JP5507998B2 - 免疫刺激のための多量体 - Google Patents

Description

本発明はヒト又は動物の免疫系の活性を調節する多量体非コード核酸分子、それを生成する方法及び多量体非コード核酸分子を含むワクチンに関する。

各病原体に特異のリンパ球の選択に続く適応的免疫反応及びクローン増殖及びそれのエフェクター細胞への分化は遅れて生じ（３−５日）、免疫性記憶（immunologic memory）の形成を通して各病原体からの長時間にわたる保護をもたらすが、先天性免疫系の細胞は病原体を胚細胞をコードする受容体を持つ保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）（pathogen-associated molecular patterns）に基づいて認識し、そして直ちに反応する。異なるタイプの細胞に応じた、異なる反応にはサイトカイン(例えば、IL-1 , IL-6, TNF-α)及びケモカイン(例えば、IL-8/CXCL8, MIP-1α/β, MCP-1 )の分泌、エフェクター機構の活性化（食菌作用、呼吸器分泌、殺菌物質又は溶菌顆粒の分離）、共刺激分子の発現(CD80, CD86)並びにＭＨＣ分子の発現の強化を含む。他方、これにより、侵入した病原体を除去することのできるエフェクター細胞を集め及び活性化し、他方で、適応的免疫系の細胞はその活性化に必要なシグナルを受け取る。

改善された免疫応答を作り出すために、CpGオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)が新しいクラスの免疫調節性分子として使用されている。その様なメチル化されていないＣＧモチーフが細菌性ＤＮＡに生じ、そして免疫系に「危険信号」（danger signal）を示す。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）であるため、これらは主に先天性免疫系の非特異的活動を起す(Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835)。

CpG-ODNはサイトカイン インターロイキンー１２、インターフェロンーγ及び腫瘍壊死因子αによりT_H1 の強調された免疫反応（T_H1-accentuated immune response）を引起す。

上記のCpG-ODNを持つ免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）は僅かの長さの塩基であり、それにコードされたタンパク質の発現によっては機能しない。

ＩＳＳは共有結合的に閉じた核酸分子である。それはその塩基がそれ自身で部分的にペアーを組むことができるオリゴヌクレオチド及び３０の塩基及び幾つかのＣＧモチーフを含む１又は２のループより成り、以下において担体分子と呼ぶ。

細胞免疫反応による強い刺激は、干渉がなければ患者に取り不満足な免疫活性となっていた規則的周期調節に影響を与えることが可能である。

CpG-DNAの安定化で用いられる様に、ホスホロチオエート骨格を持つCpG-ODNの修飾は、タンパク質に対する非特異結合（Brown 1994）のみならず、特に毒性が見られること（Heikenwalder 2004, Levin 1999）を含み、多くの深刻な欠陥がある。

このために、新しい種類の、共有結合で閉じられた免疫刺激DNAが開発された(EP 1196178)。これらのDNA分子は、回文構造の重複を持つ５’及び３’末端に自己相補的領域を持つ２つの化学的に合成されたDNA分子よりなり、２つのDNA分子の結紮は共有結合により閉じた分子を作り出す。非相補的領域にＣＧモチーフを持つこれらのDNA分子は、CpG-ODN（Ｂ細胞上の表面分子CD80, CD40, MHCの発現の強化及びPBMCによるIL-6, IFN-γ, IFN-α, IL-12, TNFαの分泌）と類似の活性を示すが、ホスホロチオエート骨格を持つCpG-ODNと比較して、マウスにおいて幾らか異なる発現パターン及び極めて低い毒性を持つ。しかし、従来技術のこの免疫刺激DNAは、ヒト又は動物の免疫系活性の調節に関して多くの欠点を持つ。

必ずしもヒト又は動物の免疫系活性を望ましいレベルに調整し、特に常にその誘因となることが可能とは限らない。

上記の最先端技術がある中で、本発明の目的は改善された免疫反応を誘発することの可能な、好適な免疫刺激DNA分子、それを生成する方法並びに前記免疫刺激DNA分子を含むワクチンを提供することにある。

本発明においては、免疫刺激の意味は、免疫系の媒介物質及びエフェクター細胞、すなわち、特に現在知られているヘルパー機能を持つ胸腺細胞及び細胞毒性を持つ胸腺細胞、B細胞及びいわゆるNK（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ及び単球並びに樹脂状細胞及びその前駆体、及びその機能がまだ明らかになっていない免疫系内の機能を掌る細胞集団が、核酸分子により刺激を受けて、増殖し、移動し、分化し又は活性を示すことを言う。免疫調節とは、その原型又は成熟する過程において、免疫反応の介在によるものか否かを問わず、又はその性質において事前に確立された反応を変えるものか否かを問わず、上に規定した意味での一般的刺激に加えて、免疫反応の種類又は性格に対し影響を与えることを言う。

本発明は多量体非コード核酸分子を提供することにより課題を解決する。多量体分子は以下のステップを含む方法により生成することができる：
- 水中で５’末端がリン酸化されているオリゴデオキシリボ核酸配列を提供する、
- 乾燥残留物が得られるまで凍結乾燥し、続いて緩衝液中で再懸濁する、
- T4-DNAリガーゼを加え、反応混合物を形成する、及び
- 反応混合物を３７℃で少なくとも３０分培養する。

最も驚くことには、上に記載のステップの順序は、従来技術の分子よりもヒト又は動物の免疫系の活性を調節するために用いるのにより適している多量体分子を生成する。本発明の多量体分子は本質的にデオキシリボ核酸分子であり、前記核酸分子は好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドの長さを持つのが良く、より好ましくは２００、特に好ましくは３００より大きい長さであるのが良い。EP 1 196 178は、そのステムループ構造よりモノマーと呼ぶことのできる分子を開示し、その発明の方法は、多くのその様なステムループ モノマー構造が多量体又はオリゴマー構造として集まる分子を提供する。驚くことには、結果の集合物は免疫系を調節するのに効果的である。それ自身簡潔であり、また上で述べた実験室での典型的なプロセスのステップが効果的な構造を形成することは驚くべきことである。

EP 1 196 178による構造と比較すると、本発明の多量体分子はより高分子の複合体を提供する。

図１はLuttmann 2004によるPBMCの分離のためのフィコール‐ハイパーク密度勾配遠心分離を表す。 図３はDNA mfoldにより算出された２次構造を表す。 図４は種々のdSLIMの結紮及びT7−消化を表す。 図６は種々のdSLIMのHPLC精製クロマトグラムを表す。 図７はエタノール沈殿後の種々のdSLIMを表す。 図８は種々のdSLIMの熱変性を表す。 図９は種々のdSLIMの熱変性及び再生を表す。 図１０は種々のdSLIMの熱変性及び再生を表す。 図１１は画分３と二量体分子60L1の比較を表す。 図１２は媒体中のdSLIMの培養を表す。 図１３は媒体中のODN M362の培養を表す。 図１４はFCSを用いた及び用いない媒体中でのdSLIM及びODN M362の培養を表す。 図１７はIFN-γ (a), IFN-α(b), IL-6 (c) PBMCのELISA測定結果を表す。 図２０はIFN-γ(a), IFN-α(b), IL-6 (c)のELISA測定結果の正規化された平均値を表す。 図２２はIL-8 HEK293-TLR9のELISA測定結果（異なる刺激条件）を表す。 図２４はIL-8 HEK293-TLR9のELISA測定結果（異なる刺激時間）を表す。 図２８はIL-8 HEK293-TLR9のELISA測定結果（異なるdSLIM）を表す。

本発明の好ましい実施の態様においては、オリゴマー化又は多量体集合体、すなわち、本発明の分子は、オリゴデオキシリボ核酸配列が以下の配列を含むことに特徴がある：

c) 塩基配列AACG TTCTTCGGGG CGTTを持つオリゴデオキシリボ核酸配列を含む
d) 前記オリゴデオキシリボ核酸配列は４０から１６００のヌクレオチドの長さを持つ。

本発明における多量体集合体は、これらの好ましい配列を含むが、家畜及びヒトの免疫系の活性を刺激するのに特に適している。

特に好ましい場合は、
c) に示す塩基配列は

の配列に含まれる。

驚くべきことに、上の配列が存在することにより、分子は特に高い効果を持ち、本発明の意味における効果は免疫系の活性化であると理解される。

本発明の好ましい他の実施の態様においては、分子がデオキリリボヌクレオシド残基の部分的に単鎖の、共有結合による閉じた連鎖を含むことを意図している。すなわち、それが組み込まれた標的組織の分子の活性を効果的に長引かせる要因となっている、集合したオリゴマー又は重合分子構造内におけるデオキリリボヌクレオシド残基の部分的に単鎖の、共有結合による閉じた連鎖である。

本発明の好ましい他の実施の態様においては、分子は塩基配列N¹N²CGN³N⁴を含むことを意図しており、N¹N²はGT, GG, GA, AT 又はAAの群の要素であり、N³N⁴はCT 又はTTの群の要素であり、Cはデオキシシトシン、Gはデオキシグアノシン、Aはデオキシアデノシン、及びTはデオキシチミジンである。

特に好ましい実施の態様においては、塩基配列N¹N²CGN³N⁴は、デオキリリボヌクレオシド残基の閉じた連鎖の単鎖領域にある。免疫系を刺激することにおいて高い効果的な活性を示すのは特にこれらの好ましい分子である。

本発明はまた、多くの置換基に共有結合している本発明の分子に関し、前記置換基は好ましくはペプチド、タンパク質、単糖類、抗原構造、DNA及び/又はRNA分子であるのが良い。

本発明はまた、本発明による少なくとも一つの分子及び化学療法剤を含む組合わせ剤に関する。驚くべきことに、本発明による分子による免疫系の驚異的な高い刺激効果は、本発明の剤が周知の化学療法剤と組み合わされ、その組み合わせが腫瘍に使用された場合更に向上させることができる。本発明での組合わせ剤は、またキットの形で提供することができ、そこでは本発明の剤と従来の化学療法剤は別々に準備することができる。この様に、好ましい実施の態様においては、キットの少なくとも２つの成分を同時に又は時間を違えて使用することができる。例えば、本発明の組合わせ剤の投与により、免疫系を活性化することができ、その結果その後に使用される化学療法剤が特に効果的にその効力を発揮することができる。また、明らかにまず化学療法剤を使用し、その後に本発明の分子をヒト又は動物の組織に時間を違えて投与することもできる。

特定の腫瘍には、本発明の分子及び化学療法剤を同時に投与するのが好ましい。

本発明のある好ましい実施の態様においては、化学療法剤は、抗体、アルキル化剤、プラチナ類似体（platinum analog）、挿入剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、及び/又はＬ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシカルバミド、ミトタン及び/又はアマニチンを含む群から選択される。

本発明の好ましい実施の態様においては、アルキル化剤は以下を含む群から選択される：
ナイトロジェンマスタード（nitrogen mustard）誘導体、特に、
- シクロホスファミド(cyclophosphamid),
- イホスファミド(ifosfamid),
- トロフォスファミド(trofosfamid),
- メルファラン(melphalan)及び/又は
- クロラムブシル(chlorambucil)
アルキルスルホン酸(akylsulfonate), 特に、
- ブスルファン(busulfan) 及び/又は
- トレオスルファン(treosulfan)
ニトロソウレア(nitrosourea), 特に、
- カルムスチン(carmustine),
- ロムスチン(lomustine),
- ニムスチン(nimustine),
- エストラムスチン(estramustine)及び/又は
- ストレプトゾトシン (streptozotocin)
- プロカルバジン(procarbazine) 及びダカルバジン（dacarbazine),
- テモゾロマイド(temozolomide) 及び/又は
- チオテバ(thiotepa).

