EA017860B1 - Мультимер для иммуностимуляции - Google Patents

Мультимер для иммуностимуляции Download PDF

Info

Publication number
EA017860B1
EA017860B1 EA200802310A EA200802310A EA017860B1 EA 017860 B1 EA017860 B1 EA 017860B1 EA 200802310 A EA200802310 A EA 200802310A EA 200802310 A EA200802310 A EA 200802310A EA 017860 B1 EA017860 B1 EA 017860B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tumors
molecules
molecule
dna
composition according
Prior art date
Application number
EA200802310A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200802310A1 (ru
Inventor
Маттиас ШРОФФ
Бургардт Виттиг
Мануэль ШМИДТ
Жанин Лёр
Original Assignee
Мологен Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мологен Аг filed Critical Мологен Аг
Publication of EA200802310A1 publication Critical patent/EA200802310A1/ru
Publication of EA017860B1 publication Critical patent/EA017860B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)

Abstract

Изобретение относится к мультимерной некодирующей нуклеотидной молекуле для модуляции активности иммунной системы человека или животного, способу её получения и к вакцине, которая содержит мультимерную некодирующую нуклеотидную молекулу.

Description

Данное изобретение относится к мультимерной некодирующей нуклеотидной молекуле для модуляции активности иммунной системы человека или животного, способу её получения и к вакцине, которая содержит мультимерную некодирующую нуклеотидную молекулу.
Хотя адаптивный иммунный ответ в результате селекции лимфоцитов, специфических к соответствующему патогену, и их клональной экспансии и дифференцировки в эффекторные клетки вырабатывается лишь с задержкой (3-5 дней), но затем он предоставляет длительную защиту от соответствующего патогена за счёт формирования иммунологической памяти, клетки естественной иммунной системы узнают патогены по патоген-ассоциированным молекулярным паттернам (РАМР) с помощью рецепторов, кодированных в зародышевых клетках, и сразу же отвечают. Реакции, различные для разных типов клеток, включают секрецию цитокинов (например, 1Ь-1, 1Ь-6, ΤΝΕ-α) и хемокинов (например, 1Ь8/СХСБ8, ΜΙΡ-1α/β, МСР-1), активацию эффекторных механизмов (фагоцитоз, респираторный секрет, высвобождение бактерицидных веществ или литической гранулы), экспрессию костимулирующих молекул (СИ80, СО86), а также повышенную экспрессию молекул МНС (главного комплекса гистосовместимости). С одной стороны, это рекрутирует и активирует эффекторные клетки, способные элиминировать проникший патоген, а с другой стороны, клетки адаптивной иммунной системы получают сигналы, необходимые для их активации.
Для выработки повышенного иммунного ответа используют СрС олигонуклеотиды (СрС ΘΌΝ) как новый класс иммуномодуляторов. Такие неметилированные СО мотивы встречаются в бактериальной ДНК и являются сигналом опасности для иммунной системы. Будучи патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР), они вызывают, главным образом, неспецифическую активацию естественной иммунной системы (Кпед, Ναι. Меб 2003, 9: 831-835).
СрО ΘΌΝ индуцируют Тн1-усиленный иммунный ответ через цитокины интерлейкин-12, интерферон-γ и фактор некроза опухолей α.
Иммуностимулирующие нуклеотидные последовательности (Ι88), несущие вышеуказанные СрО ΘΌΝ, имеют в длину только несколько оснований и не функционируют через посредство экспрессии кодированных ими белков.
Ι88 представляют собой нуклеотидные молекулы, замкнутые ковалентными связями. Они состоят из олигонуклеотидов, основания которых могут претерпевать частичное спаривание с самими собой, и одной или двух петель, которые содержат 30 оснований и нескольких СО мотивов, и ниже в данном описании именуются молекулы носителя (молекулярные носители).
Мощная стимуляция клеточного иммунного ответа содействует усилению влияния на регуляторные циклы, которые в отсутствие воздействия вызывали бы иммунную активность, недостаточную для пациента.
Модификация СрО ΘΌΝ при содействии включающего фосфоротиоатные звенья скелета, используемая при стабилизации СрО ΌΝΑ (ДНК СрО), имеет ряд недостатков, включая, в частности, наблюдаемую токсичность [Не1кеиета16ег 2004, Ьеут 1999], а также неспецифическое связывание с белками [Вго^и 1994].
По этой причине был создан новый класс соединений (Европейский патент ЕР 1196178). Эти молекулы ДНК, имеющие две самокомплементарные области на 5'- и 3'-концах с перекрываниями палиндромов (перевертышей, инвертированных повторов), так что лигирование двух молекул ДНК даёт ковалентно замкнутую молекулу. Эти молекулы ДНК с СО мотивами в некомплементарной области показывает активность, аналогичную активности СрО ΘΌΝ (повышенная экспрессия поверхностных молекул СЭ80. СЭ40. МНС на В клетках и секреция 1Ь-6, ΙΕΝ-γ, ΙΡΝ-α, 1Б-12. ΤΝΕ-α в РВМС), но по сравнению с СрО ΘΌΝ с фосфоротиоатным скелетом имеют несколько отличный паттерн экспрессии и значительно более низкую токсичность в организме мышей. Однако эта иммуностимулирующая ДНК из предыдущего уровня техники имеет ряд недостатков в том, что касается модуляции активности иммунной системы человека или животных. Не всегда возможно модулировать, в особенности запускать, инициировать, активность иммунной системы человека или животного на заданном уровне.
С учётом вышеуказанного положения предыдущего уровня техники задачей (целью) настоящего изобретения является создание подходящих иммуностимулирующих молекул ДНК, способных инициировать повышенный иммунный ответ, способа их получения, а также вакцин, содержащих указанные иммуностимулирующие молекулы ДНК.
В контексте настоящего изобретения иммуностимуляция означает, что медиаторные и эффекторные клетки иммунной системы, а именно в особенности известные в настоящее время тимоциты, В клетки и так называемые ΝΚ (природные клетки-киллеры) клетки, макрофаги и моноциты, а также дендритные клетки и их предшественники, так же, как популяции клеток, при предположении функций в иммунной системе, функции которых ещё неясны, стимулируются таким образом, что наблюдается пролиферация, миграция, дифференцировка или активность за счёт использования нуклеотидных молекул. Иммуномодуляция означает, что помимо общей стимуляции в описанном выше значении наблюдается также влияние иммунной реакции на тип или характер либо за счёт участия иммунной реакции в процессе возникновения или созревания, либо за счёт изменения характера ранее известной реакции.
- 1 017860
Настоящее изобретение решает эту задачу путём создания мультимерной молекулы некодирующей нуклеиновой кислоты. Мультимерную молекулу можно получать методом, включающим следующие стадии:
получение 5'-фосфорилированной последовательности олигодезоксирибонуклеиновой кислоты в воде, лиофилизация до получения сухого остатка с последующим ресуспендированием в буферном растворе, добавление Т4 ДНК лигазы, при этом образуется реакционная смесь, инкубация реакционной смеси при 37°С в течение по меньшей мере 30 мин.
Самое удивительное, что в результате последовательности вышеуказанных стадий получают мультимерную молекулу, которая более подходит для применения с целью модуляции активности иммунной системы человека или животных, чем молекулы предыдущего уровня техники. Мультимерная молекула в значении по настоящему изобретению является практически молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты, причём указанная нуклеотидная молекула предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, более предпочтительно 200, особенно предпочтительно более 300. В то время как в Европейском патенте ЕР 1196178 раскрываются молекулы, которые с учётом их структуры типа стебельпетля можно называть мономерами, способ по изобретению предусматривает молекулы, в которых несколько таких мономерных структур стебель-петля объединяются в мультимерные или олигомерные структуры. Удивительно то, что полученные соединения (результаты сборки) эффективно модулируют иммунную систему. Поразительно, что сами по себе (рег ке) простые и обычные стадии лабораторных методов, указанные выше, приводят в результате к образованию эффективных структур. По сравнению со структурами в соответствии с Европейским патентом ЕР 1196178 мультимерные молекулы по данному изобретению представляют собой более высокомолекулярные комплексы.
В предпочтительном варианте изобретения олигомерное или мультимерное соединение (результат сборки), а именно молекула по данному изобретению, характеризуется тем, что последовательность олигодезоксирибонуклеиновой кислоты содержит следующие последовательности:
а) СТТССТССАС АССТТСТТАС СААССТТСТС СТТСАССТТС САСАСААС, или
б) АССТТССТТС ТАСТААССТТ СССТСААССА АССТТСАТСТ ТСАТААССТТ СССТАСАТСА, или
в) представляет собой олигодезоксирибонуклеотидную последовательность, имеющую последовательность оснований ААСС ТТСТТССССС ССТТ,
г) указанная олигодезоксирибонуклеотидная последовательность имеет в длину 40-1600 нуклеотидов.
Мультимерные соединения (результаты сборки) в значении по настоящему изобретению, которые включают предпочтительные последовательности, особенно пригодны для стимуляции активности иммунной системы домашних животных и людей.
В предпочтительном варианте изобретения последовательность оснований по признаку в) включена в последовательность ССТАССССТТ АССАССТТСА ТТССААААСС ТТСТТССССС ССТТСТТАСС ТССТААСС ССТАССССТТ АССАССТТСА ТТССААААСС ТТСТТССССС ССТТСТТАСС ТССТААСС. Поразительно, что присутствие вышеприведённой последовательности имеет следствием особенно высокий эффект молекулы, причём этот эффект в значении по изобретению следует понимать как активацию иммунной системы.
В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что молекула содержит частично однонитевую, ковалентно замкнутую цепь дезоксирибонуклеозидных остатков. Именно частично однонитевая ковалентно замкнутая цепь дезоксирибонуклеозидных остатков в сборной олигомерной или полимерной структуре молекулы ответственна за пролонгированную высокую активность молекулы в организме-мишени, в который она включена.
В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что молекула содержит последовательность оснований №н2ССМ3М4, где Ν!Ν2 обозначает какой-либо член из группы СТ, СС, СА, АТ и АА, Ν3Ν4 обозначает какой-либо член из группы СТ или ТТ, а С обозначает дезоксицитозин, С обозначает дезоксигуанозин, А обозначает дезоксиденозин и Т обозначает дезокситимидин.
В особенно предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что последовательность оснований Ν^^ΟΝΝ расположена в однонитевой области замкнутой цепи дезоксирибонуклеозидных остатков. В частности, эти предпочтительные молекулы, которые проявляют самую высокую эффективность при стимулировании иммунной системы.
Данное изобретение относится также к молекуле по изобретению, связанной ковалентными связями с рядом заместителей, причём указанные заместители предпочтительно являются пептидами, белками, сахаридами, антигенными структурами, молекулами ДНК и/или РНК.
Изобретение также относится к комбинированному агенту, содержащему по меньшей мере одну молекулу по изобретению и один химиотерапевтический агент. Как ни удивительно, невероятно высокий уровень стимуляции иммунной системы молекулой по изобретению можно даже повысить, если агент по изобретению объединить с хорошо известным химиотерапевтическим агентом и комбинированный агент
- 2 017860 используют против опухолей. Комбинированный агент в значении по изобретению можно также приготовить в виде набора, в котором агент по изобретению и химиотерапевтический агент из предыдущего уровня техники присутствуют по отдельности. Так, в предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере два компонента из набора можно вводить одновременно или в разное время. Например, введение комбинированного агента по изобретению может активировать иммунную систему таким образом, что введённый затем химиотерапевтический агент может проявить особенно высокую активность. Очевидно, можно также сначала вводить в организм человека или животного химиотерапевтический агент, а спустя некоторое время можно ввести молекулу по изобретению. В случае определённых опухолей предпочтительно одновременное введение молекулы по изобретению и химиотерапевтического агента.
В предпочтительном варианте изобретения химиотерапевтический агент выбирают из группы, включающей антитела, алкилирующие агенты, платиновые аналоги, интеркалирующие агенты, антибиотики, ингибиторы митоза, таксаны, ингибиторы топоизомераз, антиметаболиты и/или Ь-аспарагиназу, гидроксикарбамид (гидроксимочевину), митотан и/или аманитины.
В предпочтительном варианте изобретения алкилирующие агенты выбирают из группы, включающей производные азотного мустина, в особенности циклофосфамид, ифосфамид, трофосфамид, мельфалан и/или хлорамбуцил, алкилсульфонаты, в особенности бусульфан и/или треосульфан нитрозомочевины, в особенности кармустин, ломустин, нимустин, эстрамустин и/или стрептозотоцин, прокарбазин и дакарбазин, темозоломид и/или тиотеп.
Алкилирующие агенты оказывают особенно сильное действие на опухоли, тем самым ингибируя их рост.
В предпочтительном варианте изобретения платиновые аналоги выбирают из группы, включающей цисплатин, карбоплатин и/или оксалиплатин.
В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что интеркалирующие агенты выбирают из группы, включающей антрациклины, в особенности доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, эпирубицин и/или идарубицин, митоксантрон, амсакрин и/или доксофлуридин.
В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что антибиотики выбирают из группы, включающей блеомицин, актиномицин Ό (дактиномицин) и/или митомицин.
В другом предпочтительном варианте изобретения, возможно, удобнее выбирать ингибиторы митоза из группы, включающей алкалоиды Ушеа гокеа, в особенности винорелбин, винкристин (онковин), винбластин и/или виндезин.
В другом, особенно предпочтительном варианте изобретения таксаны выбирают из группы, включающей паклитаксел и/или доцетаксел.
Кроме того, может быть предпочтительным выбирать ингибиторы топоизомераз из группы, включающей ингибиторы топоизомеразы I, в особенности камптотецин, топотекан и/или иринотекан, и/или ингибиторы топоизомеразы II, в особенности этопозид, тенипозид.
Предпочтительно также, чтобы антиметаболиты в отдельном варианте изобретения выбирались из группы, включающей антагонисты фолиевой кислоты, в особенности метотрексат, аналоги пиримидина, в особенности 5-фторурацил, капецитабин, цитозин арабинозид (цитарабин) и/или гемцитабин, аналоги пурина, в особенности 6-тиогуанин, пентостатин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, флударабин и/или кладрибин.
Изобретение также относится к набору, содержащему соединение (молекулу) по изобретению и химиотерапевтический агент необязательно вместе с информацией относительно смешивания (объединения) содержимого набора. Как указано выше, изобретение относится также к фармацевтическому агенту, содержащему соединение (молекулу) по изобретению, или комбинированному агенту, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
Кроме того, изобретение относится к применению указанной молекулы (соединения), комбинированного агента или фармацевтического агента для получения агента для модуляции иммунной системы человека или животного или для модуляции активности такой иммунной системы. Под модуляцией иммунной системы человека или животного понимают любое воздействие на иммунную систему, которое приводит в результате к ингибирующему действию иммунной системы на опухоли или раковые заболевания. Можно понимать, что модуляция активности иммунной системы является синонимом или описывает активности иммунной системы, общеизвестные специалистам в данной области техники, которые направлены против опухолей и, как ни удивительно, усиливаются агентами по изобретению. Более конкретно, модуляция представляет собой стимуляцию или усиление эффектов, вызываемых иммунной системой, или самой иммунной системы. Так, в предпочтительном варианте изобретения агенты по изобретению можно использовать для стимуляции Т-клеточно-опосредованного иммунного ответа, но также и независимого от Т-клеток иммунного ответа. В предпочтительном варианте изобретения этот процесс может включать пролиферацию В клеток или активацию В клеток.
