 10% FCS (BioWhittaker), 1x MEM vitamins (Biochrom), 1x insulin transferrin-Selenium-X (Gibco), 1mM L-glutamine (BioWhittaker), 1g / l NaHCO3 (Gibco), 1g / l glucose for DMEM (Gibco), 50 ⁇ g / ⁇ l gentamicin (BioWhittaker).
  • Suspension medium for malignant melanoma cells undiluted RPMI medium 1640 (with ultraglutamine, BioWhittaker), 10% FCS (BioWhittaker), 50 ⁇ g / ⁇ l gentamicin (BioWhittaker)
  • MIDGE Two covalently closed minimalistic DNA expression vectors, called "MIDGE" were used.
  • One expression vector was used for the expression of human interleukin-7 (IL-7), the other for the expression of the human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).
  • IL-7 human interleukin-7
  • GM-CSF human granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • the MIDGE vectors were synthesized according to the SOP regulation and in the class B corresponding laboratory with subsequent quality control.
  • the coding gene sequence for IL-7 and GM-CSF was amplified from human white blood cell mRNA using reverse transcriptase-PCR (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcriptase-PCR
  • the amplificates were inserted into the plasmid pMOK, a pUC19 derivative, between the SstI and Kpnl interfaces.
  • PMOK has an intron and a polyadenylation sequence from the SV40 virus (MOLOGEN, Berlin, Germany).
  • the plasmid pMOK was completely digested with the restriction enzyme Eco31 I overnight at 37 ° C. Restriction digestion generated two DNA fragments. One consisted of the kanamycin resistance gene and other sequences necessary for the propagation of the plasmid in bacteria. The other fragment consisted of the sequences that were to become part of the MIDGE DNA: enhanced CMV promoter, chimeric intron, the corresponding gene sequence and the polyadenylation sequence from SV-40.
  • the 5 'phosphorylated hairpin-shaped oligodeoxynucleotides (TIB-MolBiol, Berlin) became 5' -PH-GGG AGT CCA GTT TTC TGG AC-3 'and 5' PH-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC-3 using the enzyme T4-DNA ligase 'Ligated in the presence of the restriction enzyme Eco31 I overnight at 37 D C to the DNA fragment forming the MIDGE DNA.
  • the reaction was stopped by heating to 70 ° C.
  • the resulting mixture of nucleic acids was treated with the enzyme T7 DNA polymerase.
  • the MIDGE DNA was purified by anion exchange chromatography and precipitated with isopropanol (cf. EP 0 941 318 B1).
  • Double-stranded immunolatory oligodeoxynucleotides (d-SLIM)
  • Double-stranded immunomodulators d-SLIMs of the ISS30 type were produced after (SOP) and final quality control in the class B laboratory.
  • ODN Single-stranded, hairpin-shaped, 5'-phosphorylated oligodeoxyribonucleotides
  • a modified device for cell acceleration the Biolistic PDS-1000 / He (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), was used for the ex-vivo gene transfer into the cell nucleus of the tumor cells and the control cells.
  • the modification relates to a device for pressure distribution (cf. EP 0732 395 B1). More than 1.5 Fix10 7 cells can be treated per shot.
  • the ballistic method is combined with the magnetic separation of the transfected cells. Although the magnetic separation was not carried out, the magnetic particles were nevertheless also introduced into the cells, since they increase the binding capacity of the gold particles for DNA. So far, this method of ballistic DNA transfer could only be used with adherently growing cells.
  • 1-2x10 7 cells In order to ensure the DNA transfer into the tumor cells, they were plated on a 44 mm 2 polycarbonate membrane (Transwell TM, pore size 3.0 ⁇ m, from Costar). 1-2x10 7 cells, depending on their size, can be loaded onto such a membrane, compared to 1-2x10 6 for adherent cell cultures in culture vessels with comparable surface contents. Cell recovery and viability are significantly improved, and the treatment time is greatly reduced. Standard conditions, depending on the morphological and functional differences of the tumor line types, were developed.
  • the tumor cell suspensions were adjusted to a concentration of 5x10 6 cells / ml in the cell suspension media.
  • a Transwell membrane was washed with 15 ml medium from both sides for 5 min. equilibrated. The medium layer above the membrane was then removed and 2-4 ml of the tumor cell suspension was applied uniformly to the polycarbonate membrane. The cells colonized the membrane, while the suspension medium was able to drain through the membrane pores into deeper membrane layers. Excess medium in the deeper layers was removed through an opening until no liquid residues were visible over the monolayer layer.
  • the medium below the membrane is a very important technical support during the transfection process and keeps the cells moist and viable.
  • the membranes coated with the particles were attached at a distance of 15 mm from the stop screen.
  • the monolayer layer of the tumor cells on the Transwell membrane was placed approximately 90 mm below the stop screen.
  • the ballistic transfer accelerated the gold particles towards the tumor cells with a pressure of 1550 psi.
  • the tumor cells were covered with 10 ml of prewarmed cell suspension medium and transferred into 15 ml centrifuge tubes by careful pipetting. After sedimentation of the cells at 300xg and 4 ° C for 5 min, they were dissolved in medium. Aliquots were again retained for sterility tests, cell recovery and viability tests, for FACS analyzes, and for determining cytokine expression. The transfection efficiency was determined as described (Foa et al., 1994, Nat. Immun. 13: 65-75)).
  • the transfected tumor cell suspension was dried again, taken up in 1.5 ml freezing medium (80% FCS, 10% DMSO, 10% suspension medium) and stored in portions of 5x10 6 to 2x10 7 cells in sealed 2 ml freezer tubes. The tubes were stored at -80 ° C at 1 ° C / min in liquid nitrogen.
  • a tube was removed from the liquid nitrogen and thawed in a water bath with gentle shaking at 37 ° C. Then it was briefly disinfected from the outside with 70% ethanol. The thawed cell suspension was slowly and dropwise transferred into 50 ml PBS (without Ca 2+ and Mg 2+ ) at 4 ° C, and centrifuged at 300xg, at 4 ° C for 5 min. The pellet was carefully taken up in 50 ml of PBS, dried again, dissolved in 1 ml of PBS and transferred to 2 ml vessels (Biopure TM, Eppendorf).
  • the contents were drawn onto a 1 ml syringe, sealed with a screw cap, irradiated 3 times with gamma radiation for 667 sec, which corresponded to a total dose of 105 gray. Then the syringe was transported to the clinic in a sterile, double-walled and shockproof container at 4 ° C.
  • Peripheral blood lymphocytes were treated with various monoclonal antibodies to human surface antigens.
  • the antibodies were AK against human CD3, CD4, CD8, CD16, CD11a, CD14, CD19, CD25, CD28, CD45, CD54, CD56 and HLA-DR (Immunotech Hamburg, Germany).
  • AKs from the same isotype were used as controls.
  • the labeled cells were washed and then analyzed with the FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Irrelevant AKs were used to determine the background for this study, it was less than 2%. 10 4 cells of each sample were analyzed.
  • CytoTox 96 a non-radioactive, cytotoxic test (Promega, Madison, Wisconsin) was used to determine and compare the cytotoxic activity of the peripheral blood lymphocytes. These examinations were carried out on days 0, 14, 28, 56 and 84.
  • the test is a calorimetric alternative to the 51 chromium release test.
  • the quantitative measure is lactate dehydrogenase (LDH), which is released by cells like 51 Cr in cell lysis.
  • the free LDH is determined in the supernatant after a 30 minute incubation using a coupled enzymatic test.
  • the amount of dye released is proportional to the amount of lysed cells. The absorption was measured at 490 nm.
  • 5000 target cells were applied in triplicate in V-shaped 96-well tissue culture plates and incubated for four hours with different ratios of effector and target cells. After the incubation, 50 ⁇ l aliquots were transferred to a new 96 well plate. 50 ⁇ l of the substrate mix was added to each chamber and subsequently incubated in the dark for 30 min at RT. 50 ⁇ l stop solution were added before the determination. Autologous tumor cells were targeted used. Each experiment was carried out in triplicate and an average was formed. The lytic unit (LU) was determined by titration curves. An LU is defined as the number of effector cells that are required to achieve a 10% lysis of 10 4 target cells.