アルキル化剤は特に腫瘍に高い効果を持ち、その成長を阻害する。

本発明の好ましい実施の態様においては、プラチナ類似体は
- シスプラチン(cisplatin),
- カルボプラチン(carboplatin)及び/又は
- シュウ酸プラチン(oxaliplatin)
を含む群から選択される。

本発明の他の好ましい実施の態様においては、挿入剤は以下を含む群から選択される：
アントラサイクリン(anthracycline), 特に、
- ドキソルビシン（アドリアマイシン）(doxorubicin (adriamycin)),
- ダウノルビシン(daunorubicin),
- エピルビシン(epirubicin)及び/又は
- イダルビシン(idarubicin),
- ミトキサントロン(mitoxantrone),
- アクサクリン(amsacrin) 及び/又は
- ドキシフルリジン(doxifluridine)
本発明の他の好ましい実施の態様においては、抗生物質は以下を含む群から選択される：
- ブルオマイシン(bleomycin),
- アクチノマイシンD（ダクチノマイシン）(actinomycin D (dactinomycin))及び/又は
- マイトマイシン(mitomycin)
本発明の他の好ましい実施の態様においては、有糸分裂阻害剤は以下を含む群から選択するのが有利である：
ビンカロセアのアルカロイド(alkaloide of Vinca rosea), 特に、
- 酒石酸ビノレルビン(vinorelbine),
- ビンクリスチン（オンコビン）(vincristine (oncovin)),
- ビンブラスチン(vinblastine)及び/又は
- ビンデシン(vindesine)
本発明の他の特に好ましい実施の態様においては、タキサンは以下を含む群から選択される：
- パクリタキセル(paclitaxel) 及び/又は
- ドセタキセル(docetaxel).
更に、トポイソメラーゼ阻害剤は以下を含む群から選択しても良い：
トポイソメラーゼI 阻害剤(topoisomerase-I-inhibitor), 特に、
- カンプトセシン（camptothecin）,
- トポテカン(topotecane) 及び/又は
- イリノテカン(irinotecane)及び/又は
トポイソメラーゼ II 阻害剤(topoisomerase-Il-inhibitor),特に、
- エトポシド(etoposide)
- テニポシド(teniposide).
また、本発明のある特異の実施の態様においては、代謝拮抗物質は以下を含む群から選択しても良い：
葉酸拮抗薬(floric acid antagonist), 特に、
- メトトレキサート(methotrexate),
ピリミジン類似体(pyrimidi analog), 特に、
- ５−フルオロウラシル(5-fluorouracil),
- カペシタビン(capecitabine),
- シトシンアラビノシド（シタラビン）(cytosin arabinoside (cytarabine) )及び/又は
- ゲミシタビン(gemcitabine),
プリン類似体(purin analog), 特に、
- ６−チオグアニン(6-thioguanine),
- ペントスタチン(pentostatine),
- アザチオプリン(azathioprine),
- ６−メルカプトプリン(6-mercaptopurine),
- フルダラビン(fludarabine) 及び/又は
- クラドリビン(cladribine)
本発明はまた、任意選択的に、キットの内容物を組み合わせることに関する情報と共に、本発明の分子及び化学療法剤を含むキットに関する。上で述べた様に、本発明はまた、任意選択的に薬剤として許容可能な担体と共に本発明の分子又は組み合わせ剤を含む医薬品に関する。

更に、本発明は前記分子、組み合わせ剤、又はヒト又は動物の免疫系を調節し又はその様な免疫系の活性を調節するための剤を生成するための医薬品の使用に関する。ヒト又は動物の免疫系の調節は、免疫系の、腫瘍又は癌に対する阻害効果となる免疫系に与える影響の全てを言うと理解される。免疫系の活性の調節も同義と理解することができ、又は当業者に良く知られている免疫系の活性について言うものであり、その活性は腫瘍に対するものであり、驚くべきことには、その活性は本発明の剤により強化される。より具体的には、調節は免疫系の活性又は免疫系そのものに対する刺激又は効果を増大させることを言う。この様に、好ましい実施の態様においては、本発明の剤はT細胞の媒介による免疫反応のみならず、またT細胞から独立の免疫反応を刺激するのに用いることができる。本発明の好ましい実施の態様においては、このプロセスはB細胞の増殖又はB細胞の活性化を含むこともある。

ある特に好ましい実施の態様においては、免疫系の活性を調節することにより刺激を与えることでサイトカインが分泌され、又はより高いレベルで分泌される。特に本発明の分子又は本発明の組み合わせ剤を治療又は予防ワクチンにおける補助剤として使用することが望ましい。特に効果的方法では、本発明の剤は細胞の成長異常の治療に用いることができ、ある好ましい実施の態様においては、細胞の成長異常は腫瘍疾患である。ある好ましい方法では、腫瘍疾患は以下の腫瘍を含む群から選択される疾患である、すなわち、耳鼻咽喉領域の腫瘍；内側鼻、副鼻腔、鼻咽喉、唇、口腔、中咽頭、喉頭、下喉頭、耳、唾液腺、及び傍神経節腫の腫瘍； 非小細胞性気管支癌腫、小細胞性気管支癌腫を含む肺腫瘍； 縦隔腫瘍；胃腸管腫瘍；食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、及び胆道、小腸、結腸及び直腸の腫瘍、肛門がん；腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、ペニス、及び睾丸の腫瘍を含む泌尿器性殖器腫瘍；頸部、膣、外陰、子宮癌、悪性絨毛性疾患、卵巣癌腫を含む婦人科腫瘍； 子宮管（Tuba Fallopii）の腫瘍、腹腔の腫瘍、乳癌、内分泌器官の腫瘍；甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍、脾臓内分泌部腫瘍、カルチノイド腫瘍、カルチノイド症候群、多発性内分泌腫瘍症候群、骨及び軟部組織の肉腫、甲皮腫、皮膚腫瘍を含む腫瘍；皮膚及び眼肉黒色腫を含む黒色腫；中枢神経系腫瘍；幼児期の腫瘍であって、網膜芽腫、ウイルムス（Wilms）腫瘍,神経線維腫症、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫腫瘍ファミリー、横紋筋肉腫を含む；非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性リンパ腫、ホジキン病を含むリンパ腫；急性白血病、慢性脊髄及びリンパ性白血病、形質細胞腫、脊髄異形成症状群、腫瘍随伴性症、不明な原発巣の転移（CUP症状群）、腹膜癌症；免疫抑制に関連する悪性腫瘍で、Kaposi肉腫の様なAIDS関連悪性腫瘍、AIDS関連リンパ腫、中枢神経系のAIDS関連リンパ腫、AIDS関連ホジキン病及びAIDS関連肛門性器部腫瘍、移植関連悪性腫瘍；脳転移、肺転移、肝臓転移、骨転移、胸膜転移及び心膜転移及び悪性腹水を含む転移した腫瘍。

本発明の範囲を限定することを意図したものではないが、以下に、本発明を実施例を参照しつつより詳細に説明する。

個々の方法に必要とされる装置、材料及び溶液は各方法において示される。以下の表は機器及び材料のリストを含むが、これらの装置、材料は使用されたものであり、特定の方法、及び溶液の準備に必要な化学品及び溶液を示すものではない。

使用されたODN 及びdSLIM, mfoldを用いた配列の選択
dSLIMの構造調査ためのモデル分子を生成するために使用された配列の多くはWWW (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)で利用可能なmfoldソフトウエアを用いて構築された。それは熱力学データに基づく核酸の二次構造を予測するために用いられるプログラムである（Zuker 2003）。dSLIMを合成するために用いられる、５８ヌクレオチドの長さのDNAの配列（以下ODNと呼ぶ）、は「DNA mfold」中で線状DNAとして与えられ、標準設定及び以下のパラメータ、すなわち、37℃の温度、イオン濃度150 mM Na⁺及び0.5 mM Mg²⁺、オリゴマー修正（oligomer correction）を用いた。

G構造の形成を調査するためにモデル分子のベースとしてdSLIM-30L1の配列を用いた。まず、この配列を、連続するグアニン残基が存在しない様に修飾し、一方相補領域（以下、ステム（stem）と呼ぶ）のGC比率を維持した。非相補領域配列（以下、ループ（loop）と呼ぶ）が、好ましくはWatson-Crick塩基対が出来ず、連続したグアニン残基が存在しない様に修飾された。ループの修飾の結果、この領域内にあるCGモチーフが30L1に倣って修飾された。この様に構築されたモデルODNは以下KGと呼ぶ。GL ODNは、ループにポリ（G）を持つKGに対応し、30L1に起こるものに比べると、ループCGモチーフ内に位置しない。MS ODNは開始分子30L1に対応するが、ステム（stem）に追加のグアニン残基を持つ。GS, GLS ODN及びML ODNは上記ODNのステム及びループの組み合わせを含む。夫々のCGがTGで置換されたno30L1及びnoGL分子が、CGモチーフの観測された効果の依存度を調査するためのコントロール分子として用いられた。コンカテマー化により形成される様に、dSLIM-60L1分子が「二量体」dSLIM-30L1のモデル分子として使用された。それは、２つの部分的に相補的であるが、非自己相補的であるODN (60L1forw及び 60L1 rev)より成り、ODNは、ハイブリッド後に５’張り出しを持ち、これに対応する３’張り出し及び自己相補的５’及び３’領域を持つ他のODN(30L1 -AGGG)を結紮することができる。上の３つのODNのループ配列は30L1の配列に対応する。

HPLC中で連続するNaCl勾配による分離法を用いて、大量のdSLIM-30L1を分離することより得られるdSLIM-30L1の画分はMelanie Rothe (Mologen AG)により提供された。

この作業で使用されるODNは、５’末端がリン酸化され（例外：M362, 2006)、HLCで精製後３ｇ/lの濃度で水に溶解されたものであり、TIB-Molbiol (Berlin)より購入した。

その４つのH架橋結合部位の配向より、グアニンはグアニンーグアニン塩基対により８つのH架橋を持つ環式塩基４つ組み（Gカルテット）を形成することができる。したがって、多くの連続するグアニン ヌクレオチドを含むDNA配列は、４量体らせん形構造を形成することができ、そこではグアニン塩基は特定のスタッキング相互作用（stacking interation)を示す高レベルの平面性を示す。配列中のグアニン ヌクレオチドの位置、数及び分布により、種々のG構造の形成が可能であり、それは次の３つのグループに分類することができる：
G2'-DNA（２分子 平行又は逆平行四量体）, G4’-DNA(単分子逆平行四量体)又はG4-DNA（四分子 平行四量体）。G4-DNAは自己集合性ナノ構造、いわゆるG ワイアー（wire）を形成することができる。利用可能なグアニン残基の数、その配置及び取り囲むWatson-Crick塩基対を別として、G構造の形成及び時には非常に高い安定性は、温度、DNA濃度及び種々のカチオン（例えば、Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺の存在）に依存する。例えば、G4構造は短鎖重合体、免疫グロブリン スイッチ部位及びHIV DNAに見出された（Sen 1992, Marsh 1994,1995）。

次に、種々のループ及びステム配列の組み合わせを含む種々の単量体及び多量体分子が生成された。長い、短いモチーフ又はポリ（G）モチーフを持たない３つのループ及び３つのステム配列が各回用いられ、G構造を形成する能力に影響を与えた。安定したG構造は４つの連続するグアニン塩基のみを持つ短いODN（１２マー）中で適当な条件で形成することができる。長いODN中では長いモチーフが必要となる。その理由は安定的なG構造を形成する可能性は、全体の配列に貢献するグアニン塩基の比率に関連することが確かであるからである（Sen 1992）。