В особенно предпочтительном варианте изобретения модуляция активности иммунной системы вызывает стимуляцию таким образом, что цитокины секретируются или повышается уровень их секреции. Возможно, особенно предпочтительно использовать соединение (молекулу) по изобретению или комби
- 3 017860 нированный агент по изобретению в качестве адъюванта при терапевтической или профилактической вакцинации. Особенно эффективно агенты по изобретению можно использовать при лечении нарушений роста клеток, и в предпочтительном варианте изобретения нарушение роста клеток представляет собой опухолевое заболевание. В предпочтительном варианте опухолевое заболевание представляет собой заболевание, выбранное из группы, содержащей опухоли уха, носа, горла, включая опухоли внутри носа, опухоли назального синуса, носоглотки, на губах, в полости рта, опухоли мезофаринкса (ротоглотки), гортани, гипофаринкса (подглоточника), уха, слюнных желез, и параганглиомы, опухоли лёгких, включающие немелкоклеточные карциномы бронхов, мелкоклеточные карциномы бронхов, опухоли средостения, опухоли желудочно-кишечного тракта, включающие опухоли пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, колоректальные карциномы и анальные карциномы, опухоли мочеполовой системы, включая опухоли почек, мочеточника, мочевого пузыря, простаты, уретры, пениса и яичек, гинекологические опухоли, включая опухоли шейки матки, влагалища, вульвы, рак матки, злокачественную трофобластическую опухоль, карциному яичника, опухоли маточной трубы (фаллопиевой трубы), опухоли брюшной полости, карциному молочной железы, опухоли эндокринных органов, включая опухоли щитовидной железы, паращитовидной железы, коры надпочечника, эндокринные опухоли поджелудочной железы, карциноидные опухоли и карциноидный синдром, множественные эндокринные неоплазии, саркомы костных и мягких тканей, мезотелиомы, кожные опухоли, меланомы, включая кожные и внутриглазные меланомы, опухоли центральной нервной системы, опухоли детского возраста, включая ретинобластому, опухоль Вильмса, нейрофиброматоз, нейробластому, семейство опухолей типа саркомы Юинга, рабдомиосаркому, лимфомы, включая неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, первичные лимфомы центральной нервной системы, болезнь Ходжкина, лейкозы, включая острые лейкозы, хронический миелоидный и лимфатический лейкозы, опухоли плазматических клеток, синдромы миелодисплазии, паранеопластические синдромы, метастазы с неизвестной первичной опухолью (синдром СИР), перитонеальный карциноматоз, злокачественное заболевание, связанное с иммуносупрессией, включая злокачественное заболевание, обусловленное СПИДом, такое как саркома Капоши, обусловленные СПИДом лимфомы центральной нервной системы, обусловленная СПИДом болезнь Ходжкина и обусловленные СПИДом анальногенитальные опухоли, злокачественное заболевание, обусловленное трансплантацией, метастазирующие опухоли, включая метастазы в мозг, метастазы в лёгкие, метастазы в печень, метастазы в кости, метастазы в перикард и в плевру, и злокачественные асциты.
Не предполагая ввести ограничение, изобретение более подробно объясняется далее со ссылкой на примеры.
Оборудование, материалы и растворы, необходимые для отдельных методов, представлены при описании соответствующего метода. Нижеприведённые таблицы включают список оборудования и материалов, которые были использованы, и не относятся к конкретному методу, и химические реагенты и растворы, необходимые для приготовления растворов.
Используемые оборудование, материалы, химические вещества и растворы
Название Пронзводнтель/Поставщик
Оборудование
Микроцентрифуга ВюГи^е Рюо Негеапз
Цифровой рН метр Кпзск
Нагревательный столик НЕС Рго^гебб 51£та
Магнитная мешалка ΙΚΑ МАС КЕО .Тапке апс1 Кипке!
Весы с верхней загрузкой 5анопи$
Дозатор Асси 1е1 Вгап4
Вортекс Сете 2 5с1епбйс 1пв1гитеп(8
Материалы
Одноразовые пипетки на 5,10,25 мл Сотт§ В.У. ЫГе Баепсез
Фильтр ВоШе-Ιορ (на горловину флакона) 0.2 мкм Νιιηο
Микродозаторы различных размеров КоЙ1
Реакционные сосуды (колбы) на 0.5 мл, 1.5 мл ЕррепбогГ
Шприцы (стерильные, 10 мл, 100 мл) Вес1оп ϋΐείάηδοη
Шприцевой фильтр 0,45/0.2 мкм $сЫе1сЬег & 5сЬи!1
Химические реагенты, растворы
АР5 (аденозин- 5’- фосфосульфат) Ше ТесЬпо1о§1е8
АТР (АТФ) 81£та
Бластицидин 5 (10 мг/мл) Ιηνίνοβοη
Борная кислота Ко±
В8А (альбумин бычьей сыворотки) 51рпа
Кумасси Бриллиантовый голубой К-250 Зет
Среда ΏΜΕΜ ВюДЛЛййакег
Этанол абсолютный ЕТ. Вакег
- 4 017860
Этидия бромид 5|§та
ЕВ5 (эмбриональная бычья сыворотка) В1О\¥Ъ1йакег
мёсь Коей
Να2ΕΟΤΑ·2Η2Ο Ко1й
ИаС1 КоСй
ИаКз Мегск
Ацетат натрия (безводный) ΚοιΗ
РВ8, не содержащий Са апб М^ Вю^УЫиакег
Пенициллин/стрептомицин Вю\¥кШакег
Среда ИРМ В1оА¥Ьй.!акег
Сахароза Κοϋι
Соляная кислота (НС1) 25% Ко1Ь
Серная кислота (Щ8О4) КоШ
ТАЕ буфер (50 х) АррНСЬет
ТЕМЕЙ КоШ
Трис ГИга Βοίίι
Раствор трипсина Вю^ЛТпНакег
Твин (Τν/ееп) 20 Κοϋι
Используемые ΟϋδΝ и 68ЫМ, селекция последовательностей с применением программы ш1о1б.
Многие из последовательностей, используемые для создания модельных молекул с целью исследования структуры 08ЫМ (ДНК-иммуномодуляторов на основе фосфородиэфиров), конструируют с применением программы ш1о1б, доступной в Интернете (Ьйр://^^^.Ыо1п£о.гр1.е0и/арр11са11оп8/ш£о10). Она представляет собой программу, применяемую для прогнозирования вторичной структуры нуклеотидов на основании термодинамических данных [Хикег, 2003]. Последовательности ДНК протяжённостью 58 нуклеотидов, называемые ниже в данном описании ΟϋΝ, применяемые для синтеза 08ЫМ, вводят в виде линейной ДНК в программу ϋΝΆ ш1о1б, используя стандартные настройки и следующие параметры: температура 37°С, концентрация ионов 150 мМ Να' и 0,5 мМ Мд2+, коррекция олигомера. Последовательность 68ЫМ-30Ь1 используют в качестве основы для модельных молекул для исследования образования О структур. Сначала последние модифицируют таким образом, чтобы в них отсутствовали последовательные гуаниновые остатки, но при этом сохранялось ОС соотношение комплементарной области (называемой далее в данном описании стебель). Последовательность некомплементарной области (называемой далее в данном описании петля) модифицируют таким образом, чтобы предпочтительно не было возможно образование пар оснований по Уотсону-Крику и чтобы совсем отсутствовали последовательные остатки гуанина. В результате модификации петли СО мотивы, находящиеся в этой области, модифицируют по сравнению с 30Ь1. Модельные ΟϋΝ, конструированные таким образом, далее в данном описании именуются КО. ОЬ ΟϋΝ соответствует КО с поли(О) последовательностью в петле, которая, в отличие от последовательности в 30Ь1, не находится внутри СО мотивов. М8 ΟϋΝ соответствует исходной молекуле 30Ь1, но содержит дополнительный остаток гуанина в стебле. О8, ОЬ8 и МЬ ΟϋΝ включают комбинации стебля и петли вышеописанных ΟϋΝ. Молекулы по30Ь1 и поОЬ, с заменой СО на ТО в каждой, используют в качестве молекул для контроля зависимости наблюдаемого эффекта СО мотивов. Молекулу 68ЫМ-60Ь1 используют в качестве модельной молекулы димерной 68ЫМ-30Ь1, которая могла бы образовываться в результате конкатемеризации. Она состоит из двух частично комлементарных, но не самокомплементарных, ΟϋΝ (бСЖИопх и 60Ь1геу), которые, после гибридизации, содержат 5'-выступ, к которым могут лигироваться другой ΟϋΝ (30Ы-АООО) с соответствующим 3'выступом и самокомплементарные 5'- и 3'-области. Последовательности петель вышеуказанных 3 ΟϋΝ соответствуют последовательностям петель 30Ь1.
Фракции д8ЫМ-30Ь1, полученные разделением большого количества Т8ЫМ-30Ь1 в непрерывном градиенте ΝαΟ методом ВЭЖХ, поставляет Ме1аше Ко1Ье (Мо1одеп АО).
ΟϋΝ, используемые в данной работе, получают от ΤΙΒ Мо1Ыо1 (Вег1ш) с 5' фосфорилированием (исключения: М362, 2006), растворяют в Н2О с концентрацией 3 г/л после очистки методом ВЭЖХ.
Используемые ΟϋΝ (фосфоротиоат: маленькие буквы)
Название Последовательность Структурные особенности Молекуляр мая масса (г/моль)
ЗОН ССТ АСС СОТ ТАС САС СТГ САТ ТСС ААА АСС ТТС ТТС ССС ССС ТТС ТГА ССТ ССТ ААС С С4 в стебле и петле (51,Ы) 17871
КС СТС САС СТС ТАС САС СТГ САТ ТСС АТА ТСС ТГС ТТС СТС ТСС ТТС ТТА ССТ ССТ АСА С нет поли(О) последовательностей, петля неспарена (52.12) 17723
мъ ССТ АСС ССТ ТАС САС СТГ САТ ТСС АТА ТСС ТГС ТТС СТС ТСС ТГС ТТА ССТ ССТ ААС С стебель из ЗОЫ, петля из КС (51.12) 17723
М5 ССТ АСС ССТ ССС ССС СТГ САТ ТСС ААА АСС ТГС ТГС ССС ССС ТГС ТГА ССС ССС САС С ЗОЫ с дополнительным С$ встебле (53.Ы) 17874
СЬ СТО САС СТС ТАС САС СТГ ССС ССС СТА ТСС ТТС ТГС СТС ТСС ТГС ТТА ССТ ССТ АСА С КО с Са в петле (52. 13) 17885
05 ССТ АСС СОТ ОСО ССС СТГ САТ ТСС АТА ТСС ТГС ТГС СТС ТСС ТГС ТГА ССС ССС САС С КС со стеблем из М5 (53, 12) 17726
ОЬ5 ССТ АСС СОТ ССС ССС СТГ ССС ССС СТА тсс ТГС ТТС СТС ТСС ТГС ТГА ССС ССС САС с стебель М5, петля из СЬ (53,13) 17888
позои ССТ АСС ССТ ТАС САС СТГ САТ ТСС ААА АТС ТГС ТГГ ССС СТС ТТС ТТА ССТ ССТ ААС С ЗОЫ без СС мотивов (ТС вместо СО) 17871
поОЬ СТС САС СТС ТАС САС СТГ ТСС ОСС СТА ТТС ТГС ТТТС СТС ТТС ТТС ТГА ССТ ССТ АСА С СЬ без СО мотивов (ТО вместо СО) 17900
- 5 017860
бои 1огл> ССТ АСС ОСТ ТАС САС СТГ САТ ТСС ААА АСС ТГС ТТС 060 ССС ГГС ТГТ ССС САА ТСС ТСС АА не самокомлементарная, петля из ЗОЫ 19147
60Ы «ν ССС СТГ ССА ССА ГГС ССС АТС АТТ СОА ААА СОТ ТОТ ТСС ССС СОТ ТОТ ТАС ОТО ОТА АСС СС не самокомлемеетарная, петля из ЗОЫ 19108
зоиАС(Ю ССС СТГ АСС АСС ТТС АТТ ССА ААА ССТ ТСТ ТСС ОСС ССТ ТСТ ТАС СГС СТА А самокомплементарная, 3’ выступ 16177
М362 (ее (ее се§ Ис еаа сеа с§( (£а г СрО- С фосфоротиоатный каркас 7640
2006 κβ ΐββ ιπ ίβΐ е§1 щ βπ СрС-В фосфоротиоатный каркас 7303
Благодаря ориентации своих сайтов связывания с четырьмя Н мостиками гуанин способен образовывать циклический квартет оснований с 8 Н мостиками (С квартет) за счёт образования пар гуанингуанин. Поэтому последовательность ДНК, содержащая несколько последовательных гуаниновых нуклеотидов, способна образовывать тетрамерную спиральную структуру, в которой гуаниновые основания проявляют высокую степень планарности со специфическим стэкинг-взаимодействием. В зависимости от положения, числа и распределения гуаниновых нуклеотидов в последовательности возможно образование различных С структур, которые можно разделить на три группы: С2' ДНК (бимолекулярные параллельные или антипараллельные тетраплексы), С4' ДНК (мономолекулярные антипараллельные тетраплексы) или С4 ДНК (тетрамолекулярные параллельные тетраплексы). С4 ДНК способна образовывать самособирающиеся наноструктуры, четырёхцепочечные ДНК, называемые С \\тге5. Помимо нескольких свободных гуаниновых остатков и их расположения и спаривания соседних оснований по УотсонуКрику, образование и стабильность С, последняя иногда бывает очень высокой, зависит от температуры, концентрации ДНК и присутствия различных катионов (например, Να'. К+, Мд2'. Са2+). Например, структуры С4 структуры идентифицированы в последовательностях теломеров, сайтах переключения (свичсайтах) иммуноглобулиновых генов и в ДНК ВИЧ [8еп 1992, МатЛ 1994, 1995].
Далее, получены различные мономерные и мультимерные молекулы, содержащие комбинации различных последовательностей петли и стебля. Каждый раз используют три последовательности петли и три последовательности стебля, включающие длинные, короткие поли(С) мотивы или не включающие эти мотивы, тем самым влияя на способность образования С структур. Стабильные С структуры могут образовываться в соответствующих условиях в коротких ΘΌΝ (12-мер) только с четырьмя последовательными гуаниновыми основаниями. В более длинных ΘΌΝ необходимы более длинные мотивы, так как возможность образования стабильных С структур позитивно коррелирует с относительным содержанием гуаниновых оснований в целой последовательности [8еи, 1992].
В случае молекул, содержащих длинные поли(С) мотивы, наблюдается повышенное образование мультимерных молекул. Также профили элюции этих молекул отличаются от профилей элюции молекул, не содержащих длинных поли(С) мотивов тем, что появляется два пика, причём пик при большем объёме элюции соответствует распределению ДНК, обнаруживаемому в верхней части агарозного геля. Наиболее заметное изменение наблюдается для СЬ, молекулы, у которой поли(С) мотивы локализованы на петле. В этом случае два отчётливо разделённых пика можно различить в профиле элюции, где пик с большим объёмом элюции имеет более высокую интенсивность, чем пик с меньшим объёмом элюции. Для СЬ количество ДНК, диффузно распределённой в геле выше полосы мономера, сравнительно велико, распространяясь при распределении до кармана геля. Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что в мультимерных комплексах присутствует относительно большое количество ДНК. Распределение пиков в профиле ВЭЖХ элюции и распределение ДНК после электрофореза в агарозном геле аналогичны в конструкциях, содержащих поли(С) мотивы в стебле (С8, М8). В их профиле элюции наблюдается маленький второй пик при больших объёмах элюции и малозаметное однородное распределение ДНК выше полосы мономера в агарозном геле. Что касается паттерна (характера, рисунка) пика (ВЭЖХ) и распределения ДНК (агарозный гель), характер перемещения (миграции) в ВЭЖХ и агарозном геле, наблюдаемый для молекул с поли(С) мотивами в петле и в стебле (СЬ8), является промежуточным между СЬ и С8 и М8. В профиле элюции наблюдаются два отдельных пика равной высоты, а количество ДНК, распределённой в верхней области геля, заметно выше, чем для молекул с поли(С) мотивами в стебле (С8 и М8), но ниже, чем для СЬ. Следовательно, образованию мультимерных молекул особенно способствует расположение поли(С) мотивов в петле, как в случае с СЬ. Причиной этого является отсутствие конкуренции между образованием пары оснований по Уотсону-Крику и образованием С структур в однонитевой петле. Это необходимое условие также выполняется в СЬ8 молекуле. Однако, в этом случае, поли(С) мотивы, как возможные партнёры по взаимодействию, присутствуют как в стебле, так и в петле. Поэтому возможно образование внутримолекулярных С2 структур, а именно образующихся в значительной степени независимо от концентрации. В результате они составляют конкуренцию межмолекулярному образованию С структур, так что образование более высокомолекулярных комплексов уменьшается в случае СЬ8 по сравнению с СЬ. Самая низкая тенденция к образованию более высокомолекулярных комплексов наблюдается в молекулах с поли(С) мотивами в стебле, хотя поли(С) мотивы в этом случае длиннее, чем в СЬ.
При равных количествах исходного вышеописанные характеристики не наблюдаются в мономерной молекуле 30Ь1, которая подобно СЬ8, имеет поли(С) мотивы в стебле и петле. Причиной этого является, с одной стороны, то, что поли(С) мотивы в этой молекуле короче, чем в мультимерных молекулах. С другой стороны, прогнозирование структуры с помощью программы ДНК шТоИ показывает повы
- 6 017860 шенную тенденцию к образованию пар оснований по Уотсону-Крику в петле, так что вероятность образования С структуры должна дополнительно уменьшаться. Однако как и мультимерные молекулы с длинными поли(С) мотивами, фракция Ρ4, полученная из большого количества 30Ь1 при разделении методом ВЭЖХ, также показывает вышеописанное диффузное распределение ДНК в верхнем участке геля и остальной ДНК в карманах геля при электрофорезе в полиакриламидном геле (см. фиг. 3.1.9). Очевидно содержание высокомолекулярных комплексов С структур в 30Ь1 так мало, что их обнаружение возможно только, когда используют большие количества исходного.