  • the proliferation test "Easy for you” (Biomedica, Vienna, Austria) was used to determine the proliferation of the peripheral blood lymphocytes (PBL), which were taken from the patients before, during and after the treatment.
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • ELISA reader a chromophoric substrate solution with the aid of a spectrophotometer (ELISA reader).
  • the incubation with the substrate solution was carried out for four hours, depending on the metabolic performance of the cells. Converted derivative, the absorption maximum is at 490 nm.
  • the experiments were carried out in triplicate and averaged.
  • Cytokine levels in the patient's sera from day 0, 14, 28, 56 and 84 were determined by an enzyme test (ELISA).
  • the IL-7 ELISA kit purchased from Laboserv (Staufenberg, Germany); the R&D Systems IFN-gamma, TNF-alpha and TGF-beta1 ELISA kit (Quantikine, Minneapolis, Minnesota); and the GM-CSF-ELISA from Promocell (Heidelberg, Germany). Soluble IL-7, IFN-gamma, TNF-alpha, TGF-beta1 and GM-CSF in concentrations of 9, 3, 4.4, 7, 1.5 pg / ml to 1000, 500, 500, 1000, 500 pg / ml could be used be determined.
  • the microtiter plates were coated with a monoclonal AK, which bound the cytokines after incubation in the serum. After several washing steps to
  • DTH delayed type hypersensitivity
  • PBMC Peripheral blood monocytes
  • a HATF multititer plate (Millipore, Eschborn, Germany) was dissolved with 500ng anti-lFN-gamma antibody (AK) (Biozol, Eching, Germany) in coating solution (3.8g / l NaHCO 3, 1.9g / l Na 2 CO 3 ), coated at 4 ° C overnight. After washing three times, the plate was blocked with 200 ⁇ l blocking solution (5% BSA in phosphate buffer) at 37 ° C. for 30 min. After washing, 10 5 peripheral blood lymphocytes were applied per well and incubated overnight (at 37 ° C, 5%
  • AK anti-lFN-gamma antibody
  • the plate was washed and incubated with 500ng of a second biotin-labeled IFN-gamma-AK (Biozol) overnight at 4 ° C.
  • Avidin and BCIP / NBT solution (Sigma, Deisenhofen, Germany) were used for the detection.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vakzine und deren Herstellung zur Behandlung von Patienten mit definierten Tumorerkrankungen, bestehend aus Tumorzellen, wobei diese Tumorzellen ex-vivo mit für bestimmte Zytokine kodierenden Expressionskonstrukten transfiziert wurden. Als Adjuvanz werden immunstimulierende Oligodesoxyribonukleotide eingesetzt.

Description

Tumorvakzine
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Vakzine zur therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solcher Vakzine.
Tumorerkrankungen sind eine der wesentlichsten Todesursachen in der industrialisierten Welt. Etablierte Methoden der Therapie von Krebserkrankungen wie chirur- gische Entfernung, Bestrahlung und Chemotherapie führen häufig bestenfalls zu einem zeitlich begrenzten Rückgang der Erkrankung.
Vor diesem Hintergrund sind in den letzten Jahren, einhergehend mit einem vertieften Verständnis der molekularen Mechanismen des Zellstoffwechsels und der Signaltransduktionswege, die der Zellteilung und dem gezielten Zelltod zugrundeliegen, vermehrt Ansätze zur Behandlung von Tumorerkrankungen vorgeschlagen worden, die immunologische oder gentherapeutische Hintergründe haben (Greten und Jaffee, 1999, J. Clin. Oncol. 17: 1047-1060).
Grundgedanke der immunologischen Ansätze ist es, den Tumor als aberrante Zelle dem Immunsystem zu präsentieren, und ausgehend von der Erwartung, daß es natürliche Aufgabe des Immunsystems ist, solche aberranten Zellen zu erkennen und zu vernichten, diese Mechanismen auch gegen die die Erkrankung begründende Tumorzellpopulation einzuleiten.
Stand der Technik
Bekannt ist, dass sich das immunologische Zellsystem unter physiologischen Be- dingungen im Gleichgewicht zwischen Zellabbau und Zellaufbau befindet. Die Proliferation, Differenzierung, Funktion und Regulation, der Zeil-Zeil Kontakt und die Ausbildung von immunologischen Erkennungsstrukturen werden von Zytokinen gesteuert.
Zytokine kontrollieren unter anderem das Wachstum und die Differenzierung von Leukocyten, die Initialphase der Immunantwort, und sie stimulieren und supprimie- ren Effektorfunktionen des Immunsystems.
Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Zytokine bekannt, beispielsweise das Interleukin 1 : ein lymphocytenaktivierender Faktor, Interleukin 2: ein T-Zell- Wachstumsfaktor, Interleukin 3: ein Mastzellen-Wachstumsfaktor, Interleukin 4: ein B-Zell-stimulierender Faktor, Interleukin 7 und andere Interleukine sowie der Granu- lozyten/Makrophagen-koloniestimulierende Faktor (GM-CSF), der Tumor-Nekrose-
Faktor (TNF), die Familie der Interferone und zahlreiche andere.
In der US 5,589,466 wird offenbart, Säuger zu immunisieren, indem man DNA oder RNA injiziert, wobei die DNA- oder RNA-Moleküle in Konstrukten transportiert werden. Es wird beschrieben, dass die verwendeten Konstrukte frei von viralen Parti- kein sind.
Aus der US 5,681 ,562 ist bekannt, Patienten mit bestimmten Krebserkrankungen Zellen zu injizieren, die mit Interleukinen kodierender DNA oder RNA transfiziert sind. Das Immunsystem des Patienten soll so gegen Antigene von Tumoren stimuliert werden. In der Patentschrift werden Versuche beschrieben, in denen Fibrobla- sten von Mäusen durch retrovirale Vektoren, kodierend für IL-2 transfiziert wurden. Ebenso beschrieben ist der in-vivo Versuch, in dem die Wirksamkeit der Behandlung an einem murinen Dickdarmkarzinom-Modell getestet wurde. Die Mäuse, denen transfizierte Fibroblasten s.c. injiziert wurden, entwickelten im Vergleich zu Kontrollgruppen ein deutlich verlangsamtes Tumorwachstum. In in-vitro Versu- chen mit humanen transfizierten Fibroblasten konnte ebenfalls ein deutlich erhöhtes
IL-2 Expressionsniveau bestimmt werden. Neben fehlenden klinischen Daten, die über das Maus-Modell hinausgehen, sind die als Expressionsvektor verwendeten viralen Vektoren als wenig vorteilhaft anzusehen. Durch die Instabilität des attenu- ierten Impfstammes ist eine Rückverwandlung in einen virulenten Stamm nicht auszuschließen, außerdem können die viralen Bestandteile selbst immunogen wirken, was zu einer Herabsetzung ihrer Wirksamkeit durch das Immunsystem des Patienten führt. Diese auszugshaften Risiken stehen einer breiten Anwendung als ten führt. Diese auszugshaften Risiken stehen einer breiten Anwendung als gentherapeutischer Vektor in erheblichem Maße gegenüber.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten zeigen, dass der Transfer von Expressionsplasmiden für humanes Interleukin 7 (IL-7) in Tumorzellen zu einer erhöhten Sensitivität gegen Effektorzellen des Immunsystems führt, besonders bei autologem Transfer (Finke et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 260-268).
Mehrere Publikationen zeigen, dass die besten therapeutischen Resultate durch eine Kombination von Zytokingenen mit dem Wachstumsfaktor GM-CSF erzielt werden (Paillard, 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2457-2458; Schadendorf et al., 1995, J. Mol. Med. 73: 473-477). Offenbar spielt dabei die Aktivierung von antigen- präsentierenden Dendritischen Zellen sowie die Stimulation einer Effektorzellpopulation die wesentliche Rolle.