更に長いポリ（G）を持つ分子は多量体分子をより形成することを示す。また、これらの分子の溶出特性は、長いポリ（G）モチーフを持たないものとは、２つのピークが現れる点で異なり、高い溶出容量のピークはアガロースゲルの上部領域に見られるDNA分布に相当する。最も際立った変化がGL、すなわち、そのポリ（G）モチーフがループに局在している分子において観察された。ここで２つの明確に別々のピークが溶出プロフィールにおいて区別され、より高い溶出容量のピークはより低い溶出容量のそれよりも強いものであった。GLでは、単量体バンドの上のゲル中に分散したDNAの量は比較的多量であり、その分布はゲルのポケットにまで拡がっていた。これらの観察により比較的多量のDNAが多量体に存在すると結論することができる。HPLC溶出プロフィール中のピークの分布及びアガロースゲル電気泳動によるDNAの分布は、ステム(GS, MS)中のポリ（G）モチーフを含む構築体中のものと同様であった。これらは溶出プロフィール中のより高い溶出容量で小さな第二のピークを示し、アガロースゲル中の単量体バンドより上で弱く見える、DNAの均質の分布を示す。ピークパターン（HPLC）及びで分布（アガロースゲル）について言うと、ループ及びステム（GLS）中にポリ（G）モチーフを持つ分子について観察されたHPLC及びアガロースゲルでの移行挙動はGL及びGS及びMSのそれの間であった。同じ高さの２つの別々のピークが溶出プロフィールで観察され、そしてゲルの上部領域でのDNA分布の量はステム（GS及びMS）中にポリ（G）モチーフを持つ分子よりも幾らか高く、GLよりも低かった。したがって、多量体分子の形成は、GLの場合と同様に、ポリ（G）モチーフがループにある場合に特に有利である。この理由はWatson-Crick塩基対の形成と短鎖ループのG構造の形成間に競合が起きないためである。この前提条件はまたGLS分子中でも適用された。しかし、この場合には相互反応の可能なパートナーとしてのポリ（G）モチーフがステム及びループの両方に存在する。そのため、分子間の、したがって濃度と関係なく大きく進行する、分子内G2構造の形成が可能である。その結果、これらはG構造の分子間形成に対する競合となり、GLSではより高分子量体の形成がGLに比べて低減する。この場合ポリ（G)モチーフはGLのそれより長いが、ステム中にポリ（G）を持つ分子において、より分子量の大きい複合体を形成する傾向が極めて低いことが観察された。

開始材料が同じ量である場合、上に記載の特徴は、GLSの様にステム及びループにポリ（G)モチーフを持つ単量体分子30L1では観察されなかった。この理由は恐らく、一方ではこの分子中のポリ（G）モチーフは多量体分子中のそれよりも短いためであろう。他方、「DNA mfold」から予測される構造はループ中にWatson-Crick塩基対を形成する傾向がより高いことを示し、そのためG構造の形成の可能性が更に低減される。しかし、長いポリ（G)モチーフを持つ多量体分子の様にHPLCの分離手段により多量の３０L1から得られたF4画分はまた、上に記載の、ゲルの上部領域での拡散したDNA分布及びポリアルキルアミドゲル電気泳動においてゲルポケット中にDNが残っていることを示す（説明図３．１．９を参照）。明らかにG構造のより分子量の大きい複合体の割合は、３０L1では低いためその検出はより多量の開始材料を用いた場合のみ可能である。

対照的に、ポケット中のDNA割合は、ループにポリ（G）モチーフを持つGL及びGLSでは完全には消失せず、規則的な、追加のバンドパターンを認めることが可能である。これは恐らく、二量体又は三量体又は分解されないDNAが集合体に残っているためであり、これらは変性により集合体から分解されそしてグアニンーグアニン相互作用によりお互いに未だ結合しているためである。

実験での特性では、長いポリ（G）モチーフを持つ多量体分子は事実G構造により形成されることを示す。上部ゲル領域での均質なDNA分布の出現は別として、その特性にはポリアクリルアミドゲル中のGL及びGLSで観察される様に、変性後の規則的バンドが見られることを含む。

３０LIから分離されたゲルの上部３分の１におけるバンドと対照的に、KG及びMLで観察されるバンドは変性後は最早認められなかった（説明図３．１．６を参照）。したがって、これらのバンドは２つの単量体分子の間の塩基対相互作用により形成される二量体であり、その結果容易に熱変性により分離され得る。これらがKG及びML中で好んで現出する理由は、２つの分子の相互作用に都合の良い共通のループ配列によると思われる。

大量の３０L１分子のHPLC分画により、ゲル中で高度に異なる移行挙動を示す４つの画分を得た。個々の画分を濃縮することによりそれらを別々の溶液に分離し、ゲル中でそれまで認識不可能であった多くのバンドが認識されるようになった。第一の画分の移行挙動は観察された２つの単量体構造に対応し、第二の画分の移行挙動は両方の構造の連続する混合物に対応し、そこではオープン構造がこの画分の変性後にその多くの部分を占め、第三の画分の移行挙動は主に上に記載の二量体分子に対応する。第四の画分では、DNAが明らかにゲルポケットに残っているのが見られるが、その移行挙動はMSに類似していた。

水中で観察されたゲル中の移行距離に比べて、細胞培養媒体中の３０L1の二量体に相当するバンド及び３０L1の第３画分のバンドの移動は驚くべきものであった。クーマシー染色ゲルとの比較で分かる様に媒体中の対応するバンドは低タンパク質バンドと同じレベルであった。したがって、バンドの移動は二量体分子のタンパク質への結合により起きるものと考えることができる。

単量体構造に対応するバンドの移行挙動は媒体を追加することでは殆んど変わらず、GLにおいて初めてオープン構造に対応するバンドが増加するのが観察された。３７℃で５時間培養した後、事前に観察された２つのバンドの間のDNAの拡散した分布がKG及び３０L1で見られ、オープン構造に対応するバンドの強度はKGでは低減していた。選択された条件では、オープン構造は水性溶液に比べて僅かに好ましい結果であった。媒体中で２７時間培養後に、ML及びGLの観察されたDNA強度は大きく低減しており、またKGに於いてさえ、強度が低減している低位バンドにおいて初めて見ることができ、一方３０L1では強度が僅かに減少していた。その唯一の説明は、オープン構造は、二重鎖構造よりも容易に分解されるということであろう。

種々の単量体及び多量体分子の免疫刺激効果が、これらの分子により刺激した後のヒトの献血のPBMCの浮遊物中のIFN-γ, IFN-α及びIL-6の濃度を決定することにより調査された。

ヒトの献血のPBMCを用いて分子の活性を決定するのに用いられるテスト方法は高度に複雑なシステムであり、異なる細胞が相互作用及び/又はサイトカイン分泌によりお互いに影響し合うため、観察された反応が特定の細胞種又は反応経路によるものであるとすることは殆んど不可能である。更に、個々の提供者の提供物の間に大きなばらつきがあり、より多くの独立したテストが必要となる。このテスト方法の有利な点は、十分確立された全てのインビトロシステムの中でインビボ状態に最も近いということである。

テストの結果は、またIL-8/CXCL8が細胞ストレス誘発因子に反応して分泌されるため、用いられる細胞活性の検出は細胞培養条件により比較的強く影響を受けることを示す。特にこれは刺激を与える前に媒体が取替えられず（説明図３．３．１参照）及び非刺激細胞中に於いてさえ高い濃度のIL- 8/CXCL8の検出される場合の細胞について得られた結果より明らかである。非刺激細胞中で測定されたケモカイン濃度と刺激を受けた細胞中で測定されたケモカイン濃度の比率は１．３であり、これは媒体が取替えられた場合の細胞に比べて非常に低い。後者の比率は２．３であった。したがって、可能な限りの意味ある情報を得るためには、このテストでは細胞ストレスの殆どない条件で培養することが特に重要である。恐らく、細胞ストレスが、播種２４時間後に刺激された細胞より得られた結果が、集合（confkuence）して成長させた細胞から得られた結果ほど明りょうでない理由であろう。細胞の移植及びそれと関連する細胞培養技術は高度の細胞ストレスを産み出す。

刺激時間の依存に関係するテストで観察された様に（説明図３．３．２参照）刺激された細胞と刺激されていない細胞の間の分泌ケモカインの量の差は６時間後に初めて検出することができた。IL-8/CXCL8の量は６から２４時間の間で増加したが、２４時間から４８時間の間では観察された増加量は僅かであった。

テストで使用された分子の活性が２つのテストで調査され、使用された個々の分子間の差が観察された（説明図３．３．３）。

テスト中のIL-8/CXCL8の最大分泌はGLによる刺激により誘発されたもので、これはODN 2006による誘発より幾らか高いものであった。KG 及び30L1による刺激に続き測定されたIL-8/CXCL8の量は幾らか低く、KGは30L1に比べ幾らか高い活性を示した。これらの異なる単量体及び多量体分子の活性の観察された差は、観察された構造の違いによるものであろう。したがって、KG及びGLは、30L1と比べてCGモチーフを持つループ領域がオープン構造を持つ傾向があることを示すと思われ、そのためその単鎖形が好ましい。表面プラズモン共鳴法によりRutz他によって示される様に、単鎖DNAは二重鎖DNAよりもより高い親和性をもってTLR9に結合し（Rutz 2004）、それがKG及びGLが30L1 に比べて幾らか高い活性を持つ理由であると思われる。しかし、CGモチーフは30L1及びKG/GLにおいてさえ異なり、そのため活性が異なるのはまた異なるCGモチーフの受容体に対する親和性が異なるためと思われる。

集合体を形成する可能性の最も高い分子であるGLは、両方のテストで試験された分子中で最も高い活性を示したが、それは恐らくより高分子量複合体による受容体の架橋がより強いことによると思われる。しかし、PBMCによる試験ではGLの活性が向上した事実は観察されなかった。他方、PBMCのより複雑なシステムに存在する他のパターン認識受容体がそこで観察される単量体及び多量体分子の免疫調節性活性に関係している可能性があり、それが分子の他の構造の特徴を認識するものである。この様に、例えば、認識はTLR8又はTLR7の様な他の核酸特異な受容体により進行し、それにより共同作業又は調節効果を作り出すことが可能となるであろう。

結論として、特に単量体分子中のループに、ポリ（G)モチーフが存在することは多量体を形成するのに有利である。更にこれらの複合体は熱変性に対して高い安定性を持つ。

種々の構築体の免疫調節性の違いを同定するために、これらの構築体がPBMC
による刺激試験で用いられた。

結果は多量体分子は特に高い活性を持つことを示す。

DNA濃度の決定
ODN及び単量体DNA分子の濃度が260 nm (A₂₆₀)での吸光度の測定により決定された。260 nmで吸光を起すのは核酸塩基の芳香族環であり、個々の塩基は異なるモル吸収係数εを持つ(A>G>T>C)。発色団―発色団（Chromophor-Chromophor）相互作用の結果、二重鎖核酸は単鎖核酸よりも吸収が低い（淡色効果）。

濃度を決定するために、決定されるDNA溶液の対応容量がまずエッペンドルフ容器で最終容量が300 μL(ODN 1 :200, dSLIM 1 :100)になるよう、TE緩衝液で希釈された。DNA溶液は次に石英キュベットに移され、260 nmでの吸光度がTE緩衝液に対し光度計で測定された。濃度は測定された吸光度から次の等式により計算された：
c (μg/mL) = A₂₆o x 希釈係数 x 変換係数
変換係数は概算値であり、二重鎖DNAで50 μg/ml及び単鎖DNAで33 μg/ml と概算される。ODN及び単量体DNA分子中の二重鎖領域の割合より、50 μg/mlの標準変換係数が使用される。別々の希釈液により各々について、二度に亙り測定し、その平均値を算出した。

単量体DNA分子の生成
単量体DNA分子を生成するために、細菌による汚染を防ぐため殺菌した（使い捨ての）材料及び新しい緩衝液又は−２０℃で保存したろ過殺菌された緩衝液が使用された。その理由は少量の内毒素があっても刺激の結果は誤ったものとなり得るからである。

単量体DNA分子の生成の第一ステップは、２つのODNをT4 DNAリガーゼを用いて結紮することである。 T4 DNAリガーゼは、平滑末端又は付着端を持つ二重鎖DNA又はRNA中の５’―リン酸及び３−OH末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。さらに、二重鎖DNA, RNA又はDNA−RNA ハイブリッド中の単鎖切断を修復することができる。

２つのODNの結紮は１つのODNの５’リン酸張出し及び他のODNの３’末端の間で進行し、それにより環状分子を形成する。この反応から同様に本発明の多量体DNA分子が生成される。