Напротив, доля ДНК в кармане не полностью исчезает в случае СЬ и СЬ8, которые имеют поли(С) мотивы в петле, и можно распознать паттерн дополнительной полосы. Вероятно, её образуют димеры или тетрамеры или не распавшиеся ΘΌΝ, оставшиеся в агрегатах, которые перешли в раствор из агрегатов при денатурации и всё ещё связаны друг с другом за счёт гуанин-гуанинового взаимодействия.
Найденные экспериментально свойства показывают, что мультимерные молекулы с длинными поли(С) мотивами на самом деле образуются С структурами. Помимо появления однородного распределения ДНК в верхнем участке геля, указанные свойства включают появление регулярных полос после денатурации, как это наблюдается для СЬ и СЬ8 в полиакриламидном геле.
В отличие от полосы в верхней трети геля, которую выделяют из 30Ь1, полосы, наблюдаемые для КЬ и МЬ, более не распознаются после денатурации (см. фиг. 3.1.6). Следовательно, это полосы димеров, которые образуются за счёт взаимодействия пар оснований между двумя мономерными молекулами, и, в результате, могут легко разделяться с помощью термической денатурации. Предпочтительный их вид в КС и МЬ может определяться их общей последовательностью петли, которая содействует взаимодействию двух молекул.
ВЭЖХ фракционирование большого количества 30Ь1 молекулы (соединения) даёт 4 фракции, которые проявляют совершенно различный характер миграции (перемещения) в геле. Концентрация единичных фракций позволяет их растворять по отдельности, так что становятся видимыми несколько полос, не распознаваемых в геле.
Характер миграции первой фракции соответствует характеру миграции, наблюдаемому для двух мономерных конформаций, характер миграции второй фракции соответствует характеру миграции, наблюдаемому для постоянной смеси обеих конформаций, где открытая конформация преобладает после денатурации этой фракции, и характер миграции третьей фракции в основном соответствует характеру миграции димерной молекулы, описанной выше. Имеющая чётко различаемые части ДНК, которые остались в кармане геля, четвёртая фракция аналогична М8 по своему характеру миграции.
Сдвиг полосы, соответствующей димеру для 30Ь1 и фракции 3 30Ь1 в среде культуры клеток, по сравнению с величиной пробега в геле, наблюдаемой в воде, удивителен. Сравнение с гелем, окрашенным Кумасси голубым, показывает, что соответствующая полоса в среде выходит на том же уровне, что и более низкая полоса белка. Следовательно, можно предположить, что сдвиг полосы вызван связыванием димерной молекулы с белками.
Характер миграции (пробега) полос, соответствующих конформациям мономера, слабо меняется при добавлении среды, только в случае СЬ наблюдается увеличение полосы, соответствующей открытой конформации. После инкубации при 37°С в течение пяти часов ранее наблюдавшееся диффузное распределение было видно в КС и 30Ь1, где интенсивность полосы, соответствующей открытой конформации, понижается для КС. В выбранных условиях открытая конформация немного предпочтительнее по сравнению с водным раствором. Через 27 ч инкубации в среде наблюдаемые интенсивности ДНК для МЬ и СЬ резко уменьшаются, и даже в случае КС наблюдается только низшая полоса с пониженной интенсивностью, тогда как в случае 30Ь1 наблюдается минимальное уменьшение интенсивности. Одним возможным объяснением этого является тот факт, что открытые конформации легче расщепляются, чем двухнитевые (двухцепочечные) конформации.
Следовало изучить иммуностимулирующий эффект различных мономерных и мультимерных молекул путём определения концентраций ΙΡΝ-γ, ΙΡΝ-α и 1Ь-6 в супернатантах РВМС донорской человеческой крови после стимуляции этими молекулами.
Тест-система, используемая для определения активности молекул с применением РВМС донорской человеческой крови, представляет собой в высшей степени сложную систему, в которой различные клетки могут влиять друг на друга за счёт взаимодействия и/или секреции цитокинов, так что отнесение наблюдаемого ответа к конкретному типу клеток или реакционному пути едва ли возможно. Кроме того, имеются большие различия между результатами для отдельных доноров, поэтому необходимо большее число независимых тестов. Преимущество этой тест-системы состоит в том, что она ближе всего подходит к ίη νίνο ситуации среди всех возможных общепринятых ίη νίίτο систем.
Тесты показывают, что обнаружение активации используемых клеток представляет собой процесс, на который довольно сильное влияние оказывают условия культивирования клеток, так как 1Ь-8/СХСЬ8 секретируются также в ответ на факторы, вызывающие стресс. В частности, это становится очевидным благодаря результатам, полученным на клетках, у которых среду не заменяли перед стимуляцией (см. фиг. 3.3.1) и где высокая концентрация 1Ь-8/СХСЬ8 детектируется даже в нестимулированных клетках. Определяемое отношение концентрации хемокинов, измеряемой в нестимулированных клетках, к кон
- 7 017860 центрации хемокинов, измеряемой в стимулированных клетках, составляет 1.3 и, следовательно, является очень низким по сравнению с клетками, у которых заменяли среду. В последнем случае отношение равно 2.3. Следовательно, чтобы получить возможно более информативные результаты, в данном тесте особенно важно культивировать клетки практически в отсутствие клеточного стресса. По-видимому, клеточный стресс является причиной того, что результаты, полученные на клетках, стимулированных через 24 ч после засевания, являются не такими чёткими, как результаты, полученные на клетках, выращенных до монослоя. Пассирование клеток и связанные с ним методы культивирования клеток вызывают сильный клеточный стресс.
Как ясно из результатов испытания, относящегося к зависимости от времени стимуляции (см. фиг. 3.3.2), разницу в количестве секретированных цитокинов между нестимулированными и стимулированными клетками можно обнаружить только через 6 ч. Количество 1Ь-8/СХСЬ8 увеличивается за время между 6 и 24 ч, тогда как увеличение за время от 24 до 48 ч очень мало.
Активности молекул в тест-системе изучают в двух тестах, в которых наблюдается различия между отдельными используемыми молекулами (см. фиг. 3.3.3).
Наивысшая секреция 1Ь-8/СХСЬ8 в тесах индуцируется стимуляцией с помощью СЬ, эта стимуляция несколько выше, чем стимуляция, вызванная ΘΌΝ 2006. Количество 1Ь-8/СХСЬ8 после стимуляции с помощью КС и 30Ь1 немного ниже, причём КС проявляет несколько более высокую активность по сравнению с 30Ь1. Экспериментально определённая разница в активности этих различных мономерных и мультимерных молекул, возможно, вызвана наблюдаемыми структурными различиями. Так, можно показать, что КС и СЬ, по сравнению с 30Ь1, имеют тенденцию к открытой конформации области петли с СС мотивами, так что предпочтительной является их однонитевая форма. Как определил ΡιιΙζ с1 а1. методом поверхностного плазмонного резонанса, однонитевая ДНК связывается с ТЬК.9 с более высокой аффинностью, чем двухнитевая ДНК |ΒυΙζ. 2004], что может быть причиной несколько более высокой активности КС и СЬ, по сравнению с 30Ь1. Однако СС мотивы различны даже в 30Ь1 и КС/СЬ, так что различная активность может быть вызвана различной аффинностью к рецептору различных СС мотивов.
СЬ, молекула с наивысшей эффективностью, образующая агрегаты, проявляет наивысшую активность среди тестированных молекул в обоих тестах, что, вероятно, объясняется более прочным перекрёстным связыванием (сшиванием) рецепторов с помощью высокомолекулярных комплексов. Однако повышенная активность СЬ в тестах на РВМС не наблюдается. С другой стороны, возможно, в иммуномодулирующую активность мономерных и мультимерных молекул вносят вклад рецепторы с другим паттерном распознавания, нежели наблюдаемый, находящиеся в более сложных системах РВМС, которые узнают другие структурные особенности (признаки) молекул. Так, например, возможно, что узнавание протекает также через рецепторы, специфические к другим нуклеотидам, такие как ТЬР8 или ТЬК.7, вызывая при этом согласованный или модулирующий эффект.
В заключение можно сказать, что конкретно присутствие поли(С) мотивов в петле мономерных молекул способствует образованию мультимерных комплексов. Кроме того, эти комплексы обладают высокой устойчивостью к термической денатурации.
Для определения разницы между иммуномодулирующими эффектами различных конструкций последние используют в опытах по стимуляции РМВС.
Результаты показывают, что мультимерные молекулы обладают особенно высокой активностью.
Определение концентрации ДНК.
Концентрацию ΘΌΝ и мономерных молекул ДНК определяют, измеряя величину поглощения при 260 нм (А260). Именно ароматическое кольцо нуклеотидных оснований отвечает за поглощение при 260 нм, при этом отдельные основания имеют различные молярные коэффициенты поглощения ε (А>С>Т>С). В результате взаимодействий хромофор-хромофор поглощение двухнитевых нуклеиновых кислот ниже, чем однонитевых нуклеиновых кислот (гипохромный эффект).
Для определения концентрации соответствующий объём раствора определяемой ДНК сначала разводят ТЕ буфером в пробирке (сосуде) Эппендорфа до конечного объёма 300 мкл (ΘΌΝ 1:200, 68ЫМ 1:100). Раствор ДНК переносят затем в кварцевую кювету и на фотометре определяют поглощение при 260 нм относительно ТЕ буфера. Концентрацию рассчитывают исходя из полученной величины поглощения по следующему уравнению:
с (мкг/мл) = А260х фактор разведениях фактор конверсии.
Фактор конверсии является приблизительной величиной и предположительно равен 50 мкг/мл для двухнитевой ДНК и 33 мкг/мл для однонитевой ДНК. Вследствие участия двухнитевых областей в ΘΌΝ и мономерных ДНК молекулах, применяют стандартизированный фактор конверсии 50 мкг/мл. Каждый раз делают двойные определения с раздельными разведениями, из них рассчитывают среднее значение.
Получение мономерных молекул ДНК
Для получения мономерных молекул ДНК используют стерильные (одноразовые) материалы и свежие буферные растворы или буферные растворы, очищенные стерильной фильтрацией после хранения при -20°С, с тем чтобы избежать загрязнения бактериями, так как на результаты стимуляции могут повлиять малые количества эндотоксинов.
- 8 017860
Первой стадией при получении мономерных молекул ДНК является лигирование двух ΘΌΝ с помощью Т4 ДНК лигазы. Т4 ДНК лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5'фосфатным и 3'-ОН концами в двухнитевой ДНК или РНК по тупым или липким концам. Кроме того, она может восстанавливать (репарация) однонитевые разрывы в двухнитевых ДНК, РНК или гибридах ДНК-РНК.
Лигирование двух ΘΌΝ происходит между 5'-фосфатным выступом одного ΘΌΝ и З'-концом другого ΘΌΝ, при этом образуется кольцевая молекула. Аналогично, в результате этой реакции образуются мультимерные молекулы ДНК по изобретению.
Исходное количество ΘΌΝ для получения нужных молекул составляет 500-1000 мкг. Для лигирования ΘΌΝ применяют в концентрации 0,55 г/л в 1х лигазном буфере. С этой целью их разводят водой для промывки (Леща пазе) и добавляют соответствующее количество 10х лигазного буфера. После тщательного перемешивания добавляют такое количество Т4 ДНК лигазы, чтобы получить отношение 0,01 и/мкг ДНК. Партию для лигирования инкубируют на водяной бане при 37°С в течение 15-24 ч.
Для разрушения нелигированных ΘΌΝ используют расщепление с помощью Т4. Т7 ДНКполимераза представляет собой зависящую от матрицы ДНК полимеразу, которая катализирует синтез ДНК в направлении 5'-3', но также обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью на одно- и двухнитевой ДНК, тем самым является пригодной для расщепления нелигированных ΘΌΝ.
Перед осуществлением Т7 расщепления проверяют избыток лигирования. С этой целью 0,3 мкг ΘΌΝ, партию после лигирования и расщепление тестируемой Т7 каждый раз разделяют на 3% агарозном геле (см. 2.4.1). Для тестирования Т7 расщепления используют избыток Т7 ДНК полимеразы в отношении 10 и/1,1 мкг ДНК в объёме 21 мкл. Реакцию проводят в течение 1 ч при 37°С и заканчивают, нагревая до 70°С в течение 10 мин.
Для расщепления Т7 партию после лигирования разводят Леща пазе и соответствующим количеством 10х лигазного буфера, так, чтобы концентрация ДНК составляла 0,3 г/л в 1х лигазном буфере. Добавляют количество Т7 ДНК полимеразы, необходимое для того, чтобы соблюдалось отношение 0,03 и/мкг ДНК. Эту загрузку инкубируют на водяной бане при 37°С в течение 15-24 ч. За ходом реакции следят, отбирая 0,3 мкг лигированной партии наряду с 0,3 и 0,9 мкг партии Т7 расщепления на 3% агарозном геле.
Очистка молекул (соединений) по изобретению.
Очистку осуществляют анионообменной хроматографией. Метод основан на том, что в пористой матрице (неподвижная фаза) имеются положительно заряженные группы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот при рН выше 2, так что последние связываются с неподвижной фазой. Сила взаимодействия зависит от величины рН, ионной силы подвижной фазы и отрицательных зарядов, имеющихся в молекуле. Незаряженные молекулы либо не взаимодействуют с неподвижной фазой, либо это взаимодействие отсутствует, и они быстро элюируются подвижной фазой с низкой ионной силой. При повышении ионной силы подвижной фазы молекулы, связанные с неподвижной фазой, вытесняются с колонки. В результате более сильного взаимодействия с неподвижной фазой нуклеотиды большего размера элюируются с колонки позже, чем нуклеотиды меньшего размера [Ьой8ре1сй, 19984 Ми1йагй1, 2003].
Для очистки в качестве неподвижной фазы используют ДМАЕ-фрактогель, полимерная смола с диметиламиноэтильными группами. Для разделения применяют №1С1 в ступенчатом градиенте (0, 50, 100% 1 М ЫаС1).
Перед началом процесса очистки все впускные и выпускные отверстия ВЭЖХ установки, в нерабочем состоянии заполненные 20% этанолом, сначала промывают Леща пазе и заполняют колонку. С этой целью в колонку помещают 1,6-1,8 мл ДМАЕ, заполняют водой до краёв и встряхивают колонку, чтобы гарантировать равномерное распределение. Затем колонку соединяют с ВЭЖХ устройством так, чтобы не было пузырьков воздуха. Колонку промывают при скорости потока 1 мл/мин до тех пор, пока не осядет содержимое колонки. Закрепляют верхний поршень на матрице таким образом, чтобы не проходили пузырьки, и вытесняют из колонки избыточную воду. Колонку снова связывают с ВЭЖХ хроматографом (устройством) и промывают при скорости потока 1 мл/мин, а возможное образовавшееся мёртвое пространство между матрицей и поршнем удаляют, повторяя последнюю стадию. Собранную, подготовленную таким образом колонку, так же, как и ВЭЖХ хроматограф, последовательно уравновешивают буфером Т20 при скорости потока 1 мл/мин. Равновесие в колонке устанавливают, используя примерно 10кратный объём насадки (матрицы, носителя) в колонке, и проверяют с помощью полосок рНиндикаторной бумаги. Гамильтоновским шприцем загружаемые партии инъецируют в ВЭЖХхроматограф с помощью петли для образца объёмом 2 мл. ВЭЖХ-хроматограф контролируют, используя протокол с программой, созданной для осуществления автоматического фракционирования. Однако в некоторых случаях выходящие побочные пики фракционируют вручную. Перед нанесением образца колонку уравновешивают двумя объёмами колонки (СУ), а затем, пропуская через колонку 5 СУ Т20 буфера, элюируют несвязанные молекулы (белки, нуклеотиды) с последующей элюцией слабо связанных молекул (АТР, ΘΌΝ), используя 7 СУ 50% Τ20Ν1000 буфера, и элюцией ЙЗЬТМ, используя 7 СУ 100%
- 9 017860