Bislang ist es jedoch unklar, welche Zytokingene in Kombination mit GM-CSF die effektivste anti-tumorale Immunantwort auszulösen in der Lage sind.
In Experimenten in Mäusen zeigte sich, daß eine Impfung mit
Expressionskonstrukten kodierend für IL-7 einen anti-tumoralen Effekt zeigte (Miller et al., 1993, Blood 18: 3686-3694; Murphy et al., 1993, J. Clin. Invest. 92: 1918- 1924).
Echte therapeutische Erfolge sind allerdings auch im Mausmodell bislang nicht veröffentlicht.
Darüberhinaus ist bei Versuchen zur Stimulation von Immunantworten durch Gentherapie mit Plasmid-DNA oder Oligonukleotid-Sequenzen beobachtet worden, daß gewisse Nukleinsäuresequenzen, die CpG-Motive (CpG = unmethyliertes Cytosin-Guanosin) aufweisen, eine enorme immunstimulatorische Wirkung haben können (Schmidt-Wolf et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 185-189; Roman et al., 1997, Nat. Med. 3: 849-854). Immunstimulatorische Sequenzen (lSS) sind aus diesem Grunde schon früh als Adjuvantien in DNA-basierten Immunisierungsprotokollen gegen infektiöse Erreger eingesetzt wurden (Sato et al., 1996, Science 273: 352-354). In Mausexperimenten zeigte sich, daß die Verabreichung von CpG-reichen DNA-Sequenzen zu einer starken Aktivierung der B-Zellen führt und die Expression bestimmter Zytokine, beispielsweise von IL-6 und GM-CSF, anregt. Die Lehre von Gebrauch und Herstellung immunstimulatorischer, CpG-enthaltender ISS ist in der WO 98/18810 umfassend erläutert.
Aus der WO 00/04918 ist bekannt, Tumorzellen mit Genen, kodierend beispielsweise für Interferon-gamma und GM-CSF, zu transfizieren. Als Expressionsvektoren werden Plasmide eingesetzt. Diese Schrift zeigt ein Konzept auf, Tumor- Erkrankungen per Immuntherapie zu behandeln. Aussagekräftige in-vivo bzw. in- vitro Daten oder klinische Ergebnisse, die die Wirksamkeit der beanspruchten Vak- zine belegen, werden nicht gezeigt. Bemerkt sei, dass diese plasmid-basierten Vektoren für eine Anwendung in der humanen Gentherapie nicht ohne Vorbehalt geeignet sind, da sie neben den therapeutischen Sequenzen genetische Funktionseinheiten tragen, die sie für ihre Replikation benötigen. Daneben weisen sie Antibiotika- Resistenzgene auf, die für ihre Selektion unerläßlich sind. Es erfolgt also eine dau- ernde Expression therapeutisch nicht erwünschter Säuger - oder Bakterienproteine.
Trotz langjährigen Forschungen und erfolgversprechenden Ansätzen, ist es bisher nicht gelungen, eine wirksame immun-basierte Therapie gegen Tumorerkrankungen zu entwickeln.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vakzine als Arzneimittel zur Behandlung von mit Zytokinen in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, wie beispielsweise Krebserkrankungen zur Verfügung zu stellen, die spezifisch und effizient einsetzbar ist und insbesondere zur Induktion von tumorspezifischen Immunantworten führt. Ferner soll ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung einer derartigen Vakzine bereitgestellt werden.
Lösung der Aufgabe und Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung einer Vakzine zur Behandlung von Patienten mit definierten Tumorerkrankungen, bestehend aus Tumorzellen eines Patienten, wobei diese Tumorzellen zuvor ex-vivo mit für lnterleukin-7 (IL-7) und makrophagenaktivierenden Faktor GM-CSF kodie- renden Expressionskonstrukten transfiziert wurden. Unter Transfektion soll das Ein- bringen von Nukleinsäurensequenzen mittels biologischer, chemischer oder physikalischer Methoden verstanden werden, in dessen Folge es zu anhaltender oder vorübergehender Expression von durch diese Sequenzen kodierter Proteine kommt.
Zusätzlich wurden immunstimulatorische Nukleinsäuresequenzen (ISS) als Adju- vanz eingesetzt. Die CpG-Motive der ISS bewirken eine Erhöhung der Aktivität von NK-Zellen und Makrophagen sowie eine starke Stimulation der zellulären TH1- Immunantwort. Bevorzugt werden kovalent geschlossene ISS mit einer Länge von 30 bp eingesetzt, wie sie in der WO 01/07055 beschrieben werden. Die erfindungsgemäßen Konstrukte werden als d-SLIM (double Stem-Loop immunomodulating Oligodeoxyribonucleotides) im weiteren bezeichnet.
Überraschend wurde gefunden, dass die Kombination von Nukleinsäuren, die für einen Makrophagenaktivierenden Faktor und ein Interleukin kodieren, in einer Zelle, in der diese Nukleinsäuren exprimiert werden, dazu führt, dass ein effektiver und spezifischer Impfschutz erzielt werden kann.
Als DNA-Expressionskonstrukte können Plasmide eingesetzt werden, bevorzugt werden erfindungsgemäß minimalistische immunologisch definierte Genexpressionskonstrukte verwendet. Dabei handelt es sich um lineare, kovalent geschlossene Expressionskassetten, die lediglich aus dem CMV Promotor, einem Intron, der entsprechenden Gensequenz und einer Polyadenylierungssequenz be- stehen. Diese kovalent geschlossenen minimalistische DNA-Konstrukte werden im folgenden als MIDGE® Vektoren bezeichnet (MIDGE®: MINIMALISTIC jMMUNO- LOGICALLY DEFINED GENE EXPRESSION VECTORS); vgl. EP 0 941 318 B1. Die MIDGE-Konstrukte haben den Vorteil, dass mit ihnen auf Strukturen verzichtet werden kann, die für die therapeutische Wirkung nicht essentiell sind, was letztlich die Nachteile der Genfähren viralen Ursprungs vermeidet.
Die Erfindung betrifft somit die Kombination von mindestens zwei exprimierbaren Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe von Nukleinsäuren, die für mindestens ein Interleukin und mindestens einen Makrophagenaktivierenden Faktor kodieren ?
Die zwei Nukleinsäuren können dabei in einem oder mehreren (bevorzugt zwei) Expressionskonstrukten eingebracht sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verstanden:
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff Behandlung die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung eines Arzneistoffes.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff Makrophage- naktivierender Faktor und/oder Interleukin sowohl natürlich vorkommende Makrophagenaktivierende Faktoren und/oder Interleukine als auch alle Modifikationen, Mutanten oder Derivate der Makrophagenaktivierenden Faktoren und/oder Interleukine, mittels Rekombinationstechniken hergestellte Makrop agenaktivieren- de Faktoren und/oder Interleukine, die Aminosäure-Modifikationen, wie Inversionen, Deletionen, Insertionen, Anlagerungen usw. enthalten, sofern zumindest ein Teil der essentiellen Funktionen der Wildtyp-Makrophagenaktivierenden Faktoren und/oder Interleukine vorhanden ist. Solche Makrophagenaktivierenden Faktoren und/oder Interleukine können auch ungewöhnliche Aminosäuren und/oder Modifikationen, wie eine Alkylierung, Oxidation, Thiol-Modifikation, Denaturierung und Oligomerisation und dergleichen umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Makrophagenaktivierende Faktoren und/oder Interleukine insbesondere Proteine, Peptide und/oder Fusionspeptide sein, die neben anderen Proteinen, Peptiden oder Teilen davon Makrophagenaktivierende Faktoren und/oder Interleukine insge- samt oder teilweise enthalten. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Makrophagenaktivierenden Faktoren und/oder Interleukine verkürzte Formen der natürlich vorkommenden Makrophagenaktivierende Faktoren und/oder Interleukine.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass eine Tumorzelle mindestens ein Nukleinsäu- remolekül, das für einen Makrophagenaktivierenden Faktor (bevorzugt GM-CSF) und ein Interleukin (bevorzugt lnterleukin-7) gemeinsam kodiert, umfasst. Diese Tumorzellen stammen von Patienten mit einer definierten Tumorerkrankung, wie beispielsweise bevorzugt Nierenkarzinom, malignes Melanom und/oder Dickdarmkarzinom. In diese Zellen werden mittels biologischer, chemischer und/oder physika- lischer Transfektionsmethoden die DNA-Expressionskonstrukte eingebracht, die in den Zellen zur Expression führen. Die transfizierten Zellen dienen als Vakzine und werden den Patienten mit eben solchem Krankheitsbild appliziert, denen selbst oder anderen Patienten mit gleichem Krankheitsbild zuvor die Zellen entnommen wurden. Der Körper der Zellentnahme kann der mit dem Arzneimittel zu behandelnde Körper sein; der Körper der Zellentnahme kann aber auch gerade nicht der mit dem Arzneimittel zu behandelnde Körper sein.