分子を生成するためのODNの開始時の量は５００から１０００μgであった。結紮にはODNが1 xリガーゼ緩衝液中0.55 g/ｌ濃度で使用された。そのために、水洗浄剤及び相当する量の１０ｘリガーゼ緩衝液により希釈された。完全に混合した後、0.01 U/μg DNA の割合となる様にT4 DNAリガーゼが加えられた。結紮バッチは水浴中37°C で15-24時間培養された。

結紮されていないODNを分解するためにT7による消化が行われた。T7 DNAポリメラーゼは、５’−３’方向のDNA合成を触媒するばかりか、また単鎖及び二重鎖DNAで３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を持つテンプレート依存（template dependent） DNAポリメラーゼであり、したがって、結紮されていないODNの分解に適している。

結紮が旨く行われたか否かはT７消化の前に検査された。そのため各0.3 μgのODN、結紮バッチ及び試験用T７消化剤が３％アガロースゲル上で分離された（２．４．１を参照）。試験用T７消化剤として、余剰T7 DNAポリメラーゼが10 U/1 ,1 μg DNAの比率で２１μLの容量で用いられた。反応は37℃で１時間進行し、７０℃まで１０分加熱して終了させた。

T7消化のため、結紮バッチは水洗浄液及び相当量の１０ｘリガーゼにより希釈され、DNAが１ｘリガーゼ緩衝液中0,3 g/ｌの濃度となる様にした。

0.03 U/μg DNAの比率となるに必要なT7DNAポリメラーゼ量が加えられた。バッチは水浴中３７℃で１５から２４時間培養された。反応が旨く進行したか否かの検査は、0.3 μg結紮バッチを、0.3 μg及び0.9 μgのT7消化バッチとともに3%アガロースゲル上で分離して行った。

本発明による分子の精製
精製は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行った。この方法の原理は多孔質母材（固定相）中のプラスの荷電群の存在をベースにし、それはｐH2以上のマイナスに荷電した核酸のリン酸基と相互反応し、そしてリン酸基は固定相と結合する。

相互作用の強さはｐHの値、移動相のイオン力及び分子に存在する負荷電に依存する。非荷電分子は、固定相に反応せず又は弱い相互反応のみしか起さず、そして低イオン力の移動相により急速に溶出する。移動相のイオン力を増すことにより、固定相に結合した分子はカラムから除かれる。固定相とのより強い相互反応の結果、より大きい核酸はより小さいものよりも溶出が遅くなる（Lottspeich 1998, Muelhardt 2003）。

ジメチルアミノエチル基を持つポリマー樹脂であるフラクトゲル（fractogel）‐DMAEが精製時の固定相として使用された。段階的勾配(0%, 50%, 100% 1 M NaCl)のNaClが分離のために用いられた。

精製を開始する前に、不使用時には２０％エタノールで満たされているHPLC装置の全ての出口及び入口はまず水洗浄剤により洗浄され、そしてカラムが満たされた。そのために1.6-1.8 mlのDMAEがカラムに容れられ、口まで水で満たされ、そして均一に分布させるためカラムが揺すられた。つぎに、カラムは空気の泡を含まない状態でHPLC装置に接続された。カラムはカラムの材料が完全に落着くまで1 mｌ/分の流量で洗浄された。上部ピストンが空気の泡を含まない状態でマトリクス上にネジ込まれ、過剰の水がカラムから排出された。カラムはHPLC装置に再び接続され、1 mｌ/分の流量で洗浄され、そして恐らく発生するであろうマトリクスとピストンの間のデッドスペースが最終ステップを繰り返すことにより除去された。全体のHPLC装置及びこの様に詰められたカラムは、続いて1 ml/分の流量のT20緩衝液により平衡状態にされた。カラムの平衡状態は約１０倍のカラムマトリクス容量を用いて実行され、ｐH指示薬片を用いて確認された。バッチはハミルトン針を用いて２ｍｌテストループによりHPLC装置に注入された。HPLC装置は自動分画を行うようにデザインされたソフトウエアプロトコールによりコントロールされた。しかし、あるケースでは、発生した副次的ピークは手動で分画された。サンプルを使用する前にカラムはカラムの２倍の容量（CV）で平衡にされ、そして非結合分子（タンパク質、ヌクレオチド）の溶出が５CVの T20緩衝液により実施され、続いて弱く結合している分子（ATP, ODN）が7 CVの50% T20N1000 緩衝液で溶出され、及びdSLIMが7 CV の100% T20N1000緩衝液により溶出された。流量は１ml/分であった。その後、カラムは次のサンプルを使用するため、10 CV のT20緩衝液で再平衡状態にされ、HPLC装置の出口及び入口が手動によりT20緩衝液で洗浄された。

HPLC精製分子はエタノール沈殿により濃縮され、脱塩された。一価の陽イオンの存在下で、アルコール中の核酸は不溶沈殿物を形成し、遠心分離により分離することができる。共沈殿塩は、核酸と異なりその中で可溶であるため、７０％エタノールで洗浄により大部分を除去することができる。余り沈殿しない少量の核酸の沈殿を増大させるため、低温で沈殿を実施し、及び/又はMg²⁺-イオンを加えることが可能である。その後の使用に支障がないのであれば、tRNA又はグリコーゲンの様なキャリアー材料も加えることができ、それにより核酸濃度を効果的な濃縮度に増大させることができる（Lottspeich 1998, Muelhardt 2003）。

沈殿のため、HPLC精製された各画分がCorex遠心分離用ガラス容器に移され、1/100 容量の1 M MgCI₂、1/10容量の3 M 酢酸ナトリウム及び2．5容量の96% エタノールが加えられた。バッチは混合され、2-24時間20℃で沈殿させた。続いてバッチは10.000 rpm (11.000 g)及び４℃で３０分遠心分離され、浮遊物が除去され、5 ml 70% エタノールで洗浄され、そして更に10-30分間 10.000rpm(11.000 g)及び4°Cで遠心分離された。浮遊物が除去され、DNAペレットはアルコール臭が消えるまで空気乾燥された。DNAは100-350 μlの水洗浄剤中で採取され1.5 mlの無菌反応槽に移された。

再懸濁のための容量は、収率５０％の１ｇ/ｌ濃度が得られる様に、生成のために使用されるDNAの量を参照して概算された。

アガロースゲル電気泳動法
核酸の分離及び特性決定のためには電気泳動法が好適な手段である。核酸は広範囲のｐHに亙り負に荷電しており、アガロース又はポリアクリルアミドのマトリクス中の電場におかれ、そして陽極に移動する。その移動速度はそのサイズにより種々変わる。ゲル電気泳動中の核酸（約１０ｋｂまで）の挙動は２つの理論を用いて記述することができる。

オグストロン遮蔽効果（Ogstron screening effect）は、核酸は球形をしており、粒子の円周が大きいほどゲルマトリクスとより頻繁に衝突するとの仮定に基づいており、そのためより大きい分子は小さい分子よりもより大きく速度を落とす。この理論に依ると、その直径がゲルの孔径よりも大きい分子はゲルを通して移動することはないと考える。レプテーション理論では、核酸はゲル中でその球形を失い、ゲル中を蛇の様に一方の端を先頭にして動き、その移動は長い分子は短い分子よりも時間を要する。核酸の移動速度に与えるサイズの影響から、二次構造の形成はゲル中の移行挙動に影響を与える。この様に、例えば、プラスミドDNAの移行挙動はその構造により異なる。移動速度はオープン（形式I）から線状（形式III）、超ラセン（形式II）を経て、変性（コイル状）プラスミドDNAへと増加する。線状二重鎖DNA（形式III）では、ログ（log₁₀）長さ(bp)とゲル中の相対的移動距離の間に広い範囲に亙り相関関係があり、そのため長さ標準に基づいて比較的正確なサイズの決定が可能である。

ゲル中の核酸の検出は、その平面構造のためDNA中にインターカレートした臭化エチジウムを用いて実施することができ、UV領域（２５４−３６６nm）の光で蛍光励起が可能であり、その放射はオレンジー赤領域（５９０nm）で観測される（Lottspeich 1998）。

アガロースは海草から得られる多糖類であり、冷却後の水溶液中で比較的大きな孔を持つゲルを形成する(1% (w/v)約150 nm)。孔のサイズはアガロース濃度に逆比例する。アガロースゲルは0.1から25 kbの長さの核酸の分離に適している。アガロースゲルの優位な点はその比較的大きい分離範囲を持ち且つ取り扱いが容易なことである。しかし、小さいDNA断片の分解は非常に遅い。比較的小さなDNA断片の分離に適しているのは、アガロースから誘導された形の篩アガロース（Sieve Agarose）である（Lottspeich 1998, Muehlhardt 2003）。

本発明のODN及び分子を分離するために、0,125 μg/mL臭化エチジウムを含む1 x TAE緩衝液中の３％アガロースゲルが用いられた。BioRadシステムを用いて水平ゲルが鋳造された（８ポケットを持つ小さいゲル４０ml、２０ポケットを持つ大きなゲル１００ｍｌ）。解析されるサンプルは、適した長さ標準と共に１ｘテスト緩衝液(2.4.3参照)中で使用された。電気泳動法が1 x TAE緩衝液中で120 Vで30分実施された。ゲルはゲル記録装置を用いて写真に記録された。

天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）
ポリアクリルアミドゲルは架橋剤N,N^'-メチレンビスアクリルアミド（methylenbisacrylamid）を用いて アクリルアミド モノマーのフリーラジカル共重合により形成される。ゲルの孔のサイズは約3-6 nmの範囲であり、全アクリルアミド濃度(% T = m_acryiamde + m_bisacryiamid (w/v))及び架橋の程度(% C = m_bisacryiamid / m_Acrylamide ⁺ m_{bisacryiamide})に依存する。

そのサイズはCが定数でTが増大するにつれ減少し、Tが定数でCが５％で最小になる。ポリアクリルアミドゲルは、特に小さいDNA断片(< 1 kb)に対して非常に良い分解能を持つ。しかし、分離範囲はアガロースゲルに比べて実質的により狭い。分離範囲は勾配ゲルを用いることで広くすることができる。ポリアクリルアミドゲルの優れた分解能は異なるDNA構造を区別し得、そのDNA構造は、その異なる形のため温度及びイオン濃度により影響され得ることのある異なる移行挙動を示す。

8% T_、 2,6 % Cのゲルは分子の分離対し、１ｘTBE中の12% T, 5% CゲルはODNの分離に最適であることが分かった。水平ゲル（horizontal gel）は電気泳動(15 ml/ゲル_（小）, 25 ml/ゲル_（大）)の前日に鋳造され、冷蔵庫に一夜保存された。サンプルを使用する前に、ゲルに対し、電流の変化(10-11 mA)が最早観察されなくなるまで７０V(170 V_（大）)で事前電気泳動が実施された。サンプルは、染料を加えることなく適当な長さ標準（２．４．３を参照）と共に１ｘ試験緩衝液中で用いられた。電気泳動の進行をモニターするために、１ｘ負荷染料（loading dye）が別のレーンで使用された。電気泳動は定電圧７０V(170 V_（大）) (≒ 9 V/cm)及び室温で１ｘTBE中で実施され、ブロモフェノール ブルーがゲルの底に到達した後直ぐに終了させた（約２時間）。電気泳動の後にゲルは臭化エチジウム溶液中で１０−１５分染色され、そしてゲル文書化装置を用いて撮影された。背景が過度に染色されている場合、ゲルは脱イオン水で１０−３０分洗浄された。

バンド割り当てのための熱変性及び再生
単量体DNA分子は円形DNA分子であり、プラスミドDNAの様にゲル中で複雑な移行挙動を示すため、ゲル中で観察されるバンドを特定の構造又はサイズに割り当てることは容易ではない。異なるサイズの分子と対照的に、異なる構造は好適な条件では相互に可逆でありうるという事実は区別するのに用いることができる。

異なる構造は圧縮の程度が異なることを示し、したがって、ゲル中で異なる移行挙動により判別され、圧縮された形のDNAはしばしばより容量の大きい開かれた形のDNAに比べてゲル中でより高い移動性を示す。圧縮された形は、水素結合を壊すことにより開かれた形に転換される。

ポリアクリルアミドゲルで観察されるバンドを割当てるため、分子は９５℃までに１０分加熱して熱変性させた。変性されたサンプルは再生を防ぐために直ちに氷上で冷却された。このため各dSLIM分子を１ｘTE緩衝液中に0.05 g/L濃度で含むマスターミックス（mastermix）が生成された。バッチは半分に分けられ、１のバッチは加熱され、他の１のバッチは室温で置かれた。ゲル上で用いられるサンプルは両方のバッチから採られ、５ｘサンプル緩衝液の相当量が加えられ、８％天然ポリアクリルアミドゲル上で分離された。再生を観察するために残りの変性されたバッチが再度分けられ、その後３日間４℃及び３７℃で各々培養された。残りの、変性されていないバッチは４℃で保存され同様に３日後に分けられ、その一の部分は上に記載の様に変性され、他の部分は室温で置かれた。バッチは５ｘサンプル緩衝液の相当量が加えられ、８％天然ポリアクリルアミドゲル上で分離された。

細胞培養媒体での培養
分子の活性はPBMC及びHEK293細胞を用いてインビトロでテストされた。分子は緩衝液よりもむしろタンパク質を含む細胞培養媒体で溶解され、３７℃で培養された。その意図するところは、これらの修飾されたパラメータの分子及びODNの構造及び安定性に対する影響を調査することにある。

DNA分子の活性に種々の形で影響を与える一つの重要な要素は、タンパク質に対する非特異結合である。タンパク質に対する結合は非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（天然PAGE）中のDNAの移行挙動を変えるため、タンパク質が存在する中ではDNAバンドのシフトが認められ得る。殆どの場合DNA―タンパク質複合体の電気泳動的移動はDNAに比べて減少し、DNA小円では、タンパク質結合により圧縮の程度が増加すると電気泳動的移動もまた増加することもある（Toulme 1995）。

刺激テストで用いられた分子及びODNの刺激テストで起きる条件下での挙動を検討するために、ODN及び分子の溶液が媒体中で1 μMの濃度に希釈され、暖房具で５時間又は２４時間３７℃で培養され、又は５ｘサンプル緩衝液の適当な量を加えて、ポリアクリルアミドゲル上で直接分離された。H₂O中で同様に希釈されたODN及び分子溶液が比較のため用いられた。観察された変化はタンパク質の存在により引起されたことを確認するため、本発明のODN及び分子を含むバッチは、FCSが加えられていない媒体中で1 μM濃度に希釈された。ゲル中のDNA及びタンパク質バンドの移行距離を比較しタンパク質結合があり得ることを結論付けするために、DNAのみならずタンパク質の検出がゲル中でなされた。

タンパク質を追加的に検出することは、核酸の検出に続いて行われた。ゲルは定着液中で３０分定着処理され、続いてクーマシー溶液（Coomassie solution）中で３０−６０分染色された。過剰の染料は脱染料液中で一夜培養により除去され、ゲルはゲル記録装置により写真撮影された。

使用されたDNA長さ標準
長さ標準として、供給者により推奨された量/ｍｍポケット幅が、毎回１ｘサンプル緩衝液中で使用された。使用された標準は以下の通りである：
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas)
GeneRuler 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas)
10 bp DNA Ladder (Invitrogen)
25 bp DNA Ladder (Invitrogen)
細胞培養
細胞培養の操作は全て、無菌ディスポ‐ザブル材料を用いて無菌条件下で実施された。

培養器中の条件は、37°C, 5 % CO₂,湿度90%であった。

PBMC中の分子の免疫調節効果の調査
多量体分子の免疫調節効果の調査のために、ELISAを用いてヒトの献血から採取されたリンパ球及び単球のサイトカイン分泌が測定された。

リンパ球及び単球、また抹消血単核球 (PBMC) =抹消血の単核球細胞画分とも呼ばれる、の単離のための開始材料は白血球濃縮物であり、また軟膜（buffy coat）とも呼ばれるが、全血を遠心分離することにより得られ、DRK-Blutspendedienst Berlin Wannseeから購入された。フィコール−ハイパーク（Ficoll- Hypaque）密度勾配遠心法により、PBMCは白血球濃縮物（プラズマ、血小板、赤血球、顆粒球）の他の成分から分離することができる。フィコール−ハイパーク分離媒体はFicoll 400の混合物を含む溶液であり、サッカロース モノマーの強く分枝したポリマーであり、エピクロロヒドリン及びジアトリゾエート ナトリウム（sodium diatrizoate）（Hypaque）により架橋され密度が1.077 g/mLである。その最上部に希釈白血球濃縮物の層を持つ分離媒体を等密度遠心することにより、異なる成分を異なる密度に応じて分離することが可能であり、それによって説明図２．５．１に示す画分を得る(Luttmann 2004)。

PBMCを単離するために、各白血球濃縮物は無菌の250 mLの瓶に移されPBSにより1:2に希釈された。15 mL フィコール−ハイパーク溶液が毎回４つの50 mL遠心分離管に入れられ、注意深く約30 mLの血液―PBSの混合物が１０ｍｌピペットを用いて上部層に入れられ、停止することなく８００ｇで２０分間遠心分離された（全時間約５０分）。PBMCを含む境界層は注意深く５ｍｌピペットで吸い出され２０ｍｌの冷却されたPBSと共に５０ｍｌの遠心分離管に移された。赤血球、フィコール−ハイパーク及び血小板の汚染物を除去するため、細胞は次に多数回洗浄された。PBMCの単離がなされるまでの全てのステップは、血小板が凝固しないように室温で実施され、洗浄ステップは、使用されたプラスチック材料に単球が付着し、そしてそれにより失われないように４℃で実施された。第一の洗浄ステップでは細胞は４℃で８分間、４００ｇで遠心分離された。浮遊物は吸い出されそして細胞ペレットは５ｍｌの冷却されたPBSに再懸濁され、冷却されたPBSにより４５ｍｌまで充填された。続く洗浄ステップが同様方法で実施されたが、遠心分離は３００ｇで５分実施された。洗浄ステップは、浮遊物がなくなり、ペレットが黄色になるまで繰り返された（５−６度）。細胞は次に５ｍｌの冷却媒体中でその都度再懸濁され、一緒にされ、そして冷却媒体で満たされ容量が３０mlにされた。細胞数は8 μmの排除サイズで自動細胞計測器を用いて測定され、そして冷却媒体を用いて4 x 10⁶ 細胞/mLの濃度に調製された。

事前に単離された600 μlの4 x 10⁶ 細胞/mL濃度のPBMCが各２４ウエル細胞培養プレートに置かれた。その後、テストされる対応容量の分子が加えられバッチの濃度は1 μMとされた。細胞は培養器で２日間（４２−４８時間）培養された。

細胞浮遊物がEppendorf反応容器に移されBiofuge中で３０００ｒｐｍで４分間遠心分離された。この様にして得られた、細胞を含まない浮遊物は新しい反応容器に移され、そしてELISAによりサイトカイン濃度を決定するために直接使用されるか、−７０℃で保存された。

HEK293細胞の培養
細胞は162 cm²細胞培養瓶で培養された。これらの細胞は1.3-1.9 x 10⁵ 細胞/cm²
の密度で播種された。培養器での２−３日の培養に続いて細胞は１：３に分けられた。このために、媒体が吸い出され、細胞は１０ｍlPBSで洗浄され、そして続いて室温で３−５分間培養され、その後5 mLトリプシン/ EDTA溶液によって分離された。反応は５ｍｌの媒体を加えて終了させた。細胞は再懸濁され、更に５ｍｌ媒体が加えられた。５ｍｌの細胞懸濁液は各回、細胞培養瓶に保存されるか、又は新しい瓶に移され、そして４５ｍｌの媒体が加えられた。時々、媒体が吸い出される前に、瓶の底から幾らかの細胞が分離された。この場合細胞は無菌遠心分離管に移され、３００ｇで４分間遠心分離された。その後、媒体は吸い出され、細胞は5 mLトリプシン/ EDTA溶液中で再懸濁され、そして１０ｍｌの媒体が加えられ、上に記載した様に新しい細胞培養瓶に移された。

HEK293細胞の刺激
テストを実施するために、HEK293-TLR9及びHEK293ヌル細胞が0.6-1 x 10⁶ 細胞/mｌ濃度で各回２４ウエル細胞培養プレートに400 μLの容量で播種され、１−５日培養された。細胞数が8 μmの排除サイズで細胞計測器を用いて決定され、適当な濃度に調整された。長期の培養では媒体は４８時間後に取替えられた。このため、媒体は注意深く吸い出され、そして各回400 μlの新しい媒体が注意深く細胞に追加された。また、あるバッチでは、媒体は刺激物を加える直前に取替えられた。最終濃度が各々2.5 μM 及び1 μMになる様に適当な容量のODN/分子を加えることにより刺激を与えた。LPSが0.5 μg/mlの濃度で用いられた。その後細胞は培養器中で種々異なる時間（６−４８時間）培養された。最終的に、媒体は１．５ｍｌ反応容器に移され、恐らく含まれているであろう細胞をペレット化するためにBiofugeで1400rpmで遠心分離され、そして浮遊物はELISAによりIL-8濃度を決定するために使用された。

ELISAによるサイトカイン/ケモカインの検出
PBMC 上のdSLIMの免疫調節効果を調べるためにIL-6, IFN-α及びIFN-γの誘発（induction）が測定された。

IL-6は種々の活性化されたリンパ球及び単球により分泌される多機能サイトカインであり、肝細胞の急性期タンパク質を誘発することは別として、リンパ球の成長、分化、及び食作用を増進する効果を持つ（Kirchner 1994）。

IFN-αは、幾つかのサブタイプを持ち、主に抗ウイルス効果を持つタイプIインターフェロンのファミリーに関する。大量のIFNがTLR7, 8又は9の活性化に続くpDC により分泌される（Perry 2005）。 また1.3.2項を参照。

IFN-γは顕著にNK及びT細胞により分泌されるが、また単球、樹脂状細胞及びB細胞により分泌される。これは唯一のタイプIIのインターフェロンであり、タイプIインターフェロンと対照的に抗ウイルス効果よりも免疫調節効果を持つ。その分化での役割は別として、IFN-γはT_H1に向けられた免疫反応を示す最も重要なエフェクターサイトカインである。

IL8/CXCL8の分泌は形質転換されたHEK293細胞中のTLR9の活性を検出するために用いられた。IL-8は白血球のみならず、また線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞により分泌されるCXCケモカインである。IL8/CXCL8の誘発は、例えば、IL-1 及びTNF-γによるばかりでなく、またPRR及び低酸素状態の様な環境要素によっても進む。

IL8/CXCL8の発現はNF-α 及びAP- 1の共同活性化による転写の制御によりそしてmRNAの安定化のレベルで制御される。好中球の活性剤としての効果は別として、IL8/CXCL8は種々の白血球に走化性効果を持ち組織中での白血球の移動プロセスに関与する（Mukaida 2003）。

PBMC及びHEK293細胞の細胞培養浮遊物中のサイトカインを検出するために、酵素リンク免疫吸着法(ELISA)がSandwich-ELISAの形で用いられた。これは検出されるタンパク質に特異の抗体が吸着によりマイクロタイタープレートの表面に固定される数量免疫アッセイである。抗原を各抗体に結合させることは同様に前者を固定させ、そして他の成分は洗浄により除去することができる。抗原及び抗体を結合させることは平衡反応であり、結合された抗原の量は濃度に依存する。抗原の検出は第二の特異の、ビオチニル化された抗体を用いて行われ、抗体は、続いて検出に用いられるストレプトアビジンと共役結合した酵素に結合する。ここで実施されるアッセイでは、酵素は西洋ワサビ ペルオキシダーゼ（HRP）を用いた。実際に測定された量は、規定された時間の範囲内での酵素により転換された発色性基質の量（濃度）である。ここで用いる基質はTMB (3,3^',5,5^'-テトラメチルベンジジン (3,3^',5,5^'-Tetramethylbenzidine)であり、これはH₂O₂の存在下で酸化され370 nm (青色)の波長を吸収する。反応はH₂SO₄を加えることによる終了させ、それにより吸収される波長を450 nm (黄色)に変える（Luttmann 2004）。決定されるべきサイトカインの既知の濃度の一連の標準希釈列を用いて、この様にして細胞培養浮遊物中のまだ知られていないサイトカインの濃度を決定することができる。