Τ20Ν1000 буфера. Скорость потока составляет 1 мл/мин. Затем колонку снова уравновешивают с помощью 10 СУ Τ20 буфера перед нанесением следующего образца, а впускные и выпускные отверстия ВЭЖХ-хроматографа вручную промывают буфером.
Соединения (молекулы), очищенные методом ВЭЖХ, концентрируют, применяя осаждение этанолом, и обессоливают. В присутствии одновалентных катионов нуклеиновые кислоты в спирте образуют нерастворимый осадок, который можно отделить центрифугированием. Значительную часть соосаждённой соли можно удалить, промывая 70% этанолом, так как, в отличие от нуклеиновых кислот, соль в нём растворяется. Для увеличения выхода при работе с меньшими количествами нуклеиновых кислот, менее склонных к осаждению, можно их осаждать при низкой температуре и/или добавлять ионы Мд2'. Если это не помешает последующему применению, можно также добавлять носители, такие как тРНК или гликоген, которые повышают относительную концентрацию нуклеиновых кислот [Ьо118ре1сй, 1998; ΜϋΐйаМ1, 2003].
Для осаждения соответствующие фракции после очистки методом ВЭЖХ переносят в центрифужные пробирки Согех и добавляют 1/100 об. 1 М МдС12, 1/10 об. 3 М раствора ацетата натрия и 2,5 об. 96% этанола. Загруженные партии смешивают и осаждают при 20°С в течение 2-24 ч. Партии последовательно центрифугируют при 10000 об/мин (11000 д) и 4°С в течение 30 мин, супернатант удаляют, промывают, добавляя 5 мл 70% этанола, и центрифугируют ещё в течение 10-30 мин при 10000 об/мин (11000 д) и 4°С. Супернатант удаляют, а осадок ДНК сушат на воздухе до тех пор, пока не исчезнет запах спирта. ДНК растворяют в 100-350 мкл Леща гиъе и переносят в стерильную реакционную пробирку (сосуд) на 1,5 мл. Объём для ресуспендирования определяют в зависимости от количества ДНК, используемой при приготовлении, таким образом, чтобы при выходе 50% концентрация составляла 1 г/л.
Электрофорез на агарозном геле
Электрофорез в геле является подходящим методом разделения и определения характеристик нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты, будучи заряжены отрицательно в широком диапазоне значений рН, подвергаются воздействию электрического поля в матрице, агарозной или полиакриламидной, и движутся к аноду. Скорость их движения (миграции) меняется в зависимости от их размера. Поведение нуклеиновых кислот (примерно, вплоть до 10 КБ (килобаз) в процессе электрофореза можно описать на основе двух теорий при их совместном применении. ОдЦгоп скрининг основан на предположении, что нуклеиновые кислоты принимают сферическую форму и сталкиваются с гелеобразной матрицей тем чаще, чем больше объём (окружность) частицы, таким образом, движение более объёмных молекул замедляется сильнее, чем малых. Согласно этой теории молекулы, диаметр которых больше диаметра пор геля, не должны мигрировать в геле. Теория рептационного движения предполагает, что нуклеиновые кислоты теряют свою сферическую форму в геле и движутся через гель, подобно змее, одним концом вперёд, при таком движении более длинным молекулам требуется больше времени, чем коротким. Ввиду влияния размера на скорость движения нуклеиновых кислот, образование вторичных структур влияет на характер движения в геле. Так, например, характер движения плазмидной ДНК меняется в соответствии с её конформацией. Скорость миграции (движения) повышается от открытой (форма I) через линейную (форма III), суперспиральную (форма II) к денатурированной (спиральной, скрученной) плазмидной ДНК. Для линейной двухнитевой (двухтяжевой) ДНК (форма III) в широком диапазоне существует корреляция между 1од10, длиной (в п.о.) и относительным путём миграции в геле, так что можно относительно точно определить размер исходя из стандартов длины.
Детекцию нуклеиновых кислот в гелях можно осуществлять, используя этидия бромид, который ввиду его плоскостной (планарной) структуры включается в ДНК, так что возможно возбуждение флуоресценции под действием света в УФ-области (254-366 нм), излучение которой наблюдается в оранжевокрасной области (590 нм) [Ьойкрекй, 1998].
Агароза представляет собой полисахарид, который выделяют из морских водорослей, при охлаждении в водном растворе (1% (вес/об.)) он образует гели с относительно большими порами (около 150 нм). Объём пор обратно пропорционален концентрации агарозы. Агарозные гели пригодны для разделения нуклеиновых кислот 0,1-25 КБ в длину. Преимущество агарозных гелей заключается в их относительно широком диапазоне разделения и в том, что с ними легко работать. Однако разделение малых ДНК фрагментов происходит очень медленно. Подходящим для разделения меньших ДНК фрагментов является 81еуе Адагоке, дериватизированная форма агарозы [Ьойкреюй, 1998; МШППагШ, 2003].
Для разделения ΟΌΝ и молекул по изобретению используют 3% агарозный гель в буфере 1хТАЕ с 0,125 мкг/мл этидия бромида. Используя систему ВюЯаб, наносят гели на пластины для горизонтального гель-электрофореза (40 мл для малого количества геля с 8 карманами, 100 мл для большого количества геля с 20 карманами). Образцы для анализа наносят в 1х тест-буфере наряду со стандартами соответствующей длины (см. 2.4.3). Электрофорез проводят в буфере 1х ТАЕ при 120 V (В) в течение 30 мин. Гели фотографируют с помощью оборудования для гель-документирования.
Электрофорез в чистом полиакриламидном геле (РАСЕ).
Полиакриламидные гели получают радикальной сополимеризацией мономеров акриламида с применением Ν,Ν'-метиленбисакриламида в качестве отвердителя (сшивающего агента). Размер пор гелей
- 10 017860 находится в примерном диапазоне около 3-6 нм и зависит от общей концентрации акриламида (% Т =т
снижается при повышении Т при постоянной С и достигает минимума при 5% С при постоянной Т. Полиакриламидные гели обладают очень хорошей разрешающей способностью, в особенности в отношении малых ДНК фрагментов (< 1 КБ). Однако диапазон разделения значительно ниже по сравнению с агарозным гелем. Диапазон разделения можно увеличить, если использовать градиентные гели. Более высокая разрешающая способность полиакриламидных гелей позволяет разделять различные конформации ДНК, которые, вследствие их разных форм, проявляют различный характер миграции (движения), на который может влиять температура и концентрация ионов.
Найдено, что гели с 8% Т, 2,6% С являются оптимальными для разделения молекул, а гели с 12% Т, 5% С в 1х ТВЕ - для разделения ΘΌΝ. Горизонтальные гели наносят за день до электрофореза (15 мл/гельмал., 25 мл/гельбольш.) и хранят в холодильнике в течение ночи. Перед нанесением образца проводят преэлектрофорез гелей при 70 В (170 Вбольш.) до тех пор, пока не перестанет изменяться сила тока (10-11 мА). Образцы наносят в 1х тест-буфере вместе со стандартами соответствующей длины (см. 2.4.3) без добавления красителей. Для контроля за ходом электрофореза на отдельную дорожку наносят 1х красителя для загрузки. Электрофорез проводят в 1х ТВЕ при постоянной разнице потенциалов 70 В (170 Вбольш.) (~9 В/см) и комнатной температуре и заканчивают, как только бромфенол голубой достигает нижнего конца геля (около 2 ч). По окончании электрофореза гели окрашивают в растворе этидия бромида в течение 10-15 мин и делают снимки с помощью оборудования для гель-документирования. При избыточном окрашивании фона гели отмывают в деминерализованной воде в течение 10-30 мин.
Термическая денатурация и ренатурация для отнесения полос.
Так как мономерные ДНК молекулы являются кольцевыми ДНК молекулами, у которых, подобно плазмидной ДНК, наблюдается сложный характер миграции в геле, отнесение полос в геле к конкретной конформации или конкретному размеру является непростым делом. Тот факт, что две различные конформации в отличие от молекул различного размера могут обратимо взаимно превращаться друг в друга, можно использовать в дифференцировке.
Различные конформации имеют различную степень компактности (уплотнения) и, следовательно, характер их миграции в геле должен различаться, причём компактные формы ДНК часто проявляют более высокую подвижность в геле по сравнению с более объёмными открытыми формами ДНК. Компактные формы превращаются в открытые формы при разрыве водородных мостиков.
Для того чтобы сделать отнесения полос в полиакриламидном геле, молекулы термически денатурируют, нагревая при 95°С в течение 10 мин. Денатурированные образцы сразу же помещают на лёд, чтобы предупредить ренатурацию. Для этой цели получают мастер-микс, который включает соответствующую молекулу 68Ь1М в концентрации 0,05 г/л в 1х ТЕ буфере. Партию делят пополам и 1 из половин партии нагревают, а другую половину оставляют при комнатной температуре. К образцам для нанесения на гель, взятым из этих партий, добавляют соответствующее количество 5х буфера для образцов и разделяют на чистом 8% полиакриламидном геле. Для наблюдения за ренатурацией оставшуюся партию денатурированного продукта делят ещё раз и затем инкубируют в течения 3 дней при 4 и 37°С соответственно. Оставшуюся неденатурированную партию хранят при 4°С и аналогично делят через 3 дня, одну часть денатурируют как описано выше, а другую часть хранят при комнатной температуре. К этим партиям прибавляют соответствующее количество 5х буфера для образцов и разделяют на чистом 8% полиакриламидном геле.
Инкубация в среде для клеточных культур.
Активность молекул проверяют ίη νίΐτο на клетках РМВС и НЕК293. Соединения (молекулы) растворяют скорее в белоксодержащей среде для клеточных культур, нежели в буфере, и инкубируют при температуре 37°С. Следовательно, целью является изучить влияние этих модифицированных параметров на структуру и стабильность молекул и ΘΌΝ.
Важным фактором, который может различными способами влиять на активность молекул ДНК, является неспецифическое связывание с белками. Связывание с белками меняет характер миграции ДНК при электрофорезе в неденатурирующем полиакриламидном геле (нативный (чистый) РАСЕ), так что можно распознать сдвиг полосы ДНК в присутствии белка. В большинстве случаев электрофоретическая подвижность комплекса ДНК-белок снижается по сравнению с ДНК; в случае ДНК миниколец электрофоретическая подвижность также может повышаться, если степень сжатия повышается за счёт связывания с белком [Тои1те, 1995].
С целью изучения молекул и ΘΌΝ, применяемых в тестах по стимуляции с точки зрения их поведения в условиях, в которых проводят тесты по стимуляции, растворы ΘΌΝ и молекул разводят средой до концентрации 1 мкМ и инкубируют в течение 5 ч или 24 ч при 37°С на нагревательном столике или после добавления соответствующего количества 5х буфера для образцов, непосредственно разделяют на полиакриламидном геле. Для сравнения наносят растворы ΘΌΝ и молекул с соответствующим разведением в Н2О. Чтобы проверить, что наблюдаемые изменения вызваны присутствием белков, партии, включающие ΘΌΝ и молекулы по изобретению, разводят до концентрации 1 мкМ в среде, к которой до
- 11 017860 бавлена РС8 (эмбриональная (фетальная) телячья сыворотка). Для того чтобы сравнить пройденные в геле расстояния (дистанции) для полос ДНК и белков, что позволило бы сделать выводы относительно возможного связывания с белком, в гелях обнаруживают как ДНК, так и белки.
Дополнительную детекцию белков проводят после детекции нуклеиновых кислот. Г ели фиксируют в течение 30 мин в растворе для фиксации, а затем окрашивают в течение 30-60 мин в растворе Кумасси бриллиантового голубого. Избыток красителя удаляют инкубацией в растворе для обесцвечивания в течение ночи и делают снимки гелей с помощью оборудования для гель-документирования.
Применяемые стандарты длины ДНК.
Что касается стандартов длины, каждый раз наносится количество/мм ширины кармана, рекомендуемое производителем, в 1х буфере для образцов. Используют следующие стандарты:
6епеКи1ет 100 Ьр ΌΝΆ Ьаббет Р1ик (100 п.о. ДНК-лэддер) (ΜΒΙ Реттейак), 6епеКи1ет 50 Ьр ΌΝΆ Ьаббет Р1ик (50 п.о. ДНК-лэддер) (ΜΒΙ Реттейак), 10 п.о. ДНК-лэддер (1иуйтодеи), 25 п.о. ДНК-лэддер (1иуйтодеи).
Культура клеток.
Все операции с культурой клеток осуществляют в стерильных условиях, применяя стерильные материалы одноразового пользования.
Условия в инкубаторе: 37°С, 5% СО2, влажность 90%.
Изучение иммуномодулирующего эффекта молекул в РВМС.
Для изучения иммуномодулирующего эффекта мультимерных молекул методом ЕЬ18А определяют секрецию цитокинов лимфоцитами и моноцитами, выделенными из донорской человеческой крови.
Исходным материалом для выделения лимфоцитов и моноцитов, также называемых мононуклеарными клетками (мононуклеарами) периферической крови (РВМС) = фракции мононуклеарных клеток периферической крови, является концентрат лейкоцитов, также называемый лейкоцитарной плёнкой, который получают центрифугированием цельной крови, его поставляет ПКК-В1йкреибеб1еик1 Вет1т Уаппкее. Используя центрифугирование в градиенте плотности Р1со11-Нурацие, можно отделить РВМС от других компонентов лейкоцитного концентрата (плазмы, тромбоцитов, эритроцитов, гранулоцитов). Среда для разделения Р1со11-Нурацие представляет собой раствор, включающий смесь Фиколла 400, сильно разветвлённого полимера мономеров сахарозы, сшитых с помощью эпихлоргидрина и диатризоата натрия (Нурацие) с плотностью 1,077 г/мл. Используя изопикническое центрифугирование среды для разделения с расположенным наверху слоем разведённого лейкоцитного концентрата, можно разделять компоненты по их плотности, получая при этом фракции, представленные на фиг. 2.5.1 [Ьийтаии, 2004].
Для выделения РВМС каждый лейкоцитный концентрат переносят в стерильный флакон на 250 мл и разводят 1:2 в РВ8. Каждый раз 15 мл раствора Р1со11-Нурацие помещают в четыре центрифужные пробирки на 50 мл, осторожно, пипеткой на 10 мл сверху наливают слой, примерно 30 мл, смеси кровь-РВ8 и центрифугируют при 800 д в течение 20 мин, делая перерывы (общее время около 50 мин). Содержащую РВМС поверхность раздела осторожно отсасывают пипеткой на 5 мл и переносят в центрифужные пробирки на 50 мл, содержащие 20 мл холодного РВ8. Для удаления примесей эритроцитов, Р1со11/Нурацие и тромбоцитов затем клетки отмывают в несколько стадий. В то время как все стадии вплоть до выделения РВМС проводят при комнатной температуре с тем, чтобы избежать агрегации тромбоцитов, стадии отмывки осуществляют при 4°С с целью предупреждения адгезии моноцитов к используемым материалам из пластика и, следовательно, их потери. На первой стадии отмывки клетки центрифугируют при 400 д в течение 8 мин при 4°С. Супернатант отсасывают, а клеточный осадок ресуспендируют в 5 мл холодного РВ8 и доводят до 45 мл холодным РВ8. Последующие стадии отмывки проводят таким же образом, но центрифугируют при 300 д в течение 5 мин. Стадии отмывки повторяют до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным, а осадок не станет жёлтым (примерно 5-6 раз). Каждый раз клетки далее ресуспендируют в 5 мл холодной среды, объединяют и объём доводят до 30 мл, добавляя холодную среду. Число клеток определяют с помощью автоматического счётчика клеток с размером исключения 8 мкм и холодной средой доводят до концентрации 4х 106 клеток/мл.
600 мкл выделенных ранее РВМС с концентрацией 4х106 клеток/мл помещают в каждую лунку 24луночных планшетов для клеточных культур. Затем добавляют соответствующий объём испытуемых молекул (соединений) таким образом, чтобы концентрация в партии была равна 1 мкМ. Клетки инкубируют в течение 2 дней (42-48 ч) в инкубаторе. Суспензию клеток переносят в реакционную пробирку (сосуд) Эппендорфа и центрифугируют на микроцентрифуге ВюГиде при 3000 об/мин в течение 4 мин. Полученный таким образом бесклеточный супернатант переносят в новую реакционную пробирку и либо непосредственно используют для определения концентрации цитокинов методом ЕЬ18А, либо оставляют храниться при -70°С.
Культивирование клеток НЕК293.