Die zu behandelnden Zellen können aus einem einzigen Körper stammen oder von mehreren Körpern mit gleichem Krankheitsbild vereint (gepoolt) werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Vakzine mindestens ein immunmodulierendes Oligodesoxyribonukleotid umfassen. Das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid umfasst einen zirkulären Strang Des- oxyribonukleinsäure mit einer teilweise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid hanteiförmig.
Die immunstimulatorischen Nukleinsäuresequenzen („ISS") sind nur einige Basen lang und wirken nicht über die Expression von auf ihnen kodierten Proteinen. Die meisten bekannten immunmodifizierenden kurzen Oligodesoxyribonukleotidsequen- zen („ODN") enthalten ein unmethyliertes Cytosin-Guanosin-Motiv. Insbesondere üben doppelsträngige Moleküle mit der relevanten immunstimulatorischen Sequenz im Doppelstrangbereich eine nennenswerte stimulatorische Wirkung aus. Die kurzen Desoxyribonukleinsäuremoleküle, bestehen insbesondere aus einer ringförmig geschlossenen Folge von Nukleosidresten. Solche ringförmig geschlossenen Desoxyribonukleinsäuremoleküle können mit Vorteil aus offenkettigen Desoxyribonukleinsäuremolekülen, welche eine in Teilen selbstkomplementäre Sequenz aufweisen und miteinander oder einem zweiten Molekül ein intermediär stabiles Hybrid bilden können, gewonnen werden. Vorteilhafterweise kann das Molekül auch durch intra- molekulare Ligation eines Moleküls, welches mindestens zwei selbstkomplementäre Bereiche aufweist, welche durch nur eine Lücke im Phosphatrückgrat getrennt sind, gewonnen werden. Die so gewonnenen Moleküle weisen keine freien 5'- oder 3'- Enden auf und sind somit nicht für Exonukleasen zugänglich.
Vorzugsweise kann das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid eine Se- quenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfassen, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element aus- gewählt aus der Gruppe umfassend CT-oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Deso- xyguanosin, A Desoxyadenosin und T Desoxythymidin ist. Vorzugsweise ist die Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxy- ribonukleotids positioniert. Mit Vorteil umfasst das Oligodesoxyribonukleotid 20 bis 200 Nukleotide. Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die ausgewählten und eingesetzten Nukleinsäuresequenzen (d-SLIM) zusätzlich eine enorme immunstimulatorische Wirkung haben. Diese immunstimmulatorischen Nukleinsäuren entfalten ihre Wirkung erfindungsgemäß, beispielsweise in den Impfstoffen, insbesondere über eine sekundäre Stimulation der Ausschüttung ko-stimulatorischer Faktoren.
Vorzugsweise findet die Transfektion in eine Zelle statt. Bei den Zellen handelt es sich zweckmäßigerweise um eine allogene Zelle, eine heterotope Zelle, eine synge- ne Zelle, eine xenogene Zelle, eine autologe Zelle, eine virus-infizierte Zelle, eine entartete Zelle, eine transformierte Zelle, eine antikörperbeladene Zelle und/oder eine undifferenzierte Zelle. Die Zellen sind bevorzugt Säugerzellen, insbesondere humane Zellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäu- remolekül eine DNA, insbesondere eine cDNA oder eine genomische DNA. Selbstverständlich kann es auch vorteilhaft sein, dass das Nukleinsäuremolekül eine RNA ist.
Zur Transfektion können biologische, chemische und/oder physikalische Methoden eingesetzt werden, die zum Stand der Technik gehören, beispielsweise Transfektion mittels ballistischem Transfer, Polykationen-Transfektion, Kalziumphosphat- präzipitation, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Liposomenfusion, virale Transfekti- onssysteme, Lipofektion und/oder Elektroporation in-vivo und/oder in-vitro. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Transfektion mittels ballistischem Transfer.
Weitere vorteilhafte Methoden sind die biologischen Transfektionsmethoden wie der rezeptorvermittelte Gentransfer. Hierbei beispielsweise wird ein DNA-
Expressionkonstrukt, dass für mindestens einen Makrophagenaktivierbaren Faktor und mindestens ein Interleukin kodiert, kovalent mit einem Oligopeptid verbunden, welches vorzugsweise die Kern-Lokalisierungssequenz (Nuclear Localization Signal = NLS) aus dem Simian Virus SV-40 ist.
Durch die Verwendung weiterer, zum Teil synthetisch hergestellter Peptide ist es möglich, die Transfektionseffizienz bei Zellen und Liposomen weiter zu steigern. Diese Methode eignet sich insbesondere für den zellspezifischen in-vivo- Gentransfer nach intravenöser Applikation.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und der Beschreibung. Die überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels (als Impfstoff zur Karzinomtherapie), sowie das erfindungsmäße Verfahren wird anhand der Tabellen und den Ausführungsbeispielen deutlich; es zeigt:
Tabelle 1 Charakteristik der einbezogenen 10 Patienten.
Die Altersspanne betrug 46 bis 69 Jahre. Acht Patienten waren männlichen, zwei weiblichen Geschlechts. Ein Patient litt an Dickdarmkarzinom, vier an malignem Melanom und fünf Patienten an Nierenzellkarzinom. Nierenzellkarzinome haben sehr schlechte Heilungsaussichten. Die Lokalisation der Metastasen ist ebenfalls gezeigt.
Tabelle 2 dargestellt ist die Transfektionseffizienz. Nach in-vitro Transfektion mit Expressionskonstrukten kodierend für IL-7 und GM-CSF sekretieren alle Zellen die Zytokine IL-7 und GM-CSF.
Tabelle 3 zeigt die Zytokin-Profile der Seren der
Patienten. In den Seren wurde der Gehalt an IL-7, Interferon-gamma und TGF-ß (Transforming Growth Factor-ß) bestimmt. Dabei war der Serumspiegel für IL-7 und Interferon-gamma meßbar erhöht. Tabelle 4 zeigt die exprimierten Oberflächenantigene der periphären Blutlymphozyten (PBL). Es gab insbesondere einen signifikanten Anstieg von CD8,
CD3 und CD 56 positiven PBL. Die Zytotoxizität dieser Zellen nahm damit infolge der Behandlung deutlich zu.
Tabelle 5 zeigt die Zunahme der zytotoxische Aktivität der
PBL infolge der Behandlung. Die Zytotoxizität der PBL erhöhte sich durch die Behandlung signifikant (p=0,01).
Das Konzept der zugrunde liegenden klinischen Studie ist veröffentlicht (Schmidt- Wolf et al., 1994). In der damals durchgeführten Studie wurden Patienten, mit IL-7, IL-12 und GM-CSF gentherapeutisch behandelt. Im Unterschied zu der vorliegenden Erfindung wurden die Patienten nicht mit einer Kombination der Zytokingene behandelt, sondern jedes Zytokin einzeln in einer Patientengruppe als Vakzin eingesetzt. Ein signifikanter Behandlungserfolg war nicht sichtbar. Lediglich bei den mit GM-CSF behandelten Patienten zeigte sich eine immunologische Reaktion, die sich jedoch nicht in einer meßbaren klinischen Reaktion niederschlug.