必要な抗体ペア、標準、酵素及び基質溶液はキットの形でR&D Systemsより購入した。使用する装置及び材料は以下の表に示す。

IL-6 及びIFN-γ
PBMCの細胞培養浮遊物中のIL-6 及びIFN-γの検出はR&D Systemsの「DuoSet ELISA Development System」キットを用いて、添付された指示に従って行った。そのために、「捕捉抗体」（capture antibody)はPBSを用いてそれぞれ4 μg/mｌ(IFN-γ)及び2 μg/mｌ(IL-6)の濃度に希釈され、そして各100 μlがマイクロタイタープレートのウエルに置かれた。プレートは室温で一夜培養され、次に洗浄緩衝液で３度洗浄され、各ウエル毎に300 μlの遮断緩衝液で１−２時間培養され、自由結合部位を飽和させた。プレートは洗浄液で３度洗浄され、続いてその都度100 μlのサンプル及び標準がプレート上に置かれた。浮遊物は、IL-6検出のため試薬緩衝液中で１：２に希釈されて使用され、IFN-γの検出では希釈されなかった。IL-6の一連の希釈標準は以下の濃度を含む：12.5; 25; 50; 100; 200; 350; 700 pg/ml。IFN-γの一連の希釈標準は、以下の濃度を含む：12.5; 25; 50; 100; 250; 500; 1000 pg/mL。各々の場合に２度の測定が実施された。培養時間は２時間であった。洗浄緩衝液で３度洗浄した後、試薬緩衝液中の100 ng/mL (IL-6)及び 200 ng/mL (IFN-γ)の濃度の各々100 μlの「検出抗体」がそれぞれプレートに置かれた。２時間培養した後、プレートは洗浄緩衝液で３度洗浄され、反応緩衝液中で1 :200に希釈された100 μlストレプトアビジンが各ウエルに置かれた。培養時間は２０分であった。最終の３度の洗浄ステップに続いて各100 μLの基質溶液（「色試薬」A及びBの比率は１：１）がプレートに加えられ、暗所で２０分培養された。反応は50 μL の1 M H₂SO₄を加えて終了させ、各単一ウエルの吸収度がマイクロタイタープレートで450 nmで測定された。評価をSoftware SoftMax Pro 2.6によって行った。標準曲線は４パラメータフィット（4-Parameter Fit）を用いて計算した。

IFN-α
PBMCの細胞培養浮遊物中のIFN−αの検出はBiosource社のヒトのインターフェロンーα ELISAキットを用いて、キットに同封された指示に従い実施された。各ウエルの100 μlの標準及びサンプルが、事前に抗体が供給されそしてブロックされたキットのマイクロタイター片に加えられ室温で１時間培養された。

浮遊物は希釈緩衝液で１：２に希釈されて使用され、一連の標準希釈液は以下の濃度を持つ：156; 312; 625; 1250; 2500; 5000 pg/ml。洗浄ステップに続いて、希釈緩衝液C中の１００μlの抗体濃縮物Dが各ウエルに加えられ、そして室温で１時間培養された。プレートは３度洗浄され、HRP希釈剤中の100 μl HRPが各プレートに加えられ、そして１時間培養された。溶液は４度洗浄されて除去され、100 μLの基質溶液Gが各ウエルにピペットで加えられた。これは暗部で２０分培養され、そして反応は100 μLの停止液（Stop-Solution） Hを加えて終了させた。450 nmでの吸収がマイクロプレートリーダーで測定された。SoftMax Pro 2.6ソフトウエアを用いて評価がなされた。標準曲線が点と点間（point-to-point）フィットにより算出された。

IL-8/CXCL8
HEK293細胞の細胞培養浮遊物中のIL-8/CXCL8の検出が、R&D Systems社のDuoSet ELISA 開発システムキットを用い、その指示に従って実施され、その検出方法はIL-6及びIFN-γのものと同一であった。一連の標準希釈液は以下の濃度を含む：31.25; 62.5; 125; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml。浮遊物が希釈されない形で使用された。使用された抗体濃度は；捕捉抗体4 μg/mL、検出抗体20 ng/mLであった。

多量体DNA分子の生成及びその説明
構造的特徴、特にG構造を形成する能力に好都合な特徴に対する影響を調査するために、種々の領域にポリ（G）モチーフを持つ単量体DNA分子の組合せが、本発明の方法を用いて生成され、その方法は凍結乾燥は別として、モノマーの生成方法に従うものである。そのため、各ステム及びループの３つの異なる配列が組み合わされるが、その配列は他方グアニン塩基の数及び局在化に於いて異なるのみならず、またDNA mfoldプログラムにより予測されるループの二次構造においても異なっていた。個々の配列及びその構造的特徴は以下の表に示す。

以下の図表は使用された組み合わせ及び用いた命名法の概略を示すものである。

上に示す様に、本発明において、多量体分子又はオリゴマー分子と呼ぶことも出来る重合dSLIM分子は、組織において免疫反応の向上を誘発するのに非常に適している。向上した免疫反応は化学療法剤との関係で剤を優位に使用することを可能にした。２つの剤の加算的効果に比べて、化学療法剤と本発明の剤の組み合わせは腫瘍の治療で相乗効果を生み出す。上に述べたプロセス（主請求項を参照）により得ることができる本発明の剤と組み合わせることにより、追加的に使用された化学療法剤又は細胞増殖抑制剤の効果の全てが向上する。dSLIM分子の単量体形は化学療法剤又は細胞増殖抑制剤と既に組み合わされているが、多量体又は重合した形のdSLIMを細胞増殖抑制剤と組み合わせることにより実現される効果は全く驚くものであった。単量体の形のdSLIM及び細胞増殖抑制剤を含む組み合わせ剤を実際に使用することにより、細胞増殖抑制剤の特定の特性のみが改良されるが、その全体の特性は―重合形の場合と同様に―改良することはできなかった。また、重合/多量体の形のdSLIMによる免疫系の活性化は驚くほど高く、そのため腫瘍の治療における全般の結果は、単量体の形の細胞増殖抑制剤の使用に比べて驚くほど良いものであった。そのため、特に転移の形成が、細胞増殖抑制剤/化学療法剤及びこれらの剤と共に投与することにより、組織中の多量体dSLIM分子の使用を通じて予防された。本発明の意味での組み合わせることには、両方の剤を時間を変えて投与することのみならず同時に行うことも言うと了解される。

説明図３．１．１は、DNA mfoldにより算出された３つのループ配列のdSLIM分子３０L1（例えば、MS）及びKG(例えば、ML, GS, GL₁ GLS) の２つの異なる２次構造を例示する。30L1と対照的に、選択された条件ではループ中の塩基ペアはKGについては予測されなかった。

種々の単量体及び多量体分子の生成
説明図３．１.２は、0.3 μgの結紮バッチの分離及び３％アガロースゲル中の30L１ODNと共に異なるdSLIM分子のテストT7消化の結果を示す。異なる分子が分離された全てのレーンにおいて、そのレベルまでマーカーの１００ｂｐ断片が移動したレベルより下方の短距離の位置にバンドが見られ、そのバンドは単量体分子に対応する。

30L1ODNを含むレーンでは、単量体分子のバンド以下のバンドが見られる。

L3 (GL, GLS)を含む分子ではDNAの不明瞭な分布がポケットまでのゲルの上部領域に見られ、その分布は結紮バッチに比べてT7消化バッチ中のGLでは、際立って強く、GLSでは弱い。長いポリ（G）モチーフ(GL, GS, GLS MS)を含む分子ではゲル中のバンドは他の分子(30L1, KG, ML)に比べて相対的に不明瞭である。T7消化バッチが用いられたレーンでは、蛍光強度は、特にゲルの上部領域では、結紮バッチが用いられたそれらのレーンに比べて弱い。

説明図３．１．３は、続く、異なる分子のHPLC精製のクロマトグラムを示す。各点は、分離されるサンプルを注入後にカラムを通して流れた容量（ピンクの破線）に対する260 nmでの吸光度(青い線)をプロットしたものである。緑の線は0%, 50% 及び100% の1 M NaCl緩衝液(T20N1000)のNaCl緩衝液勾配を示す。その2.5 mｌ及び0% T20N1000 (F2) の最大値を持つ第一のピークは非結合分子に対応し、その8 mｌ及び50% T20N1000 (F3)において最大値を持つ第二のピークは固定相に低い親和性を持つ分子に対応する（画分F4に比べて１２倍の量を使用したにも拘らず、DNAはこれらの何れの画分にもアガロースゲル中には検出されなかった）。14 mL 及び100% T20N1000 (F4)で最大値を持つ第三のピークは単量体分子に対応する。

説明図３．１．３：異なる単量体及び多量体分子のHPLC精製クロマトグラム
a) 30L1 b) ML_、c) KG, d) MS, e) GS, f) GLS, g) GL,カラム：1 mL DMAE
使用量：700 μg；流量：１ｍｌ/分；緩衝液A: 20 mM Tris、pH 7;緩衝液B：20 mM Tris, 1 M NaCl, pH7;勾配：0%, 50% 100% 緩衝液B
異なる分子のクロマトグラムを比較すると、F4はポリ（G)モチーフすなわち、S3又はL3 (30L1 , ML, KG)を含まない分子の単一のピークであることは明らかである。対照的に、S3を含むこれらの分子ではF4で肩が観測される。

L3 (GL, GLS)を含む分子では、最大値は２つのピークを持ちGl及びGLSの間で異なる強度分布を持つ。GLSでは、両方の部分的最大値はおおよそ同じ強度を持ち、他方GLでは、より多容量で観測される部分的最大値は、低容量での部分的最大値よりも強度が強い。表れる副次的最大値（side maximum）又は肩は手動操作により画分に分離された。画分はその溶出の時系列順にF1及びF2と呼ばれた。

エタノール沈殿に続いて上記のHPLC分離によるdSLIM画分、すなわち、最終生成物が説明図３．１．４に示すアガロースゲルに使用された。全てのレーンで単量体分子に対応するバンドが、100 bpマーカー断片の移動距離以下の短距離の位置に見られる。ML及びKGでは、第二の弱いバンドがこのバンドの上の短距離の位置に見られ、そのバンドはMLではより強い強度を持つ。GL, MS及びGLSは他の分子よりもゲル中で幾らか高い移動性を示す。ポリ（G)モチーフを含まない分子(30L1、KG, MS)では、dSLIMバンドの上に約200 bpのレベルまでの非離散的強度分布を見ることが出来る。更にKG 及びMLでは２００ｂｐマーカー断片のレベルにおいて弱いバンドを見ることが出来る。

説明図３．１．４：エタノール沈殿後の種々の単量体及び多量体分子
3% アガロースゲル、使用量 0.3 μg, マーカー100 bp 0,5 μg (100 bp, 30L1 , 30L1 , KG, ML, GL-F1 , GL-F2, MS-F1 , MS-F2, GS-F1 , GS-F2 GLS-F1 , GLS-F2, 100 bp)
複数ピーク分布が観測され、最大値がHPLC精製において分画されている分子では、画分１は主に単量体バンドに対応し、画分２がそれに適用されるレーンは単量体バンドの上の広い範囲に亙り強度分布が見られる。ここでMS及びGSは同様な強度分布を持ち、それはおおよそ単量体バンドから始まり５００ｂｐに対応する移動レベルまで拡がる。他方、GLにおいては、２００ｂｐより上で始まり、ゲルのポケットまで拡がる。しかし、GLSではDNAの分布は、単量体バンドから始まり全レーンに亙り観察することができる。

説明図３．１．６：種々の単量体及び多量体分子の熱変性
天然PAGE 8% Gel (2.6% C), 使用量 0.25 μg, マーカー25 bp 0.3 μg (25 bp, 非処理, 変性95°C 10分: 30L1 , MS, ML, KG, GS, GL-F2, GLS-F2)
説明図３．１．６のゲルはゲル中の移行挙動に対する異なる分子の熱変性の影響を示す。そのために、バッチは分割され一部が95℃まで１０分加熱され、直ちに氷上で冷却され、使用された。観測されたバンドは説明図３．１．５で述べたゲル中のそれに対応するが、このケースでは、非分離DNAがMS及びGSでゲルのポケットに見られ、MSでは第二のバンドが見られ、それは３０L１の第二のバンドと同じレベルで見られる。

GS及びMSは、説明図３．１．５に示すゲルと異なる生産バッチであり、HPLC分画での副最大値を持つ部分が別々に回収されなかった。変性及び非変性dSLIMを持つゲル中のバンドを比べると、加熱後の全ての分子において第一のバンドの強度は減少し、第二のバンドの強度は増大していた。ゲル中の上部３分の１に現れるML及びKG中のバンドは変性後には最早見られない。また、MS及びGSが使用されたレーンのポケット中のDNAは、変性後は見ることが出来ない。

GL-F2 及びGLS-F2のレーンではポケット中のDNAの量は同様に減少しているが、他方、規則的に配置されたバンドの数の主要部分が第二のバンドの上に見られる。

変性により起きた変化が可逆的であるか否かを検討するために、変性を受けたサンプルが分けられ、それぞれ4℃ 及び37℃で３日間培養された。非処理dSLIMバッチは4℃で保存され、同様に3日後に分けられそして各回とも一定分量が95℃まで10分加熱され、直ちに氷上冷却された。バッチを分離するために用いられた天然PAGEの使用結果は説明図３．１．７及び３．１．８．に示す。非処理及び変性サンプルは説明図３．１．６．に示したゲルについて記載したと同様に、ゲル中での移行挙動を示す。その移行挙動では、４℃で培養された変性サンプルは使用直前に変性されたサンプルに対応する。37℃で培養されたサンプルはゲル中で非処理サンプルのそれとおおよそ対応する移行挙動を示す。しかし、30L1、MS及びGSの第二のバンドの強度はこれよりも大きい。GS及びMSの他の異なる点はゲルのポケットに残っていたDNAの量であり、これは非処理サンプルに比べて非常に低いものである。

二量体分子及び単量体30L1画分
上部3分の１に見られるバンドが二量体に対応するバンドであるかを検討するために大量の単量体分子からHPLC分離により得られ及びこのバンドを表す画分 (F3)が二量体分子60L1と共に天然PAGEに用いられた。

説明図３．１．９：画分３と二量体分子60L1の比較
天然PAGE 8% ゲル (5% C)、使用量0.25 μg, マーカー25 bp 0.3 μg (25 bp, F3, F3 95℃, 60L1 , 60L1 95℃, HPLCによるdSLIM30L1 、60L1の精製による画分1 (F1 ), 画分2 (F2), 画分3 (F3), 画分4 (F4))
観測されたバンドは同じレベルにある。変性された形のサンプルをゲルに用いると、バンドは、非処理サンプルを適用したレーン比べてゲル中高いレベルにあることが分かった。天然PAGEの対応するレーンは、HPLC分画の手段により得られる単量体30L１の4つの異なる画分の分離の結果と共に説明図３．１．９．に示す。

培養媒体、タンパク質結合
細胞培養液中の条件による、特にタンパク質が存在する場合の、刺激のために使用された分子への影響を調査するために、分子が細胞培養液媒体中で0.5 及び27 時間、37℃で培養され、天然PAGEを用いて水で溶解された分子共に分離された。DNA染色に続いて媒体中に存在するタンパク質がゲル中でクーマシィー染色により検出された。結果を説明図3.1.10及び3.1.11に示す。

説明図3.1.10：媒体中の単量体分子の培養
天然 PAGE 8% ゲル (5% C), 使用量0.25 μg, マーカー25 bp 0.3 μg, マーカー50 bp 0.3 μg (50 bp, 27時間媒体, 5 時間媒体, 0 h 時間媒体, H₂O: 30L1, ML, F3, KG, 25 bp)
天然PAGE 8% ゲル(2.6% C)₁ 使用量 0.5 μg, 25 bp 0.5 μg (27 時間媒体, 5時間媒体, O時間媒体, H₂O: GL, 25 bp)
クーマシィー染色断片、説明図3.1.11 a) に示す天然8% PAGE (5% C) (27 時間媒体, 5時間媒体, 0時間媒体, H₂O: ML)
説明図3.1.10 a）及び3.1.10 b）は、その上に分子を用いた、臭化エチジウム染色されたPAGEを示す。説明図3.1.10 c）は移行距離を比べるために使用されたクーマシィー染色されたゲルの断片の典型的な例を示す。異なるバッチを含むレーンの比較では、媒体中の全ての分子のゲルポケットにバンドが表れているが、H₂Oレーンには（GLを除き）見られない。30L１及び画分３のH₂O中のゲルの上部領域に現れているバンドはタンパク質の、低部分のバンドのレベルにある媒体中の短移行距離を示す。DNA及びタンパク質の両方のバンドの強度は培養時間が長くなると共に弱まる。GLについては、H₂Oに比べて媒体中の第二のバンドの強度は増す。

説明図3.1.11：媒体中のODN M362の培養
天然PAGE 12% ゲル(5% C), 使用量0.25 μg, マーカー25 bp 0.3 μg (25 bp, H₂O, 0 時間媒体, 5時間媒体, 27時間媒体)
クーマシィー染色断片、説明図3.1.12 a)の天然PAGE 12% ゲル(5% C) (H₂O, 0時間媒体, 5時間媒体, 27時間媒体)
説明図3.1.11はホスホロチオエートにより保護されたコントロール分子M362が用いられた天然PAGEを示す。この説明図より明らかに分かる様に、ゲルの底部端のH₂O中に見られるDNAバンドは媒体中で消えていた。それに替わりゲル中の上部端のバンド、これらの移行距離において低部分のタンパク質バンド（説明図3.1.11 b)に対応するものであるが、及びゲルポケット中にバンドが見られる。

培養時間が長くなるとDNAバンドの強度が減少するのがこの場合にも見られる。

観察された変化が媒体の他の成分よりもタンパク質の存在により引起されるかを確かめるため、比較のため分子がFCSを添加することなく希釈された。

説明図3.1.12中で、ゲルの対応するレーンはdSLIM (KG) 及びM362を典型的に示す。ODN及び分子がFCSを添加することなく分離しているレーンは、その強度分布に於いて、水中で溶解されたODN及びdSLIMが用いられた場合のレーンに対応する。対照的にFCSを用いて媒体中で溶解されたODN及び分子は天然PAGE中で移行挙動を示し、それは媒体中で希釈された単量体分子及びODNが使用されたレーンを示す説明図3.1.10及び3.1.11中の移行挙動に対応する。

免疫刺激効果：PBMCの刺激
異なる分子の免疫刺激効果がヒトの献血から分離されたPBMCで調査された。

そのため、PBMCは各分子又はコントロール分子M362により最終濃度1 μMで48時間培養され、細胞培養浮遊物中のIL-6, IFN-α及びIFN-γがELISAを用いて測定された。何も添加せず培養された細胞がコントロールとして使用された。

4つの献血（供血者A-D）から分離されたPBMC浮遊物のELISA測定結果は説明図3.2.1 a-cの図表に示す。各数値は2度実施した測定結果の平均値であり、エラーバー（error bar）はこれらから決定された二重標準偏差（double standard deviation）を表す。＊を付した値は、PBMCの刺激の追加に二重の実施がなされたものであり、そして示された値は4つのELISA測定結果の平均値に対応する。エラーバーはこれらの4つの値の二重標準偏差に対応する。

説明図3.2.1 a-c:IFN-γ (a), IFN-α(b), IL-6 (c) PBMCのELISA測定結果
異なる供血者A-Dの浮遊物PBMC (600 μL中のバッチ当たり2,4 x 106細胞)、1 μM dSLIM/ODN M362で48時間刺激、標準測定範囲‐‐‐、＊二重決定細胞培養、エラーバー：二重決定(double determination) ELISA法による２ｘ標準偏差（＊二重決定細胞培養＋二重決定ELISA = 4 つの数値)
図表を参照して説明すると、直ちに判明する、驚くべき特徴は、異なる供血者の浮遊物中のサイトカイン濃度は強い偏差を示しており、そのためデータの比較が妨げられる。二重決定として細胞培養中で追加的に決定された標準偏差はELISAでの二重決定のみから決定される標準偏差に相当し、その差はPBMCの差に帰せられることを示す。刺激を受けないバッチでは、全てのドナーについてサイトカインが検出されず又は単に非常に低い濃度のサイトカインが検出された。IL-6及びIFN-γ濃度の決定においては、算出された数値の幾つかは標準測定範囲の上限であるか、又はその外にあり、IFN-γで10.000 pg/mｌまで、dSLIMのIL-6で3500 pg/mｌ まで、及びM362で7,000pg/mLまでである。

異なるドナーのデータをより良く比較するために、得られたサイトカインの値は正規化（normalize）された。このため、M362について算出された値でのサイトカインの決定された濃度パーセントが各ドナーについて算出された。こ4人のドナーのこの様に正規化されたデータの平均値は説明図3.2.2 a-cの図表に示す。各エラーバーは平均偏差値に対応する。各ドナーの間に見られる大きな差よりエラーバーは非常に大きい。しかし、少なくともこの図表により個々の分子の傾向を推測することができる。

説明図3.2.2 a-c：IFN-γ(a), IFN-α(b), IL-6 (c)のELISA測定結果の正規化された平均値
ELISA測定結果は正規化された説明図3.2.1を参照：ドナー当たりのM362の％
サイトカインの量、4人のドナーの平均値、エラーバー：平均偏差値
IFN-γでは、テストされた分子の算出値は、M362の値に対して40%から80%の間であり、一方KG, ML 及びGLS-F2の値はむしろ低部領域にあり、GL-F2は上部領域にあった。

IFN-αの異なる構築体のパーセント平均値はGL-F1、GLS-F1及びGL-F2について算出された値がM362の約５０％であることを除いてはおおよそM362のそれに対応する。

IL-6の対M362パーセントの平均値は30L1、MS, GS, GL-F2及びGLS-F2では５０％より小さく、MS及びGLS-F2 −最低のエンドトキシン濃度を持つ構築体− はまた最低値であった。エンドトキシン値が得られないGL-F1及びGL-F2の値はM362に対し50％より僅かに大きかった。最大のIL-6値は、M362のそれに相当するか又は100％を超えるが、KG 及びMLで刺激された細胞中に見られた。また、最大のエンドトキシン濃度はこれらの２つの構築体で測定された。

説明図3.3.2: IL-8 HEK293-TLR9刺激時間のELISA測定結果
浮遊物HEK293-TLR9: 400 μL/バッチ (5 x 10⁵ 細胞/mL);
2,5 μM ODN 2006による刺激6 時間, 24時間, 48時間; 0,5 μg/ml LPS; 細胞播種3日後刺激（48時間後、及び刺激前に媒体を取替え）；エラーバー：２ｘELISA二重決定値による標準偏差
a)の刺激を受けた/刺激を受けていないバッチのケモカインの量の割合；エラーバー：ELISA二重決定からの相対的エラーの合計
測定されたケモカイン濃度は比較的低いものである。しかし、培養時間の増加によるIL-8/CXCL8量の増大が全てのバッチで観測され得るが、それは24時間から48時間にかけて非常に低くなる。ここでもLPSにより刺激された、及び刺激を受けていない細胞の各数値はその大きさに於いてほぼ同じであり、ODN 2006により刺激を受けた細胞の数値は、刺激を受けていない細胞に比べて１．５倍に増大している。時間を異にする時点で測定された刺激を受けた/刺激を受けていないバッチのIL-8/CXCL8の量の割合は変わらないことが認められ、そのため更に24時間刺激が与えられた。

説明図3.3.4: 種々の単量体分子のIL-8 HEK293ヌル細胞のELISA測定結果
浮遊物HEK293-ヌル細胞：400 μｌ/バッチ (1 x 10⁶ 細胞/mｌ); 2 μM ODN 2006/dSLIMによる刺激 24 時間; 0,5 μg/ml LPS; 細胞播種4日後刺激
（48時間後及び刺激を与える前に媒体を取替え）：エラーバー：２ｘELISA.二重決定による標準偏差
a)の刺激を受けた/刺激を受けていないバッチのケモカインの量の割合；エラーバー：ELISA二重決定による相対的エラーの合計
IL-8/CXCL8-分泌、刺激を受けていないバッチと比べて異なる刺激剤により培養されたバッチのいずれにおいても本質的な違いは観測されない。

Claims (35)

1. ヒト又は動物の免疫系の活性を調節する多量体分子であって、前記分子が:
   少なくとも2つのステム ループモノマー構造を持ち、前記モノマー構造はＧ構造の形成により多量体分子の集合物として集まり、前記分子は、塩基配列N ¹ N ² CGN ³ N ⁴ を含み、N ¹ N ² はGT, GG, GA, AT 又はAAの群の要素であり、N ³ N ⁴ はCT 又はTTの群の要素であり、Cはデオキシシトシン、Gはデオキシグアノシン、Aはデオキシアデノシン、及びTはデオキシチミジンである、多量体分子。
2. 請求項１の分子が以下の配列、すなわち、
   

   

   c) 塩基配列AACG TTCTTCGGGG CGTTを持つオリゴデオキシリボ核酸配列を含む、及び
   d) 前記オリゴデオキシリボ核酸配列は４０から１６００のヌクレオチドの長さを持つ、
   を含むことを特徴とする、前記分子。
3. ｃ）の塩基配列が以下の配列、すなわち、
   

   

   に含まれる、請求項１又は２の分子。
4. 前記分子がデオキリリボヌクレオシド残基の部分的に単鎖の、共有結合による閉じた連鎖を含む、請求項１乃至３のいずれか１項の分子。
5. 前記塩基配列N¹N²CGN³N⁴が、デオキリリボヌクレオシド残基の閉じた連鎖の単鎖領域にある、請求項１乃至４のいずれか１項の分子。
6. 一以上の置換基が共有結合により前記分子に結合している、請求項１乃至５のいずれか１項の分子。
7. 前記置換基がペプチド、タンパク質、単糖類、抗原分子、DNA及び/又はRNAを含む群の一つから選択される、請求項６の分子。
8. 請求項１乃至７のいずれか１項の分子及び化学療法剤を含む組合わせ剤。
9. 前記化学療法剤が抗体、アルキル化剤、プラチナ類似体（platinum analog）、挿入剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、及び/又はＬ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシカルバミド、ミトタン及び/又はアマニチンを含む群から選択される、請求項１乃至８のいずれか１項の組合わせ剤。
10. 前記アルキル化剤が以下を含む群、すなわち、
    ナイトロジェンマスタード（nitrogen mustard）誘導体、
    アルキルスルホン酸(akylsulfonate)及び
    ニトロソウレア(nitrosourea)
    から選択される請求項１乃至９のいずれか１項の組合わせ剤。
11. 前記ナイトロジェンマスタード（nitrogen mustard）誘導体は、
    シクロホスファミド(cyclophosphamid),
    イホスファミド(ifosfamid),
    トロフォスファミド(trofosfamid),
    メルファラン(melphalan)、及び
    クロラムブシル(chlorambucil)を含む群から選択され、
    アルキルスルホン酸(akylsulfonate)は、
    ブスルファン(busulfan) 及び
    トレオスルファン(treosulfan) 含む群から選択され、及び
    ニトロソウレア(nitrosourea)は、
    カルムスチン(carmustine),
    ロムスチン(lomustine),
    ニムスチン(nimustine),
    エストラムスチン(estramustine)、
    ストレプトゾトシン (streptozotocin)
    プロカルバジン(procarbazine)
    ダカルバジン（dacarbazine),
    テモゾロマイド(temozolomide)、及び
    チオテパ(thiotepa) を含む群から選択される、
    請求項１０の組合わせ剤。
12. 前記プラチナ類似体が
    シスプラチン(cisplatin),
    カルボプラチン(carboplatin)及び
    シュウ酸プラチン(oxaliplatin)
    を含む群から選択される、請求項１乃至１１のいずれか１項の組合わせ剤。
13. 前記挿入剤は以下を含む群、すなわち、
    アントラサイクリン(anthracycline),
    ミトキサントロン(mitoxantrone),
    アムサクリン(amsacrin) 及び
    ドキシフルリジン(doxifluridine)、
    から選択される、請求項１乃至１２のいずれか１項の組合わせ剤。
14. アントラサイクリン(anthracycline)が
    ドキソルビシン（アドリアマイシン）(doxorubicin (adriamycin)),
    ダウノルビシン(daunorubicin),
    エピルビシン(epirubicin)及び
    イダルビシン(idarubicin),
    を含む群れから選択される、請求項１３の組合わせ剤。
15. 前記抗生物質が以下を含む群、すなわち、
    ブレオマイシン(bleomycin),
    アクチノマイシンD（ダクチノマイシン）(actinomycin D (dactinomycin))及び
    マイトマイシン(mitomycin)、
    から選択される請求項１乃至１４のいずれか１項の組合わせ剤。
16. 有糸分裂阻害剤は以下の群、すなわち、
    ビンカロセアのアルカロイド(alkaloide of Vinca rosea)から選択される、請求項１乃至１５のいずれか１項の組合わせ剤。
17. 前記ビンカロセアのアルカロイド(alkaloide of Vinca rosea)が 酒石酸ビノレルビン(vinorelbine),ビンクリスチン（オンコビン）(vincristine (oncovin)),
    ビンブラスチン(vinblastine)及びビンデシン(vindesine)を含む群から選択される、請求項１６の組合わせ剤。
18. 前記タキサンが以下を含む群、すなわち、
    パクリタキセル(paclitaxel) 及び
    ドセタキセル(docetaxel)、
    から選択される、請求項１乃至１７のいずれか１項の組合わせ剤。
19. 前記トポイソメラーゼ阻害剤が以下を含む群
    すなわち、
    トポイソメラーゼI 阻害剤(topoisomerase-I-inhibitor),及び、
    トポイソメラーゼ II 阻害剤(topoisomerase-Il-inhibitor),
    から選択される、請求項１乃至１８のいずれか１項の組合わせ剤。
20. トポイソメラーゼI 阻害剤(topoisomerase-I-inhibitor)が
    カンプトセシン（camptothecin）,
    トポテカン(topotecane)、 及び
    イリノテカン(irinotecane)を含む群から選択され、及び
    トポイソメラーゼII 阻害剤(topoisomerase-Il-inhibitor)が、
    エトポシド(etoposide)及び
    テニポシド(teniposide) 含む群から選択される、
    請求項１９の組合わせ剤。
21. 前記代謝拮抗物質が以下を含む群、すなわち、
    葉酸拮抗薬(floric acid antagonist),
    ピリミジン類似体(pyrimidi analog),及び
    プリン類似体(purin analog)
    から選択される、請求項１乃至２０のいずれか１項の組合わせ剤。
    
    
22. 請求項２１の組合わせ剤であって、
    葉酸拮抗薬(floric acid antagonist)が
    メトトレキサート(methotrexate)を含む群れから選択され、
    ピリミジン類似体(pyrimidi analog)が、
    ５−フルオロウラシル5-fluorouracil),
    カペシタビン(capecitabine)、
    シトシンアラビノシド（シタラビン）(cytosin arabinoside (cytarabine) )及び
    ゲミシタビン(gemcitabine) を含む群れから選択され、及び
    プリン類似体(purin analog)が
    ６−チオグアニン（6-thioguanine)、
    ペントスタチン(pentostatine),
    アザチオプリン（azathioprine),
    ６−メルカプトプリン(6-mercaptopurine),
    フルダラビン(fludarabine) 及び
    クラドリビン(cladribine) を含む群れから選択される、
    前記組合わせ剤。
23. 請求項１乃至７のいずれか１項の分子、及び/又は請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤を含むキット。
24. 薬剤として使用する、請求項１乃至７のいずれか１項の分子及び請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤。
25. 請求項１乃至７のいずれか１項の分子、及び/又は請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤を含む医薬品。
26. さらに薬剤として許容可能な担体を含む請求項２５の医薬品。
27. ヒト又は動物の免疫系を調節し又はその様な免疫系の活性を調節するための剤を生成するための、請求項１乃至７のいずれか１項の分子、請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤、及び請求項２５又は２６の医薬品の使用。
28. 前記調節が免疫系を刺激し又はその活性を増大させることを特徴とする、請求項２７の使用。
29. 刺激は、T細胞の媒介による免疫反応又はT細胞から独立の免疫反応を含む、請求項２８の使用。
30. 前記免疫反応がB細胞の増殖及び/又はB細胞の活性化を含む、請求項２９の使用。
31. 免疫系の刺激はサイトカインの分泌を含む、請求項２８乃至３０のいずれか１項の使用。
32. 請求項１乃至７のいずれか１項の分子、及び/又は請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤が治療又は予防ワクチンにおける補助剤として使用される、請求項２５又は２６の医薬品。
    
    
33. 請求項１乃至７のいずれか１項の分子、及び/又は請求項８乃至２２のいずれか１項の組合わせ剤及び請求項２５又は２６の医薬品を細胞の成長異常の治療の治療剤の生成に用いる、使用。
34. 前記細胞の成長異常は腫瘍疾患である、請求項３３の使用。
35. 腫瘍疾患が以下の腫瘍を含む群から選択される、請求項３４の使用：耳鼻咽喉領域の腫瘍；内側鼻、副鼻腔、鼻咽喉、唇、口腔、中咽頭、喉頭、下喉頭、耳、唾液腺、及び傍神経節腫の腫瘍； 非小細胞性気管支癌腫、小細胞性気管支癌腫を含む肺腫瘍； 縦隔腫瘍；胃腸管腫瘍；食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、及び胆道、小腸、結腸及び直腸の腫瘍、肛門がん；腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、ペニス、及び睾丸の腫瘍を含む泌尿器性殖器腫瘍；頸部、膣、外陰、子宮癌、悪性絨毛性疾患、卵巣癌腫を含む婦人科腫瘍； 子宮管（Tuba Fallopii）の腫瘍、腹腔の腫瘍、乳癌、内分泌器官の腫瘍；甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍、脾臓内分泌部腫瘍、カルチノイド腫瘍、カルチノイド症候群、多発性内分泌腫瘍症候群、骨及び軟部組織の肉腫、甲皮腫、皮膚腫瘍を含む腫瘍；皮膚及び眼肉黒色腫を含む黒色腫；中枢神経系腫瘍；幼児期の腫瘍であって、網膜芽腫、ウイルムス（Wilms）腫瘍,神経線維腫症、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫腫瘍ファミリー、横紋筋肉腫を含む；非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性リンパ腫、ホジキン病を含むリンパ腫；急性白血病、慢性脊髄及びリンパ性白血病、形質細胞腫、脊髄異形成症状群、腫瘍随伴性症、不明な原発巣の転移（CUP症状群）、腹膜癌症；免疫抑制に関連する悪性腫瘍で、Kaposi肉腫の様なAIDS関連悪性腫瘍、AIDS関連リンパ腫、中枢神経系のAIDS関連リンパ腫、AIDS関連ホジキン病及びAIDS関連肛門性器部腫瘍、移植関連悪性腫瘍；脳転移、肺転移、肝臓転移、骨転移、胸膜転移及び心膜転移及び悪性腹水を含む転移した腫瘍。
    
    

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