Клетки выращивают во флаконах для клеточных культур 162 см. Их засевают при плотности 1,31,9х105 клеток/см2. После инкубации в инкубаторе в течение 2-3 дней клетки делят 1:3. С этой целью среду отсасывают, клетки отмывают с помощью 10 мл РВ8, а затем инкубируют при комнатной темпера
- 12 017860 туре в течение 3-5 мин с последующим отделением при добавлении 5 мл раствора трипсин/ЕЭТА. Реакцию прекращают, добавляя 5 мл среды. Клетки ресуспендируют и добавляют другую порцию - 5 мл среды. Каждый раз 5 мл клеточной суспензии либо оставляют в культуральном флаконе, либо переносят в новый флакон и добавляют 45 мл среды. Периодически перед отсасыванием среды некоторые клетки отделяют от дна флакона. В этом случае клетки переносят в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 300 г в течение 4 мин. Затем среду отсасывают и клетки ресуспендируют в 5 мл раствора трипсин/ЕЭТА, добавляют 10 мл среды и переносят в новый культуральный флакон, как описано выше.
Стимуляция клеток НЕК293.
Для проведения теста клетки НЕК293-ТЬВ9 и НЕК293 пи11 с концентрацией 0,6-1х106 клеток/мл каждый раз засевают в объёме 400 мкл в 24-луночные культуральные планшеты и культивируют в течение 1-5 дней. Число клеток определяют с помощью счётчика клеток с размером исключения 8 мкм и доводят до нужной концентрации. При продолжительном культивировании среду заменяют через 48 ч. С этой целью среду осторожно отсасывают и каждый раз к клеткам осторожно добавляют 400 мкл свежей среды. Также в некоторых партиях среду меняют непосредственно перед добавлением стимуляторов. Стимуляцию проводят, добавляя соответствующий объём ΘΌΝ/молекул таким образом, чтобы достичь конечной концентрации 2,5 и 1 мкМ соответственно. ЬРЗ (липополисахариды) используют в концентрации 0,5 мкг/мл. Затем клетки различное время (6-48 ч) инкубируют в инкубаторе. Наконец, среду переносят в реакционные пробирки (сосуды) на 1,5 мл, центрифугируют на микроцентрифуге ВюГиде при 1400 об/мин для осаждения предположительно включённых клеток, а супернатанты используют для определения концентрации 1Ь-8 методом ЕБ1ЗА.
Детектирование цитокинов/хемокинов методом ЕБ18А.
Для изучения иммуномодулирующего действия 6ЗЫМ на РВМС определяют индукцию 1Ь-6, ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-γ.
1Ь-6 представляет собой многофункциональный цитокин, который секретируется различными активированными лимфоцитами и моноцитами и помимо индукции белков острой фазы в гепатоцитах оказывает промотирующее действие на рост, дифференцировку и фагоцитоз лимфоцитов [КпсЬпег, 1994].
ΙΕΝ-α, который имеет несколько подтипов, относится к семейству интерферонов типа I, проявляющих, главным образом, антивирусный эффект. Большие количества ΙΕΝ секретируются рЭС после активации ТЬВ7, 8 или 9 [Репу, 2005], см. также раздел 1.3.2.
ΙΕΝ-γ секретируется преимущественно ΝΚ и Т-клетками, но также моноцитами, дендритными клетками и В-клетками. Только интерферон типа ΙΙ, в отличие от интерферонов типа Ι, проявляет скорее иммуномодулирующий, нежели антивирусный эффект. Помимо роли, которую он играет в дифференцировке, ΙΕΝ-γ является наиболее важным эффекторным цитокином ТН1-направленного иммунного ответа.
Секрецию ΙΕ8/ί.’Χί.Έ8 используют для детекции активации ТЬВ9 в трансформированных НЕК293 клетках. ГБ-8 представляет собой СХС хемокин, секретируемый лейкоцитами, но также фибробластами, эндотелиальными и эпителиальными клетками. Индукция ΙΕ8/ί.'Χί.Έ8 протекает, например, через ЕС-1 и ΊΝΕ-γ, но также через РИИ и внешние факторы (факторы окружающей среды), такие как гипоксия. Экспрессию ΙΕ8/ί.'Χί.Έ8 регулируют, регулируя транскрипцию за счёт совместной активации ΝΕ-α и АР-1 и уровня мРНК стабильности. Помимо его действия в качестве активатора нейтрофилов, ΙΕ8/ί.'Χί.Έ8 оказывает хемотаксическое действие на различные лейкоциты и участвует в процессе трансмиграции лейкоцитов в тканях [МикаМа, 2003].
Для обнаружения цитокинов в супернатантах клеточных культур клеток РВМС и НЕК293 используют твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА) в виде метода сэндвич-ЕиЗА. Он представляет собой количественный иммуноанализ, в котором антитела, специфические к детектируемому белку, иммобилизуют на поверхности микротитрационного планшета с помощью адсорбции. Связывание антигена с соответствующим антителом, точно так же иммобилизует первый, а другие компоненты можно удалить отмывкой. Связывание антигена и антитела является равновесной реакцией, так что количество связанного антитела зависит от концентрации. Обнаружение антигена осуществляют, используя второе специфическое биотинилированное антитело, которое, в свою очередь, связывается с конъюгированным со стрептавидином ферментом, применяемым для обнаружения. В анализе по данному описанию фермент представляет собой пероксидазу хрена (НИР). Действительное измеряемое количество представляет собой количество (концентрацию) хромогенного субстрата, реагирующего при участии фермента за определённый промежуток времени. Субстратом, используемым в данном описании в качестве субстрата, используют ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), который окисляется в присутствии Н2О2, поглощая свет с длиной волны 370 нм (синий). Реакцию прекращают, добавляя Н2ЗО4, при этом длина волны поглощения становится 450 нм (жёлтый) [Ьийтапп, 2004]. Применяя стандартные серийные разведения известной концентрации определяемого цитокина, можно таким образом определить неизвестные концентрации цитокинов в супернатантах клеточных культур.
Необходимые пары антител, растворы стандартов, ферментов и субстратов получают от фирмы Β&Ό Зуйешк в виде наборов. Оборудование и материалы для проведения эксперимента представлены в
- 13 017860 нижеприведённой таблице.
1Ь-б и ΙΕΝ-γ.
Обнаружение Щ-6 и ΙΕΝ-γ в супернатантах культур клеток РВМС осуществляют, используя наборы ОноБе! ЕЫБЛ Эсус1ортсп1 Бу§!ет от Κ&Ό БуЧепъ в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Для этой цели иммобилизуемое антитело разводят в РВБ до концентрации 4 мкг/мл (ΙΕΝ-γ) и 2 мкг/мл (1Ь6) соответственно и каждый раз 100 мкл помещают в лунки микротитрационного планшета. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение ночи, затем отмывают 3 раза буфером для отмывки, добавляют в каждую лунку по 300 мкл блокирующего буфера и инкубируют в течение 1-2 ч для насыщения свободных сайтов связывания. Планшет отмывают 3 раза отмывочным буфером и каждый раз затем 100 мкл образцов и стандартов помещают на планшет. Супернатанты применяют в разведении 1:2 в буфере для реагентов для детекции 1Ь-6 и без разведения для детекции ΙΕΝ-γ. Стандартные серийные разведения 1Ь-6 содержат следующие концентрации: 12,5; 25; 50; 100; 200; 350; 700 пг/мл. Стандартные серийные разведения ΕΕΝ-γ содержат следующие концентрации: 12,5; 25; 50; 100; 250; 500; 1000 пг/мл. В каждом случае определения делают в двойном повторе. Время инкубации составляет 2 ч. После трёхкратной отмывки отмывочным буфером каждый раз 100 мкл антитела для детекции в концентрации 100 нг/мл (16--6) и 200 нг/мл (ΙΕΝ-γ) соответственно в буфере для реагента помещают на планшет. После инкубации в течение 2 ч планшет отмывают 3 раза отмывочным буфером и в каждую лунку помещают по 100 мкл конъюгата стрептавидин-НКР в разведении 1:200 в буфере для реагента. Время инкубации составляет 20 мин. После последней стадии трёхкратной промывки каждый раз в планшеты добавляют 100 мкл раствора субстрата (окрашивающего реагента А и В в соотношении 1:1) и инкубируют в течение 20 мин в темноте. Реакцию заканчивают, добавляя 50 мкл 1 М Н2Б04, а поглощение в каждой отдельной лунке определяют при 450 нм на ридере для микропланшет. Оценку осуществляют с помощью программы БойМах Рго 2,6. Стандартную кривую рассчитывают по 4-параметрической модели.
ΙΕΝ-γ.
Детекцию ΙΕΝ-γ в супернатантах культур клеток РВМС осуществляют, используя набор Нитап Ιη1егГетои-а (человеческий интерферон-α) ЕЫБЛ от Вюкоитсе в соответствии с прилагаемыми инструкциями. В микротитрационные стрипы, входящие в состав набора, уже содержащие антитела и блокированные, добавляют 100 мкл стандартов и образцов и инкубируют в течение 1 ч при КТ. Супернатанты используют в разведении 1:2 в буфере для разведения, и стандартные серийные разведения содержат следующие концентрации: 156; 312; 625; 1250; 2500; 5000 пг/мл. После стадии отмывки в каждую лунку добавляют 100 мкл концентрата антитела Ό в буфере для разведения С и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты отмывают 3 раза и в каждый планшет добавляют 100 мкл НКР в разбавителе НКР и инкубируют в течение 1 ч. Раствор удаляют, отмывают 4 раза и в каждую лунку пипеткой добавляют по 100 мкл раствора субстрата С. Их инкубируют в темноте в течение 20 мин и реакцию заканчивают, добавляя 100 мкл стоп-раствора Н. Поглощение при 450 нм на ридере для микропланшет. Оценку осуществляют с помощью программы БойМах Рго 2,6. Стандартную кривую рассчитывают по двухточечной модели.
К-З/СХСЕЙ
Детекцию К-З/СХСЙЗ в супернатантах культур клеток НЕК293 проводят, используя набор ИиоБе! ЕЫБЛ Оеуе1ортеи1 БуЧет от Κ&Ό БуЧепъ в соответствии с прилагаемыми инструкциями аналогично детекции, описанной для ΙΕ-6 и ΙΕΝ-γ. Стандартные серийные разведения содержат следующие концентрации: 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 пг/мл. Супернатанты используют без разведения. Антитела применяют в следующих концентрациях: иммобилизуемое антитело 4 мкг/мл, антитело для детекции 20 нг/мл.
Получение и описание мультимерных молекул ДНК.
Для изучения влияния структурных особенностей, в частности, таких, которые способствуют образованию С структур, методами по изобретению получают комбинации мономерных молекул ДНК с поли(С) мотивами в различных областях, эти методы, помимо лиофилизации, соответствуют методам получения мономеров. Для этой цели каждый раз объединяют три различных последовательности для стебля (Б) и петли (Ь), которые, с одной стороны, отличаются числом и локализацией гуаниновых оснований, но также вторичной структурой петли, предсказанной с помощью программы ΌΝΆ шГо1й. Отдельные последовательности и их структурные особенности представлены в нижеприведённой таблице.
- 14 017860
Таблица 3.1
Структурные признаки (особенности) и последовательности Ь1-Ь3, 81-83 (красный: поли(С))
Структурные признаки
Назва- ние Последовательность Поли(С) последовательность Тенд. петли, к раскрытию
ы Τ САТ ТСС ААА АСС ТТС ТТС ССС ССС ТТСТТ короткий (С«) в СС мотиве нет
Ь2 Т САТ ТСС АТА ТСС ТТС ТТС СТС ТСС ТТСТТ нет да
ьз Т ССС ССС СТА ТСС ТТС ТТС СТС ТСС ТТС ТТ длинный (Сб) вне СС мотива да
81 5'-ССТ АСС ССТ ТАС САС СТ... 3 - ССА АТС СТС СА... короткий
82 5’-СТС САС СТС ТАС САС СТ... З'-САС АТС СТС СА ... нет
83 5-ССТ АСС ССТ ССС ССС СТ ... З'-ССА ССС ССС СА ... ДЛИННЫЙ (С4ТС5)
На следующей диаграмме дан общий обзор используемых комбинаций и их обозначение, используемое ниже в данном описании.
Таблица 3.2
Обозначение (номенклатура) молекул с различными комбинациями петля/стебель
Как показано выше, полимерные молекулы 68ЫМ, которые в значении по изобретению можно также называть мультимерными молекулами или олигомерными молекулами, очень подходят для индукции усиленного иммунного ответа в организме. Усиленный иммунный ответ позволяет успешно использовать агенты в сочетании с химиотерапевтическими агентами. В сравнении с аддитивным эффектом двух агентов комбинация химиотерапевтических агентов и агентов по изобретению вызывает синергический эффект при лечении опухолей. Благодаря комбинации с агентом по изобретению, который можно получать с применением описанных выше стадий процесса (см. основной пункт Формулы изобретения), все эффекты дополнительных химиотерапевтических или цитостатических агентов усиливаются. Хотя мономерные формы молекул 68ЫМ уже объединяли с химиотерапевтическими или цитостатическими агентами, эффект, достигаемый при объединении мультимерной или полимерной формы 68ЫМ с цитостатическими агентами, совершенно удивителен. При применении комбинированного агента, содержащего мономерную форму 68ЫМ, и цитостатических агентов на практике было найдено, что можно улучшить только конкретные свойства цитостатических агентов, но не их общие свойства, как в случае полимерной формы. Также поразительно, что активация иммунной системы полимерной/мультимерной формой 68ЫМ выше, так что при лечении опухолей можно достичь значительно лучшего общего результата по сравнению с результатом, полученным при применении мономерной формы цитотоксических агентов. Так, в частности, образование метастаз предупреждается при введении в организм мультимерных молекул 68ЫМ, когда вместе с этими агентами вводят цитостатические агенты/химиотерапевтические агенты. Под объединением (комбинированием) по данному изобретению понимают одновременное, а также разнесённое во времени, введение обоих агентов.
На фиг. 3.1.1. приводятся в качестве примера две различные вторичные структуры молекул 68ЫМ 30Ь1 (такие как М8) и КО (такие как МЬ, 08, ОЬ, ОЬ8) для последовательностей трёх петель, рассчитанные с помощью программы ΌΝΑ ιηίοΐά. В отличие от 30Ь1, для КО не предсказывается никакого спаривания оснований в петле в выбранных условиях.
Получение различных мономерных и мультимерных молекул.
На фиг. 3.1.2 показаны результаты разделения партий лигирования по 0,3 мкг и теста Т7 расщепления различных 68ЫМ молекул наряду с 30Ь1 ΟΌΝ в 3% агарозном геле. На всех дорожках, на которых происходило разделение различных молекул, можно видеть полосу немного ниже уровня, на котором находится фрагмент маркера 100 п.о., эта полоса соответствует мономерной молекуле. На дорожке, содержащей 30Ь1 ΟΌΝ, видна полоса ниже полосы мономерных молекул. В случае молекул, содержащих Ь3 (ОЬ, ОЬ8), в верхней области геля до карманов можно видеть размытое изображение распределения ДНК, которое заметно сильнее для ОЬ и слабее для ОЬ8 в партии Т7 расщепления, нежели в партии лигирования. В случае молекул, содержащих длинные поли(О) мотивы (ОЬ, О8, ОЬ8, М8), полосы в геле
- 15 017860 относительно размыты по сравнению с другими молекулами (30Б1, КС, МБ). На дорожках, на которые нанесены пробы Т7 расщепления, интенсивности флуоресценции, особенно в верхней области геля, ниже по сравнению с дорожками с нанесёнными на них пробами лигирования.
На фиг. 3.1.3 представлены хроматограммы последующей ВЭЖХ-очистки различных молекул. На каждой графически представлено поглощение при 260 нм (синяя линия) в зависимости от объёма, прошедшего через колонку после инжекции разделяемого образца (пунктирная розовая линия). Зелёной линией показан градиент №1С1 буфера 0, 50 и 100% 1 М ЫаС1 буфера (Τ20Ν1000). Первый пик с максимумом при 2,5 мл и 0% Τ20Ν1000 (Е2) соответствует несвязанным молекулам, второй пик с максимумом при 8 мл и 50% Τ20Ν1000 (Е3) соответствует молекулам с низкой аффинностью к неподвижной фазе (несмотря на нанесение в 12-кратном количестве по сравнению с фракцией Е4, ни в каких фракциях совсем не обнаружено ДНК). Третий пик с максимумом при 14 мл и 100% Τ20Ν1000 (Е4) соответствует мономерным молекулам.
Фиг. 3.1.3 - ВЭЖХ-хроматограммы очистки различных мономерных и мультимерных соединений (молекул).
а) 30Б1, Ь) МЬ, с) КС, б) М8, е) С8, ί) СБ8, д) ОБ, колонка: 1 мл ЭМАЕ; применяемое количество: 700 мкг; скорость потока: 1 мл/мин; буфер А: 20 мМ трис (Τπδ). рН 7; буфер В: 20 мМ трис, 1 М №С1, рН 7; градиент: 0, 50, 100 буфер В.
При сравнении хроматограм различных молекул чётко видно, что Е4 является единственным пиком для молекул, не содержащих поли(С) мотивов, а именно, ни 83, ни Б3 (30Б1, МБ, КС). Напротив, имеется плечо в Е4 для тех молекул, которые содержат 83. В случае молекул, содержащих Б3 (СБ, СБ8), максимум имеет два пика с разной интенсивностью распределения в СБ и СБ8. В случае СБ8 оба парциальных максимума имеют примерно одинаковую интенсивность, тогда как для СБ парциальный максимум, наблюдаемый при большем объёме, имеет более высокую интенсивность, чем максимум при меньшем объёме. Побочные (боковые) максимумы или плечи фракционируют отдельно вручную. Фракции обозначают Е1 и Е2 в соответствии с хронологическим порядком их элюции.