Erfindungsgemäß wurden zehn Patienten mit metastasierten soliden Tumoren Tumormaterial entnommen, diese außerhalb des Körpers mit Expressionsvektoren kodierend für IL-7 und GM-CSF transfiziert und diese Zellen nach Kultivierung ex- vivo sowie nach Zugabe von immunstimulatorischen Sequenzen, dem Patienten wieder zugeführt. Die Patienten erhielten am 0., 14., 28. und 56. Tag vier subkutane Injektionen .
Alle Patienten befanden sich zu Beginn der Behandlung in einer fortgeschrittenen Phase der Erkrankung. Ein Patient war an Dickdarmkarzinom erkrankt, vier Patienten an malignem Melanom und fünf Patienten an Nierenzellkarzinom (Patientencharakteristik s. Tabelle 1). Nierenzellkarzinomerkrankungen gehören unter den Neoplasien zu Gruppe derer mit sehr schlechten Heilungsaussichten. Die Patienten wurden für eine Dauer von 84 Tagen beobachtet. Tabelle 1 Charakteristik der Patienten
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In-vitro Untersuchungen zur Zytokin-Niveaubestimmung wurden durchgeführt; es zeigte sich bei allen transfizierten Zeilen eine erhöhte Sekretion von IL-7 und GM- CSF (s. Tabelle 2).
Tabelle 2 Zytokin Werte in Picogramm (pg) nach Transfektion der Primärkultur (Transfektions Effizienz)
Figure imgf000012_0002
n.b. nicht bestimmt Der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte erfindungsgemäße Impfstoff aus modifizierten Tumorzellen zeigt überraschende Wirkungen. Es ist vorteilhaft, dass der erfindungsgemäße Impfstoff eine Tumor-spezifische Immunantwort induziert. Beispielsweise ist der Serumspiegel von IL-7 und Interferon- gamma der Patienten nach der Behandlung messbar erhöht (s. Tabelle 3). Signifikante Unterschiede der Zytokin-Niveaus vor und nach der Behandlung waren nicht feststellbar. Es gab insbesondere einen signifikanten Anstieg von CD8 und CD3 positiven periphären Blutlymphozyten (PBL). Die Zytotoxizität dieser Zellpopulation stieg signifikant während der Behandlung von 21 ,5% auf 25,6% (aus Mittelwerten am 84. Tag berechnet) bei allen Patienten nach Abschluss der Behandlung. Die Signifikanz betrug p=0,03 (s. Tabelle 4). Vergleichbar war die Zunahme an PBLs, die CD 56 exprimierten von 16,3% auf 27,5% (aus Mittelwerten am 84. Tag berechnet). Auch hier betrug die Signifikanz p=0,03 (s. Tabelle 4).
Tabelle 3 Ergebnisse der Zytokin Bestimmung (ELISA)
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Tabelle 4 Exprimierte Oberflächenantigene der periphären Blutlymphozyten (PBL)
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Zum Vergleich der Veränderung der Zytotoxizität der PBL wurden diese den Patienten vor, während und nach der Behandlung entnommen. Bemerkenswerterweise erhöhte sich die Zytotoxizität der PBL während der Behandlung signifikant p=0,01 (s. Tabellen 4 und 5).
Tabelle 5 Zunahme der Zytotoxizität der periphären Blutlymphozyten (PBL) während der Behandlung
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Die klinischen Ergebnisse stützen sich hauptsächlich auf Computerthomographische (CT) Auswertungen. Folgende Formulierungen sollen entsprechend World Health Organization (1979) gelten: als eine partielle Reaktion (partial Response, PR) wird der Rückgang der erfaßbaren Tumorherde um mehr als 50% in den letzten vier Wochen sowie die Unterdrückung neuer Tumorherde bezeichnet. Unter stabilem Krankheitsverlauf (stable disease, SD) ist das Gleichbleiben des Zustandes zu verstehen. Alle Patienten vertrugen die Behandlung gut und es traten keine unerwünschten Nebenwirkungen auf.
Von zehn Patienten zeigten fünf eine klinisch signifikante Reaktion. Das bedeutet, daß zwei Patienten einen stabilen Verlauf (SD) nach der Behandlung zeigten, ein Patient eine gemischte Reaktion (mixed Response, MR), d. h. ein Fortschreiten der
Metastierung im Unterleib und ein Rückgang der Metastasen in der Lunge und ein Patient eine partielle Reaktion (PR) entwickelte. Bei einem Patienten war ein vollständiger Rückgang (complete Response, CR) der Tumorherde zu beobachten.
Bemerkenswerterweise stammen vier der erfolgreich behandelten Patienten aus der Gruppe mit der Ausgangsdiagnose Nierenzellkarzinom. Der Behandlungserfolg bedeutet, das bei einem Patient eine minimale Reaktion, bei zwei Patienten ein stabiler Krankheitsverlauf (SD) und bei einem Patienten sogar eine komplette Reaktion (complete Response, CR) zu verzeichnen war.
Der Patient mit der kompletten Reaktion zeigte folgendes Ausgangsbild: Metastasen bis zu 3 cm Größe in der Lunge, eine 4x4x3 cm große Metastase infiltrierte die benachbarte Rippe, Metastasen in den Rippen IV und VII und einen großen Nierentumor. Der Nierentumor wurde nach seiner Entfernung auf Bestätigung der Diagnose Nierenzellkarzinom überprüft. Eine Teil des Tumors wurde für die Vakzin Herstellung benutzt. Nach vierfacher Impfung mit transfizierten Zellen konnte ein Rückgang der Metastasen in der Lunge und Knochen beobachtet werden. Beim
Patienten zeigte sich ein vollständiger Rückgang (Remission) der Tumorherde für mehr als 24 Monate (CT-Aufnahmen nicht gezeigt).
Fünf aller behandelten Patienten zeigten ein Fortschreiten der Erkrankung (progressive Disease).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung von Tumorerkrankungen im fortgeschrittenen Stadium mit dem Erfindungsgegenstand, zur Erzeugung von in- vivo anti-tumorspezifischen Immunantworten in der Lage ist und zu meßbaren klinischen Ergebnissen führt. Im Lichte der zu erwartenden Verhältnisse bei der zugrundeliegenden Erkrankung zeigen diese Ergebnisse die beeindruckend Wirksamkeit der Behandlung. Diese Impfung könnte gerade bei Patienten im Anfangsstadium einer Tumor-Erkrankung eine vielversprechende Therapieform sein.
Im folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung auf dieses Beispiel zu beschränken ist.
Behandlung von metastasierendem Dickdarmkarzinom, Nierenzellkarzinom und malignem Melanom
Auswahl der Patienten: Patienten mit metastasierendem Dickdarmkarzinom, Nierenzellkarzinom oder malignem Melanom, im Alter zwischen 18 und 70 Jahren, und einem Kamofsky-Index von 70-100 waren aufnahmeberechtigt. Ausschlusskriterium waren: eine vorhergegangene Zytokinbehandlung oder Chemotherapie, die weniger als 28 Tage zurücklag, Kreatinwerte über 265μmol/l, Bilirubinwerte über 51μmol/l, nichtkompensierte Herzinsuffizienz, ventrikuläre Rhyt usstörungen, schwere psychatrische Krankheiten, aktive Hepatitis A, B oder
C, HIV Infektion.
Behandlung: Neben der Anamnese wurden die folgenden Parameter vor Begin der Behandlung bestimmt: physische Untersuchung, Hämatologie (Hämoglobin, Hematocrit, Leukozyten und Plättchenzahl), chemische Blutwerte and Urinanalyse. Es wurde für die Immunstatusbestimmung Blut genommen. DHT (Delayed type hypersensitivity) Hauttests wurden mit dem Multitest Merieux Test (Leimen, Germany) durchgeführt. Röntgenaufnahmen des Oberkörpers sowie Computertomographien des Oberkörpers und Abdomens wurden erstellt. Die Patienten erhielten vier subkutane Injektionen mit mindestens 1x106 Zellen ihrer zuvor ex-vivo behandelten Tumorzellen. Umfassende immunologische Untersuchungen, hämatologische Untersuchungen und grobe klinische Untersuchungen (physische Untersuchung, Ultraschall Untersuchung und Untersuchung des Unterleibes, bei Bedarf) wurden am 14., 28. und 56. Tag wiederholt. Eine komplette klinische und immunologische Untersuchung, vergleichbar mit der eingangs durchgeführten Auswahluntersuchung, fand am 84. Tag statt. Aufbereitung der Tumorzellsuspension
Die Tumorzellsuspension wurde behandelt, wie es für primäre Zellkulturen beschrieben ist (Finke, et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 260-268). Den Patienten operativ steril entnommene Tumorproben wurden unmittelbar in eisgekühltes Suspensionsmedium in 50 ml Falcon Zentrifugenröhrchen mit Schraubdeckeln überführt. Der Transport der gekühlten Proben zum Labor, in dem die ex-vivo Behandlung der Patientenzellen stattfand, dauerte zwischen 1-3 h.
Alle folgenden Verfahren wurden nach Arbeitsanweisungen (SOP) durchgeführt. Sämtliche Präparationen der Tumorzellen wurden in Klasse A und B (Reinraum) Umgebung unter GMP-analogen Bedingungen und S2-Sicherheitsklassifikation gemäß dem deutschen Gentechnikgesetz durchgeführt. Nur GMP-zertifizierte Chemikalien, Kulturmedien, Lösungsmittel und Materialien wurden verwendet. Steriltests wurden von einem zertifizierten Labor entsprechend DAB 10 V.2.1.1 durchgeführt. Auf Kontamination mit Mycoplasmen wurde mit Hilfe eines kommerziellen PCR-Kits StrataClean™ (StrataGene) getestet.
Als Eingangskontaminationskontrolle der Tumorproben wurden Aliquote des Suspensionsmediums für Sterilitätstests aufbewahrt. Das Tumormaterial wurde 2x mit je 50 ml PBS (ohne Ca2+ and Mg2+, Bio Whittaker), enthaltend 50 μg/ml Gentamycin (Bio Whittaker) und 1 μg/ml Amphotericin B (Gibco), bei 4°C gewaschen. Offensichtliches Nicht-Tumorgewebe und abgestorbenes Gewebe wurde so weit wie möglich mit Skalpel oder Schere entfernt. Das Tumorgewebe wurde dann in 140 mm Petrischalen (Falcon) überführt, die ungefähr 20 ml (abhängig von der Tumorgröße) Suspensionsmedium enthielten und in kleine Stücke geschnitten. Zellsiebe von 100 μm, 70 μm, und 40μm Porendurchmesser (Falcon) nach abnehmender Größe befanden sich in 50 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon), die Gewebestückchen wurden durch mechanischen Druck durch diese Siebe gedrückt. Während dieses Vorganges wurden die Siebe ständig mit Suspensionsmedium gespült. Der Gewebezerfall in einzelne Zellen, wurde mikroskopisch überwacht und das Sieben bei Bedarf wiederholt. Die Tumorzellen wurden durch Zentrifugation erhalten (350xg, 4°C, 7 min) und durch Resuspension und Zentrifugation in PBS (ohne Ca2+ and Mg2) bei 4°C gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und ihre Größenverteilung gemessen (Multisizer II, Sigma). Die Vitalität wurde mittels Durchflußzytometer durch Propidiumiodid-Färbung überprüft. Von einem Teil der Zellen wurde eine Zellkultur angelegt. Aliquote der Suspension wurden für einen Sterilitätstest aufbewahrt.
Suspensionsmedium für die Nierenkarzinomzellen: unverdünntes L-15 Medium (BioWhittaker), 10% FCS (BioWhittaker), 1x MEM Vitamine (Biochrom), 1x Insulin- Transferrin-Selenium-X (Gibco), 1mM L-Glutamin (BioWhittaker), 1g/l NaHCO3 (Gibco), 1g/l Glukose für DMEM (Gibco), 50μg/μl Gentamicin (BioWhittaker).
Suspensionsmedium für die malignen Melanomzellen: unverdünntes RPMI Medium 1640 (mit Ultraglutamin, BioWhittaker), 10% FCS (BioWhittaker), 50μg/μl Gentamicin (BioWhittaker)
Minimalistische immunologisch definierte Genexpressionskonstrukte (MIDGE)
Zwei kovalent geschlossene minimalistische DNA-Expressionsvektoren, „MIDGE" genannt, wurden eingesetzt, Ein Expressionsvektor diente der Expression des menschlichen lnterleukin-7 (IL-7), der andere der Expression des menschlichen Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktors (GM-CSF). Die MIDGE- Vektoren wurden nach SOP-Vorschrift und in der Klasse B entsprechendem Labor mit anschließender Qualitätskontrolle synthetisiert.
Die kodierende Gensequenz für IL-7 und GM-CSF wurde mit Hilfe der Reverse- Transkriptase-PCR (RT-PCR) aus mRNA menschlicher weißer Blutzellen amplifiziert. Die Amplifikate wurden in das Plasmid pMOK, ein pUC19 Abkömmling, zwischen die SstI und Kpnl Schnittstellen inseriert. PMOK besitzt neben dem starken "early immediate promotor" aus dem CMV-Virus, ein Intron und eine Polyadenylierungssequenz aus dem SV40-Virus (MOLOGEN, Berlin, Germany).
Das Plasmid pMOK wurde mit dem Restriktionsenzym Eco31 I über Nacht bei 37°C vollständig verdaut. Durch den Restriktionsverdau wurden zwei DNA-Fragmente erzeugt. Das eine bestand aus dem Kanamycin-Resistenzgen, sowie anderen zu Propagierung des Plasmides in Bakterien notwendigen Sequenzen. Das andere Fragment bestand aus den Sequenzen, die Bestandteil der MIDGE-DNA werden sollten : enhanced CMV-Promotor, chimäres Intron, der entsprechenden Gense- quenz und der Polyadenylierungssequenz aus SV-40. Mittels des Enzymes T4-DNA Ligase wurden die 5' phosphorylierten haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotide (TIB-MolBiol, Berlin) 5' -PH-GGG AGT CCA GTT TTC TGG AC-3' und 5' PH- AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC-3' in Anwesenheit des Restriktionsenzymes Eco31 I über Nacht bei 37DC an das die MIDGE-DNA bildende DNA Fragment ligiert. Die
Reaktion wurde durch Erhitzen auf 70°C gestoppt. Das resultierende Gemisch an Nukleinsäuren wurde mit dem Enzym T7-DNA-Polymerase behandelt. Die MIDGE- DNA wurde durch Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt und mit Isopro- panol gefällt (vgl. EP 0 941 318 B1).
Doppelsträngige immunolatorische Oligodeoxynucleotide (d-SLIM)
Doppelsträngige Immunomodulatoren d-SLIMs des ISS30 Typs wurden nach (SOP) und abschließender Qualitätskontrolle im Klasse B Labor hergestellt.
Einzelsträngige, haarnadelförmige, 5'-phosphorylierte Oligodesoxyribonukleotide (ODN) mit der Sequenz 5'-CCT AGG GGT TAG CAC TCA TTG GAA AAC GTT CGG GGC GTT CTT GGT GGT AACC-3' wurden (TIB-MolBiol, Berlin, Germany) bezogen und mit T4-DNA-Ligase (MBI Fermentas, Leon Roth) ligiert. Nach Verdau der restlichen Edukte mit T7-Polymerase and chromatographischer Aufreinigung, wurden die ODN durch Ethanol und Sodium-Magnesium Acetat Fällung konzentriert und in PBS gelöst (vgl. WO 01/07055)
Ballistischer DNA-Transfer
Für den ex-vivo Gen Transfer in den Zellkern der Tumorzellen und der Kontrollzellen wurde ein modifiziertes Gerät zur Zellenbeschleunigung die Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) angewendet. Die Modifizierung betrifft eine Vorrichtung zur Druckverteilung (vgl. EP 0732 395 B1). Pro Schuß lassen sich so mehr als 1,5χ107 Zellen behandeln. Zusätzlich ist die ballistische Methode kombiniert mit der magnetischen Separation der transfizierten Zellen. Obwohl die magnetische Separation nicht durchgeführt wurde, wurden die magnetischen Partikel trotzdem mit in die Zellen eingebracht, da sie die Bindungskapazität der Goldpartikel für DNA verstärken. Bisher konnte dieses Verfahren des ballistisch DNA Transfers nur bei adhärent wachsenden Zellen angewendet werden. Um den DNA-Transfer in die Tumorzeilen zu gewährleisten, wurden sie auf eine 44 mm2 Polycarbonat-Membran (Transwell ™, Porengröße 3,0 μm, von der Firma Costar) platiert. 1-2x107 Zellen, abhängig von ihrer Größe, können auf so eine Membran geladen werden, verglichen mit 1-2x106 bei adhärenten Zellkulturen in Kulturgefäßen mit vergleichbaren Oberflächeninhalt. Die Zellwiedergewinnung und Lebensfähigkeit sind wesentlich verbessert, des weiteren ist die Behandlungszeit stark verkürzt. Standardbedingungen, abhängig von den morphologischen und funktionalen Unterschieden der Tumorzeiltypen, wurden entwickelt.
Die Tumorzellsuspensionen wurden auf eine Konzentration von 5x106 Zellen/ml in den Zellsuspensionsmedien eingestellt. Eine Transwell-Membran wurde mit 15 ml Medium von beiden Seiten für 5 min. aquilibriert. Danach wurde die Mediumschicht oberhalb der Membran entfernt und 2-4 ml der Tumorzellsuspension gleichmäßig auf die Polycarbonat-Membran aufgetragen. Die Zellen besiedelten die Membran, während das Suspensionsmedium durch die Membranporen in tiefere Membranschichten abfließen konnte. Überschüssiges Medium in den tieferen Schichten wurde durch eine Öffnung entfernt, bis keine flüssigen Reste über der Monolayer-Schicht mehr sichtbar waren. Das Medium unterhalb der Membran ist eine sehr wichtige technische Unterstützung während des Transfektionsvorganges und hält die Zellen feucht und lebensfähig.
Auf jede der sieben Trägermembranen (Bio-Rad) wurde 15 μl einer Goldsuspension pipettiert. Nachdem sich die Goldpartikel (1 ,6 μm Durchmesser, bezogen von Bio- Rad, Hercules, CA, USA) abgesetzt hatten, wurde der Überstand entfernt. Zu ihrer Beschichtung mit DNA und den kolloidalen superparamagnetischen Partikeln
(mittlerer Durchmesser: 65 nm, Milteny GmbH), wurden 30 μl einer 1 :3 (v/v) DNA:Partikel Lösung, mit einer DNA-Konzentration von 2mg/ml pro Expressionvektor auf die Membranen pipettiert. Nach Aufwirbelung des Goldes konnte sich das Gemisch absetzen. Der Überstandes wurde entfernt und die beschichteten Goldpartikel trockneten bei Raumtemperatur (RT).
Die mit den Partikeln beschichteten Membranen wurden in einem Abstand von 15 mm von dem Stoppsieb befestigt. Die Monolayer Schicht der Tumorzellen auf der Transwell-Membran wurde ungefähr 90 mm unterhalb des Stoppsiebes angebracht. Durch den ballistischen Transfer wurden die Goldpartikel in Richtung der Tumorzellen mit einem Druck von 1550 psi beschleunigt.
Sofort nach dem Gentransfer wurden die Tumorzellen mit 10 ml vorgewärmten Zeilsuspensionsmedium bedeckt und durch vorsichtiges Abpipettieren in 15ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Sedimentation der Zellen bei 300xg and 4°C für 5 min wurden sie in Medium gelöst. Widerum wurden Aliquots für Steriltests, Tests zu Zellwiederherstellung u.- lebensfähigkeit, für FACS Analysen, und zur Bestimmung der die Zytokin-Expression zurückbehalten. Die Transfektions-Effizienz wurde wie beschrieben bestimmt (Foa et al., 1994, Nat. Immun. 13: 65-75)).
Die transfizierte Tumorzellsuspension wurde abermals getrocknet, in 1 ,5 ml Gefriermedium aufgenommen (80% FCS, 10% DMSO, 10% Suspensionsmedium) und in Portionen zu 5x106 bis 2x107 Zellen in versiegelten 2 ml Gefriertubes aufbewahrt. Die Röhrchen wurden bei -80°C a 1 °C/min in flüssigem Stickstoff gelagert.
Vorbereitungen der Zellen für die Vakzinierung
Ein Röhrchen wurde aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und unter vorsichtigem Schütteln bei 37°C im Wassebad aufgetaut. Danach wurde es von außen kurz mit 70% Ethanol desinfiziert. Die aufgetaute Zellsuspension wurde langsam und tropfenweise in 50 ml PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) bei 4°C überführt, und bei 300xg, bei 4°C, für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig in 50 ml PBS aufgenommen, abermals getrocknet, in 1 ml PBS gelöst und in 2 ml Gefäße überführt (Biopure™, Eppendorf). Der Inhalt wurde auf eine 1 ml Spritze gezogen, mit einem Schraubverschluß versiegelt, 3x für 667 sec mit Gamma-Strahlung bestrahlt, was einer Gesamtdosis von 105 gray entsprach. Dann wurde die Spritze in einem sterilen, doppelwandigen und stoßsicheren Container bei 4°C in die Klinik transportiert.
Immunologische Studien Für die meisten Untersuchungen wurden gefrorene Zellen benutzt. Daher konnten zu verschiedenen Zeitpunkten entnommene Zellen in einer Untersuchung getestet werden. Für die Durchflußzytometrischen Analysen wurden frische Zellen verwendet.
Immunofluoreszenz und Durchflußzvtometrische Studien
Periphäre Lymphocyten des Blutes wurden mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen menschliche Öberflächenantigene versehen. Unter den Antikörpern waren AK gegen menschliches CD3, CD4, CD8, CD16, CD11a, CD14, CD19, CD25, CD28, CD45, CD54, CD56 and HLA-DR (Immunotech Hamburg, Germany). AK vom gleichen Isotyp wurden als Kontrollen benutzt. Die markierten Zellen wurden gewaschen und anschließend mit dem FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Für die Bestimmung des Hintergrundes wurden für diese Studie irrelevante AK eingesetzt, er betrug weniger als 2%. 104 Zellen jeder Probe wurden analysiert.
Zvtotoxischer Test
Der CytoTox 96, ein nicht-radioaktiver zvtotoxischer Test (Promega, Madison, Wisconsin) wurde verwendet, um die zytotoxische Aktivität der periphären Blutlymphozyten zu bestimmen und zu vergleichen. Diese Untersuchungen erfolgten am 0., 14., 28., 56. and 84. Tag. Der Test ist eine kalorimetrische Alternative zum 51 Chrom-Freisetzungstest. Quantitatives Maß ist die Lactat Dehydrogenase (LDH), die bei Zelllysis genau wie 51Cr von den Zellen abgegeben wird. Die freie LDH wird im Überstand nach einer 30-minütigen Inkubation unter Benutzung eines gekoppelten enzymatischen Tests bestimmt. Die Menge an freigesetztem Farbstoff ist dabei proportional der Menge an lysierten Zellen. Die Absorbtion wurde bei 490 nm gemessen. 5000 Zielzellen wurden in dreifacher Ausführung in V-förmige 96-Loch Gewebekulturplatten aufgetragen und für vier Stunden mit verschiedenen Verhältnissen von Effektor und Zielzellen inkubiert. Nach der Inkubation wurden Aliquote von 50 μl auf eine neue 96 Lochplatte überführt. 50 μl des Substratmixes wurde in jede Kammer dazugegeben und nachfolgend im Dunkeln für 30 min bei RT inkubiert. Vor der Bestimmung wurden 50 μl Stopplösung dazugegeben. Autologe Tumorzellen wurden als Zielzellen verwendet. Jedes Experiment wurde -dreifach durchgeführt und ein Mittelwert gebildet. Die lytische Einheit (LU) wurde durch Titrationskurven bestimmt. Eine LU wird definiert als die Anzahl an Effektorzellen, die nötig sind, um eine 10% Lysis von 104 Zielzellen zu erreichen.
Proliferations Assay
Der Proliferationstest „Easy for you" (Biomedica, Vienna, Austria) wurde verwendet, um die Proliferation der periphären Blutlymphozyten (PBL), die den Patienten vor, während und nach der Behandlung entnommen wurden waren, zu bestimmen. PBL wurden aus periphärem Blut mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation erhalten und gemäß Protokoll unter Verwendung einer chromophoren Substratlösung mit Hilfe eines Spektrophotometers (ELISA reader) analysiert. Die Inkubation mit der Substratlösung erfolgte für vier Stunden, abhängig von der Stoffwechselleistung der Zellen. Das gelbe Tetrazolium wird im Verlauf in das rote Formazan-Derivat umgewandelt, dessen Absorptionsmaximum bei 490 nm liegt. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und ein Mittelwert gebildet.
Enzym-immunologischer Test
Die Zytokin-Niveaus in den Seren der Patienten vom 0, 14, 28, 56 and 84 Tag wurden durch einen Enzymtest (ELISA) bestimmt. Der IL-7-ELISA-Kit käuflich erworben bei Laboserv (Staufenberg, Germany); der IFN-gamma-, TNF-alpha- und TGF-beta1 -ELISA Kit von R&D Systems (Quantikine, Minneapolis, Minnesota); und der GM-CSF-ELISA von Promocell (Heidelberg, Germany). Damit konnte lösliches IL-7, IFN-gamma, TNF-alpha, TGF-beta1 und GM-CSF in Konzentrationen von 9, 3, 4.4, 7, 1.5 pg/ml bis 1000, 500, 500, 1000, 500 pg/ml, bestimmt werden. Die Microtiter-Platten waren mit einem monoklonalen AK beschichtet, der nach Inkubation im Serum die Zytokine band. Nach mehreren Waschschritten zum
Entfernen des ungebundenen Proteins, wurde ein Enzym-gekoppelter (Merrettich- Peroxidase) polyklonaler AK dazugegeben, der in der flüssigen Phase die Zytokine band. Nach dem Waschen wurde die Substratlösung dazugegeben und die Farbentwicklung wurde bei einer Wellenlänge λ= 450 nm verfolgt. Die optische Dichte der Proben war vergleichbar mit der Kalibrierungskurve. Zur Erzeugung der Kalibrierungskurve waren Standardproben gemäß den WHO-Standards verwendet wurden.
Überempfindlichkeitsreaktion
Ein käuflich zu beziehender Delayed type hypersensitivity (DTH)-Test, (Multi Test Merieux, Leimen, Germany) wurde vor und nach der Behandlung angewendet. Eine positive Hautreaktion wurde eine auftretende Härtung innerhalb von 48 h bezeichnet, wenn ihr mittlerer Durchmesser größer als 5 mm betrug.
Präparation der autologen Lymphozvten
Periphäre Blutmonozyten (PBMC) wurden aus heparinisierten periphären Blut mittels Lymphoprep (GIBCO, Karlsruhe, Germany) mittels Dichtezentrifugation erhalten. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in flüssigem Stickstoff in der Anwesenheit von mehr als 20% FCS für ELISPOT und zytotoxische Assays gefriergetrocknet.
ELISPOT-Test
Eine HATF Multititerplatte (Millipore, Eschborn, Germany) wurde mit 500ng anti-lFN- gamma Antikörper (AK) (Biozol, Eching, Germany) in Beschichtungslösung (3.8g/l NaHCO3, 1.9g/l Na2CO3) gelöst, bei 4°C über Nacht beschichtet. Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte mit 200μl Blockinglösung (5% BSA in Phosphatpuffer) bei 37°C über 30 min geblockt. Nach dem Waschen wurden 105 periphäre Blutlymphozyten pro Loch aufgetragen und über Nacht inkubiert (bei 37°C, 5%
C02). Die Platte wurde gewaschen und mit 500ng eines zweiten Biotin-gelabelten IFN-gamma-AK (Biozol) über Nacht bei 4°C inkubiert. Für den Nachweis wurden Avidin and BCIP/NBT-Lösung (Sigma, Deisenhofen, Germany) verwendet.
Statistische Analyse
Wilcoxons angepaßter paarweiser und unpaarweiser Test wurde zur Analyse der statistischen Signifikants benutzt. Ein p- Wert < .0,05 wird als signifikant betrachtet.

Claims

Patentansprüche
1. Vakzine zur Behandlung von Patienten mit definierten Tumorerkrankungen, bestehend aus Tumorzellen eines Patienten, wobei diese Tumorzellen zuvor ex-vivo mit für lnterleukin-7 (IL-7) und makrophagenaktivierenden Faktor (GM-CSF) kodierenden Nukleinsäuremolekülen transfiziert wurden.
2. Vakzine nach Anspruch 1 , wobei die für lnterleukin-7 (IL-7) und makrophagenaktivierenden Faktor (GM-CSF) kodierenden Nukleinsäuremoleküle in einem oder mehreren Expressionskonstrukten vorliegen.
3. Vakzine nach Anspruch 2, wobei das Expressionskonstrukt ein Plasmid ist.
4. Vakzine nach Anspruch 2, wobei das Expressionskonstrukt eine linear- doppelsträngige, kovalent geschlossene Expressionskassette ist, die lediglich aus einem CMV Promotor, einem Intron, der für lnterleukin-7 (IL-7) und / oder makrophagenaktivierenden Faktor (GM-CSF) kodierenden Gensequenz und einer Polyadenylierungssequenz besteht, welche an beiden Enden des Doppelstrangs durch eine kurze Schleife einzelsträngiger Nukleosidreste ko- valent geschlossen ist.
5. Vakzine nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei diese zusätzlich immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotide als Adjuvanz umfaßt.
6. Vakzine nach Anspruch 5, wobei das immunmodulierende Oligodesoxyribo- nukleotid
a) eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfasst, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,
b) und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teilweise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.
7. Vakzine nach Anspruch 4 und 6, wobei die Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und 40 bis 200 Nukleotide umfasst.
8. Vakzine nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei diese ei- nen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
9. Vakzine nach Anspruch 1 , wobei die Zellen ausgewählt sind aus Nierenkar- zinomzellen, malignen Melanomzellen und/oder Dickdarmkarzinomzellen.
10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 1 bis 9 zur Behandlung von Patienten mit definierten Tumorerkrankungen, wobei Tumorzellen eines Patienten ex-vivo mit für lnterleukin-7 (IL-7) und makrophagenaktivierenden Faktor (GM-CSF) kodierenden Nukleinsäuremo- lekülen transfiziert werden, immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotide (d-SLIM) als Adjuvanz eingesetzt werden und anschließend in eine applikationsfähige pharmazeutische Zusammensetzung überführt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Tumorerkrankung um ein
Dickdarmkarzinom, ein Nierenzellkarzinom und/oder ein malignes Melanom handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die Tumorzellen von mehreren Patienten mit derselben Tumorerkrankung stammen.
13. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid einen zirkulären Strang Desoxy- ribonukleinsäure mit einer teilweise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfasst, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxyadenosin und T Desoxythymidin ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und 40 bis 200 Nukleotide umfasst.
16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäuremoleküle in einem oder mehreren Expressionskonstrukten vorliegen.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 16, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Transfektion mittels ballistischem Transfer, Polykati- onen-Transfektion, Kalziumphosphatpräzipitation, Mikroinjektion, Pro- toplastenfusion, Liposomenfusion, virale Transfektionssysteme, Lipofektion und/oder Elektroporation erfolgt.
18. Verfahren nach den Anspruch 10, wobei es sich bei den Tumorerkrankungen um mit Zytokinen im Zusammenhang stehende Krankheiten, insbesondere bösartige oder gutartige Tumore, handelt.
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