Вышеописанные фракции 68Б1М, полученные в результате разделения методом ВЭЖХ, после осаждения этанолом, а именно конечные продукты, наносят на агарозный гель, представленный на фиг. 3.1.4. На всех дорожках полосу, соответствующую мономерным молекулам, можно видеть чуть ниже пробега маркера фрагмента 100 п.о. В случае МБ и КС можно распознать вторую, более слабую полосу чуть выше этой полосы (маркера фрагмента 100 п.о.) с более высокой интенсивностью в случае МБ. СБ, М8 и СБ8 проявляют несколько более высокую подвижность (мобильность) в геле, чем остальные молекулы. В случае молекул, не содержащих длинных поли(С) мотивов (30Б1, КС, М8), выше полосы 68Б1М можно рассмотреть непрерывное распределение интенсивности вплоть до уровня примерно 200 п.о. Кроме того, для КС и МБ можно увидеть слабую полосу маркера фрагмента 200 п.о.
Фиг. 3.1.4 - различные мономерные и мультимерные соединения (молекулы) после осаждения этанолом.
3% агарозный гель, нанесённое количество 0,3 мкг, маркер 100 п.о. 0,5 мкг (100 п.о., 30Б1, 30Б1, КС, МБ, СБ-Е1, СБ-Е2, М8-Е1, М8-Е2, С8-Е1, С8-Е2, СБ8-Е1, СБ8-Е2, 100 п.о.)
В случае молекул, для которых наблюдается многопиковое (многовершинное) распределение и максимумы фракционируют методом ВЭЖХ-очистки, каждая фракция 1 в основном соответствует полосе мономера, тогда как на дорожках с нанесённой на них фракцией 2 наблюдается в основном распределение интенсивности в широком диапазоне выше полосы мономера. В данной работе для М8 и С8 наблюдается одинаковое распределение интенсивности, начиная примерно от полосы мономера и до длины пробега, соответствующего 500 п.о. С другой стороны, в случае СБ это распределение начинается выше 200 п.о., продолжаясь до кармана геля. Однако для СБ8 можно наблюдать распределение ДНК по всей дорожке, начиная от полосы мономера.
Фиг. 3.1.6 - термическая денатурация различных мономерных и мультимерных молекул.
Нативный (чистый) РАСЕ, 8% гель (2,6% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., без обработки, денатурация 95°С в течение 10 мин: 30Б1, М8, МБ, КС, С8, СБ-Е2, СБ8-Е2).
На изображении геля на фиг. 3.1.6 показано действие термической денатурации различных молекул на характер их миграции в геле. Для этой цели партии делят и часть нагревают при 95°С в течение 10 мин, сразу же охлаждают льдом и наносят. Наблюдаемые полосы соответствуют полосам в геле, описанным в разделе 3.1.5, но в этом случае неразделённая ДНК наблюдается в кармане геля для М8, а также С8, а вторая полоса видна в случае М8, она находится на том же уровне, что и вторая полоса 30Б1. С8 и М8 включают партию, отличную от партии в геле на фиг. 3.1.5, где боковые максимумы в ВЭЖХфракционировании не отбирают по отдельности. Сравнение полос в геле с денатурированным и неденатурированным 68Б1М показывает, что интенсивность первой полосы у всех соединений (молекул) после нагревания понижается, а второй полосы повышается. Полоса на дорожках с МБ и КС, наблюдаемая в верхней трети гели, после денатурации больше не видна. Также после денатурации нельзя больше видеть ДНК в карманах дорожек, на которые нанесены М8 и С8. Аналогично, на дорожках с СБ-Е2 и СБ8-Е2 количество ДНК в кармане снижается, но, с другой стороны, выше второй полосы видно основное число
- 16 017860 равномерно расположенных полос.
Для того чтобы исследовать, являются ли изменения, вызванные денатурацией, обратимыми, денатурированные образцы делят на части и инкубируют в течение 3 дней при 4 и 37°С соответственно. Партии необработанного 68Ь1М хранят при 4°С, аналогичным образом через 3 дня делят на части и каждый раз одну аликвоту нагревают при 95°С в течение 10 мин и сразу же помещают на лёд. Результаты нативного РАСЕ (в чистом геле), применяемого для разделения партий, представлены на фиг. 3.1.7 и 3.1.8. На изображениях необработанных и денатурированных образцов видно, что у них такой же характер миграции в геле, что и на фиг. 3.1.6. По своему характеру миграции денатурированные образцы, инкубированные при 4°С, соответствуют образцам, денатурированным непосредственно перед нанесением. Характер миграции в геле образцов, инкубированных при 37°С, в значительной степени соответствует характеру миграции необработанных образцов. Однако интенсивность второй полосы для 30Ь1, М8 и С8 больше, чем для вышеуказанных образцов. Другое различие для 08 и М8 наблюдается в количестве ДНК, остающегося в кармане геля, которое очень мало по сравнению с необработанным образцом.
Фракции димерных и мономерных молекул 30Ь1.
Чтобы определить, действительно ли полоса, видимая в верхней трети, представляет собой полосу, соответствующую димеру, фракцию (Е3), полученную из большого количества мономерного соединения (мономерных молекул) разделением методом ВЭЖХ и содержащую эту полосу, наносят на нативный РАСЕ вместе с димерным соединением (димерной молекулой) 60Ь1.
Фиг. 3.1.9 - сравнение фракции 3 с димерным соединением (молекулой) 60Ь1.
Нативный РАСЕ (электрофорез в чистом геле), 8% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., Е3, Е3 95°С, 60Ь1, 60Ь1 95°С, фракция 1 (Е1), фракция 2 (Е2), фракция 3 (Е3), фракция 4 (Е4), выделенные при ВЭЖХ-очистке 68Ь1М 30Ь1, 60Ь1).
Наблюдаемые полосы находятся на одном уровне. При нанесении на гель образцов в денатурированном виде полосы находятся на более высоком уровне в геле по сравнению с дорожкой, на которую нанесены необработанные образцы. Соответствующие полосы нативного РАСЕ представлены на фиг. 3.1.9 вместе с результатами разделения четырёх различных фракций мономера 30Ь1, полученных при фракционировании методом ВЭЖХ.
Среда для инкубации, связывание белка.
Для изучения влияния условий в клеточной культуре, в особенности присутствия белков, на молекулы, используемые для стимуляции, последние инкубируют в среде культур клеток в течение 0,5 и 27 ч при 37°С и разделяют наряду с молекулами (соединениями), растворёнными в воде, методом нативного РАСЕ. После окрашивания ДНК белки в среде детектируют окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым. Результаты представлены на фиг. 3.1.10. и 3.1.11.
Фиг. 3.1.10 - инкубация мономерных молекул в среде.
Нативный РАСЕ, 8% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг, маркер 50 п.о. 0,3 мкг (50 п.о., 27, 5, 0 ч среда, Н2О: 30Ь1, МЬ, Е3, КС, 25 п.о.).
Нативный РАСЕ, 8% гель (2,6% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, 25 п.о. 0,35 мкг (27, 5, 0 ч среда, Н2О: СЬ25 п.о.).
Окрашивание Кумасси бриллиантовым голубым, нативный (чистый) 8% РАСЕ (5% С), см. фиг. 3.1.11 а) (27 ч среда, 5 ч среда, 0 ч среда, Н2О: МЬ).
На фиг. 3.1.10 а) и 3.1.10 Ь) показано окрашивание этидия бромидом геля РАСЕ с нанесёнными на него соединениями (молекулами). На фиг. 3.1.10 с) представлен типичный пример геля, окрашенного Кумасси, применяемого для сравнения длин пробега. Сравнение полос, включающих различные партии, показывает, что у всех соединений (молекул) в среде появляется полоса в кармане геля, отсутствующая на дорожках с Н2О (за исключением СЬ). У полосы, появляющейся в верхней области геля в Н2О в случае 30Ь1 и фракции 3, наблюдается более короткая длина пробега в среде, она находится на уровне низшей полосы белка. Интенсивность полос как ДНК, так и белка снижается при увеличении времени инкубации. В случае СЬ интенсивность 2 полосы в среде повышается по сравнению с Н2О.
Фиг. 3.1.11 - инкубация ΟΌΝ М362 в среде.
Нативный РАСЕ, 12% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., Н2О, 0 ч среда, 5 ч среда, 27 ч среда).
Окрашивание Кумасси бриллиантовым голубым, нативный РАСЕ, 12% гель (5% С), на фиг. 3.1.12 а) (Н2О, 0, 5, 27 ч среда).
На фиг. 3.1.11 показан нативный РАСЕ (электрофорез в чистом геле), в котором наносят контрольную молекулу М362 с защитной фосфоротиоатной группой. Как чётко видно на чертеже, полоса ДНК, видимая в Н2О на нижнем крае геля, исчезает в среде. Напротив, можно видеть полосу в верхнем крае геля, соответствующую по длине (пути) пробега нижней полосе белка (фиг. 3.1.11 Ь), и полосу в кармане геля. В этом случае также можно наблюдать снижение интенсивности полос ДНК по мере увеличения времени инкубации.
Чтобы проверить, что наблюдаемые изменения вызваны скорее присутствием белков, нежели других компонентов среды, для сравнения молекулы также разводят в среде без добавления ЕС8 (фетальной (эмбриональной) телячьей сыворотки). На фиг. 3.1.12 представлены соответствующие дорожки геля для
- 17 017860
68ЫМ (КО) и М362. Дорожки, на которых ΘΌΝ и молекулы разделяются в среде в отсутствие ЕС8, соответствуют по своей интенсивности распределения дорожкам, на которые ΘΌΝ и 68ЫМ наносят в виде раствора в воде. Напротив, ΘΌΝ, растворённые в среде с ЕС8, и молекулы в нативном РАОЕ показывают характер миграции, который соответствует характеру миграции, описанному на фиг. 3.1.10 и 3.1.11 для тех дорожек, на которые нанесены мономерные молекулы и ΘΌΝ, разведённые в среде.
Иммуностимулирующий эффект: стимуляция РВМС.
Иммуномодулирующий эффект различных молекул изучают на РВМС, выделенных из донорской человеческой крови. С этой целью РВМС инкубируют с соответствующей молекулой (соединением) или контрольной молекулой М362 с конечной концентрацией 1 мкМ в течение 48 ч, а количество ΙΕ-6, ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-γ в супернатантах клеточных культур определяют методом ЕЫ8А. Клетки, инкубируемые в отсутствие каких-либо добавок, используют в качестве контроля.
Результаты, полученные методом ЕЫ8А при исследовании супернатантов РВМС 4 человекдоноров крови (доноры А-Ό), представлены в виде диаграмм на фиг. 3.2.1 а)-с). Величины соответствуют средним значениям, полученным в результате определений в двойном повторе, а усы показывают выведенное из них двойное стандартное отклонение. Величины, помеченные знаком *, означают, что проведено дополнительное двойное определение стимуляции РВМС и эти указанные величины соответствуют средним значениям из четырёх результатов, полученных методом ЕЫ8А. Усы показывают двойное стандартное отклонение для этих четырёх значений.
Фиг. 3.2.1 а)-с) - результаты ЕЫ8А ΙΕΝ-γ (а), ΙΕΝ-α (Ь), ΙΌ-6 (с) РМВС.
Супернатанты РВМС (2,4х106 клеток на партию 600 мкл) от разных доноров А-Ό, стимуляция 48 ч с использованием 1 мкМ 68ΕΙΜ/ΘΌΝ М362, стадартный результат измерения —, * культура клеток с определением в двойном повторе (двукратным), усы: 2х стандартное отклонение от определения в двойном повторе ЕЫ8А (* культура клеток с определением в двойном повторе (двукратным) + определения в двойном повторе ЕЫ8А = 4 значения).
Что касается диаграмм, особенностью, сразу бросающейся в глаза, являются очень значительные колебания концентрации цитокинов в супернатантах различных доноров, что затрудняет сравнение данных. Стандартные отклонения значений, дополнительно определяемых в культуре клеток в виде двойных определений (в двойном повторе), сравнимы со стандартными отклонениями, просто получаемыми из двойных определений (в двойном повторе) в ЕЫ8А, это показывает, что эти различия вызваны различием в клетках РВМС. В нестимулированных партиях от всех доноров либо совсем не обнаруживают цитокинов, либо обнаруживают очень низкие концентрации цитокинов. При определении концентраций ΙΌ-6 и ΙΕΝ-γ некоторые из определяемых величин находятся на верхнем пределе или вне стандартного интервала измерений, который составляет вплоть до 10000 мкг/мл для ΙΕΝ-γ, вплоть до 3500 мкг/мл для Ш-6 для 68ЫМ и 7000 мкг/мл для М362.
Для более точного сравнения данных, полученных от разных доноров, полученные в результате величины цитокинов нормализуют. Для этой цели для каждого донора рассчитывают процентное содержание определяемых концентраций цитокинов в величине, определённой для М362. Средние значения нормализованных таким образом данных от четырёх доноров представлены на диаграммах на фиг. 3.2.2 а)-с). Величина каждого уса соответствует средней величине отклонения (девиации). Вследствие большой разницы между показаниями для отдельных доноров, усы очень велики. Однако с помощью диаграмм можно, по меньшей мере, оценить тенденцию для отдельных молекул.
Фиг. 3.2.2 а)-с) - нормализованные средние значения результатов определения методом ЕЫ8А для ΙΕΝ-γ (а), ΙΕΝ-α (Ь), ΙΌ-6 (с).
Результаты ЕЫ8А см. фиг. 3.2.1, нормализованные: количество цитокинов в % М362 на донора, среднее значение для 4 доноров, усы: средняя величина отклонения (девиации).
Для ΙΕΝ-γ расчетные значения для испытуемых молекул составляют между 40 и 80% относительно величин М362, а значения для КО, МЬ и 6Ε8-Ε2 находятся скорее в нижней, а для 6Ε-Ε2 - в верхней области.
Средние выраженные в процентах значения различные конструкций для ΙΕΝ-α приблизительно соответствуют значениям М362, за исключением значений, рассчитанных для 6Ε-Ε1, ОЕ8-Г1 и О^-Ε2, которые составляют только около 50% от значений М362.
Средние величины процентного содержания М362 для Ш-6 ниже 50% для 30Ь1, М8, О8, ОЕ-Г2 и О^8-Ε2. а в случае М8 и ОЕ8-Г2 - конструкций с самой низкой концентрацией эндотоксина, получены также самые низкие значения. Значения для ОЬ^ и О^-Ε2, где совсем не обнаружено эндотоксинов, немного выше 50% относительно М362. Наивысшие значения Ш-6, которые соответствуют значениям для М362 или превышают 100%, обнаружены в клетках, стимулированных с помощью КО и МЬ. Также для двух конструкций определяют наивысшую концентрацию эндотоксинов.
Фиг. 3.3.2 - результаты, полученные методом ЕЫ8А, время стимуляции ΙΌ-8 НЕК293-ТЬК9.
Супернатанты НЕК293-ТЬК9: 400 мкл/партия (5х106 клеток/мл); стимуляция 6, 24, 48 ч при использовании 2,5 мкл ΘΌΝ 2006; 0,5 мкг/мл ЬР8; стимуляция через 3 дня после засевания клеток (среду заменяют через 48 ч и перед стимуляцией); усы: 2х стандартное отклонение от двукратного определения
- 18 017860 методом ЕБ18А.
Отношения количеств хемокина в стимулированных/нестимулированных партиях из а); усы: сумма относительных погрешностей двукратного определения методом ЕБ18А.
Измеряемые концентрации хемокина относительно низки. Однако повышение количества 1Ь8/СХСБ8 при увеличении времени стимуляции можно наблюдать во всех партиях, однако это повышение становится очень низким при увеличении времени от 24 до 48 ч. Также относительные значение для ЬР8-стимулированных и нестимулированных клеток примерно равны по величине, а для клеток, стимулированных с помощью ΘΌΝ 2006, увеличены примерно в 1,5 по сравнению с нестиму лированными клетками. Не обнаружено никакой разницы в отношениях количеств 1Ь-8/СХСЬ8 стимулированных/нестимулированных партий, определяемых в различные моменты времени (в различных временных точках), по этой причине дальнейшую стимуляцию проводят в течение 24 ч.
Фиг. 3.3.4: Результаты ЕЫ8А для 1Ь-8 НЕК293 пи11 различных мономерных молекул.
Супернатанты НЕК293 пи11: 400 мкл/партия (1х106 клеток/мл); стимуляция в течение 24 ч с помощью 2 мкМ ΘΌΝ 2006/й8ЫМ; 0,5 мкг/мл ЬР8; стимуляция через 4 дня после засевания клеток (среду заменяют через 48 ч и перед стимуляцией); усы: 2х стандартное отклонение от двукратного определения методом ЕБ18А.
Отношения количеств хемокина в стимулированных/нестимулированных партиях из а); усы: сумма относительных погрешностей двукратного определения методом ЕБ18А.
Ни в одной из инкубированных с указанными различными стимуляторами партий не наблюдается никакой значительной разницы в секреции 1Ь-8/СХСЬ8 по сравнению с нестимулированной партией.

Claims (29)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Мультимерная молекула для модулирования активности иммунной системы человека или животного, содержащая по меньшей мере две мономерные структуры стебель-петля, которые объединены в мультимерную молекулу с образованием С-структур, при этом молекула содержит последовательность оснований Ν'ΝΪΟΝ’Ν, где Ν!Ν2 обозначает какой-либо элемент из группы СТ, СС, СА, АТ или АА, Ν3Ν4 обозначает какой-либо элемент из группы СТ или ТТ, а С обозначает дезоксицитозин, С обозначает дезоксигуанозин, А обозначает дезоксиденозин и Т обозначает дезокситимидин.
  2. 2. Молекула по п.1, отличающаяся тем, что олигодезоксирибонуклеиновая кислота содержит следующие последовательности:
    а) СТТССТССАС АССТТСТТАС СААССТТСТС СТТСАССТТС САСАСААС, или
    б) АССТТССТТС ТАСТААССТТ СССТСААССА АССТТСАТСТ ТСАТААССТТ СССТАСАТСА, или
    в) олигодезоксирибонуклеотидную последовательность, имеющую последовательность оснований ААСС ТТСТТССССС ССТТ, которая имеет в длину 40-1600 нуклеотидов.
  3. 3. Молекула по п.2, отличающаяся тем, что последовательность оснований по признаку в) включена в последовательность ССТАССССТТ АССАССТТСА ТТССААААСС ТТСТТССССС ССТТСТТАСС ТССТААСС ССТАССССТТ АССАССТТСА ТТССААААСС ТТСТТССССС ССТТСТТАСС ТССТААСС.
  4. 4. Молекула по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что содержит частично однонитевую, ковалентно замкнутую цепь дезоксирибонуклеозидных остатков.
  5. 5. Молекула по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что последовательность оснований расположена в однонитевой области замкнутой цепи из дезоксирибонуклеозидных остатков.
  6. 6. Молекула по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что один или более заместителей связаны с молекулой ковалентными связями.
  7. 7. Молекула по п.6, отличающаяся тем, что заместитель выбирают из группы, включающей пептиды, белки, сахариды, антигенные структуры, молекулы ДНК и/или РНК.
  8. 8. Композиция, содержащая молекулу по любому из пп.1-7 и химиотерапевтический агент.
  9. 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что химиотерапевтический агент выбирают из группы, включающей антитела, алкилирующие агенты, платиновые аналоги, интеркалирующие агенты, антибиотики, ингибиторы митоза, таксаны, ингибиторы топоизомераз, антиметаболиты и/или Ь-аспарагиназу, гидроксикарбамид (гидроксимочевину), митотан и/или аманитины.
  10. 10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что алкилирующие агенты выбирают из группы, включающей производные азотного мустина, в особенности циклофосфамид, ифосфамид, трофосфамид, мельфалан и/или хлорамбуцил, алкилсульфонаты, в особенности бусульфан и/или треосульфан, нитрозомочевины, в особенности кармустин, ломустин, нимустин, эстрамустин и/или стрептозотоцин, прокарбазин и дакарбазин, темозоломид и/или тиотепу.
  11. 11. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что платиновые аналоги выбирают из группы, включающей цисплатин, карбоплатин и/или оксалиплатин.
  12. 12. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что интеркалирующие агенты выбирают из группы,
    - 19 017860 включающей антрациклины, в особенности доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, эпирубицин и/или идарубицин, митоксантрон, амсакрин и/или доксофлуридин.
  13. 13. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что антибиотики выбирают из группы, включающей блеомицин, актиномицин Ό (дактиномицин) и/или митомицин.
  14. 14. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что ингибитор митоза выбирают из группы, включающей алкалоиды Утса гокеа (растения барвинок розовый), в особенности винорелбин, винкристин (онковин), винбластин и/или виндезин.
  15. 15. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что таксаны выбирают из группы, включающей паклитаксел и/или доцетаксел.
  16. 16. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что ингибиторы топоизомераз выбирают из группы, включающей ингибиторы топоизомеразы I, в особенности камптотецин, топотекан и/или иринотекан, и/или ингибиторы топоизомеразы II, в особенности этопозид, тенипозид.
  17. 17. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что антиметаболиты выбирают из группы, включающей антагонист фолиевой кислоты, в особенности метотрексат, аналоги пиримидина, в особенности 5фторурацил, капецитабин, цитозин арабинозид (цитарабин) и/или гемцитабин, аналоги пурина, в особенности 6-тиогуанин, пентостатин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, флударабин и/или кладрибин.
  18. 18. Набор, содержащий молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17 и информацию относительно смешивания содержимого набора.
  19. 19. Применение молекулы по любому из пп.1-7 или композиции по любому из пп.8-17 в качестве лекарственного средства для модулирования активности иммунной системы человека или животного.
  20. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
  21. 21. Применение молекулы по любому из пп.1-7, композиции по любому из пп.8-17, или фармацевтической композиции по п.20 для модуляции иммунной системы человека или животного или для модуляции активности такой иммунной системы.
  22. 22. Применение по п.21, отличающееся тем, что модуляция представляет собой стимуляцию или повышение активности иммунной системы.
  23. 23. Применение по п.22, отличающееся тем, что стимуляция включает Т-клеточно-опосредованный или независимый от Т-клеток иммунный ответ.
  24. 24. Применение по п.23, отличающееся тем, что иммунный ответ включает пролиферацию В-клеток и/или активацию В-клеток.
  25. 25. Применение по любому из пп.21-24, отличающееся тем, что стимуляция иммунной системы включает секрецию цитокинов.
  26. 26. Применение по любому из пп.21-25, отличающееся тем, что молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17 применяют в качестве адъювантов при терапевтической или профилактической вакцинации.
  27. 27. Применение молекулы по любому из пп.1-7, композиции по любому из пп.8-17 и/или фармацевтической композиции по п.20 для лечения нарушения роста клеток.
  28. 28. Применение по п.27, отличающееся тем, что нарушение роста клеток представляет собой опухолевое заболевание.
  29. 29. Применение по п.28, отличающееся тем, что опухолевое заболевание выбирают из группы, содержащей опухоли уха, носа, горла, включая опухоли внутри носа, опухоли назального синуса, носоглотки, на губах, в полости рта, опухоли мезофаринкса (ротоглотки), гортани, гипофаринкса (подглоточника), уха, слюнных желез, и параганглиомы, опухоли лёгких, включая немелкоклеточные карциномы бронхов, мелкоклеточные карциномы бронхов, опухоли средостения, опухоли желудочно-кишечного тракта, включая опухоли пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, колоректальные карциномы и анальные карциномы, опухоли мочеполовой системы, включая опухоли почек, мочеточника, мочевого пузыря, простаты, уретры, пениса и яичек, гинекологические опухоли, включая опухоли шейки матки, влагалища, вульвы, рак матки, злокачественную трофобластическую опухоль, карциному яичника, опухоли маточной трубы (фаллопиевой трубы), опухоли брюшной полости, карциномы молочной железы, опухоли эндокринных органов, включая опухоли щитовидной железы, паращитовидной железы, коры надпочечника, эндокринные опухоли поджелудочной железы, карциноидные опухоли и карциноидный синдром, множественные эндокринные неоплазии, саркомы костных и мягких тканей, мезотелиомы, кожные опухоли, меланомы, включая кожные и внутриглазные меланомы, опухоли центральной нервной системы, опухоли детского возраста, включая ретинобластому, опухоль Вильмса, нейрофиброматоз, нейробластому, семейство опухолей типа саркомы Юинга, рабдомиосаркому, лимфомы, включая неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, первичные лимфомы центральной нервной системы, болезнь Ходжкина, лейкозы, включая острые лейкозы, хронический миелоидный и лимфатический лейкозы, опухоли плазматических клеток, синдромы миелодисплазии, паранеопластические синдромы, метастазы с неизвестной первичной опухолью (синдром СИР), перитонеальный карциноматоз, злокачественное заболевание, связанное с иммуносупрессией, включая злокачественное заболевание, обусловленное СПИДом, такое как саркома Капоши,
    - 20 017860 обусловленные СПИДом лимфомы центральной нервной системы, обусловленная СПИДом болезнь Ходжкина и обусловленные СПИДом анально-генитальные опухоли, злокачественное заболевание, обусловленное трансплантацией, метастазирующие опухоли, включая метастазы в мозг, метастазы в лёгкие, метастазы в печень, метастазы в кости, метастазы в плевру и в перикард, и злокачественные асциты.
EA200802310A 2006-05-11 2007-05-11 Мультимер для иммуностимуляции EA017860B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006023332 2006-05-11
PCT/DE2007/000887 WO2007131495A2 (de) 2006-05-11 2007-05-11 Multimer zur immunstimulation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200802310A1 EA200802310A1 (ru) 2009-06-30
EA017860B1 true EA017860B1 (ru) 2013-03-29

Family

ID=38694253

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802310A EA017860B1 (ru) 2006-05-11 2007-05-11 Мультимер для иммуностимуляции

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9499815B1 (ru)
EP (1) EP2027266B1 (ru)
JP (1) JP5507998B2 (ru)
KR (1) KR20090012265A (ru)
CN (1) CN101490257A (ru)
AT (1) ATE492639T1 (ru)
AU (1) AU2007250331A1 (ru)
BR (1) BRPI0711607A2 (ru)
CA (1) CA2651568A1 (ru)
DE (1) DE502007006037D1 (ru)
DK (1) DK2027266T3 (ru)
EA (1) EA017860B1 (ru)
ES (1) ES2357692T3 (ru)
MX (1) MX2008014380A (ru)
MY (1) MY145369A (ru)
PT (1) PT2027266E (ru)
WO (1) WO2007131495A2 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2058397A1 (de) * 2007-11-07 2009-05-13 Mologen AG Multimeres Assemblat zur Immunstimulation
EP2246433A1 (de) * 2009-04-30 2010-11-03 Mologen AG Concatemere zur Immunmodulation
DE102012209673A1 (de) 2012-06-08 2013-12-24 Artcline Gmbh Verfahren zum Herstellen einer Leukozytenpräparation und Leukozytenpräparation
EP3024936B1 (en) 2013-07-25 2019-09-04 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
GB2523187A (en) 2014-02-18 2015-08-19 Mologen Ag Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct
CN106535876B (zh) 2014-06-04 2020-09-11 埃克西奎雷股份有限公司 免疫调节剂通过脂质体球形核酸的多价递送以用于预防或治疗应用
CA2968531A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
LU92821B1 (en) * 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
EP3691749A1 (en) * 2017-08-31 2020-08-12 Mologen AG Tlr-9 agonists for modulation of tumor microenvironment

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001007055A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-01 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Kovalent geschlossenes nukleinsäuremolekül zur immunstimulation
WO2002060476A2 (de) * 2001-01-31 2002-08-08 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Tumorvakzine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE512668T1 (de) * 2003-12-30 2011-07-15 Mologen Ag Allogenes tumortherapeutikum

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001007055A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-01 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Kovalent geschlossenes nukleinsäuremolekül zur immunstimulation
WO2002060476A2 (de) * 2001-01-31 2002-08-08 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Tumorvakzine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRIEG ARTHUR M.: "CpG motifs: The active ingredient in bacterial extracts?", NATURE MEDICINE, vol. 9, no. 7, July 2003 (2003-07), pages 831-835, XP002461381, ISSN: 1078-8956, the whole document *
SCHMIDT M. ET AL.: "Cytokine and Ig-production by CG-containing sequences with phosphorodiester backbone and dumbbell-shape", ALLERGY (OXFORD), vol. 61, no. 1, January 2006 (2006-01), pages 56-63, XP002461380, ISSN: 0105-4538, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
DE502007006037D1 (de) 2011-02-03
US9499815B1 (en) 2016-11-22
MX2008014380A (es) 2009-03-02
WO2007131495A2 (de) 2007-11-22
WO2007131495A3 (de) 2008-06-19
EA200802310A1 (ru) 2009-06-30
PT2027266E (pt) 2011-03-14
EP2027266B1 (de) 2010-12-22
CN101490257A (zh) 2009-07-22
MY145369A (en) 2012-01-31
AU2007250331A1 (en) 2007-11-22
JP2009536519A (ja) 2009-10-15
EP2027266A2 (de) 2009-02-25
BRPI0711607A2 (pt) 2012-11-06
ES2357692T3 (es) 2011-04-28
CA2651568A1 (en) 2007-11-22
DK2027266T3 (da) 2011-04-11
ATE492639T1 (de) 2011-01-15
JP5507998B2 (ja) 2014-05-28
KR20090012265A (ko) 2009-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017860B1 (ru) Мультимер для иммуностимуляции
Collins et al. Epithelial chemokine CXCL14 synergizes with CXCL12 via allosteric modulation of CXCR4
Boudjellab et al. Bovine interleukin-1 expression by cultured mammary epithelial cells (MAC-T) and its involvement in the release of MAC-T derived interleukin-8
Ly et al. Transcription factor T-bet in B cells modulates germinal center polarization and antibody affinity maturation in response to malaria
Nakamura et al. RNA plasticity and selectivity applicable to therapeutics and novel biosensor development
KR101556339B1 (ko) 페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물
WO2021000598A1 (zh) 一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用
TWI454277B (zh) 用於免疫調節之連鎖子
US20090253134A1 (en) Cellular Pyrogen Test
Dowling et al. Toll-like receptors: ligands, cell-based models, and readouts for receptor action
CN108603180A (zh) 聚合酶复合体的纯化
Li et al. The role of STAT-6 as a key transcription regulator in HeLa cell death induced by IFN-γ/TNF-α co-immobilized on nanoparticles
WO2015184224A1 (en) Aptamer targeting mage-a3 peptide and uses thereof
Li et al. Chemical reagents modulate nucleic acid-activated toll-like receptors
JP2011502492A (ja) 免疫刺激のためのカテナン
Tariq et al. Macrophages M2 polarization is involved in lapatinib-mediated chemopreventive effects in the lung cancer
CN101220091B (zh) 姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用
TW202128160A (zh) 用於治療病原性血管病症之方法及組合物
CN103958683A (zh) 与肾上腺皮质刺激激素结合的分子及其应用
CN116286831B (zh) 靶向egfr t790m突变体的核酸适配体及其在制备治疗肺癌药物中的应用
KR20180119758A (ko) 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
WO2001059096A9 (fr) Methode de detection d&#39;un ligand ou d&#39;un compose a faible poids moleculaire du type ligand
Catusse et al. Rabbit neutrophil chemotactic protein (NCP) activates both CXCR1 and CXCR2 and is the functional homologue for human CXCL6
Ahmadzadeh Investigation of lung cancer cell culture supernatants activated with tlr agonists effect on macrophage polarization
Singh Engineered Organotypic Breast Tumor Model for Mechanistic Studies of Tumor-Stromal Interactions and Drug Discovery

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment