TW202128160A - 用於治療病原性血管病症之方法及組合物 - Google Patents

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Abstract

病原性血管係與正常器官之血管形成無關，但涉及病原性組織之血管，該等病原性組織諸如為引發視力疾病之新血管或腫瘤中之腫瘤賴以存活之血管。本發明藉由提供組合物及方法來提供對以新血管之產生為目標的典型抗血管生成策略之改進，該等組合物及方法可選擇性地靶向及殺傷現有病原性血管。習知抗血管生成藥物或因子抑制血管生成(新血管之生長)，但不能有效殺傷現有的病原性血管。已發現結合於且活化PLXDC1及PLXDC2蛋白質，引起視力疾病及表現此等蛋白質之腫瘤中之病原性血管中的內皮細胞之有效殺傷之藥劑，包括小分子化合物及抗體。由此，本發明提供用於消除或減少現有的病原性血管之新穎形式，藉此治療諸如糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變及癌症之疾病。

Description

用於治療病原性血管病症之方法及組合物
本發明係關於用於治療癌症及其他病原性血管病症之藥品及治療性組合物之領域。
血管生成在若干重大人類疾病之發病機制中起重要作用(Carmeliet, 2005)。除腫瘤生長及轉移以外，血管生成為若干致盲疾病之主要驅動力，包括糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)及早產兒視網膜病變。在美國，AMD及糖尿病性視網膜病變分別為老年人及工作年齡群體中之主要失明原因。早產兒視網膜病變為引起新生兒之視力損失之常見原因。
血管生成亦在癌症之發病機制(例如腫瘤產生)中起作用，因為新形成之血管向腫瘤供應生長營養物及信號，使得腫瘤能夠生長及擴散。因此，切斷腫瘤之營養物供應及傳播至遠距離位點之主要機制係有吸引力的治療策略。然而，當前抗血管生成策略僅靶向新形成之血管，且不能靶向促進疾病進程之現有血管。
抗血管生成療法可誘導不同的疾病進程模式，其在耐藥性、侵襲及轉移方面可引起更壞的結果。此外，以血管生成為目標不會治療可能例如已使腫瘤血管化之現有的血管。此項技術中需要互補療法，與抗血管生成療法不同，該等互補療法可靶向現有血管且治療癌症及其他由血管生成引起之病症(在本文中統稱為病原性血管病症)。
本發明藉由提供組合物及方法來提供對以新血管之產生為目標的習知抗血管生成策略之改進，該等組合物及方法亦可選擇性地靶向及殺傷現有病原性血管。如圖8A-C中所說明，腫瘤發育及存活依賴於血管形成以提供生長因子及營養物以及作為轉移至遠距離位點之機制。習知抗血管生成藥物或因子抑制血管生成、腫瘤生長，但不能殺傷腫瘤，因為其不能有效地殺傷現有腫瘤血管。因此，本文中描述用於治療患者中之病症之方法，其中該病症之特徵在於病原性血管且該方法包含活化患者之病原性血管中表現的含有叢蛋白域(PLXDC)之蛋白質(例如PLXDC1及PLXDC2)。本文中描述新穎化合物及抗體，其活化PLXDC1或PLXDC2蛋白質且引起內皮細胞之有效殺傷，藉此提供用於消除或減少主要病原性機制之新穎形式。
值得注意的是，在本發明之前，先前不存在靶向PLXDC1/PLXDC2以殺傷內皮細胞之小分子。又，先前不存在靶向PLXDC1/PLXDC2以殺傷內皮細胞之抗體。本文中所揭示之小分子及抗體靶向PLXDC1/PLXDC2以殺傷內皮細胞。因為PLXDC1/PLXDC2在病原性血管(諸如腫瘤血管)中高度富集且在大部分健康血管中不具有表現或具有不可偵測之表現，因此此等藥劑可特異性地殺傷病原性血管。
意外地發現此類藥劑，特定言之，抗體。據本發明人所知，所有現有抗體藥物皆為中和抗體或靶向抗體。中和抗體抑制配位體/受體相互相用，諸如修美樂(Humira)(抑制TNF-α，一種配位體)、阿瓦斯汀(Avastin)(抑制VEGF，一種配位體)、赫賽汀(Herceptin)(抑制HER2，一種受體)及克珠達(Keytruda)(抑制PD-1，一種受體)。靶向抗體可經由諸如抗體-藥物結合物及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之機制來發揮其功能。尚未發現活化抗體，尤其針對單一跨膜細胞表面受體(如PLXDC1/PLXDC2)之抗體。
本發明之態樣係關於一種用於治療患者中之病原性血管相關病症之方法。其他態樣係關於一種用於治療患者中之病症之方法，其中該病症之特徵在於病原性血管且該方法包含活化患者之病原性血管中表現的含有叢蛋白域(PLXDC)之蛋白質。活化PLXDC蛋白質可包含投與結合於PLXDC蛋白質之藥劑。
在一些實施例中，該方法包含活化病原性血管中之含有叢蛋白域(PLXDC)之蛋白質(例如PLXDC1或PLXDC2)。在一些實施例中，該方法包含向患者投與含有叢蛋白域(PLXDC)之蛋白質結合劑。在一些實施例中，PLXDC蛋白質為PLXDC1蛋白質或PLXDC2蛋白質。結合劑可為小分子或多肽，諸如抗體。
其他態樣係關於一種方法，其包含：a)獲得包含細胞之樣品，及b)測定細胞是否表現PLXDC1 (含有叢蛋白域1)或PLXDC2 (含有叢蛋白域2)。
本發明之其他態樣係關於抗PLXDC1或抗PLXDC2抗體及抗原結合片段，其可用於治療病症。在一些實施例中，抗體係選自表6、為包括表6中之任何抗體之CDR之抗體或為與表6中之任何抗體結合於相同抗原決定基之抗體。在一些實施例中，抗體係選自AA02、AA03或AA94；AA02、AA03或AA94之抗原結合片段；或AA02、AA03或AA94之人類化或嵌合版本。亦提供包含本發明之抗體或抗原結合片段之組合物、編碼本發明之抗體或抗原結合片段之核酸及包含本發明之抗體、抗原結合片段或核酸之宿主細胞。
在其他態樣中，本發明提供化合物及組合物(包括醫藥組合物)、包括化合物之套組以及使用(或投與)及製備化合物之方法。本發明亦提供化合物或其組合物，其係用於調節PLXDC1 (TEM7)和/或PLXDC2或殺傷病原性血管之方法中。本發明亦提供化合物或其組合物，其係用於治療至少部分由PLXDC1/PLXDC2或血管生成介導之疾病、病症或病狀之方法中。
本發明亦係關於對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，VH包含VH互補決定區(CDR) CDR1、VH CDR2、VH CDR3，VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含選自表6之抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。其他態樣係關於對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自表6之抗體競爭結合於PLXDC1。亦提供對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自表6之抗體競爭結合於PLXDC1。
本發明之其他態樣係關於包含抗體之組合物，編碼抗體之核酸及包含抗體或核酸之宿主細胞。
本發明亦提供一種用於鑑別PLXDC蛋白質之活化劑之方法，其包含使候選分子與PLXDC蛋白質在存在參考PLXDC活化劑之情況下接觸且偵測候選分子與PLXDC蛋白質之間的結合親和力，藉此在所偵測之結合親和力大於在不存在參考PLXDC活化劑之情況下，候選分子與PLXDC蛋白質之間的參考結合親和力時，將候選分子鑑別為PLXDC活化劑。亦描述一種用於治療患者中之病症之方法，其中該病症之特徵在於病原性血管且該方法包含向患者投與本發明之抗體。
在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2。在一些實施例中，結合劑包含小分子。在一些實施例中，結合劑包含多肽。在一些實施例中，多肽或結合劑包含PLXDC1/PLXDC2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，結合劑包含融合多肽。在一些實施例中，抗體包含AA02、AA03或AA94。在一些實施例中，結合劑包含AA02、AA03或AA94之抗原結合片段。在一些實施例中，結合劑包含AA02、AA03或AA94之人類化或嵌合版本。在一些實施例中，抗原結合片段或抗體包含來自PLXDC1抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區中之一者或兩者。在一些實施例中，重鏈可變區包含來自PLXDC1抗體之重鏈可變區之HCDR1、HCDR2及HCDR3。在一些實施例中，輕鏈可變區包含來自PLXDC1抗體之輕鏈可變區之LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合劑不能介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，在存在結合及活化PLXDC蛋白質之小分子化合物之情況下，與不存在該小分子化合物時相比，抗體或其抗原結合片段以更高的親和力結合於PLXDC蛋白質。
在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1之域A。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1之域B。在一些實施例中，藥劑結合於在基礎狀態下未暴露之PLXDC之胺基酸殘基。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1之域C。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1之域D。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC1之域E。在一些實施例中，結合劑不結合於PLXDC1之域B。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2之域A。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2之域B。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2之域C。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2之域D。在一些實施例中，結合劑結合於PLXDC2之域E。在一些實施例中，結合劑不結合於PLXDC1之域B。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為選自表6之抗體或其抗原結合片段；包括選自表6之抗體之互補決定區(CDR)VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之抗體或其抗原結合片段；或與選自表6之抗體競爭結合於PLXDC1之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，結合劑活化PLXDC。在一些實施例中，結合劑誘導NFκB活化。在一些實施例中，治療包含誘導病原性血管中之NFκB活化。在一些實施例中，治療包含增加病原性血管之壞死。在一些實施例中，病原性血管相關病症包含糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變或癌症。在一些實施例中，病原性血管相關病症包含癌症。在一些實施例中，癌症包含結腸癌。在一些實施例中，癌症包含肺癌。在一些實施例中，癌症包含實體腫瘤。在一些實施例中，癌症包含血管化腫瘤。
在一些實施例中，結合劑包含小分子。在一些實施例中，小分子為式I化合物。在一些實施例中，小分子為由表4或5中之化合物編號鑑別之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少60%的內皮細胞以細胞形狀血管化之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少80%的內皮細胞以細胞形狀血管化之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少95%的內皮細胞以細胞形狀血管化之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少60、65、70、75、80、85、90、95或100%的內皮細胞(或其中任何可導出之範圍)以細胞形狀血管化之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少50%細胞死亡之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少80%細胞死亡之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導95%細胞死亡之活性之化合物。在一些實施例中，小分子為具有誘導至少60、65、70、75、80、85、90、95或100% (或其中任何可導出之範圍)細胞死亡之活性之化合物。
在一些實施例中，藥劑為具有誘導至少95%的內皮細胞以細胞形狀血管化之活性之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，藥劑為具有誘導至少60、65、70、75、80、85、90、95或100%的內皮細胞(或其中任何可導出之範圍)以細胞形狀血管化之活性之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，藥劑為具有誘導至少50%細胞死亡之活性之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，藥劑為具有誘導至少80%細胞死亡之活性之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，藥劑為具有誘導95%細胞死亡之活性之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，藥劑為具有誘導至少60、65、70、75、80、85、90、95或100% (或其中任何可導出之範圍)細胞死亡之活性之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，本文中所提供之方法及組合物包含藥劑之組合，諸如至少1、2、3或4種抗體、化合物或其混合物。例示性治療性組合物及方案包括至少一種抗體或其抗原結合片段及至少一種本發明之化合物之投藥，或包含至少一種抗體或其抗原結合片段及至少一種本發明之化合物之組合物。
在一些實施例中，結合劑不與PEDF (色素上皮衍生因子)競爭結合於PLXDC1或PLXDC2蛋白質。在一些實施例中，藥劑不為PEDF或其模擬物。在一些實施例中，病症係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變、癌症及其組合。在一些實施例中，病原性血管相關病症包含癌症且此外其中，患者為患有惡性腫瘤之患者。在一些實施例中，腫瘤包含實體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤之直徑大於2 cm。在一些實施例中，腫瘤之直徑為至少或至多1、2、3、4、5、6、7或8 cm (或其中任何可導出之範圍)。
在一些實施例中，結合劑特異性誘導目標血管中之內皮細胞壞死。在一些實施例中，結合劑不直接誘導腫瘤細胞壞死。在一些實施例中，治療包含誘導及/或增加患者中之腫瘤之凝固性壞死。在一些實施例中，治療包含誘導及/或增加腫瘤中之梗塞。在一些實施例中，已確定患者具有病原性血管。在一些實施例中，已確定患者具有PLXDC1及/或表現PLXDC1之細胞。在一些實施例中，表現細胞包含內皮細胞。在一些實施例中，表現細胞包含PLXDC1及/或PLXDC2之細胞表面表現。
在一些實施例中，患者先前已藉由其他療法來治療病原性血管相關病症。在一些實施例中，已確定患者對該其他療法不起反應或具有毒性反應。在一些實施例中，該其他療法包含抗血管生成療法。在一些實施例中，該其他療法包含免疫療法。在一些實施例中，患者先前尚未接受對病原性血管相關病症之治療。
在一些實施例中，候選分子為抗體或抗原結合片段。參考PLXDC活化劑可為本發明之方法實施例中之小分子化合物。
在本發明之一些實施例中，細胞包含內皮細胞。在一些實施例中，b)包含測定內皮細胞是否在內皮細胞之細胞表面上表現PLXDC1 (含有叢蛋白域1)或PLXDC2 (含有叢蛋白域2)。在一些實施例中，b)包含使內皮細胞與PLXDC1或PLXDC2結合劑接觸且偵測內皮細胞與結合劑之結合或不存在內皮細胞與結合劑之結合。在一些實施例中，b)包含ELISA、FACS或西方墨點法(western blot)。在一些實施例中，該方法進一步包含測定與對照物相比，細胞中之NFkB活化之程度。在一些實施例中，對照物包含未與結合劑接觸之內皮細胞。在一些實施例中，本發明之方法包含活體外方法。
在一些實施例中，抗原結合片段包含scFv、雙功能抗體或單域抗體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與一或多種銜接多肽結合。在一些實施例中，該一或多種銜接多肽包含血清蛋白質。在一些實施例中，血清蛋白質包含白蛋白。在一些實施例中，該一或多種銜接多肽包含治療性多肽。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與治療劑結合。在一些實施例中，治療劑包含細胞毒性劑。
其他態樣係關於一種方法，其包含在細胞中表現本發明之一或多種核酸且分離自核酸表現之多肽。其他方法態樣係關於包含使本發明之抗體與PLXDC1或PLXDC2多肽接觸之方法。在一些實施例中，PLXDC1或PLXDC2多肽包含域A。在一些實施例中，PLXDC1或PLXDC2多肽包含域B。在一些實施例中，PLXDC多肽包含域C。在一些實施例中，PLXDC1或PLXDC2多肽包含域D。在一些實施例中，PLXDC1或PLXDC2多肽包含域E。本發明之其他態樣係關於一種方法，其包含針對一或多種污染物來測試本發明之組合物。
在某些實施例中，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥，其中式(I)為
Figure 02_image003
， 其中，n、R1 、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 及R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含如本文中所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，提供一種用於治療有需要之個體中之至少部分由PLXDC1或PLXDC2介導之疾病或病症之方法，該方法包含向個體投與有效量之化合物或醫藥組合物，該化合物或醫藥組合物包含如本文中所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
本發明亦提供化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以調節PLXDC之藥劑。此外，本發明提供化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以治療至少部分由PLXDC1或PLXDC2介導之疾病、病症或病狀之藥劑。
本發明亦提供化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於治療疾病，諸如癌症、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及年齡相關之黃斑變性。
其他適用於本發明之方法及組合物中之實施例及分析法描述於美國專利申請案第62/923029號、第62/916997號及第62/916983號中，其各自以引用之方式併入本文中。此外，美國專利申請案第62/923029號及第62/916997號中描述之分析法可用於測定本文中所描述之藥劑之活性。
尤其涵蓋關於本發明之一個實施例所論述的任何限制可應用於本發明之任何其他實施例。此外，本發明之任何組合物可用於本發明之任何方法中，且本發明之任何方法可用於產生或利用本發明之任何組合物。實例中所闡述之實施例之態樣亦為可在不同實例中之其他地方或本申請案中之其他地方(諸如發明內容、實施方式、申請專利範圍及圖式簡單說明中)所論述之實施例之情形中實施的實施例。
本發明之其他目的、特徵及優點將自以下詳細說明而變得顯而易見。然而，應理解，詳細說明及特定實例儘管指示本發明之特定實施例，但僅以說明方式給出，因為在本發明之精神及範疇內的各種變化及修改將由此詳細說明而變得對熟習此項技術者顯而易見。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年10月18日申請之美國臨時申請案第62/916,953號在35 U.S.C. § 119(e)下之權利，其內容以全文引用之方式併入本發明中。
PLXDC1及PLXDC2在不同類型之癌症之腫瘤血管(Beaty等人, 2007；Lu等人, 2007；Schwarze等人, 2005；St Croix等人, 2000；van Beijnum等人, 2009)及糖尿病性視網膜病變中之病原性血管(Yamaji等人, 2008)中高度特異性表現。健康血管中不存在此高度富集(Beaty等人, 2007；Lu等人, 2007；Schwarze等人, 2005；St Croix等人, 2000；van Beijnum等人, 2009)。亦在脈絡膜新生血管(年齡相關之黃斑變性(AMD)中之病原性血管生成)及局部缺血誘導之視網膜病(早產兒視網膜病變中之病原性血管生成)中發現大量PLXDC1表現。
並非所有結合於PLXDC1或PLXDC2之胞外結構域之藥劑皆可活化此等受體以殺傷內皮細胞。舉例而言，PLXDC1結合蛋白質，巢蛋白，不具有殺傷病原性血管之治療作用。已研發抗PLXDC1抗體作為潛在的抗血管生成療法。在Bagley等人,Microvasc Res. 2011年11月;82(3):253-62中，發現介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及吞噬作用之抗PLXDC1抗體。然而，此方法中之抗體依賴於ADCC，且未經設計以活化PLXDC1以殺傷內皮細胞而不損傷免疫系統。色素上皮衍生因子(PEDF)為PLXDC1及PLXDC2之天然配位體。然而，PEDF與PLXDC1或PLXDC2之結合亦未提供治療作用，如在離體/活體外模型中證明(實例1)。
本發明人研發一種新穎的陣列PLXDC1/PLXDC2結合劑，其在表現PLXDC1/PLXDC2之內皮細胞中誘導細胞死亡。此新穎的治療形式與促進ADCC之當前抗血管生成策略及當前免疫療法策略不同。如本申請案之圖式及實例中所示，此等新穎的藥劑提供與其他PLXDC1或PLXDC2靶向策略不同，且亦與抗血管生成藥物(諸如抗VEGF藥物或PEDF)不同的作用。
實例1-3提供用於篩選及鑑別可有效地引起現有腫瘤血管壞死及殺傷現有腫瘤血管之癌症治療劑(諸如小分子藥物及抗體(實例1-7))之例示性方法。特定言之，基於優先結合於由小分子活化劑活化之PLXDC1或PLXDC2之能力來鑑別適合的抗體。因為小分子活化劑促進PLXDC1或PLXDC2之活化構形，因此預期在存在活化劑之情況下優先結合於此等蛋白質之抗體可促進活化構形且能夠活化PLXDC1或PLXDC2蛋白質。
預期PLXDC1或PLXDC2在基礎狀態下形成二聚體。亦預期本發明之小分子及抗體優先結合於蛋白質之胺基酸殘基，該等胺基酸殘基在基礎狀態下可阻礙受體或使受體不穩定。此類胺基酸殘基在蛋白質處於二聚體/基礎狀態時不在蛋白質之表面上暴露。較佳地，此類殘基在二聚體界面上。其亦可為僅在二聚體解離時暴露之殘基。在一些實施例中，與殘基之結合可改變蛋白質在基礎狀態下之構形。
由抗體篩選方法證明活化抗體優先結合於未暴露之胺基酸殘基。針對抗體在存在小分子活化劑之情況下結合於PLXDC蛋白質(其促進活化構形)之能力來篩選抗體。
此亦解釋為何並非所有結合於PLXDC1/PLXDC2之配位體皆可將其活化或殺傷表現PLXDC1/PLXDC2之內皮細胞(例如腫瘤內皮細胞)。如所提供，巢蛋白，一種細胞外基質蛋白，結合於PLXDC1，但不能活化PLXDC1或殺傷表現PLXDC1之內皮細胞。又，由習知方法獲得之抗體不能活化PLXDC1/PLXDC2，因為其僅可結合於暴露之胺基酸殘基。
意外發現此類抗體及化合物。據本發明人所知，所有現有抗體藥物皆為中和抗體或靶向抗體。中和抗體抑制配位體/受體相互相用，諸如修美樂(抑制TNF-α，一種配位體)、阿瓦斯汀(抑制VEGF，一種配位體)、赫賽汀(抑制HER2，一種受體)及克珠達(抑制PD-1，一種受體)。靶向抗體可經由諸如抗體-藥物結合物及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之機制來發揮其功能。尚未發現活化抗體，尤其針對單一跨膜細胞表面受體(如PLXDC1/PLXDC2)之抗體。
此等新的治療劑可經由相關下游生物路徑引起腫瘤血管死亡。此表明本文中研發之組織模型及篩選技術之有效性。尚未報導此類藉由殺傷現有腫瘤血管來殺傷腫瘤之作用。預期此等藥劑經由活化PLXDC1或PLXDC2來活化腫瘤血管壞死。因此，本發明提供新的用於有效腫瘤治療之技術。因為PLXDC1及PLXDC2存在於許多腫瘤類型中且血管生成通常對於腫瘤發育而言係重要的，此新技術呈現用於跨越腫瘤類型之腫瘤治療之新方向。 I.         定義
如本文中所使用，術語「治療(treat/treatment)」係指治療性治療及防治性或預防性措施，其中目標為預防或減緩(減輕)不合需要的生理學變化或病症，諸如癌症或病原性血管病症之進程。有利或所需臨床結果結果包括(但不限於)症狀緩解、疾病病況減輕、疾病狀態穩定(亦即，未惡化)、疾病進程延緩或減緩、疾病病況改善或減輕以及緩解(部分或完全)，該等結果為可偵測或不可偵測的。「治療」亦可意謂與未接受治療之預期存活期相比延長存活期。需要治療之個體包括已患有病狀或病症之個體以及易於罹患病狀或病症之個體，或應預防病狀或病症之個體。
術語「藥劑」或「治療劑」在本文中用於表示化合物、小分子、化合物及/或生物學大分子(諸如核酸、抗體、抗體片段、蛋白質或肽)之混合物。此類藥劑之活性可使其適合作為「治療劑」，其為一或多種在個體中局部或全身性起作用之生物學、生理學或藥理學活性物質。
如本文中所使用，術語「活化劑」係指任何經由PLXDC1/PLXDC2來誘導細胞中之信號轉導變化之藥劑。
術語「小分子」為此項技術中之術語且包括小於約2000分子量或甚至小於約1000分子量之分子。在某些實施例中，小分子不包含複數個肽鍵。在某些較佳實施例中，小分子不為寡聚的。可針對活性來進行篩選之例示性小分子化合物包括(但不限於)肽、肽模擬物、核酸、碳水化合物、有機小分子(例如聚酮化合物)(Cane等人 (1998)Science 282:63)及天然產物提取物庫。在某些實施例中，化合物為小型、有機非肽化合物。
「個體」或「受試者」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂任何需要診斷、預後或療法之個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、家畜、農畜及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
病原性血管係與正常器官之血管形成無關，但涉及病原性組織之血管，該等病原性組織諸如為引發視力疾病之新的血管或腫瘤中之腫瘤賴以存活之血管。在一些實施例中，「病原性血管」係指可使患病組織，例如腫瘤血管化之現有血管。在其他實施例中，病原性血管可為一種血管，其為涉及例如癌症、糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變及/或任何其他具有與血管生成相關聯之病源學之疾病的疾病發作及/或進程之新近形成之血管。
遍及本申請，術語「約」係根據其在細胞及分子生物學領域中之簡單及一般含義使用，以指示值包括用於測定該值之裝置或方法之誤差之標準差。
當與術語「包含」結合使用時，字組「一(a/an)」之使用可意謂「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或多於一個」之含義相符。
如本文中所使用，術語「或」及「及/或」用於描述呈組合形式或彼此排斥之多個組分。舉例而言，「x、y及/或z」可指單獨的「x」、單獨的「y」、單獨的「z」、「x、y及z」、「(x及y)或z」、「x或(y及z)」或「x或y或z」。尤其涵蓋x、y或z可特定地自實施例排除。
字組「包含(comprising)」(及包含(comprising)之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有(having)之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括(including)之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)、「特徵在於」(或包括之任何形式，諸如「表徵為」)或「含有(containing)」(及含有(containing)之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放性的且不排除其他未列出之元素或方法步驟。
組合物及方法在使用時可「包含本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟」、「基本上由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」或「由本說明書通篇中所揭示之任何成分或步驟組成」。片語「由……組成」不包括未指定之任何要素、步驟、成分或組分。片語「基本上由……組成」將所描述之標的物之範疇限於所指定之材料或步驟及不會顯著影響其基本及新穎特徵之材料或步驟。預期在術語「包含」之情形下描述之實施例亦可在術語「由……組成」或「基本上由……組成」之情形下實施。 II.       與PLXDC1/PLXDC2之結合
術語「含有叢蛋白域之蛋白質」或「PLXDC」係指小型跨膜受體家族，其包括PLXDC1及PLXDC2。PLXDC蛋白質具有大型細胞外部分、跨膜結構域且共有高序列同源性。PLXDC蛋白質可為(但不限於)PLXDC1或PLXDC2。
PLXDC1具有如NCBI參考序列中所示之蛋白質序列：NP_065138.2：MRGELWLLVLVLREAARALSPQPGAGHDEGPGSGWAAKGTVRGWNRRARESPGHVSEPDRTQLSQDLGGGTLAMDTLPDNRTRVVEDNHSYYVSRLYGPSEPHSRELWVDVAEANRSQVKIHTILSNTHRQASRVVLSFDFPFYGHPLRQITIATGGFIFMGDVIHRMLTATQYVAPLMANFNPGYSDNSTVVYFDNGTVFVVQWDHVYLQGWEDKGSFTFQAALHHDGRIVFAYKEIPMSVPEISSSQHPVKTGLSDAFMILNPSPDVPESRRRSIFEYHRIELDPSKVTSMSAVEFTPLPTCLQHRSCDACMSSDLTFNCSWCHVLQRCSSGFDRYRQEWMDYGCAQEAEGRMCEDFQDEDHDSASPDTSFSPYDGDLTTTSSSLFIDSLTTEDDTKLNPYAGGDGLQNNLSPKTKGTPVHLGTIVGIVLAVLLVAAIILAGIYINGHPTSNAALFFIERRPHHWPAMKFRSHPDHSTYAEVEPSGHEKEGFMEAEQC (SEQ ID NO:1)，PLXDC2具有NCBI參考序列之序列：NP_116201.7：MARFPKADLAAAGVMLLCHFFTDQFQFADGKPGDQILDWQYGVTQAFPHTEEEVEVDSHAYSHRWKRNLDFLKAVDTNRASVGQDSPEPRSFTDLLLDDGQDNNTQIEEDTDHNYYISRIYGPSDSASRDLWVNIDQMEKDKVKIHGILSNTHRQAARVNLSFDFPFYGHFLREITVATGGFIYTGEVVHRMLTATQYIAPLMANFDPSVSRNSTVRYFDNGTALVVQWDHVHLQDNYNLGSFTFQATLLMDGRIIFGYKEIPVLVTQISSTNHPVKVGLSDAFVVVHRIQQIPNVRRRTIYEYHRVELQMSKITNISAVEMTPLPTCLQFNRCGPCVSSQIGFNCSWCSKLQRCSSGFDRHRQDWVDSGCPEESKEKMCENTEPVETSSRTTTTVGATTTQFRVLTTTRRAVTSQFPTSLPTEDDTKIALHLKDNGASTDDSAAEKKGGTLHAGLIIGILILVLIVATAILVTVYMYHHPTSAASIFFIERRPSRWPAMKFRRGSGHPAYAEVEPVGEKEGFIVSEQC (SEQ ID NO:2，同功異型物1)或NP_001269665：MARFPKADLAAAGVMLLCHFFTDQFQFADGKPGDQILDWQYGVTQAFPHTEEEVEVDSHAYSHRWKRNLDFLKAVDTNRASVGQDSPEPRSFTDLLLDDGQDNNTQIERVNLSFDFPFYGHFLREITVATGGFIYTGEVVHRMLTATQYIAPLMANFDPSVSRNSTVRYFDNGTALVVQWDHVHLQDNYNLGSFTFQATLLMDGRIIFGYKEIPVLVTQISSTNHPVKVGLSDAFVVVHRIQQIPNVRRRTIYEYHRVELQMSKITNISAVEMTPLPTCLQFNRCGPCVSSQIGFNCSWCSKLQRCSSGFDRHRQDWVDSGCPEESKEKMCENTEPVETSSRTTTTVGATTTQFRVLTTTRRAVTSQFPTSLPTEDDTKIALHLKDNGASTDDSAAEKKGGTLHAGLIIGILILVLIVATAILVTVYMYHHPTSAASIFFIERRPSRWPAMKFRRGSGHPAYAEVEPVGEKEGFIVSEQC (SEQ ID NO:3，同功異型物2)。其域結構展示於以下表 1 及 2 中。表 1. PLXDC 蛋白質之對準及大致域結構
PLXDC1        ---------MRGELWLLVLVLREAARALSPQPGAGHDEGPGSGWA---------------          36 PLXDC2_1      MARFPKADLAAAGVMLLCHFFTDQFQFADGKPGD-----QILDWQYGVTQAFPHTEEEVE                   55 PLXDC2_2      MARFPKADLAAAGVMLLCHFFTDQFQFADGKPGD-----QILDWQYGVTQAFPHTEEEVE                   55                                          _________________________________                                                                     域A    PLXDC1        --AKGTVRGWNRRARESPGHVSEPDRTQLSQDLG----GGTLAMDTLPDNRTR-VVEDNH                   89 PLXDC2_1      VDSHAYSHRWKRNLDFLK--AVDTNRASVGQDSPEPRSFTDLLLDDGQDNNTQIEEDTDH                   113 PLXDC2_2      VDSHAYSHRWKRNLDFLK--AVDTNRASVGQDSPEPRSFTDLLLDDGQDNNTQIE-----                   108               ____________________________________________________________                                            域A    PLXDC1        SYYVSRLYGPSEPHSRELWVDVAEANRSQVKIHTILSNTHRQASRVVLSFDFPFYGHPLR                   149 PLXDC2_1      NYYISRIYGPSDSASRDLWVNIDQMEKDKVKIHGILSNTHRQAARVNLSFDFPFYGHFLR                   173 PLXDC2_2      --------------------------------------------RVNLSFDFPFYGHFLR                 124               ______________________________________======================                               域A                            域B    PLXDC1        QITIATGGFIFMGDVIHRMLTATQYVAPLMANFNPGYSDNSTVVYFDNGTVFVVQWDHVY                   209 PLXDC2_1      EITVATGGFIYTGEVVHRMLTATQYIAPLMANFDPSVSRNSTVRYFDNGTALVVQWDHVH                   233 PLXDC2_2      EITVATGGFIYTGEVVHRMLTATQYIAPLMANFDPSVSRNSTVRYFDNGTALVVQWDHVH                   184               ============================================================                                        域B    PLXDC1        LQGWEDKGSFTFQAALHHDGRIVFAYKEIPMSVPEISSSQHPVKTGLSDAFMILNPSPDV                   269 PLXDC2_1      LQDNYNLGSFTFQATLLMDGRIIFGYKEIPVLVTQISSTNHPVKVGLSDAFVVVHRIQQI                   293 PLXDC2_2      LQDNYNLGSFTFQATLLMDGRIIFGYKEIPVLVTQISSTNHPVKVGLSDAFVVVHRIQQI                   244               =================================^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^                               域B                           域C    PLXDC1        PESRRRSIFEYHRIELDPSKVTSMSAVEFTPLPTCLQHRSCDACMSSDLTFNCSWCHVLQ                   329 PLXDC2_1      PNVRRRTIYEYHRVELQMSKITNISAVEMTPLPTCLQFNRCGPCVSSQIGFNCSWCSKLQ                   353 PLXDC2_2      PNVRRRTIYEYHRVELQMSKITNISAVEMTPLPTCLQFNRCGPCVSSQIGFNCSWCSKLQ                   304               ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~                          域C                        域D    PLXDC1        RCSSGFDRYRQEWMDYGCAQEAEGRMCEDFQDEDHDSASPDT------SFSPYDGDLTTT                   383 PLXDC2_1      RCSSGFDRHRQDWVDSGCPEESKEKMCENTEPVETSSRTTTTVGATTTQFRVLT-TTRRA                   412 PLXDC2_2      RCSSGFDRHRQDWVDSGCPEESKEKMCENTEPVETSSRTTTTVGATTTQFRVLT-TTRRA                   363               ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~******************************                            域D                          域E    PLXDC1        SSSLFIDSLTTEDDTKLNPYAGGDGLQ-NNLSPKTKGTPVHLGTIVGIVLAVLLVAAIIL                   442 PLXDC2_1      VTSQFPTSLPTEDDTKIALHLKDNGASTDDSAAEKKGGTLHAGLIIGILILVLIVATAIL                   472 PLXDC2_2      VTSQFPTSLPTEDDTKIALHLKDNGASTDDSAAEKKGGTLHAGLIIGILILVLIVATAIL                   423               ********************************************================                                     域E                         跨膜    PLXDC1        AGIYINGHPTSNAALFFIERRPHHWPAMKFRSHPDHSTYAEVEPSGHEKEGFMEAEQC                   500 PLXDC2_1      VTVYMYHHPTSAASIFFIERRPSRWPAMKFRRGSGHPAYAEVEPVG-EKEGFIVSEQC                   529 PLXDC2_2      VTVYMYHHPTSAASIFFIERRPSRWPAMKFRRGSGHPAYAEVEPVG-EKEGFIVSEQC                   480               =====_____________________________________________________                                         細胞內   
表 2. 域及位置之列表
蛋白質(SEQ ID NO:) 域 胺基酸殘基
PLXDC1 (SEQ ID NO:1) 域A 19-127
域B 128-242
域C 243-292
域D 293-359
域E 360-427
PLXDC2同功異型物1 (SEQ ID NO:2) 域A 31-151
域B 152-266
域C 267-316
域D 317-383
域E 384-454
PLXDC2同功異型物2 (SEQ ID NO:3) 域A 31-108
域B 109-207
域C 208-267
域D 268-334
域E 335-405
A.        PLXDC1及PLXDC2之調節劑
在一些態樣中，本文中提供藉由活化個體中(例如患有癌症之個體中之腫瘤血管中)之PLXDC1及/或PLXDC2蛋白質來治療癌症以及其他特徵在於表現PLXDC1或PLXDC2之病原性血管之疾病及病症之方法。在一些實施例中，活化個體中之PLXDC1及/或PLXDC2受體包含向個體直接投與本文中所描述之藥劑及/或活化劑(例如藉由向個體局部或全身性投與活化劑及/或藥劑)。在某些實施例中，本文中提供之方法係關於藉由使細胞與本文中所揭示之藥劑接觸來活化病原性血管細胞上之PLXDC1及/或PLXDC2。
在一些態樣中，本文中提供用於在個體中治療癌症或誘導壞死(例如凝固性壞死)之方法，其包含向個體投與可增加腫瘤血管細胞上之PLXDC1及/或PLXDC2之活性之藥劑。在一些實施例中，活化劑及/或藥劑為本文中所揭示之小分子(例如式I之分子)。PLXDC1及/或PLXDC2之活化劑可為PLXDC1及/或PLXDC2配位體，諸如本文中所描述之肽。其他活化劑包括小分子及/或抗體(例如本文中所揭示之抗體)。在一些實施例中，局部或全身性投與藥劑。在一些實施例中，可向個體之腫瘤或包含癌性細胞之組織局部投與藥劑及/或活化劑。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域A (SEQ ID NO:1之胺基酸19-127)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B (SEQ ID NO:1之胺基酸128-242)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C (SEQ ID NO:1之胺基酸243-292)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域D (SEQ ID NO:1之胺基酸293-359)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域E (SEQ ID NO:1之胺基酸360-427)。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域E且亦結合於PLXDC1之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域E且亦結合於PLXDC1之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域E且亦結合於PLXDC1之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域E且亦結合於PLXDC1之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域D且亦結合於PLXDC1之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域D且亦結合於PLXDC1之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域D且亦結合於PLXDC1之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域D且亦結合於PLXDC1之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C且亦結合於PLXDC1之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C且亦結合於PLXDC1之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C且亦結合於PLXDC1之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C且亦結合於PLXDC1之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B且亦結合於PLXDC1之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B且亦結合於PLXDC1之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B且亦結合於PLXDC1之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B且亦結合於PLXDC1之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域A且亦結合於PLXDC1之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域A且亦結合於PLXDC1之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域C且亦結合於PLXDC1之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域A且亦結合於PLXDC1之域B。
在一些實施例中，本發明之治療劑不結合於PLXDC1之域B。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域A (SEQ ID NO:2之胺基酸31-151或SEQ ID NO:3之胺基酸31-108)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域B (SEQ ID NO:2之胺基酸152-266或SEQ ID NO:3之胺基酸109-207)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域C (SEQ ID NO:2之胺基酸267-316或SEQ ID NO:3之胺基酸208-267)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域D (SEQ ID NO:2之胺基酸317-383或SEQ ID NO:3之胺基酸268-334)。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域E (SEQ ID NO:2之胺基酸384-454或SEQ ID NO:3之胺基酸335-405)。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域E且亦結合於PLXDC2之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域E且亦結合於PLXDC2之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域E且亦結合於PLXDC2之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域E且亦結合於PLXDC2之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域D且亦結合於PLXDC2之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域D且亦結合於PLXDC2之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域D且亦結合於PLXDC2之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域D且亦結合於PLXDC2之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域C且亦結合於PLXDC2之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域C且亦結合於PLXDC2之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域C且亦結合於PLXDC2之域B。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域C且亦結合於PLXDC2之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域B且亦結合於PLXDC2之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域B且亦結合於PLXDC2之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域B且亦結合於PLXDC2之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC1之域B且亦結合於PLXDC2之域A。
在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域A且亦結合於PLXDC2之域E。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域A且亦結合於PLXDC2之域D。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域A且亦結合於PLXDC2之域C。在一些實施例中，本發明之治療劑至少能夠結合於PLXDC2之域A且亦結合於PLXDC2之域B。
在一些實施例中，本發明之治療劑不結合於PLXDC2之域B。
在一些實施例中，與不存在PLXDC1或PLXDC2活化劑(諸如本文中所揭示之活化劑)之情況相比，本發明之治療劑在存在此類活化劑之情況下更強地結合於PLXDC1或PLXDC2。在一些實施例中，差異為至少10%、20%、50%、100%、2.5倍、3倍、4倍、5倍或10倍。
在一些實施例中，本發明之治療劑與PLXDC1或PLXDC2之結合比PEDF強至少5倍，或至少10、15、20、50、100、1000、104 、105 、106 、107 或108 倍(或其中任何可導出之範圍)。
在一些實施例中，本發明之治療劑(諸如本文中所描述之PLXDC1及/或PLXDC2受體之化合物及抗體調節劑)之結合在結合於PLXDC1及/或PLXDC2時活化細胞內信號傳導路徑。在一些實施例中，本發明之治療劑抑制PLXDC1及/或PLXDC2蛋白質之二聚作用，諸如均聚或雜二聚化。本發明之治療劑可藉由直接結合於蛋白質中之一或多個涉及二聚作用之部分或藉由結合蛋白質且改變其構形使得減少或消除二聚作用來直接抑制二聚作用。
在一些實施例中，藥劑結合於、至少結合或至多結合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(或其中任何可導出之範圍)選自PLXDC1或PLXDC2多肽之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528或529處之胺基酸殘基的胺基酸殘基，諸如由SEQ ID NO:1-3中之任一者例示之胺基酸殘基。亦特定涵蓋本文中所揭示之任何實施例中可不包含此類藥劑。在一些實施例中，藥劑與PLXDC1或PLXDC2或與某一域、抗原決定基或胺基酸殘基之結合之KD 可為至少、至多或約10-4 、10-5 、10-6 、10-7 、10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、10-12 、10-13 、10-14 或10-15 M (或其中任何可導出之範圍)。在一些實施例中，與受體之二聚形式相比，藥劑以更大的親和力結合於PLXDC1及/或PLXDC2之單體形式。舉例而言，單體形式之KD 可小於約10-4 、10-5 、10-6 、10-7 、10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、10-12 、10-13 、10-14 或10-15 M (或其中任何可導出之範圍)，且二聚形式之KD 可大於約10-1 、10-2 、10-3 、10-4 、10-5 或10-6 M (或其中任何可導出之範圍)。
在一些實施例中，抗體為在分析法中活化PLXDC1及/或PLXDC2之抗體，如實例5中表明。在一些實施例中，抗體為在分析法中顯示至少60、65、70、75、80、85、90、95或100%細胞死亡(或其中任何可導出之範圍)之功效之抗體，如實例6或7中表明。
在一些實施例中，本發明之治療劑與含有叢蛋白域之蛋白質之結合能夠引起腫瘤內皮細胞中之一或多種基因之活化，從而引起腫瘤血管死亡及腫瘤壞死。此類基因之非限制性實例包括ADAM17 (ADAM金屬肽酶域17)、BAG4 (BCL2相關永生基因4)、BIRC2 (含有桿狀病毒IAP重複序列之2)、BIRC3 (含有桿狀病毒IAP重複序列之3)、CASP8 (凋亡蛋白酶8)、CAV1 (窖蛋白1)、CHUK (核因子κB激酶複合物之抑制劑之組分)、CYLD (CYLD離胺酸63去泛素化酶)、FADD (Fas相關via死亡域)、IKBKB (核因子κB激酶子單元β之抑制劑)、IKBKG (核因子κB激酶調節性子單元γ之抑制劑)、ITCH (癢E3泛素蛋白質連接酶)、MADD (MAP激酶活化死亡域)、MAP2K3 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶3)、MAP2K7 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶7)、MAP3K1 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1)、MAP3K3 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3)、MAP3K5 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5)、MAP3K7 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶7)、MAP4K2 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶2)、MAP4K3 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3)、MAP4K4 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4)、MAP4K5 (有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶5)、NFKB1 (核因子κB子單元1)、NRK (Nik相關激酶)、NSMAF (中性神經磷脂酶活化相關因子)、PRKCI (蛋白激酶Cι)、PRKCZ (蛋白激酶Cζ)、RACK1 (活化C激酶1之受體)、RBCK1 (含有RANBP2型及C3HC4型鋅指之1)、RELA (RELA原癌基因，NF-κB子單元)、RFFL (含有環指及FYVE樣域之E3泛素蛋白質連接酶)、RIPK1 (與絲胺酸/蘇胺酸激酶1相互作用之受體)、RNF11 (環指蛋白質11)、RNF31 (環指蛋白質31)、SHARPIN (SHANK相關RH域相互作用因子)、SMPD1 (鞘磷脂磷酸二酯酶1)、SMPD2 (鞘磷脂磷酸二酯酶2)、SQSTM1 (隔離體1)、STAT1 (信號轉導與轉錄活化因子1)、TAB1 (TGF-β活化激酶1 (MAP3K7)結合蛋白質1)、TAB2 (TGF-β活化激酶1 (MAP3K7)結合蛋白質2)、TAB3 (TGF-β活化激酶1 (MAP3K7)結合蛋白質3)、TAX1BP1 (Tax1結合蛋白質1)、TNF (腫瘤壞死因子)、TNFAIP3 (TNFα誘導蛋白質3)、TNFRSF1A (TNF受體超家族成員1A)、TNFRSF1B (TNF受體超家族成員1B)、TNIK (TRAF2及NCK相互作用激酶)、TRADD (TNFRSF1A相關via死亡域)、TRAF1 (TNF受體相關因子1)、TRAF2 (TNF受體相關因子2)、TRAF5 (TNF受體相關因子5)及TXN (硫化還原蛋白)。 III.    式I化合物  A.       化學定義
如本說明書中所用，以下字組、片語及符號通常意欲具有如在下文中所闡述之含義，但使用其之上下文另有說明之情況除外。
不在兩個字母或符號之間的短劃線(「-」)用於指示取代基之連接點。舉例而言，-C(O)NH2 經由碳原子連接。在化學基團之前端或末端處之短劃線係出於方便之目的；可在具有或不具有一或多個短劃線之情況下描繪化學基團而不會丟失其普通含義。在結構中描繪為穿過線條的波浪線或虛線指示基團之間的指定連接點。除非化學或結構上需要，否則不由化學基團所書寫或提出的次序指示或暗示方向性或立體化學。
術語「Cx-y 」當與諸如醯基、醯氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基之化學部分結合使用時意謂包括鏈中含有x至y個碳的基團。舉例而言，術語「Cx-y 烷基」係指在鏈中含有x至y個碳之經取代或未經取代之飽和烴基，包括直鏈烷基及分支鏈烷基，包括鹵烷基，諸如三氟甲基及2,2,2-三氟乙基等。C0 烷基在基團位於末端位置時係指氫，位於內部時係指一鍵。術語「C2-y 烯基」及「C2-y 炔基」係指經取代或未經取代之不飽和脂族基團，其具有類似的長度及可能的上文所描述之烷基之取代，但分別含有至少一個雙鍵或參鍵。除非在上下文中以其他方式明確指定，否則單數形式「一」及「該」包括複數個參考物。因此，例如對「化合物」之參考包括複數個此類化合物且對「分析法」之參考包括對一或多種分析法及熟習此項技術者已知的其等效物之參考。
「烷基」係指非分支鏈或分支鏈飽和烴鏈。在一些實施例中，烷基具有所指示之數目之碳原子。在一些實施例中，烷基具有1至40個碳原子(亦即，C1-40 烷基)、1至30個碳原子(亦即，C1-30 烷基)、10至30個碳原子(亦即，C10-30 烷基)、1至20個碳原子(亦即，C1-20 烷基)、1至12個碳原子(亦即，C1-12 烷基)、1至8個碳原子(亦即，C1-8 烷基)、1至6個碳原子(亦即，C1-6 烷基)或1至4個碳原子(亦即，C1-4 烷基)。烷基之實例包括例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、戊基、2-戊基、異戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、二十烷基、二十二烷基及十四烷基。當藉由化學名稱命名或藉由分子式標識具有特定碳數之烷基殘基時，可涵蓋具有該碳數之所有位置異構體；因此，舉例而言，「丁基」包括正丁基(亦即，-(CH2 )3 CH3 )、第二丁基(亦即，-CH(CH3 )CH2 CH3 )、異丁基(亦即，-CH2 CH(CH3 )2 )及第三丁基(亦即，-C(CH3 )3 )；且「丙基」包括正丙基(亦即，-(CH2 )2 CH3 )及異丙基(亦即，-CH(CH3 )2 )。
可使用某些常用替代性化學名稱。舉例而言，諸如二價「烷基」、二價「芳基」等之二價基團亦可分別稱為「伸烷基」、「伸芳基」。又，除非明確指示，否者當本文中將基團之組合稱為一個部分(例如芳基烷基或芳烷基)時，最後提及之基團含有用於使該部分連接至分子之其餘部分之原子。
「烯基」係指含有至少一個碳-碳雙鍵之烷基。在一些實施例中，烯基具有所指示之數目之碳原子。在一些實施例中，烯基具有2至40個碳原子(亦即，C2-40 烯基)、2至30個碳原子(亦即，C2-30 烯基)、10至30個碳原子(亦即，C10-30 烯基)、2至20個碳原子(亦即，C2-20 烯基)、2至8個碳原子(亦即，C2-8 烯基)、2至6個碳原子(亦即，C2-6 烯基)或2至4個碳原子(亦即，C2-4 烯基)。烯基之實例包括例如乙烯基、丙烯基、丁二烯基(包括1,2-丁二烯基及1,3-丁二烯基)。
「炔基」係指含有至少一個碳-碳參鍵之烷基。在一些實施例中，炔基具有所指示之數目之碳原子。在一些實施例中，炔基具有2至40個碳原子(亦即，C2-40 炔基)、2至30個碳原子(亦即，C1-30 炔基)、10至30個碳原子(亦即，C10-30 炔基)、2至20個碳原子(亦即，C2-20 炔基)、2至8個碳原子(亦即，C2-8 炔基)、2至6個碳原子(亦即，C2-6 炔基)或2至4個碳原子(亦即，C2-4 炔基)。術語「炔基」亦包括具有一個參鍵及一個雙鍵之基團。
「烷氧基」係指基團「烷基-O-」。在一些實施例中，烷氧基具有1至40個碳原子(亦即，-O-C1-40 烷基)、1至30個碳原子(亦即，-O-C1-30 烷基)、10至30個碳原子(亦即，-O-C10-30 烷基)、1至20個碳原子(亦即，-O-C1-20 烷基)、1至12個碳原子(亦即，-O-C1-12 烷基)、1至8個碳原子(亦即，-O-C1-8 烷基)、1至6個碳原子(亦即，-O-C1-6 烷基)或1至4個碳原子(亦即，-O-C1-4 烷基)。烷氧基之實例包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基、正己氧基及1,2-二甲基丁氧基。
「烯氧基」係指基團「烯烴-O-」。在一些實施例中，烯氧基具有2至40個碳原子(亦即，-O-C2-40 烯烴)、2至30個碳原子(亦即，-O-C2-30 烯烴)、10至30個碳原子(亦即，-O-C10-30 烯烴)、2至20個碳原子(亦即，-O-C2-20 烯烴)、2至12個碳原子(亦即，-O-C2-12 烯烴)、2至8個碳原子(亦即，-O-C2-8 烯烴)、2至6個碳原子(亦即，-O-C2-6 烯烴)或2至4個碳原子(亦即，-O-C2-4 烯烴)。
「炔氧基」係指基團「炔烴-O-」。在一些實施例中，炔氧基具有1至40個碳原子(亦即，-O-C2-40 炔烴)、2至30個碳原子(亦即，-O-C2-30 烯烴)、10至30個碳原子(亦即，-O-C10-30 炔烴)、2至20個碳原子(亦即，-O-C2-20 炔烴)、2至12個碳原子(亦即，-O-C2-12 炔烴)、2至8個碳原子(亦即，-O-C2-8 炔烴)、2至6個碳原子(亦即，-O-C2-6 炔烴)或2至4個碳原子(亦即，-O-C2-4 炔烴)。
「胺基」係指基團-NRy Rz ，其中Ry 及Rz 獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、雜烷基或雜芳基；其中每一者可視情況經取代，如本文中所定義。
「芳基」係指具有單個環(例如單環)或多個環(例如雙環或三環)之包括稠合系統之芳族碳環基。在一些實施例中，芳基具有6至20個環碳原子(亦即，C6-20 芳基)、6至12個環碳原子(亦即，C6-12 芳基)或6至10個環碳原子(亦即，C6-10 芳基)。芳基之實例包括例如苯基、萘基、茀基及蒽基。然而，芳基不以任何方式涵蓋下文所定義之雜芳基或與其重疊。若一或多個芳基與雜芳基稠合，則所得環系統為雜芳基。若一或多個芳基與雜環基稠合，則所得環系統為雜環基。
「芳基烷基」或「芳烷基」係指基團「芳基-烷基-」。
「羧基酯」或「酯」係指-OC(O)Rx 及-C(O)ORx ，其中Rx 為烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、雜烷基或雜芳基；其中每一者可視情況經取代，如本文中所定義。
如本文中所使用，「羧基」係指-CO2 H或其鹽。可使用之例示性相對離子包括(但不限於)Na+ 、K+ 、Li+ 、NH4 + 及本文中所描述之其他相對離子。
「環烷基」係指具有單個環或多個環之包括稠合、橋聯及螺環系統之飽和或部分不飽和環烷基。術語「環烷基」包括環烯基(亦即，具有至少一個雙鍵之環狀基團)及具有至少一個sp3 碳原子之碳環稠合環系統(亦即，至少一個非芳族環)。在一些實施例中，環烷基具有3至20個環碳原子(亦即，C3-20 環烷基)、3至12個環碳原子(亦即，C3-12 環烷基)、3至10個環碳原子(亦即，C3-10 環烷基)、3至8個環碳原子(亦即，C3-8 環烷基)或3至6個環碳原子(亦即，C3-6 環烷基)。單環基團包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。多環環烷基係指具有至少兩個環之環烷基，其可為稠合、橋聯或螺環系統。多環基團包括例如雙環[2.2.1]庚烷基、雙環[2.2.2]辛烷基、金剛烷基、降冰片烷基、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚烷基及其類似基團。「螺環烷基」係指其中至少兩個環藉由一個共用原子連接在一起之多環環烷基，例如螺[2.5]辛烷基、螺[4.5]癸基或螺[5.5]十一烷基。螺環烷基可在環系統中含有稠合環，但非橋聯環。「稠合環烷基」係指其中至少兩個環藉由兩個共用原子連接在一起之多環環烷基，其中該兩個共用原子經由共價鍵連接。稠合環烷基在環系統中不含任何螺環或橋聯環。「橋聯環烷基」係指含有橋之多環環烷基，該橋為連接兩個「橋頭」原子之伸烷基(諸如C1-4 伸烷基)。橋聯環烷基之非限制性實例包括雙環[2.2.1]庚烷基、雙環[2.2.2]辛烷基、金剛烷基、降冰片烷基及7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚烷基。橋聯環烷基可在環系統中含有稠合環及/或螺環。此外，術語環烷基意欲涵蓋任何可與芳環稠合之非芳族環，與分子其餘部分之連接無關。
「鹵素」或「鹵基」係指佔據元素週期表之VIIA族的原子，諸如氟、氯、溴或碘。
「鹵烷基」係指如上文所定義之非分支鏈或分支鏈烷基，其中一或多個(例如1至6、1至5或1至3個)氫原子經鹵素置換。舉例而言，在殘基經超過一個鹵素取代之情況下，其可藉由使用對應於所連接之鹵素部分之數目之前綴來提及。二鹵烷基及三鹵烷基係指經兩個(「二」)或三個(「三」)鹵基取代之烷基，該等鹵基可為(但並非必須為)相同鹵素。鹵烷基之實例包括例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基及其類似基團。
「鹵烷氧基」係指如上文所定義之烷氧基，其中一或多個(例如1至6、1至5或1至3個)氫原子經鹵素置換。
「羥基烷基」係指如上文所定義之烷基，其中一或多個(例如1至6、1至5或1至3個)氫原子經羥基置換。羥基烷基之非限制性實例為-(CH2 )1-4 -OH。
「雜烷基」係指其中一或多個(但並非所有)碳原子(及任何相關氫原子)各自獨立地經相同或不同雜原子基團置換之烷基，其限制條件為與分子之其餘部分之連接點係經由碳原子。術語「雜烷基」包括具有碳及雜原子之非分支鏈或分支鏈飽和鏈。作為實例，1、2或3個碳原子可獨立地由相同或不同的雜原子基團置換。雜原子基團包括(但不限於)-NRy -、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及其類似基團，其中Ry 為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、雜烷基或雜芳基；其中每一者可視情況經取代，如本文中所定義。雜烷基之實例包括例如醚(例如-CH2 OCH3 、-CH(CH3 )OCH3 、-CH2 CH2 OCH3 、-CH2 CH2 OCH2 CH2 OCH3 等)、硫醚(例如-CH2 SCH3 、-CH(CH3 )SCH3 、-CH2 CH2 SCH3 、-CH2 CH2 SCH2 CH2 SCH3 等)、碸(例如-CH2 S(O)2 CH3 、-CH(CH3 )S(O)2 CH3 、-CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-CH2 CH2 S(O)2 CH2 CH2 OCH3 等)及胺(例如-CH2 NRy CH3 、-CH(CH3 )NRy CH3 、-CH2 CH2 NRy CH3 、-CH2 CH2 NRy CH2 CH2 NRy CH3 等，其中Ry 為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、雜烷基或雜芳基；其中每一者可視情況經取代，如本文中所定義)。在一些實施例中，雜烷基包括1至10個碳原子(C1-10 雜烷基)、1至8個碳原子(C1-8 雜烷基)或1至4個碳原子(C1-4 雜烷基)；及1至3個雜原子、1至2個雜原子或1個雜原子。
「雜芳基」係指具有單個環、多個環或多個稠合環之芳族基團，其中一或多個環雜原子獨立地選自氮、氧及硫。如本文中所使用，雜芳基包括1至20個環碳原子(亦即，C1-20 雜芳基)、3至12個環碳原子(亦即，C3-12 雜芳基)或3至8碳環原子(亦即，C3-8 雜芳基)，以及獨立地選自氮、氧及硫之1至5個雜原子、1至4個雜原子、1至3個環雜原子、1至2個環雜原子或1個環雜原子。在某些情況下，雜芳基包括5-10員環系統、5-7員環系統或5-6員環系統，其各自獨立地具有獨立地選自氮、氧及硫之1至4個環雜原子、1至3個環雜原子、1至2個環雜原子或1個環雜原子。雜芳基之實例包括例如吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并萘并呋喃基、苯并㗁唑基、苯并噻吩基(benzothienyl/benzothiophenyl)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、㖕啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異吲哚基、異喹啉基、異㗁唑基、㖠啶基、㗁二唑基、㗁唑基、1-氧離子基吡啶基、1-氧離子基嘧啶基、1-氧離子基吡𠯤基、1-氧離子基噠𠯤基、啡𠯤基、酞𠯤基、喋啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡𠯤基、嘧啶基、噠𠯤基、喹唑啉基、喹喏啉基、喹啉基、
Figure 109136020-A0101-12-0018-1
啶基、異喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基及三𠯤基。稠合雜芳環之實例包括(但不限於)苯并[d]噻唑基、喹啉基、異喹啉基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并[d]咪唑基、吡唑并[1,5-a]吡啶基及咪唑并[1,5-a]吡啶基，其中該雜芳基可經由稠合系統之任一個環結合。具有單個或多個稠合環、含有至少一個雜原子之任何芳族環視為雜芳基，與分子之其餘部分之連接無關(亦即，經由稠合環中之任一者)。雜芳基不涵蓋如上文所定義之芳基或與其重疊。
「雜環基」係指具有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個環雜原子的飽和或部分不飽和環烷基。術語「雜環基」包括雜環烯基(亦即，具有至少一個雙鍵之雜環基)、橋聯雜環基、稠合雜環基及螺雜環基。雜環基可為其中多環可為稠合環、橋聯環或螺環之單環或多環，且可包含一或多個(例如1至3個)側氧基(=O)部分或N-氧化物(-O- )部分。將含有至少一個雜原子之任何非芳族環視為雜環基，與連接無關(亦即，可經由碳原子或雜原子結合)。此外，術語雜環基意欲涵蓋含有至少一個雜原子之任何非芳族環，該環可與芳環或雜芳環稠合，與分子之其餘部分之連接無關。如本文中所使用，雜環基具有2至20個環碳原子(亦即，C2-20 雜環基)、2至12個環碳原子(亦即，C2-12 雜環基)、2至10個環碳原子(亦即，C2-10 雜環基)、2至8個環碳原子(亦即，C2-8 雜環基)、3至12個環碳原子(亦即，C3-12 雜環基)、3至8個環碳原子(亦即，C3-8 雜環基)或3至6個環碳原子(亦即，C3-6 雜環基)；具有獨立地選自氮、硫或氧之1至5個環雜原子、1至4個環雜原子、1至3個環雜原子、1至2個環雜原子或1個環雜原子。在某些情況下，雜環基包括具有總共3-10個環原子之3至10員雜環基、具有總共5-7個環原子之5至7員雜環基或具有總共5或6個環原子之5或6員雜環基。雜環基之實例包括例如氮雜環丁烷基、氮呯基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并[b][1,4]二氧呯基、1,4-苯并二㗁烷基、苯并哌喃基、苯并間二氧雜環己烯基、苯并哌喃酮基、苯并呋喃酮基、二氧戊環基、二氫哌喃基、氫哌喃基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氫異喹啉基、呋喃酮基、咪唑啉基、咪唑啶基、吲哚啉基、吲哚𠯤基、異吲哚啉基、異噻唑啶基、異㗁唑啶基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-側氧基哌𠯤基、2-側氧基哌啶基、2-側氧基吡咯啶基、㗁唑啶基、環氧乙烷基、氧雜環丁烷基、啡噻𠯤基、啡㗁 𠯤基、哌啶基、哌𠯤基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、吡唑啶基、
Figure 109136020-A0101-12-0018-1
啶基、噻唑啶基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、三噻烷基、四氫喹啉基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、四氫哌喃基、硫嗎啉基、噻嗎啉基、1-側氧基-硫嗎啉基及1,1-二側氧基-硫嗎啉基。當至少兩個環藉由一個共用原子連接在一起時，術語「雜環基」亦包括「螺雜環基」。螺雜環基環之實例包括例如雙環及三環系統，諸如2-氧雜-7-氮雜螺[3.5]壬烷基、2-氧雜-6-氮雜螺[3.4]辛烷基及6-氧雜-1-氮雜螺[3.3]庚烷基。稠合雜環基環之實例包括(但不限於)1,2,3,4-四氫異喹啉基、4,5,6,7-四氫噻吩并[2,3-c]吡啶基、吲哚啉基及異吲哚啉基，其中雜環基可經由稠合系統之任一個環結合。雜環基之實例包括糖部分，諸如葡萄糖、甘露糖、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖及塔羅糖(talose)。
如本文中所使用，術語「烷硫基」或「硫烷基」係指-S-烷基，其中術語烷基係如本文中所定義。
如本文中所使用，術語「磺醯胺基」係指-NRg S(=O)2 Rh 及-S(=O)2 NRg Rh ，其中Rg 及Rh 中之每一者獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硫烷基、芳基、芳基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、鹵烷基、雜環基、雜環基-烷基、雜芳基或雜芳基-烷基，且此外其中各Rg 及Rh 可視情況經取代，如本文中所定義。
如本文中所使用，術語「亞磺醯胺基」係指-NRg S(=O)Rh 及-S(=O)NRg Rh ，其中Rg 及Rh 中之每一者獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硫烷基、芳基、芳基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、鹵烷基、雜環基、雜環基-烷基、雜芳基或雜芳基-烷基，且此外其中各Rg 及Rh 可視情況經取代，如本文中所定義。
術語「亞碸」或「亞碸基」係指基團-S(=O)-Rg ，其中Rg 為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硫烷基、芳基、芳基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、鹵烷基、雜環基、雜環基-烷基、雜芳基或雜芳基-烷基，且此外其中Rg 可視情況經取代，如本文中所定義。
術語「磺醯基」係指基團-S(O)2 -Rg ，其中Rg 為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硫烷基、芳基、芳基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、鹵烷基、雜環基、雜環基-烷基、雜芳基或雜芳基-烷基，且此外其中Rg 可視情況經取代，如本文中所定義。「糖部分」係指糖分子(諸如單醣分子，包括葡萄糖(亦稱為右旋糖)、果糖、半乳糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖及塔羅糖)之單價自由基。如本文中所使用，糖部分為經OH及/或羥烷基取代之雜環基。然而，應理解，糖部分可以線形形式存在，如經側氧基及OH基團取代之烷基。
術語「視情況存在」或「視情況」意謂隨後所描述之事件或情形可發生或可不發生，且該描述包括該事件或情形發生之情況及該事件或情形不發生之情況。又，術語「視情況經取代」係指指定原子或基團上之任一或多個(例如1至5或1至3個)氫原子可經或可不經除氫以外之部分置換。
在某些實施例中，「經取代」包括其中一或多個(例如1至5個或1至3個)氫原子獨立地經鹵基、氰基、硝基、疊氮基、側氧基、烷基、烯基、炔基、鹵烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NRg Rh 、-C(NRg )Rh 、-C(NRg )(NRh 2 )、-NRg C(=O)Rh 、-NRg C(=O)NRg Rh 、-NRg C(=O)ORh 、-NRg S(=O)1-2 Rh 、-C(=O)Rg 、-C(=O)ORg 、-OC(=O)ORg 、-OC(=O)Rg 、-C(=O)NRg Rh 、-OC(=O)NRg Rh 、-ORg 、-SRg 、-S(=O)Rg 、-S(=O)2 Rg 、-OS(=O)1-2 Rg 、-S(=O)1-2 ORg 、-NRg S(=O)1-2 NRg Rh 、=NSO2 Rg 、=NORg 、-S(=O)1-2 NRg Rh 、-CRg (=NOH)、-NRg C(=NRh )(NRh Rh )、-SF5 、-SCF3 或-OCF3 置換之以上烷基、雜烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基中之任一者。在某些實施例中，「經取代」亦意謂其中一或多個(例如1至5個或1至3個)氫原子經-C(=O)Rg 、-C(=O)ORg 、-C(=O)NRg Rh 、-CH2 SO2 Rg 或-CH2 SO2 NRg Rh 置換之以上基團中之任一者。在前述內容中，Rg 及Rh 中之每一者獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硫烷基、芳基、芳烷基、環烷基、環烷基-烷基、鹵烷基、雜環基、雜環基-烷基、雜芳基及/或雜芳基-烷基。在某些實施例中，「經取代」亦意謂其中一或多個(例如1至5個或1至3個)氫原子經鹵基、羥基、烷基、烷基羥基或側氧基置換之以上中基團之任一者。
藉由用無限地附加之其他取代基(例如，具有經取代之烷基的經取代之芳基，該經取代之烷基本身由經取代之芳基取代，該經取代之芳基進一步由經取代之雜烷基取代等)定義取代基所獲得之聚合物或類似的無限結構並不意欲包括在本文中。除非另外說明，否則本文中所描述之化合物中的連續取代之最大數目為三。舉例而言，用兩個其他經取代之芳基連續取代經取代之芳基限於經(經(經取代之芳基)取代之芳基)取代之芳基。類似地，以上定義不意欲包括不允許之取代模式(例如，經5個氟取代之甲基或具有兩個相鄰氧環原子之雜芳基)。此類不允許之取代模式為熟習此項技術者所熟知的。
在某些實施例中，如本文中所使用，片語「一或多個」係指一至五個。在某些實施例中，如本文中所使用，片語「一或多個」係指一至三個。
本文中提供之任何化合物或結構亦意欲表示化合物之未經標記之形式以及經同位素標記之形式。化合物之此等形式亦可稱為「經同位素增濃之類似物」。除一或多個原子由具有所選擇之原子質量或質量數之原子置換以外，經同位素標記之化合物具有本文中所描繪之結構。可併入所揭示之化合物中的同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯及碘之同位素，諸如分別為2 H、3 H、11 C、13 C、14 C、13 N、15 N、15 O、17 O、18 O、31 P、32 P、35 S、18 F、36 Cl、123 I及125 I。本發明之經各種同位素標記之化合物，例如將諸如3 H或14 C之放射性同位素併入其中之化合物。此類經同位素標記之化合物可適用於代謝研究；反應動力學研究；偵測或成像技術，諸如正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子放射電腦斷層攝影術(SPECT)，包括藥物或受質組織分佈分析；或適用於個體之放射性治療。
術語「經同位素增濃之類似物」包括本文中所描述之化合物的「氘化類似物」，其中一或多個氫(諸如碳原子上之氫)經氘置換。此類化合物可呈現增加之代謝抗性，且因此適用於在向哺乳動物(尤其人類)投與時延長任何化合物之半衰期。參見例如Foster, 「Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism,」 Trends Pharmacol. Sci. 5(12):524-527 (1984)。此類化合物係藉由此項技術中熟知之手段合成，舉例而言，藉由使用其中一或多個氫已由氘置換之起始物質。
本發明之經氘標記或取代之治療性化合物可具有經改良之DMPK (藥物代謝及藥物動力學)特性，該等特性與分佈、代謝及排泄(ADME)相關。用較重的同位素(諸如氘)進行取代可得到由更大的代謝穩定性產生之某些治療性優點，例如延長之活體內半衰期、降低之劑量需求及/或治療指數之改良。經18 F、3 H、11 C標記之化合物可適用於PET或SPECT或其他成像研究。本發明之經同位素標記之化合物通常可藉由進行流程中或下文所描述之實例及製備方法中所揭示之程序，藉由用可容易獲得的經同位素標記之試劑取代未經同位素標記之試劑來製備。
此類較重同位素(特定言之，氘)之濃度可由同位素增濃因素定義。在本發明之化合物中，任何未特定表示為特定同位素之原子意謂表示該原子之任何穩定同位素。除非另有說明，否則當原子由其名稱或字母符號(諸如H、C、O或N)表示時，應理解，原子具有其天然豐度同位素組成。舉例而言，當位置經明確指定為「H」或「氫」時，應理解，該位置在其天然豐度同位素組成中具有氫。因此，在本發明之化合物中，任何明確表示為氘(D)之原子意謂表示氘。
在許多情況下，本發明之化合物能夠借助於胺基及/或羧基或與其類似之基團的存在而形成酸鹽及/或鹼鹽。
亦提供本文中所描述之化合物之醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、氘化類似物、立體異構體及立體異構體之混合物。「醫藥學上可接受」或「生理學上可接受」係指適用於製備適用於獸醫學或人類醫藥用途之醫藥組合物的化合物、鹽、組合物、劑型及其他材料。
術語既定化合物之「醫藥學上可接受之鹽」係指保留既定化合物之生物學有效性及特性且不在生物學上或其他方面不合需要的鹽。「醫藥學上可接受之鹽」或「生理學上可接受之鹽」包括例如由無機酸形成之鹽及由有機酸形成之鹽。此外，若本文中所描述之化合物係以酸加成鹽形式獲得，則可藉由使酸式鹽之溶液鹼化來獲得游離鹼。反之，若產物為游離鹼，則可根據用於自鹼化合物製備酸加成鹽之習知程序，藉由將游離鹼溶解於適合的有機溶劑中且用酸處理該溶液來產生加成鹽，尤其醫藥學上可接受之加成鹽。熟習此項技術者將認識到可用於製備醫藥學上可接受之加成鹽之各種合成方法。醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機酸及有機酸製備。來源於無機酸之鹽包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物之鹽。來源於有機酸之鹽包括例如乙酸、丙酸、葡萄糖酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸及其類似物之鹽。來源於有機酸之鹽可來源於無水有機酸或其水合物。類似地，醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由無機鹼及有機鹼製備。僅作為實例，來源於無機鹼之鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鋁鹽、銨鹽、鈣鹽以及鎂鹽。來源於有機鹼之鹽包括(但不限於)一級、二級及三級胺之鹽，該等胺諸如烷基胺(亦即，NH2 (烷基))、二烷基胺(亦即，HN(烷基)2 )、三烷基胺(亦即，N(烷基)3 )、經取代之烷基胺(亦即，NH2 (經取代之烷基))、二(經取代之烷基)胺(亦即，HN(經取代之烷基)2 )、三(經取代之烷基)胺(亦即，N(經取代之烷基)3 )、烯基胺(亦即，NH2 (烯基))、二烯基胺(亦即，HN(烯基)2 )、三烯基胺(亦即，N(烯基)3 )、經取代之烯基胺(亦即，NH2 (經取代烯基))、二(經取代之烯基)胺(亦即，HN(經取代烯基)2 )、三(經取代之烯基)胺(亦即，N(經取代之烯基)3 、單-、二-或三-環烷基胺(亦即，NH2 (環烷基)、HN(環烷基)2 、N(環烷基)3 )、單-、二-或三-芳基胺(亦即，NH2 (芳基)、HN(芳基)2 、N(芳基)3 )或混合胺等。僅作為實例，適合的胺之特定實例包括異丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三(異丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基胺基乙醇、哌𠯤、哌啶、嗎啉、N-乙基哌啶及其類似物。
一些化合物以互變異構體之形式存在。互變異構體彼此處於平衡。舉例而言，含有醯胺之化合物可與亞胺酸互變異構體以平衡形式存在。無論展示何種互變異構體且無論互變異構體之間的平衡特性如何，一般熟習此項技術者將理解，化合物包含互變異構體。因此，含有醯胺之化合物應理解為包括其亞胺酸互變異構體。類似地，含有亞胺酸之化合物應理解為包括其醯胺互變異構體。
「立體異構體」係指由相同鍵所鍵結之相同原子組成，但具有不可互換的不同三維結構之化合物。本發明涵蓋各種立體異構體及其混合物且包括：
立體異構體包括對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式，其就絕對立體化學而言可定義為(R )-或(S )-，或(D)-或(L)-(關於胺基酸)。本發明意欲包括所有此類可能的異構體，以及其外消旋及光學純形式。光學活性(+)及(-)、(R )-及(S )-或(D)-及(L)-異構體可使用對掌性合成組元或對掌性試劑來製備，或使用習知技術(例如層析及分步結晶)來解析。用於製備/分離個別對映異構體之習知技術包括自適合的光學純前驅體進行對掌性合成或使用例如對掌性高壓液相層析(HPLC)對外消旋體(或鹽或衍生物之外消旋體)進行解析。當本文中所描述之化合物含有烯烴雙鍵或其他幾何不對稱性中心時，立體異構體亦包括幾何異構體。除非另外規定，否則此類化合物意欲包括E及Z幾何異構體。
「對映異構體」為兩個立體異構體，其分子彼此為不可重疊之鏡像。「非對映異構體」為具有至少兩個不對稱原子，但彼此不為鏡像之立體異構體。
如本文中所描繪之化合物之相對中心係使用「厚鍵」型式以圖形方式指示且絕對立體化學係使用楔形鍵描繪。
當藉由結構命名或描繪所揭示之化合物之立體化學時，所命名或描繪之立體異構體相對於其他立體異構體係至少60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、99重量%或99.9重量%純。當藉由結構命名或描繪單一對映異構體時，所描繪或命名之對映異構體係至少60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、99重量%或99.9重量%光學純。以重量計之光學純度百分比係對映異構體之重量與對映異構體之重量加其光學異構體之重量的比率。
當藉由結構命名或描繪所揭示之化合物之幾何結構時，所命名或描繪之幾何異構體相對於其他幾何異構體係至少60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、99重量%或99.9重量%純。
在某些實施例中，其中存在一或多個立體異構中心，本文中所揭示之化合物可以外消旋混合物形式提供。在某些實施例中，其中存在一或多個立體異構中心，本文中所揭示之化合物可以單一對映異構體形式提供。舉例而言，可在具有大於約30% ee、約40% ee、約50% ee、約60% ee、約70% ee、約80% ee、約90% ee、約95% ee、約97% ee、約98% ee、約99% ee或更大之組合物中提供化合物。在某些此類實施例中，可在非對映異構性增濃組合物中提供化合物。舉例而言，包含本文中所揭示之化合物之非對映異構性增濃組合物可具有大於約30% de、約40% de、約50% de、約60% de、約70% de、約80% de、約90% de、約95% de、約97% de、約98% de、約99% de或更大。
在某些實施例中，可增濃治療性製劑以主要提供化合物(例如式(I)化合物)之一種對映異構體。對映異構性增濃混合物可包含例如至少約60莫耳%或更佳至少約75莫耳%、約90莫耳%、約95莫耳%或甚至約99莫耳%之一種對映異構體。在某些實施例中，增濃一種對映異構體之化合物基本上不含其他對映異構體，其中基本上不含意謂與例如組合物或化合物混合物中之其他對映異構體之量相比，所討論之物質占小於約10%，或小於約5%，或小於約4%，或小於約3%，或小於約2%，或小於約1%。舉例而言，若組合物或化合物混合物含有約98公克第一對映異構體與約2公克第二對映異構體，則稱其含有約98莫耳%第一對映異構體及僅約2%第二對映異構體。
在某些實施例中，可增濃治療性製劑以主要提供化合物(例如式(I)化合物)之一種非對映異構體。非對映異構性增濃混合物可包含例如至少約60莫耳%或更佳至少約75、約90、約95或甚至約99莫耳%之一種非對映異構體。
術語「前藥」意欲涵蓋在生理學條件下轉化成本發明之治療活性劑之化合物(例如式(I)化合物)。製備前藥之通用方法包括一或多個在生理學條件下水解以產生所需分子之所選部分。在其他實施例中，前藥係藉由個體之酶活性轉化。舉例而言，酯或碳酸酯(例如醇或羧酸之酯或碳酸酯)係本發明之較佳前藥。在某些實施例中，以上表示之調配物中之一些或所有式(I)化合物可由相應的適合的前藥置換，例如其中母化合物中之羥基呈現為酯或碳酸酯或羧酸。如本文中所使用，「治療有效量」係指足以實現所需治療作用之量。舉例而言，治療有效量可指足以改良本文中所揭示之疾病或病狀之至少一種病徵或症狀之量。
縮寫：
DCM 二氯甲烷
DIPEA 二異丙基乙胺
DMA 二甲基乙醯胺
DMAP 二甲基胺基吡啶
DMF 二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺
Equiv或eq 當量
ESI 電噴霧電離
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
EtONa 乙醇鈉
HOAc或AcOH 乙酸
HOBt 1-羥基苯并三唑
HPLC 高效液相層析
HRMS 高解析度質譜
LC 液相層析
LCMS 液相層析-質譜
mCPBA 間氯過氧苯甲酸
MeOH 甲醇
NMM N-甲基嗎啉
NMP N-甲基-2-吡咯啶酮
OXONE® 過氧硫酸鉀
PPSE 聚磷酸三甲基矽烷基酯
rt 室溫
TEA 三乙胺
THF 四氫呋喃
TLC 薄層層析
TsOH 對甲苯磺酸
B.     化合物
已鑑別結合且活化PLXDC1及PLXDC2蛋白質，引起表現此等蛋白質之病原性血管中的內皮細胞之有效殺傷之小分子。在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image005
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 n為0、1、2、3或4； R1 係選自視情況經取代之胺基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之雜環基及視情況經取代之雜芳基； R2 係選自H、鹵基、烷基、烯基、炔基、-OH、烷氧基、-CN、-NO2 、烷硫基、亞碸基、磺醯基及胺基； R5 、R7 及R8 各自獨立地選自H、鹵基、烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷硫基、亞碸基、磺醯基、羧基、酯、-CN、-NO2 、胺基及醯胺基； R6 係選自H、鹵基、烷基、羥基、烷氧基、烷硫基、亞碸基、磺醯基、羧基、酯、-CN、-NO2 、胺基、醯胺基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)，或 R6 及R7 與其所連接之原子共同形成視情況經取代之環烷基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；及 各R9 獨立地選自鹵基、烷基、-OH、烷氧基、-CN及胺基。
在某些實施例中，當R2 為C1-6 烷基時，R6 不為C1-6 烷基或C1-6 烷氧基。在其他實施例中，當R2 為C1-3 烷基時，R6 不為C1-3 烷基或C1-3 烷氧基。在某些實施例中，當R2 為乙基時，則R6 不為甲基或甲氧基。
在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image007
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 n為0、1、2、3或4； R1 係選自視情況經取代之胺基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之雜環基及視情況經取代之雜芳基； R2 係選自鹵基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、-CN及-NO2 ； R5 、R7 及R8 各自獨立地選自H、鹵基、烷基、烯基、羥基及烷氧基； R6 係選自鹵基、烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烷硫基、亞碸、磺醯基、羧基、酯、-NO2 、-CN、胺基及醯胺基；及 各R9 係獨立地選自鹵基、羥基及烷氧基。
在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image001
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 n為0或1； R1 係選自胺基、視情況經取代之雜環基及視情況經取代之雜芳基； R2 係選自烷基、烷氧基、-CN及-NO2 ； R5 、R7 及R8 各自獨立地選自H及烷氧基； R6 係選自鹵基、烷基、烷氧基、亞碸基、磺醯基、羧基、酯、-NO2 及醯胺基；及 各R9 獨立地為鹵基或烷氧基。
在某些實施例中，上文所描述之式(I)化合物具有以下中之至少一者： 1) R2 係選自C2-30 烷基、-OH、C1-40 烷氧基、C1-40 烯氧基、C1-40 炔氧基、-NO2 、烷硫基、亞碸基、磺醯基及胺基，其中 a) 當R2 為乙基時，則R6 不為甲基或甲氧基，及/或 b) 當R2 為甲氧基時，則R6 不為鹵基、C1-2 烷基或C1-2 烷氧基； 2)  R1 為視情況經取代之雜芳基、視情況經取代之橋聯雜環基、視情況經取代之稠合雜環基或視情況經取代之環庚基； 3) R1 為視情況經一個鹵基、胺基、羥基、烷氧基、-CN、-NO2 、烷基、羧基、烷硫基、亞碸基、磺醯基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、環烷基、雜環基、雜芳基、聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)取代之雜環基， 其中若取代基為烷基，則該烷基進一步經一個選自以下之取代基取代：鹵基、胺基、烷氧基、-CN、-NO2 、羧基、酯、烷硫基、亞碸基、磺醯基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、環烷基、雜環基、聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)、吡咯啶基及哌啶基；或烷基經至少一個-OR31 取代，其中R31 為聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)； 4) R1 為經至少一個選自以下之取代基取代之胺基：烷基、環烷基、雜環基、雜芳基、聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)及胺基， 其中烷基經至少一個選自以下之取代基取代：鹵基、胺基、羥基、烷氧基、-CN、-NO2 、醯胺基、羧基、酯、烷硫基、亞碸基、磺醯基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、環烷基、雜環基及雜芳基；或 5) R6 為經至少一個選自以下之取代基取代之烷基：鹵基、胺基、羥基、烷氧基、環烷氧基、雜環烷氧基、芳基氧基、雜芳基氧基、聚(乙二醇)-氧基、甲氧基聚(乙二醇)-氧基、-CN、-NO2 、側氧基、醯胺基、羧基、酯、烷硫基、亞碸基、磺醯基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、雜環基、環烷基、芳基、雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)。
在某些實施例中，R1 為經至少一個選自以下之取代基取代之雜環基：側氧基、-OH、-OR28 、-N(R28 )2 、-C(O)OR28 、烷基、芳基及雜環基，其中烷基經至少一個選自以下之取代基取代：-OH、-N(R31 )2 、-S(O)0-2 NR31 R31 、-C(O)N(R31 )2 、雜環基、環烷基、吡咯啶基及哌啶基；或烷基經至少一個-OR31a 取代，其中R31a 為聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)；且各R28 及R31 獨立地為H或烷基。
在某些實施例中，R1 為-NR3 R4 ，且R3 為H或未經取代或經至少一個選自以下之取代基取代之烷基：-OH、-N(R28 )2 、芳基及雜芳基，且R4 及R28 各自獨立地為H或烷基。
在某些實施例中，式(I)化合物為如本文中所描述之式(II)及/或(式III)及/或式(IV)及/或(式V)及/或式(VI)及/或式(VII)及/或式(VIII)及/或式(IX)及/或式(X)及/或式(XI)及/或(XII)之化合物，或其任何組合。
在某些實施例中，提供式(II)化合物：
Figure 02_image010
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中R1 、R2 、R5 、R6 、R7 及R8 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(III)化合物：
Figure 02_image012
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中R1 、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 及R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(IV)化合物：
Figure 02_image014
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中R1 、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 及R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，R1 為雜芳基或雜環基，各自視情況經第二雜環基取代，其中第二雜環基未經取代或經一或多個取代基取代，該一或多個取代基例如選自-OH、-C(O)O烷基、-C(O)NH烷基、烷基、芳基及雜環基； 其中烷基及雜環基各自未經取代或經一或多個選自-OH、烷基及芳基之取代基取代。
在某些實施例中，提供式(V)化合物：
Figure 02_image016
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體， 其中 s、t、u及v中之每一者獨立地為0、1、2或3，限制條件為s與t之和為1、2、3或4，且u與v之和為1、2、3或4； w為0、1、2或3； Z1 為C或N， 當Z1 為C時，R20a 為H、鹵基、側氧基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、-OR28 、-NHR28 、-N(R28 )2 、-C(O)R28 、-C(O)OR28 、-C(O)OH、-OC(O)R28 、-S(O)0-2 R28 、-NHS(O)0-2 R28 、-S(O)0-2 NHR28 、-NHS(O)0-2 NHR28 、-C(O)NH2 、-C(O)NHR28 、-C(O)N(R28 )2 、-NHC(O)R28 、-OC(O)NHR28 、-NHC(O)OR28 、-OC(O)N(R28 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR28 、-NR32 C(O)N(R28 )2 、聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)、視情況經OH或-C(O)OH取代之C1-30 烷基或視情況經OH或-C(O)OH取代之C1-30 雜烷基，其中R32 為H或C1-4 烷基且R28 為C1-4 烷基； 當Z1 為N時，R20a 不存在； Z2 為C或N； Z3 為CH2 、CHR25 、CR25 R25 或NR25 、O或S(O)0-2 且R25 係選自H及烷基；及 n、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 及R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(V)化合物：
Figure 02_image018
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體， 其中 s、t、u及v中之每一者獨立地為0、1、2或3，限制條件為s與t之和為1、2、3或4，且u與v之和為1、2、3或4； w為0、1、2或3； Z1 為C或N， 當Z1 為C時，R20a 為H、鹵基、側氧基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、-OR28 、-NHR28 、-N(R28 )2 、-C(O)R28 、-C(O)OR28 、-C(O)OH、-OC(O)R28 、-S(O)0-2 R28 、-NHS(O)0-2 R28 、-S(O)0-2 NHR28 、-NHS(O)0-2 NHR28 、-C(O)NH2 、-C(O)NHR28 、-C(O)N(R28 )2 、-NHC(O)R28 、-OC(O)NHR28 、-NHC(O)OR28 、-OC(O)N(R28 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR28 、-NR32 C(O)N(R28 )2 、聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)、視情況經OH或-C(O)OH取代之C1-30 烷基或視情況經OH或-C(O)OH取代之C1-30 雜烷基，其中R32 為H或C1-4 烷基且R28 為C1-4 烷基； 當Z1 為N時，R20a 不存在； Z2 為C或N； Z3 為CH2 、CHR25 、CR25 R25 或NR25 、O或S(O)0-2 且R25 係選自H及烷基； n為0、1、2、3或4； R2 係選自H、鹵基、烷基、烯基、炔基、-OH、烷氧基、-CN、-NO2 、烷硫基、亞碸基、磺醯基及胺基； R5 、R7 及R8 各自獨立地選自H、鹵基、烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烷硫基、亞碸基、磺醯基、羧基、酯、-CN、-NO2 、胺基及醯胺基； R6 係選自H、鹵基、烷基、羥基、烷氧基、烷硫基、亞碸基、磺醯基、羧基、酯、-CN、-NO2 、胺基、醯胺基、亞磺醯胺基、磺醯胺基、雜環基、雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)，或 R6 及R7 與其所連接之原子共同形成環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；及 各R9 獨立地選自鹵基、烷基、-OH、烷氧基、-CN及胺基。
在某些實施例中，提供式(VI)化合物：
Figure 02_image020
或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R20a 、Z2 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供下式之化合物：
Figure 02_image022
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(VIII)化合物：
Figure 02_image024
或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R20a 、Z2 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(IX)化合物：
Figure 02_image026
或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、Z2 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(X)化合物：
Figure 02_image028
或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R20a 、Z2 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(XI)化合物：
Figure 02_image030
或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體，其中n、s、u、v、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、Z2 及Z3 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image032
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 R2 為-OC4-30 烷基；及 n、R1 、R5 、R6 、R7 、R8 及R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image034
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 R6 為-NO2 、酯、醯胺基、烷硫基、亞碸基或磺醯基；及 n、R1 、R5 、R5 、R7 、R8 、R9 中之每一者係如本文中所定義。
在某些實施例中，R9 為-OH或-O-C1-10 烷基。在某些實施例中，各R9 獨立地為鹵基。在某些實施例中，n為1或2且各R9 獨立地為鹵基。在某些實施例中，n為1或2且各R9 為氟。
在某些實施例中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image036
， 或其醫藥學上可接受之鹽、經同位素增濃之類似物、立體異構體、立體異構體之混合物或互變異構體； 其中 R1 係選自-NR3 R4 、視情況經一至五個R20 取代之雜環基及視情況經一至五個R21 取代之雜芳基； R2 係選自H、鹵基、視情況經一至五個R19 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R19 取代之C1-30 雜烷基、-OH、-OR18 、-CN、-NO2 、-NH2 、-S(O)0-2 R18 及-NR11 R18 ； R3 係選自H、視情況經一至五個R20 取代之C1-6 烷基、視情況經一至五個R20 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R20 取代之雜環基、視情況經一至五個R21 取代之芳基及視情況經一至五個R21 取代之雜芳基， R4 係選自H、視情況經一至五個R20 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R20 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R20 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R20 取代之雜環基、視情況經一至五個R21 取代之芳基、視情況經一至五個R21 取代之雜芳基、聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)及-NR13 R14 ； R5 、R7 及R8 各自獨立地選自H、鹵基、視情況經一至五個R29 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R29 取代之C1-30 雜烷基、-OR15 、-S(O)0-2 R16 、-C(O)OR15 、-OC(O)R16 、-CN、-NO2 、-NR15 R15 及-C(O)NR15 R15 ； R6 係選自H、鹵基、視情況經一至五個R29 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R29 取代之C1-30 雜烷基、-OR17 、-S(O)0-2 R16 、-C(O)OR15 、-OC(O)R16 、-CN、-NO2 、-NR15 R15 、-C(O)NR15 R15 、-NR15 C(O)R16 、-S(O)0-2 NR15 R15 、-NR15 S(O)0-2 R16 、視情況經一至五個R29 取代之雜環基、視情況經一至五個R30 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)，或 R6 及R7 與其所連接之原子共同形成視情況經一至五個R29 取代之C5-10 環烷基、視情況經一至五個R29 取代之雜環基、視情況經一至五個R30 取代之芳基或視情況經一至五個R30 取代之雜芳基； R9 係獨立地選自鹵基、視情況經一至五個R22 取代之C1-8 烷基、-OH、-OR10 、-CN及-NR11 R12 ； n為0、1、2、3或4； R10 係獨立地選自視情況經一至五個R22 取代之C1-10 烷基及視情況經一至五個R22 取代之C3-10 環烷基； R11 及R12 各自獨立地為H或視情況經一至五個R22 取代之C1-6 烷基； R13 係選自H、視情況經一至五個R20 取代之C1-6 烷基、視情況經一至五個R20 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R20 取代之雜環基、視情況經一至五個R21 取代之芳基及視情況經一至五個R21 取代之雜芳基； R14 係選自H、視情況經一至五個R20 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R20 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R20 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R20 取代之雜環基、視情況經一至五個R21 取代之芳基、視情況經一至五個R21 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R15 獨立地選自H、視情況經一至五個R23 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R23 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R23 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R23 取代之雜環基、視情況經一至五個R24 取代之芳基、視情況經一至五個R24 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； R16 係選自視情況經一至五個R23 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R23 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R23 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R23 取代之雜環基、視情況經一至五個R24 取代之芳基、視情況經一至五個R24 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； R17 係選自H、視情況經一至五個R27 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R27 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R27 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R27 取代之雜環基、視情況經一至五個R24 取代之芳基、視情況經一至五個R24 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； R18 係選自視情況經一至五個R19 取代之C1-30 烷基及視情況經一至五個R19 取代之C1-30 雜烷基； 各R20 獨立地選自鹵基、側氧基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、-OR28 、-NHR28 、-N(R28 )2 、-C(O)R28 、-C(O)OR28 、-C(O)OH、-OC(O)R28 、-S(O)0-2 R28 、-NHS(O)0-2 R28 、-S(O)0-2 NHR28 、-NHS(O)0-2 NHR28 、-C(O)NH2 、-C(O)NHR28 、-C(O)N(R28 )2 、-NHC(O)R28 、-OC(O)NHR28 、-NHC(O)OR28 、-OC(O)N(R28 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR28 、-NR32 C(O)N(R28 )2 、視情況經一至五個R25 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R25 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R25 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R25 取代之雜環基、視情況經一至五個R26 取代之芳基、視情況經一至五個R26 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R21 獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、-OR28 、-NHR28 、-N(R28 )2 、-C(O)R28 、-C(O)OR28 、-C(O)OH、-OC(O)R28 、-S(O)0-2 R28 、-NHS(O)0-2 R28 、-S(O)0-2 NHR28 、-NHS(O)0-2 NHR28 、-C(O)NHR28 、-NHC(O)R28 、-C(O)N(R28 )2 、-OC(O)NHR28 、-NHC(O)OR28 、-OC(O)N(R28 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR28 、-NR32 C(O)N(R28 )2 、視情況經一至五個R25 取代之C1-6 烷基、視情況經一至五個R25 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R25 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R25 取代之雜環基、視情況經一至五個R26 取代之芳基及視情況經一至五個R26 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R19 或R22 獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、側氧基、C1-4 烷基、C1-4 鹵烷基、C1-4 羥基烷基、C1-4 烷氧基、-NH-C1-4 烷基、-N(C1-4 烷基)2 、-C(O)-C1-4 烷基、-C(O)O-C1-4 烷基、-C(O)OH、-S(O)0-2 -C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-C(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)-C1-4 烷基、-C(O)N(C1-4 烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)O-C1-4 烷基、-OC(O)N(C1-4 烷基)2 、-NH-C1-4 鹵烷基、-N(C1-4 鹵烷基)2 、-C(O)-C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-C(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)-C1-4 鹵烷基、-C(O)N(C1-4 鹵烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)O-C1-4 鹵烷基、-OC(O)N(C1-4 鹵烷基)2 及C3-10 環烷基； 各R25 獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、側氧基、-OR31 、-NHR31 、-N(R31 )2 、-C(O)R31 、-C(O)OR31 、-C(O)OH、-S(O)0-2 R31 、-NR32 S(O)0-2 R31 、-S(O)0-2 NR32 R31 、-NR32 S(O)0-2 NR32 R31 , -C(O)NH2 、-C(O)NHR31 、-NR32 C(O)R31 、-C(O)N(R31 )2 、-OC(O)NHR31 、-NR32 C(O)OR31 、-OC(O)N(R31 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR31 、-NR32 C(O)N(R31 )2 、視情況經一至五個R33 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R33 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R33 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R33 取代之雜環基、視情況經一至五個R34 取代之芳基、視情況經一至五個R34 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R26 獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、-OR31 、-NHR31 、-N(R31 )2 、-C(O)R31 、-C(O)OR31 、-C(O)OH、-S(O)0-2 R31 、-NR32 S(O)0-2 R31 、-S(O)0-2 NR32 R31 、-NR32 S(O)0-2 NR32 R31 、-C(O)NH2 、-C(O)NHR31 、-NR32 C(O)R31 、-C(O)N(R31 )2 、-OC(O)NHR31 、-NR32 C(O)OR31 、-OC(O)N(R31 )2 、-NR32 C(O)NH2 、-NR32 C(O)NHR31 、-NR32 C(O)N(R31 )2 、視情況經一至五個R33 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R33 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R33 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R33 取代之雜環基、視情況經一至五個R34 取代之芳基及視情況經一至五個R34 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R31 係獨立選擇之視情況經一至五個R33 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R33 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R33 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R33 取代之雜環基、視情況經一至五個R34 取代之芳基、視情況經一至五個R34 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)； 各R32 係獨立選擇之H及C1-4 烷基； 各R23 、R27 、R29 或R33 係獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、側氧基、視情況經苯基取代之C1-4 烷基、C1-4 鹵烷基、C1-4 羥基烷基、C1-4 烷氧基、-NH-C1-4 烷基、-N(C1-4 烷基)2 、-C(O)-C1-4 烷基、-C(O)O-C1-4 烷基、-C(O)OH、-S(O)0-2 -C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-C(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)-C1-4 烷基、-C(O)N(C1-4 烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)O-C1-4 烷基、-OC(O)N(C1-4 烷基)2 、-NH-C1-4 鹵烷基、-N(C1-4 鹵烷基)2 、-C(O)-C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-C(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)-C1-4 鹵烷基、-C(O)N(C1-4 鹵烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)O-C1-4 鹵烷基、-OC(O)N(C1-4 鹵烷基)2 、C3-10 環烷基、雜環基、芳基雜芳基、-(CH2 )1-30 -C(O)OH、-(CH2 )0-4 -O-聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)-O-(CH2 )0-4 -及糖部分； 各R24 、R30 或R34 係獨立地選自鹵基、-NH2 、-OH、-CN、-NO2 、C1-4 烷基、C1-4 鹵烷基、C1-4 羥基烷基、C1-4 烷氧基、-NH-C1-4 烷基、-N(C1-4 烷基)2 、-C(O)-C1-4 烷基、-C(O)OH、-C(O)O-C1-4 烷基、-S(O)0-2 -C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 烷基、-C(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)-C1-4 烷基、-C(O)N(C1-4 烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 烷基、-NHC(O)O-C1-4 烷基、-OC(O)N(C1-4 烷基)2 、-NH-C1-4 鹵烷基、-N(C1-4 鹵烷基)2 、-C(O)-C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 -C1-4 鹵烷基、-S(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-NHS(O)0-2 NH-C1-4 鹵烷基、-C(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)-C1-4 鹵烷基、-C(O)N(C1-4 鹵烷基)2 、-OC(O)NH-C1-4 鹵烷基、-NHC(O)O-C1-4 鹵烷基、-OC(O)N(C1-4 鹵烷基)2 、C3-10 環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH2 )1-30 -C(O)OH、-(CH2 )0-4 -O-聚(乙二醇)、-(CH2 )0-4 -O-甲氧基聚(乙二醇)及糖部分；及 各R28 係獨立地選自視情況經一至五個R25 取代之C1-30 烷基、視情況經一至五個R25 取代之C1-30 雜烷基、視情況經一至五個R25 取代之C3-10 環烷基、視情況經一至五個R25 取代之雜環基、視情況經一至五個R26 取代之芳基、視情況經一至五個R26 取代之雜芳基、聚(乙二醇)及甲氧基聚(乙二醇)。
在某些實施例中，聚(乙二醇)具有小於20,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有小於15,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有小於10,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有小於5,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有小於2,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有約20,000至約2,000之平均分子量。在某些實施例中，聚(乙二醇)具有約10,000至約2,000之平均分子量。
在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於20,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於15,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於15,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於10,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於5,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有小於2,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有約20,000至約2,000之平均分子量。在某些實施例中，甲氧基聚(乙二醇)具有約10,000至約2,000之平均分子量。
在某些實施例中，提供選自表3之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
在某些實施例中，提供本發明之化合物之鹽。在某些實施例中，該鹽為由鹽酸、鹽酸、磷酸、甲烷磺酸(甲磺酸鹽)、蘋果酸、丙二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸或乙酸形成的本發明之化合物之鹽。在某些實施例中，該鹽為由甲烷磺酸(甲磺酸鹽)形成之本發明之化合物之鹽。 C.       本發明之化合物藥劑  表3
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表3中展示之化合物可根據美國專利案62/916983中描述之程序合成，其以引用之方式併入以用於所有目的。 IV.     抗體
本文中揭示使用抗體(例如活化PLXDC1及/或PLXDC2受體之抗體，諸如本文中所揭示之抗體，諸如結合於本文中所描述之受體之細胞外域之抗體，諸如AA02、AA03或AA94，或表6中之抗體)來調節PLXDC1及/或PLXDC2受體之活性之方法。在一些實施例中，抗體為抗PLXDC1及/或抗PLXDC2抗體。在一些實施例中，抗體對PLXDC1及/或PLXDC2蛋白質具有特異性(例如PLXDC1及/或PLXDC2之細胞外域)。 A.     抗體
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合於目標抗原之片段，且包括嵌合、人類化、完全人類及雙特異性抗體。如本文中所使用，術語「抗體」或「免疫球蛋白」可互換地使用且係指充當動物之免疫反應之一部分的若干類別之結構上相關的蛋白質中之任一者，包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM及相關蛋白質，以及包含保留抗原結合活性之抗體CDR域之多肽。
術語「抗原」係指能夠由選擇性結合劑(諸如抗體)結合之分子或分子之一部分。抗原可具有一或多個能夠與不同抗體相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」包括分子中之任何能夠藉由結合於免疫球蛋白或T細胞受體來引發免疫反應之區域或部分。抗原決定基決定子可包括化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。通常，對特定目標抗原具有特異性之抗體將優先識別複合混合物內的目標抗原上之抗原決定基。
可使用在此項技術中熟知的許多不同的抗原決定基定位技術來鑑別既定多肽之抗原決定基區域，包括：X射線結晶學、核磁共振光譜法、定點突變誘發定位、蛋白質顯示陣列，參見例如Epitope Mapping Protocols (Johan Rockberg及Johan Nilvebrant編, 2018) Humana Press, New York, N.Y。此類技術為此項技術中已知的且描述於例如美國專利案第4,708,871號；Geysen等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984)；Geysen等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182 (1985)；Geysen等人 Molec. Immunol. 23:709-715 (1986)。此外，蛋白質之抗原性區域亦可使用標準抗原性及親水性圖來預測及鑑別。
術語「免疫原性序列」意謂一種分子，其包括至少一種抗原決定基之胺基酸序列，使得該分子能夠在適合的宿主中刺激抗體之產生。術語「免疫原性組合物」意謂包含至少一種免疫原性分子(例如抗原或碳水化合物)之組合物。
完整抗體通常由兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈構成，但在一些情況下，可包括較少的鏈，諸如駱駝中天然存在之抗體，其可僅包含重鏈。如本文中所揭示之抗體可僅來源於單一來源或可為「嵌合」的，亦即，抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體。舉例而言，可變或CDR區可來源於大鼠或鼠類來源，而恆定區來源於不同的動物來源，諸如人類。抗原或結合片段可在融合瘤中藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。除非另有指示，否則術語「抗體」包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白，其實例描述於下文中(Sela-Culang等人, Front Immunol. 2013; 4: 302; 2013)。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長輕鏈之分子量為約25,000道爾頓且包括可變區域(本文中縮寫為VL)及恆定區域(本文中縮寫為CL)。存在兩種類別之輕鏈，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。術語「VL片段」意謂單株抗體之輕鏈之片段，其包括所有或一部分輕鏈可變區，包括CDR。VL片段可進一步包括輕鏈恆定區序列。輕鏈之可變區域位於多肽之胺基端。
術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長重鏈之分子量為約50,000道爾頓且包括可變區域(本文中縮寫為VH)及三個恆定區域(本文中縮寫為CH1、CH2及CH3)。術語「VH片段」意謂單株抗體之重鏈之片段，其包括所有或一部分重鏈可變區，包括CDR。VH片段可進一步包括重鏈恆定區序列。重鏈恆定區域之數目將視同型而定。VH域位於多肽之胺基端且CH域位於羧基端，其中CH3最接近-COOH端。抗體之同型可為IgM、IgD、IgG、IgA或IgE且由重鏈定義，存在五種類型之重鏈：分別為mu (µ)、delta (d)、gamma (γ)、alpha (α)或epsilon (ε)鏈。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM1及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。
抗體可為任何同型或分類之完全免疫球蛋白、嵌合抗體或對兩種或更多種抗原具有特異性之雜交抗體。其亦可為片段(例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv及其類似物)，包括雜交片段。免疫球蛋白亦包括天然、合成或經基因工程改造之蛋白質，其藉由結合於特異性抗原以形成複合物來起到與抗體類似之作用。術語抗體包括免疫球蛋白之經基因工程改造之或以其他方式經修飾之形式，諸如以下：
術語「單體」意謂僅含有一個Ig單元之抗體。單體為抗體之基本功能單元。術語「二聚體」意謂含有兩個經由抗體重鏈之恆定域(Fc或可結晶片段、區域)彼此連接之Ig單元之抗體。可藉由接合(J)鏈蛋白質使複合物穩定。術語「多聚體」意謂含有超過兩個經由抗體重鏈之恆定域(Fc區)彼此連接之Ig單元之抗體。可藉由接合(J)鏈蛋白質使複合物穩定。
術語「二價抗體」意謂包含兩個抗原結合位點之抗體。兩個結合位點可具有相同抗原特異性或其可為雙特異性，意謂兩個抗原結合位點具有不同抗原特異性。
雙特異性抗體為一種類型之抗體，其具有兩個互補位，該兩個互補位具有用於兩種或更多種不同抗原決定基之不同結合位點。在一些實施例中，雙特異性抗體可為雙互補位，其中雙特異性抗體可特異性識別來自相同抗原之不同抗原決定基。在一些實施例中，可由一對稱為「奈米抗體」之不同單域抗體來構築雙特異性抗體。由軟骨魚及駱駝獲得及修飾單域抗體。奈米抗體可使用熟習此項技術者通常已知的技術藉由連接子接合在一起；此類用於奈米抗體之選擇及接合之方法描述於PCT公開案第WO2015044386A1號、第WO2010037838A2號及Bever等人, Anal Chem. 86:7875-7882 (2014)中，其各自以全文引用之方式特定地併入本文中。
雙特異性抗體可構築為：完全IgG、Fab'2、Fab'PEG、雙功能抗體或可scFv。可僅使用可變域，在無Fc區之情況下構築雙功能抗體及scFv，潛在地降低抗個體基因型反應之作用。雙特異性抗體可藉由多種方法產生，包括(但不限於)融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai及Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelny等人, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)，其各自以全文引用之方式特定地併入本文中。
在某些態樣中，抗原結合域可藉由與結合不同抗原之VH及VL區對一起多聚化而為多特異性或異種特異性的。舉例而言，抗體可結合於以下或與以下相互作用：(a)細胞表面抗原，(b)效應細胞之表面上之Fc受體或(c)至少一種其他組分。因此，態樣可包括(但不限於)針對抗原決定基及其他目標(諸如效應細胞上之Fc受體)之雙特異性、三特異性、四特異性及其他多特異性抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，可使用多特異性抗體且使用此項技術中已知之常規方法，經由短可撓性多肽鏈直接連接。一此類實例為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上之雙特異性抗體，但使用過短以致不允許在同一條鏈上之兩個域之間的配對之連接子，藉此迫使域與另一鏈之互補域配對，從而產生兩個抗原結合位點。連接子官能基適用於三功能抗體、四功能抗體及高階抗體多聚體之實施例(參見例如Hollinger等人, Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Polijak等人, Structure 2:1121-1123 (1994)；Todorovska等人, J. Immunol. Methods 248:47-66 (2001))。
相對於雙特異性完全抗體，雙特異性雙功能抗體亦可為有利的，因為其易於構築及表現於大腸桿菌中。可使用噬菌體呈現(WO94/13804)容易地自庫選擇具有適合的結合特異性之雙功能抗體(及其他多肽，諸如抗體片段)。若雙功能抗體之一個臂保持恆定，舉例而言，具有針對蛋白質之特異性，則可製得其中另一個臂可變化之庫及選擇具有適合的特異性之抗體。雙特異性完全抗體可藉由替代性工程改造方法製得，如Ridgeway等人, (Protein Eng., 9:616-621, 1996)及Krah等人, (N Biotechnol. 39:167-173, 2017)中所描述，其各自以全文引用之方式併入本文中。
異結合抗體係由具有不同特異性之兩個共價連接之單株抗體構成。參見例如美國專利案第6,010,902號，其以全文引用之方式併入本文中。
以高特異性結合於抗原之抗原決定基的抗體分子之Fv片段之部分在本文中稱為「互補位」。互補位由胺基酸殘基組成，該等胺基酸殘基與抗原之抗原決定基接觸以促進抗原識別。抗體之兩個Fv片段中之每一者係由呈二聚組態之兩個可變域，即VH 及VL 構成。每個可變域之一級結構包括由構架區(FR)分離及側接之三個高變環。高變環係來自任何哺乳動物之抗體分子中之具有最高一級序列可變性之區域。術語高變環有時可與術語「互補決定區(CDR)」互換使用。各抗體分子之高變環(或CDR)之長度不同。來自既定哺乳動物之所有抗體分子之構架區具有高一級序列相似性/一致性。熟習此項技術者可使用構架區之一致性來鑑別構架區及穿插於構架區中之高變環(或CDR)。高變環具有鑑別名稱，其區分高變環在多肽內之位置及高變環存在之域。VL 域中之CDR鑑別為L1、L2及L3，其中L1位於最末端且L3最靠近CL 域。CDR亦可具有名稱CDR-1、CDR-2及CDR-3。L3 (CDR-3)通常為由既定生物體產生之所有抗體分子中之具有最高可變性之區域。CDR為一級結構中之以線形方式排列且由構架區彼此分隔之多肽鏈之區域。VL 鏈之胺基端(N端)末端稱為FR1。鑑別為FR2之區域位於L1與L2高變環之間。FR3位於L2與L3高變環之間且FR4區域最靠近CL 域。此結構及命名法亦適用於VH 鏈，其包括鑑別為H1、H2及H3之三個CDR。可變域中之大部分胺基酸殘基或Fv片段(VH 及VL )為構架區之一部分(約85%)。抗體分子之三維或三級結構使得構架區相對更加位於分子之內部且與分子之外表面上之CDR一起提供大部分結構。
已研發出若干種方法且可由熟習此項技術者用於鑑別組成此等區域中之每一者之確切的胺基酸。此可使用多種多重序列比對方法及演算法中之任一者進行，該等方法及演算法鑑別組成構架區之保守性胺基酸殘基，由此鑑別長度可能不同，但位於構架區之間的CDR。已研發出用於鑑別抗體之CDR之三種常用方法：Kabat (如T. T. Wu及E. A. Kabat, 「AN ANALYSIS OF THE SEQUENCES OF THE VARIABLE REGIONS OF BENCE JONES PROTEINS AND MYELOMA LIGHT CHAINS AND THEIR IMPLICATIONS FOR ANTIBODY COMPLEMENTARITY,」J Exp Med , 第132卷, 第2號, 第211-250頁, 1970年8月中所描述)；Chothia (如C. Chothia等人, 「Conformations of immunoglobulin hypervariable regions,」Nature , 第342卷, 第6252號, 第877-883頁, 1989年12月中所描述)；及IMGT (如M.-P. Lefranc等人, 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,」Developmental & Comparative Immunology , 第27卷, 第1號, 第55-77頁, 2003年1月中所描述)。此等方法各自包括用於鑑別組成可變區之胺基酸殘基之獨特編號系統。在大部分抗體分子中，實際接觸抗原之抗原決定基之胺基酸殘基存在於CDR中，但在一些情況下，構架區內之殘基可促進抗原結合。
熟習此項技術者可使用若干方法中之任一者以確定抗體之互補位。此等方法包括：1)基於抗體可變區之胺基酸序列之化學性質及抗原決定基之組成的抗體之三級結構/抗原決定基結合相互作用之計算預測；2)氫-氘交換及質譜；3)多肽片段化及肽定位方法，其中自全長多肽產生多個重疊肽片段且評估此等肽對抗原決定基之結合親和力；4)抗體噬菌體呈現庫分析，其中哺乳動物之抗體Fab片段編碼基因由細菌噬菌體以諸如併入噬菌體之塗層中之方式表現。接著，使此表現Fab之噬菌體之群體與已固定或可由不同的外源性表現系統表現之抗原相互作用。洗去非結合Fab片段，藉此僅留下連接至抗原之特異性結合Fab片段。可容易地分離結合Fab片段及確定編碼其之基因。視需要，此方法亦可用於Fab片段之較小區域，包括Fv片段或特異性VH 及VL 域。
在某些態樣中，藉由親和力成熟抗體之一或多個CDR中之一或多種修飾來增強親和力成熟抗體，該一或多種修飾引起與不具有此等變化之親本抗體相比，抗體對目標抗原之親和力之改良。某些親和力成熟抗體將對目標抗原具有奈莫耳或皮莫耳級親和力。結合如Tiller等人, Front. Immunol. 8:986 (2017)中所說明之計算方法，藉由此項技術中已知的程序(例如Marks等人, Bio/Technology 10:779 (1992)描述藉由VH及VL域改組來進行之親和力成熟，Rajpal等人, PNAS. 24: 8466-8471 (2005)及Thie等人, Methods Mol Biol. 525:309-22 (2009)描述噬菌體呈現中使用之CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發)產生親和力成熟抗體。
嵌合免疫球蛋白為來源於不同物種之融合基因之產物；「人類化」嵌合體通常具有來自人類免疫球蛋白之構架區(FR)且一或多個CDR係來自非人類來源。
在某些態樣中，一部分重鏈及/或輕鏈與來自另一特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體以及此類抗體之片段中之相應序列一致或同源，只要其呈現所需生物活性即可。美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)。關於與嵌合抗體有關之方法，參見例如美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1985)，其各自以全文引用之方式特定地併入本文中。CDR移植描述於例如美國專利案第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中，其皆以引用之方式併入本文中以用於所有目的。
在一些實施例中，最小化來自非人類物種之抗體多肽序列可最佳化嵌合抗體功能及降低免疫原性。來自非人類抗體之非抗原識別區域之特異性胺基酸殘基經修飾以與人類抗體或同型中之相應的殘基同源。一個實例為「CDR移植」抗體，其中抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特異性抗體類別或子類別之CDR，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別之抗體中之相應的序列一致或同源。關於在人類中使用，將來自非人類免疫球蛋白之輕鏈及重鏈變化區之由CDR1、CDR2及一部分CDR3構成之V區與人類抗體構架區一起移植，用非人類CDR置換人類抗體之天然存在之抗原受體。在一些情況下，相應的非人類殘基置換人類免疫球蛋白之構架區殘基。此外，人類化抗體可包含未發現於受體抗體中或供體抗體中之殘基，以進一步改進效能。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。參見例如Jones等人, Nature 321:522 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323 (1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)；Vaswani及Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1:105 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23; 1035 (1995)；Hurle及Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428 (1994)；Verhoeyen等人, Science 239:1534-36 (1988)。
胞內抗體係位於細胞內之免疫球蛋白，與結合細胞外空間中之抗原之分泌型抗體不同，其結合於細胞內抗原。
多株抗體製劑通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體。為了產生多株抗體，用抗原或抗原片段(通常與佐劑一起且視需要與載劑偶合)使宿主(諸如兔或山羊)免疫。接著，自宿主之血清收集針對抗原之抗體。多株抗體可針對抗原進行親和力純化，使其呈單特異性。
單株抗體或「mAb」係指自僅來自親本細胞之均質抗體群體獲得之抗體，例如除可少量存在之天然存在之突變以外，該群體為一致的。各單株抗體係針對單一抗原決定子。
某些態樣係關於抗體片段，諸如結合於PLXDC1或PLXDC2之抗體片段。術語功能性抗體片段包括抗體之抗原結合片段，其保留特異性結合於抗原之能力。此等片段由可變區重鏈(VH)及/或輕鏈(VL)之各種排列構成；且在一些實施例中，包括恆定區重鏈1 (CH1)及輕鏈(CL)。在一些實施例中，其不具有由重鏈2 (CH2)及3(CH3)域構成之Fc區。抗原結合片段及其修飾之實施例可包括：(i)由VL、VH、CL及CH1域構成之Fab片段類型；(ii)由VH及CH1域構成之Fd片段類型；(iii)由VH及VL域構成之Fv片段類型；(iv)由單一VH或VL域構成之單域片段類型，dAb (Ward, 1989；McCafferty等人, 1990；Holt等人, 2003)；(v)經分離之互補決定區(CDR)區域。此類術語描述於例如Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989)；Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (編), New York: VCH Publisher, Inc.)；Huston等人, Cell Biophysics, 22:189-224 (1993)；Pluckthun及Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989)及Day, E. D., Advanced Immunochemistry, 第2版, Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y. (1990)；Antibodies, 4:259-277 (2015)中。此段落中之引用皆以引用之方式併入。
抗原結合片段亦包括保留來自輕鏈可變區之恰好、至少或至多1、2或3個互補決定區(CDR)之抗體片段。含有CDR之序列與Fc區(或其CH2或CH3區)之融合物包括於此定義之範疇內，包括例如本文中包括直接地或間接地與Fc區融合之scFv。
術語Fab片段意謂含有VL、VH、CL及CH1域之抗體之單價抗原結合片段。術語Fab'片段意謂單株抗體之單價抗原結合片段，其大於Fab片段。舉例而言，Fab'片段包括VL、VH、CL及CH1域以及全部或一部分鉸鏈區。術語F(ab')2片段意謂單株抗體之二價抗原結合片段，其包含鉸鏈區處之由二硫橋鍵連接之兩個Fab'片段。F(ab')2片段包括例如兩個VH及VL域之全部或一部分，且可進一步包括兩個CL及CH1域之全部或一部分。
術語Fd片段意謂單株抗體之重鏈之片段，其包括全部或一部分VH，包括CDR。Fd片段可進一步包括CH1區序列。
術語Fv片段意謂單株抗體之單價抗原結合片段，包括全部或一部分VL及VH且不存在CL及CH1域。VL及VH包括例如CDR。單鏈抗體(sFv或scFv)為Fv分子，其中VL及VH區已由可撓性連接子連接以形成單一多肽鏈，其形成抗原結合片段。單鏈抗體詳細論述於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利案第4,946,778號及第5,260,203號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。術語(scFv)2意謂二價或雙特異性sFv多肽鏈，其在其C端包括寡聚域，由鉸鏈區與sFv隔開(Pack等人 1992)。寡聚域包含自相關a-螺旋，例如白胺酸拉鏈，其可由其他二硫鍵進一步穩定。(scFv)2片段亦稱為「微抗體」或「微型抗體」。
單域抗體為僅含有VH或VL域之抗原結合片段。在一些情況下，兩個或更多個VH區與肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
Fc區含有兩個包含抗體之CH2及CH3域的重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個或更多個二硫鍵及CH3域之疏水性相互作用保持在一起。如本文中所使用，術語「Fc多肽」包括來源於抗體之Fc區之多肽的原生及突變蛋白形式。包括促進二聚化之含有鉸鏈區之此類多肽之截短形式。
根據實施例，使用抗原結合肽骨架，諸如互補決定區(CDR)來產生蛋白質結合分子。通常，熟習此項技術者可確定上面移植至少一個CDR之蛋白質骨架之類型。眾所周知，骨架最佳必須符合多種準則，諸如：良好的譜系學保守性；已知的三維結構；小型尺寸；存在極少或不存在轉錄後修飾；及/或易於產生、表現及純化。Skerra, J Mol Recognit, 13:167-87 (2000)。
蛋白質骨架可源自(但不限於)：III型纖維結合蛋白FN3域(稱為「單功能抗體」)、III型纖維結合蛋白域10、脂質運載蛋白、抗運載蛋白、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A之Z域、硫化還原蛋白A或具有重複模體(諸如「錨蛋白重複序列」、「犰狳重複序列」、「富含白胺酸之重複序列」及「三十四肽重複序列」)之蛋白質。此類蛋白質描述於美國專利公開案第2010/0285564號、第2006/0058510號、第2006/0088908號、第2005/0106660號及PCT公開案第WO2006/056464號中，其各自以全文引用之方式特定地併入本文中。亦可使用來源於來自蠍子、昆蟲、植物軟體動物等之毒素之骨架及神經元NO合成酶之蛋白質抑制劑(PIN)。
術語「選擇性結合劑」係指結合於抗原之分子。非限制性實例包括抗體、抗原結合片段、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體、肽、肽片段及蛋白質。
術語「結合」係指兩個分子之間由例如共價、靜電、疏水性及離子性及/或氫鍵相互作用，包括諸如鹽橋及水橋之相互作用而產生的直接締合。「免疫反應性」意謂選擇性結合劑或相關抗體將與存在於生物樣品中之抗原結合。術語「免疫複合物」係指在抗體或選擇性結合劑結合於抗原上之抗原決定基時形成之組合。
術語「親和力」係指抗體或選擇性結合劑與抗原決定基之結合強度。在抗體結合反應中，對於任何既定抗體或選擇性結合劑，此表示為親和力常數(Ka或ka有時稱為締合常數)。藉由將抗體與其抗原之結合強度與抗體與非相關胺基酸序列之結合強度進行比較來量測親和力。親和力可表示為例如抗體與其抗原之結合能力比非相關胺基酸序列大20倍。如本文中所使用，術語「親合力」係指兩種或更多種藥劑之複合物在稀釋後對解離之抗性。關於抗體及/或選擇性結合劑，術語「免疫反應性」及「優先結合」在本文中可互換地使用。
存在若干種可由熟習此項技術者用於評估任何既定抗體或選擇性結合劑對其抗原之結合親和力之實驗性方法。此通常藉由使用方程式KD=koff/kon=[A][B]/[AB]量測平衡解離常數(KD或Kd)來進行。術語koff係以每單位時間計的抗體與抗原之間的解離速率，且係指在平衡狀態下，以未結合形式存在於溶液中之抗體及抗原之濃度。術語kon係以每單位時間計的抗體與抗原之締合速率，且係指在平衡狀態下之結合之抗原-抗體複合物之濃度。用於量測KD之單位為mol/L (莫耳濃度，或M)或濃度。抗體之Ka為KD之對數且係藉由方程式Ka=1/KD測定。可用於測定KD值之一些實驗性方法之實例為：酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、等溫滴定量熱法(ITC)、螢光各向異性、表面電漿子共振(SPR)及親和力毛細電泳法(ACE)。抗體之親和力常數(Ka)為KD之對數且係藉由方程式Ka=1/KD測定。
在某些實施例中，視為適用之抗體之親和力常數(Ka)可為約、至少約或至多約106 、107 、108 、109 或1010 M或其中任何可導出之範圍。類似地，在一些實施例中，抗體之解離常數可為約、至少約或至多約10-6 、10-7 、10-8 、10-9 、10-10 M或其中任何可導出之範圍。報導本文中所論述之抗體之此等值且相同分析法可用於評估此類抗體之結合特性。當解離常數(KD)≤10-8 M時，稱為本發明之抗體「特異性結合」其目標抗原。當KD≤5×10-9 M時，抗體以「高親和力」特異性結合抗原，且當KD≤5×10-10 M時，抗體以「極高親和力」特異性結合抗原。
抗原之抗原決定基為抗原之特異性區域，抗體對該區域具有結合親和力。在蛋白質或多肽抗原之情況下，抗原決定基為抗體以高親和力結合之特異性殘基(或指定胺基酸或蛋白質區段)。抗體未必與蛋白質內之每個殘基接觸。蛋白質內之每個單一胺基酸取代或刪除亦未必影響結合親和力。出於本說明書及隨附申請專利範圍之目的，術語「抗原決定基」及「抗原決定子」用於指B及/或T細胞回應或識別之抗原上之位點。多肽抗原決定基可由相鄰胺基酸及非相鄰胺基酸形成，該等胺基酸藉由多肽之三級摺疊而毗鄰。抗原決定基通常包括至少3個且典型地，5-10個呈獨特空間構形之胺基酸。
可以多種方式測定抗體之抗原決定基特異性。舉例而言，一種方法涉及測試跨越蛋白質之完全序列且在少數胺基酸(例如3至30個胺基酸)之遞增方面不同的具有約15個胺基酸重疊肽之集合。將肽固定於微量滴定盤之單獨的孔中。舉例而言，可藉由將肽之一端生物素化來實現固定。此方法可能影響抗體對抗原決定基之親和力，因此可將相同肽之不同樣品在N及C端生物素化且固定於單獨的孔中以用於比較目的。此適用於鑑別末端特異性抗體。視情況，可包括在相關特定胺基酸處封端之其他肽。此方法適用於鑑別針對內部片段之末端特異性抗體。針對與各種肽中之每一者之結合來篩選抗體或抗原結合片段。抗原決定基定義為抗體展示高親和力結合之所有肽所共有之胺基酸之區段。
應理解，本發明之抗體可經修飾，使得其與抗體多肽序列或其片段實質上一致，且仍結合本發明之抗原決定基。當使用諸如Clustal Omega、IGBLAST、GAP或BESTFIT之程序，使用預設空位權重進行最佳比對時，多肽序列共有至少80%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性或其中任何範圍，則多肽序列為「實質上一致」。
如本文中所論述，涵蓋抗體或其抗原結合區之胺基酸序列之較小變化，如由本發明涵蓋，限制條件為胺基酸序列中之變化保持至少75%，更佳至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%及最佳至少99%序列一致性。特定言之，涵蓋保守性胺基酸置換。
保守性置換為在其側鏈中相關之胺基酸家族內進行的置換。經基因編碼之胺基酸通常基於側鏈之化學性質而分成各家族；例如酸性(天冬胺酸、麩胺酸酯)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)及不帶電極性(甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)。舉例而言，可合理地預期由異白胺酸或纈胺酸部分進行之白胺酸部分之經分離之置換或由相同家族中之結構上相關的胺基酸進行之胺基酸之類似置換將不會對所得分子之結合或特性具有重要影響，尤其當置換不涉及構架位點內之胺基酸時。藉由分析多肽衍生物之比活性可容易地確定胺基酸變化是否產生功能肽。熟習此項技術者可進行標準ELISA、表面電漿子共振(SPR)或其他抗體結合分析法，以進行未經修飾之抗體與具有保守性取代之任何多肽衍生物之間的抗原結合親和力之定量比較，該等多肽衍生物係經由熟習此項技術者可用的若干方法中之任一者產生。
熟習此項技術者可容易地製備抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物。片段或類似物之較佳胺基及羧基端位於功能性域之邊界附近。可藉由比較核苷酸及/或胺基酸序列資料與公用或專用序列資料庫來鑑別結構性及功能性域。較佳地，使用電腦化比較方法鑑別序列模體或預測其他具有已知結構及/或功能之蛋白質中存在的蛋白質構形域。熟習此項技術者可獲得用於鑑別摺疊成已知的三維結構之蛋白質序列之標準方法；Dill及McCallum., Science 338:1042-1046 (2012)。已研發出若干種用於預測蛋白質結構及編碼此等蛋白質結構之基因序列之演算法，且許多此等演算法可見於國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(全球資訊網網址ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/)及生物資訊學資源網(Bioinformatics Resource Portal)(全球資訊網網址expasy.org/proteomics)。因此，前述實例表明熟習此項技術者可識別可用於定義根據本發明之結構性及功能性域之序列模體及結構構形。
可對抗體進行構架修飾以降低免疫原性，例如藉由將一或多個構架殘基「回復突變」成相應的生殖系序列。
亦涵蓋藉由使抗原結合域與結合相同抗原(多價)或不同抗原(多特異性)之VH及VL區對進行多聚化來使得抗原結合域為多特異性或多價的。
在一些態樣中，亦涵蓋抗體之糖基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，已改變糖基化位點之數目及/或類型。舉例而言，可藉由修飾多肽序列內之一或多個糖基化位點以提高多肽對抗原之親和力來改變多肽之糖基化(美國專利案第5,714,350號及第6,350,861號)。在某些實施例中，與原生抗體相比，抗體蛋白質變異體包含更大數目或更小數目之N-連接之糖基化位點。N連接之糖基化位點之特徵在於以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中命名為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸以外之任何胺基酸殘基。用於產生此序列之胺基酸殘基之取代提供潛在的新位點以用於N-連接之碳水化合物鏈之添加。或者，消除或改變此序列之取代將阻止存在於原生多肽中之N-連接之碳水化合物鏈之添加。舉例而言，可藉由刪除Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新的N-連接之糖基化位點。抗體通常在Fc區中具有N-連接之糖基化位點。
其他抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。半胱胺酸變異體為適用的，尤其當抗體必須再摺疊成生物活性構形時。與原生抗體相比，半胱胺酸變異體可具有較少半胱胺酸殘基，且通常為偶數個以將由不成對半胱胺酸引起之相互作用最小化。
在一些態樣中，可藉由使多肽與聚乙二醇(PEG)或PEG之反應性酯或醛衍生物在其中一或多個PEG基團變成連接至多肽之條件下反應來將多肽聚乙二醇化，以延長生物半衰期。多肽聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。用於將蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術中已知的且可應用於本發明之多肽，以獲得抗體之聚乙二醇化衍生物。參見例如EP 0 154 316及EP 0 401 384。在一些態樣中，抗體結合或以其他方式連接至甲狀腺素運載蛋白(TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(正乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。如本文中所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG之任何形式。
亦提供本文中所描述之抗體及抗原結合片段之衍生物。衍生化抗體或其片段可包含任何賦予抗體或片段所需特性之分子或物質。衍生化抗體可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色、抗原性或酶分子，或可偵測珠粒)、與另一分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素)結合之分子、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥學活性部分)，或增加抗體用於特定用途(例如向諸如人類個體之個體投與，或其他活體內或活體外用途)之適合性的分子。視情況地，抗體或抗體之免疫部分可以化學方式結合或表現為具有其他蛋白質之融合蛋白質。在一些態樣中，可藉由使多肽與血清蛋白質(諸如人類血清白蛋白)結合或融合來對多肽進行化學修飾，以延長所得分子之半衰期。參見例如EP 0322094及EP 0 486 525。在一些態樣中，多肽亦可與治療劑結合，以提供療法與多肽之治療作用之組合。
在一些態樣中，涵蓋免疫結合物，其包含與細胞毒性劑(諸如化學治療劑)、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即，放射性結合物)結合之抗體或其抗原結合片段。 B.          實例抗體
能夠結合於且活化PLXDC1之實例抗體揭示於實驗實例(例如表6)中。在一個實施例中，提供抗體或其抗原結合片段，其對含有人類叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，VH包含VH互補決定區(CDR)CDR1、VH CDR2、VH CDR3，VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為選自表6之抗體之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體1-A1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體1-A5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體1-H10之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-B4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-B5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-F7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-F8之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-G4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-H2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-H9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-A7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-A9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-B3之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C4之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-C12之彼等。在一個實施例中，在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-D3之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-D6之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-D7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-D12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-E2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-E5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-E7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-E8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-E9之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-F5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-F6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-F12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-G4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-G5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-G6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-G7之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-G8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-H1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體3-H4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-A7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-A8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-B1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-B2之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-B11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-D12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-F4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體4-G12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體5-C9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體5-E2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體5-E12之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體6-G4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體6-H5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A8之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-A9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-C4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-C6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-C9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-C10之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-C11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-D11之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-D4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-D7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-E2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-E3之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-E9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-F1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-F2之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-F4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-F6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-F11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-G12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-H7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-A6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-B3之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-B10之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-C2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-D8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-E4之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-E5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-G1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-G3之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體9-H9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體2-C8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體8-D9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-A9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-B2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-B5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-C1之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-C3之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-C9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-C11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-D7之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-E1之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-E6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-E7之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-F11之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-F12之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體10-G5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-B6之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-D8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-D10之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-D11之彼等。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-G2之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-G5之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-G9之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-H8之彼等。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3為抗體11-H11之彼等。
來自此等抗體之實例CDR序列(Kabat)展示於表7中。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、248、341、435、497及517之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:225、249、342、436、498及518之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、250、343、437、499及519之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:227、251、344、438、500及520之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:228、252、345、439、501及521之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、253、346、440、501及522之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、254、347、441、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:230、255、348、442、502及524之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:231、256、349、443、500及525之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:232、257、350、444、500及526之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:227、258、351、445、500及527之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、259、352、446、502及528之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、260、353、445、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、261、354、447、500及529之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:232、262、355、448、503及530之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、263、356、449、500及531之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、264、357、450、500及532之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、265、358、451、504及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、266、359、448、500及533之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、267、360、452、502及534之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:233、268、361、439、501及535之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、269、362、453、502及536之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:234、270、363、454、502及537之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、271、364、444、500及538之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、272、365、455、502及539之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、273、366、456、501及540之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、274、367、457、501及541之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、275、368、444、503及542之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:234、270、363、446、502及543之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、276、369、458、502及544之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、277、370、454、502及545之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:232、278、371、459、500及531之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、279、372、460、504及531之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:231、280、373、444、505及546之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:235、281、374、461、501及547之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、282、375、462、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、283、376、463、506及548之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、284、377、464、501及549之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:236、285、378、435、507及550之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、286、379、465、508及551之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、287、380、435、509及552之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:237、288、381、466、509及553之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:238、289、382、467、510及554之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、290、376、435、511及555之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:239、291、383、435、508及556之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、292、384、468、512及557之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:240、293、385、469、502及558之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:231、294、386、445、500及559之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、295、387、470、501及560之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、296、388、435、498及561之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、297、389、435、498及562之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:241、298、390、454、513及563之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、299、376、459、505及564之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、300、391、445、500及565之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、301、392、471、501及566之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、302、393、472、500及567之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、303、394、473、500及523之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、304、395、462、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、305、396、444、500及568之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、306、397、474、505及569之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、307、398、463、500及570之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、308、399、472、503及531之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:242、309、400、442、514及571之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、310、376、475、500及530之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、311、401、476、513及572之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:243、312、402、477、515及573之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、313、403、478、516及535之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、314、404、479、513及574之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、315、405、439、516及575之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、303、394、473、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:234、316、406、438、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、317、407、439、516及576之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:244、318、408、458、514及577之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:234、270、363、446、502及543之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、304、395、462、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、300、391、445、500及565之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:231、280、373、438、500及578之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、319、409、439、516及579之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、317、407、439、516及576之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:245、320、410、480、516及580之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、317、407、439、516及576之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:242、321、411、481、500及581之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、322、412、482、503及582之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、323、413、474、500及583之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、324、414、445、505及584之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、325、415、450、500及585之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:243、312、416、477、515及573之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、325、415、450、503及585之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、300、417、445、500及565之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、326、418、483、500及531之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、327、419、484、500及529之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、279、420、485、500及531之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、304、421、486、500及523之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、328、422、470、501及586之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、329、376、484、500及548之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、300、417、445、500及565之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、330、423、487、505及587之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、279、424、438、500及588之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:246、331、425、488、501及589之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、332、426、489、516及566之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、333、427、490、501及590之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:247、334、428、491、516及535之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、335、429、492、500及567之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:224、336、430、493、502及591之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:232、337、431、494、500及592之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:241、298、390、454、513及563之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、338、432、495、502及593之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:229、339、433、496、503及529之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、340、434、438、500及548之胺基酸序列。在一個實施例中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO:226、269、362、454、502及594之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包括表6中之任何抗體之VH及VL。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:4及5之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:6及7之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:8及9之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:10及11之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:12及13之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:14及15之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:16及17之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:18及19之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:20及21之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:22及23之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:24及25之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:26及27之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:28及29之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:30及31之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:32及33之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:34及35之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:36及37之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:38及39之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:40及41之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:42及43之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:44及45之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:46及47之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:48及49之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:50及51之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:52及53之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:54及55之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:56及57之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:58及59之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:60及61之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:62及63之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:64及65之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:66及67之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:68及69之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:70及71之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:72及73之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:74及75之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:76及77之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:78及79之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:80及81之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:82及83之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:84及85之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:86及87之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:88及89之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:90及91之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:92及93之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:94及95之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:96及97之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:98及99之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:100及101之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:102及103之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:104及105之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:106及107之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:108及109之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:110及111之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:112及113之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:114及115之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:116及117之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:118及119之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:120及121之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:122及123之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:124及125之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:126及127之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:128及129之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:130及131之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:132及133之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:134及135之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:136及137之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:138及139之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:140及141之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:142及143之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:144及145之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:146及147之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:148及149之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:150及151之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:152及153之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:154及155之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:156及157之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:158及159之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:160及161之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:162及163之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:164及165之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:166及167之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:168及169之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:170及171之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:172及173之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:174及175之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:176及177之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:178及179之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:180及181之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:182及183之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:184及185之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:186及187之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:188及189之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:190及191之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:192及193之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:194及195之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:196及197之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:198及199之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:200及201之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:202及203之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:204及205之胺基酸序列。
在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:206及207之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:208及209之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:210及211之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:212及213之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:214及215之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:216及217之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:218及219之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:220及221之胺基酸序列。在一個實施例中，VH及VL分別具有SEQ ID NO:222及223之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH CDR1包含SEQ ID NO:224-247中之一者之胺基酸序列，VH CDR2包含SEQ ID NO:248-340中之一者之胺基酸序列，VH CDR3包含SEQ ID NO:341-362中之一者之胺基酸序列，VL CDR1包含SEQ ID NO:435-496中之一者之胺基酸序列，VL CDR2包含SEQ ID NO:497-516中之一者之胺基酸序列且VL CDR3包含SEQ ID NO:517-594中之一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體可包含與SEQ ID NO:224-594具有至少65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性(或其中任何可導出之範圍)之CDR。
在某些態樣中，多肽可以包含來自SEQ ID NO:4-223之可變重鏈或可變輕鏈之1、2及/或3個CDR。CDR可為已由Kabat、IMGT或Chothia測定之CDR。在其他實施例中，多肽可具有與此等1、2或3個CDR相比具有1、2及/或3個胺基酸變化(添加1或2個胺基酸、刪除1或2個胺基酸或取代)之CDR。在其他實施例中，抗體可替代或額外地在CDR外之區域及/或可變區中經人類化。在一些態樣中，多肽替代或額外地包含與可變區之胺基酸序列至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%一致或同源之胺基酸序列，該可變區之胺基酸序列不為CDR序列，亦即，可變區構架。
自胺基至羧基端，CDR為CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，多肽可具有與CDR1、CDR2或CDR3相比具有1、2及/或3個胺基酸變化(添加1或2個胺基酸、刪除1或2個胺基酸或取代)之CDR。在一些實施例中，SEQ ID NO:4-223之CDR可在CDR之胺基或羧基端處進一步包含1、2、3、4、5或6個額外胺基酸；在一些實施例中，SEQ ID NO:4-223之CDR可排除CDR之胺基或羧基端處之1、2、3、4、5或6個胺基酸。額外胺基酸可來自SEQ ID NO:4-223之重鏈及/或輕鏈構架區，其展示為緊鄰CDR。因此,實施例係關於包含在CDR之胺基端或CDR之羧基端處具有至少或至多或恰好1、2、3、4、5、6或7個胺基酸之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及/或LCDR3之抗體，其中額外胺基酸係展示為緊鄰CDR之SEQ ID NO:4-223之1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。其他實施例係關於包含一或多個CDR之抗體，其中CDR為SEQ ID NO:224-594之片段且其中片段不具有來自CDR之胺基或羧基端之1、2、3、4或5個胺基酸。在一些實施例中，CDR可不具有來自羧基端之一、2、3、4、5、6或7個胺基酸且可進一步包含來自CDR之胺基端之構架區之1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸。在一些實施例中，CDR可不具有來自胺基端之一、2、3、4、5、6或7個胺基酸且可進一步包含來自CDR之羧基端之構架區之1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸。在其他實施例中，抗體可替代或額外地在CDR外之區域及/或可變區中經人類化。在一些態樣中，多肽替代或額外地包含與可變區之胺基酸序列至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%一致或同源之胺基酸序列，該可變區之胺基酸序列不為CDR序列，亦即，可變區構架。
在其他實施例中，多肽或蛋白質包含來自SEQ ID NO:4-223之輕鏈及重鏈可變區中之任一者或兩者之1、2、3、4、5及/或6個CDR，且1、2、3、4、5及/或6個CDR與此等CDR相比可具有1、2及/或3個胺基酸變化。在一些實施例中，可變區外之一部分或所有抗體序列經人類化。蛋白質可包含一或多個多肽。在一些態樣中，蛋白質可含有一個或兩個與重鏈多肽類似之多肽及/或1個或2個與輕鏈多肽類似之多肽。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段在表6、表7中鑑別之VH、VL或CDR區、SEQ ID NO:4-223之VH及VL區或SEQ ID NO:224-594之CDR的胺基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130 (或其中任何可導出之範圍)處包含、包含至少或包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個取代(或其中任何可導出之範圍)。在一些實施例中，表6、表7中鑑別之VH、VL或CDR區、SEQ ID NO:4-223之VH及VL區或SEQ ID NO:224-594之CDR的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130處之胺基酸經丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸取代。
在一些實施例中，表6、表7中鑑別之VH、VL或CDR區、SEQ ID NO:4-223之VH及VL區或SEQ ID NO:224-594之CDR的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130處之胺基酸經保守性胺基酸取代。
在一些實施例中，表6、表7中鑑別之VH、VL或CDR區、SEQ ID NO:4-223之VH及VL區或SEQ ID NO:224-594之CDR的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130處之胺基酸經非保守性胺基酸取代。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150個(或其中任何可導出之範圍)SEQ ID NO:4-594中之任一者。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含SEQ ID NO:4-594中之任一者之至少、至多或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150個(或其中任何可導出之範圍)相鄰胺基酸，其與SEQ ID NO:4-594中之任一者具有至少、至多或約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% (或其中任何可導出之範圍)相似性、一致性或同源性。
在一些態樣中，存在一種多肽，諸如抗體或抗原結合片段，其在SEQ ID NO:4-594中之任一者之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130處起始且包含SEQ ID NO:4-594中之任一者之至少、至多或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130個(或其中任何可導出之範圍)相鄰胺基酸或核苷酸。
本發明之胺基酸序列變異體可為取代、插入或缺失變異體。在一些實施例中，與特定序列(諸如本文中所揭示之序列中之任一者)相比，本發明之多肽中之變化影響或影響至少或影響至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個蛋白質或多肽之非相鄰或相鄰胺基酸。變異體可包含與本文中提供或參考之任何序列具有至少50%、60%、70%、80%或90% (包括其間的所有值及範圍)一致性之胺基酸序列。變異體可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個取代胺基酸。
亦將理解，胺基酸及核酸序列分別可包括其他殘基，諸如N或C端胺基酸，或5'或3'序列，且仍基本上一致，如本文中所揭示之序列中之一者中所闡述，只要序列符合上述準則即可，包括保持與蛋白質表現有關之生物學蛋白質活性。末端序列之添加尤其適用於可能例如包括各種側接編碼區之5'或3'部分中之任一者之非編碼序列之核酸序列。
缺失變異體通常不具有參考蛋白質之一或多個殘基。可缺失個別殘基或可缺失多個相鄰胺基酸。可將終止密碼子引入(藉由取代或插入)編碼核酸序列中以產生經截短之蛋白質。
插入突變體通常涉及在多肽中之非末端點處添加胺基酸殘基。此可包括插入一或多個胺基酸殘基。亦可產生末端添加物且可包括融合蛋白質，其為本文中描述或參考之一或多種肽或多肽之多聚體或串聯體。
取代變異體通常含有一個胺基酸更換蛋白質或多肽內之一或多個位點處之另一胺基酸，且可經設計以在損失或不損失其他功能或特性之情況下調節多肽之一或多種特性。取代可為保守性，亦即，一個胺基酸由具有類似化學特性之胺基酸置換。「保守性胺基酸取代」可涉及一種胺基酸類別之成員由相同類別之另一成員更換。保守性取代在此項技術中已熟知且包括例如以下變化：丙胺酸變成絲胺酸；精胺酸變成離胺酸；天冬醯胺變成麩醯胺酸或組胺酸；天冬胺酸變成麩胺酸；半胱胺酸變成絲胺酸；麩醯胺酸變成天冬醯胺；麩胺酸變成天冬胺酸；甘胺酸變成脯胺酸；組胺酸變成天冬醯胺或麩醯胺酸；異白胺酸變成白胺酸或纈胺酸；白胺酸變成纈胺酸或異白胺酸；離胺酸變成精胺酸；甲硫胺酸變成白胺酸或異白胺酸；苯丙胺酸變成酪胺酸、白胺酸或甲硫胺酸；絲胺酸變成蘇胺酸；蘇胺酸變成絲胺酸；色胺酸變成酪胺酸；酪胺酸變成色胺酸或苯丙胺酸；及纈胺酸變成異白胺酸或白胺酸。保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來併入。其包括肽模擬物或胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。
或者，取代可為「非保守性」，使得影響多肽之功能或活性。非保守性變化通常涉及用化學上相異的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，諸如用極性或帶電胺基酸取代非極性或不帶電胺基酸，且反之亦然。非保守性取代可能涉及將一種胺基酸類別之成員更換成另一種類別之成員。
熟習此項技術者可使用熟知的技術確定適合的如本文所闡述之多肽之變異體。熟習此項技術者可藉由靶向咸信對活性不重要之區域來鑑別分子中可在不破壞活性的情況下進行改變之適合的區域。熟習此項技術者亦將能夠鑑別在類似蛋白質或多肽中具有保守性之胺基酸殘基及分子之部分。在其他實施例中，對生物活性或結構而言重要的區域可經歷保守性胺基酸取代而不顯著改變生物活性或不會不利地影響蛋白質或多肽結構。
在進行此類改變時，可考慮胺基酸之親水性指數。蛋白質之親水性概況係藉由對各胺基酸分配數值(「親水性指數」)且接著沿肽鏈重複計算此等值之平均值來計算。已基於各胺基酸之疏水性及電荷特徵來對其分配值。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/半胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。此項技術中通常理解親水性胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能方面之重要性(Kyte等人, J. Mol. Biol. 157:105-131 (1982))。認為胺基酸之相對親水性特徵有助於所得蛋白質或多肽之二級結構，其又定義蛋白質或多肽與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原等)之相互相用。亦已知某些胺基酸可取代其他具有類似親水性指數或分數之胺基酸，且仍保留類似生物活性。在基於親水性指數進行改變時，在某些實施例中，包括親水性指數在±2以內之胺基酸之取代。在本發明之一些態樣中，包括在±1以內之胺基酸之取代且在本發明之其他態樣中，包括在±0.5以內之胺基酸之取代。
在此項技術中亦應理解，可基於親水性來有效地進行類似胺基酸之取代。美國專利案4,554,101 (其以引用之方式併入本文中)陳述，由鄰近胺基酸之親水性決定的蛋白質之最大局部平均親水性與該蛋白質之生物學特性相關。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如由其相鄰胺基酸之親水性所決定)與其免疫原性及抗原結合(亦即，蛋白質之生物學特性)相關。已對此等胺基酸殘基分配以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值進行改變時，在某些實施例中，包括親水性值在±2以內之胺基酸之取代，在其他實施例中，包括在±1以內之胺基酸之取代，且在其他實施例中，包括在±0.5以內之胺基酸之取代。在一些情況下，亦可基於親水性來鑑別來自一級胺基酸序列之抗原決定基。此等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。應理解，胺基酸可取代另一個具有類似親水性值之胺基酸且仍產生生物學上等效及免疫學上等效之蛋白質。
此外，熟習此項技術者可評述結構-功能研究，其鑑別多肽或蛋白質中之對於活性或結構而言重要的殘基。鑒於此類比較，可預測蛋白質中之與類似蛋白質中之對活性或結構而言重要之胺基酸殘基對應的胺基酸殘基之重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代以用於此類所預測之重要胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可相對於類似蛋白質或多肽中之結構來分析三維結構及胺基酸序列。鑒於此類資訊，熟習此項技術者可相對於抗體之三維結構來預測其胺基酸殘基之排列。熟習此項技術者可選擇不對預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基進行改變，因為此類殘基可能涉及與其他分子之重要相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著，可使用標準分析法針對結合及/或活性來篩選此等變異體，由此產生自此類常規實驗收集之資訊，其使得熟習此項技術者能夠確定應避免進一步取代(單獨或與其他突變組合)之胺基酸位置。可在全球資訊網expasy.org/proteomics/protein_structure發現各種可用於確定二級結構之工具。
在本發明之一些實施例中，進行胺基酸取代以：(1)降低對蛋白水解之敏感性，(2)降低對氧化之敏感性，(3)改變結合親和力以用於形成蛋白質複合物，(4)改變配位體或抗原結合親和力，及/或(5)賦予此類多肽其他物理化學或功能特性或修飾此類多肽之其他物理化學或功能特性。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單一或多重胺基酸取代(在某些實施例中，保守性胺基酸取代)。可在抗體中之位於形成分子間接觸的域之外的部分中進行取代。在此類實施例中，可使用不會實質上改變蛋白質或多肽之結構特徵之保守性胺基酸取代(例如一或多個不會破壞表徵原生抗體之二級結構之置換胺基酸)。 C.       鑑別活化抗體之方法
本發明亦提供適用於鑑別活化抗體及片段之方法及藥劑。如實驗實例中說明，活化抗體或片段在存在活化劑(諸如本發明之小分子化合物)之情況下能夠優先結合於PLXDC1或PLXDC2蛋白質。預期活化劑可使同源寡聚物解離且使得PLXDC1或PLXDC2蛋白質更易受抗體影響。在結合於PLXDC1或PLXDC2蛋白質之後，抗體能夠使蛋白質保持活性(單體)狀態。
因此，在一個實施例中，提供一種用於鑑別PLXDC蛋白質之活化劑之方法，其包含使候選分子與PLXDC蛋白質在存在參考PLXDC活化劑之情況下接觸，及偵測候選分子與PLXDC蛋白質之間的結合親和力，藉此在所偵測之結合親和力大於在不存在參考PLXDC活化劑之情況下的候選分子與PLXDC蛋白質之間的參考結合親和力時，將候選分子鑑別為PLXDC活化劑。在一些實施例中，參考活化劑為小分子化合物，諸如表3中之化合物。在一些實施例中，候選分子為抗體，諸如來自抗體庫之抗體。 V.       核酸
本文中亦提供編碼本文中所描述之結合於PLXDC1及/或PLXDC2之PLXDC1及/或PLXDC2受體、抗體、其抗原結合片段及/或多肽之核酸或聚核苷酸分子。舉例而言，聚核苷酸可編碼PLXDC1及/或PLXDC2蛋白質或其片段。核酸可存在於例如完全細胞、細胞溶解物中或以部分純化或實質上純形式存在。
在某些實施例中，核酸序列可以多種形式存在，諸如：併入之序列之經分離之區段及重組載體或編碼抗體之一條或兩條鏈之重組聚核苷酸，或其片段、衍生物突變蛋白質或變異體；足以用作雜交探針之聚核苷酸；用於鑑別、分析、突變或擴增編碼多肽之聚核苷酸之PCR引子或定序引子；用於抑制聚核苷酸之表現之反義核酸；及本文中所描述之前述各者之互補序列。亦提供編碼本文中所提供之某些抗體所針對之抗原決定基之核酸。亦提供編碼包括此等肽之融合蛋白質之核酸。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸及其人工變異體(例如肽核酸)。
術語「聚核苷酸」係指一種核酸分子，其為重組的或已自完全基因體核酸分離。術語「聚核苷酸」包括寡核苷酸(長度為100個殘基或更少之核酸)、重組載體，包括例如質體、黏質體、噬菌體、病毒及其類似物。在某些態樣中，聚核苷酸包括調節序列，自其天然存在之基因或蛋白質編碼序列實質上分離。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為RNA、DNA (基因體、cDNA或合成性)、其類似物或其組合。其他編碼或非編碼序列可(但無需)存在於聚核苷酸內。
在此態樣中，術語「基因」、「聚核苷酸」或「核酸」用於指編碼蛋白質、多肽或肽之核酸(包括適當轉錄、轉譯後修飾或定位所需之任何序列)。如熟習此項技術者將理解，此術語涵蓋基因體序列、表現卡匣、cDNA序列及較小的經工程改造之核酸區段，其表現或可經調適以表現蛋白質、多肽、域、肽、融合蛋白質及突變體。編碼全部或一部分多肽之核酸可含有編碼全部或一部分此類多肽之相鄰核酸序列。亦涵蓋特定多肽可由含有變化之核酸編碼，該等核酸具有略微不同的核酸序列，但仍編碼相同或實質上類似的蛋白質。
在某些實施例中，存在與本文中所揭示之序列具有實質上一致性之聚核苷酸變異體；使用本文中所描述之方法(例如使用標準參數之BLAST分析)，與本文中所提供之聚核苷酸序列相比，包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列一致性(包括其間的所有值及範圍)之聚核苷酸變異體。在某些態樣中，經分離之聚核苷酸將包含核苷酸序列，其編碼在整個序列長度上與本文中所描述之胺基酸序列具有至少90%，較佳95%及更高的一致性之多肽；或與該經分離之聚核苷酸互補之核苷酸序列。
與編碼序列本身之長度無關，核酸區段可與其他核酸序列(諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、其他限制酶位點、多選殖位點、其他編碼區段及其類似物)組合，使得其整體長度可顯著變化。核酸可具有任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000個或更多個核苷酸，及/或可包含一或多個其他序列，例如調節序列，及/或為較大核酸(例如載體)之一部分。因此預期可使用幾乎任何長度之核酸片段，其中總長度較佳受製備簡易性及預期重組核酸方案中之用途限制。在一些情況下，核酸序列可編碼具有其他異源編碼序列之多肽序列，例如以實現多肽之純化、輸送、分泌、轉譯後修飾，或實現治療益處，諸如靶向或功效。如上文所論述，可向經修飾之多肽編碼序列中添加標籤或其他異源多肽，其中「異源」係指與經修飾之多肽不同之多肽。 A.         雜交
在特定雜交條件下與其他核酸雜交之核酸。用於雜交核酸之方法係此項技術中熟知的。參見例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。如本文中所定義，中等嚴格雜交條件使用含有5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)、約50%甲醯胺之雜交緩衝液、6×SSC之預洗滌溶液，及55℃之雜交溫度(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，且雜交溫度為42℃)，及在0.5×SSC、0.1% SDS中之60℃之洗滌條件。嚴格雜交條件在45℃下，在6×SSC中雜交，接著在68℃下，在0.1×SSC、0.2% SDS中進行一或多次洗滌。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以提高或降低雜交之嚴格度，使得包含彼此具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之核苷酸序列之核酸通常保持彼此雜交。
影響雜交條件之選擇之參數及用於設計適合的條件之指導由例如Sambrook, Fritsch及Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 第9及11章 (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人編, John Wiley and Sons, Inc., 第2.10及6.3-6.4章 (1995)，其皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的)闡述且可由一般熟習此項技術者基於例如DNA之長度及/或鹼基組成而容易地確定。 B.       突變
可藉由突變來向核酸中引入變化，藉此在其編碼之多肽(例如抗體或抗體衍生物)之胺基酸序列中引起變化。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變。在一個實施例中，使用例如定點突變誘發方案來改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變誘發方案改變一或多個隨機選擇之殘基。無論以何種方式進行，可針對所需特性來表現及篩選突變多肽。
可在不顯著改變核酸編碼之多肽的生物活性的情況下將突變引入核酸中。舉例而言，吾人可進行在非必需胺基酸殘基處引起胺基酸取代之核苷酸取代。或者，可將選擇性改變核酸所編碼之多肽的生物活性之一或多個突變引入核酸中。參見例如Romain Studer等人, Biochem. J. 449:581-594 (2013)。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量變化之實例包括增加、降低或消除活性。定性變化之實例包括改變抗體之抗原特異性。 C.         探針
在另一態樣中，核酸分子適用作用於偵測核酸序列之引子或雜交探針。核酸分子可僅包含編碼全長多肽之核酸序列之一部分，舉例而言，可用作探針或引子之片段或編碼既定多肽之活性部分之片段。
在另一實施例中，核酸分子可用作特異性抗體序列之探針或PCR引子。舉例而言，核酸分子探針可用於診斷方法中或核酸分子PCR引子可用於擴增DNA之區域，該等區域可尤其用於分離用於產生抗體之可變域之核酸序列。參見例如Gaily Kivi等人, BMC Biotechnol. 16:2 (2016)。在較佳實施例中，核酸分子為寡核苷酸。在更佳實施例中，寡核苷酸係來自相關抗體之重鏈及輕鏈之高度可變區。在甚至更佳的實施例中，寡核苷酸編碼一或多個CDR之全部或一部分。
基於核酸之所需序列之探針可用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼相關多肽之轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。此類探針可用於鑑別表現多肽之細胞。 VI.     抗體產生  A.       抗體產生
用於產生及表徵用於診斷性及偵測分析法、用於純化及用作治療劑之抗體之方法係此項技術中熟知的，如例如美國專利案第4,011,308號；第4,722,890號；第4,016,043號；第3,876,504號；第3,770,380號；及第4,372,745號(參見例如Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；其以引用之方式併入本文中)中所揭示。此等抗體可為多株或單株抗體製劑、單特異性抗血清、人類抗體、雜交或嵌合抗體，諸如人類化抗體、經改變之抗體、F(ab')2片段、Fab片段、Fv片段、單域抗體、二聚或三聚抗體片段構築體、微型抗體或其結合於所述抗原之功能性片段。在某些態樣中，亦可根據習知技術，在溶液中或在固體負載物上合成用於各種實施例之多肽、肽及蛋白質以及其免疫原性片段。參見例如Stewart及Young, (1984)；Tarn等人, (1983)；Merrifield, (1986)；以及Barany及Merrifield (1979)，其各自以引用之方式併入本文中。
簡言之，藉由用抗原或其一部分使動物免疫且自該經免疫之動物收集抗血清來製備多株抗體。與在自然界中發現之抗原序列相比，抗原可發生改變。在一些實施例中，使用變異體或經改變之抗原肽或多肽產生抗體。通常藉由將抗原性組合物分散於生理學上可耐受之稀釋劑中以形成水性組合物來製備接種體。接著，藉由此項技術中已知的方法收集抗血清，且血清可按原樣用於各種應用或可藉由熟知方法(諸如親和層析)來純化所需抗體溶離份(Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 1988)。
製備單株抗體之方法亦為此項技術中熟知的(Kohler及Milstein, 1975；Harlow及Lane, 1988，美國專利案4,196,265，其以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的)。通常，此技術涉及用所選擇的免疫原性組合物(例如經純化或部分純化之蛋白質、多肽、肽或域)使適合的動物免疫。接著，誘導自經免疫之動物獲得之產生抗體之B細胞或所有經解離之脾細胞以與來自永生化細胞株之細胞融合，以形成融合瘤。適用於產生融合瘤之融合程序之骨髓瘤細胞株較佳不產生抗體且具有高融合效率且酶不足，從而使其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。通常，融合搭配物包括可實現使用特異性培養基選擇所得融合瘤之特性。舉例而言，融合搭配物可為次黃嘌呤/胺基喋呤/胸苷(HAT)敏感性。用於產生抗體產生脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之雜合物之方法通常包含在存在可促進細胞膜之融合的一或多種藥劑(化學或電學)之情況下混合體細胞與骨髓瘤細胞。接著，可藉由在微量滴定盤中藉由單純系稀釋來培養細胞，接著測試個別純系上清液(在約兩至三週之後)之所需反應性來進行融合瘤之選擇。用於製備融合瘤之融合程序、免疫接種方案及用於分離經免疫之脾細胞以用於融合之技術為此項技術中已知的。
其他用於製備單株抗體之技術包括B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉形，可使用分子選殖方法產生核酸或多肽，所選擇之淋巴細胞抗體方法(SLAM)(參見例如Babcook等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996))，由自經免疫之動物之脾分離的RNA製備組合性免疫球蛋白噬菌粒庫及選擇表現適合的抗體之噬菌粒，或使用Cre介導之定點重組自包含經修飾之免疫球蛋白基因座之細胞之基因體序列產生表現抗體之細胞(參見例如U.S. 6,091,001)。
可使用過濾、離心及各種層析方法(諸如HPLC或親和層析)進一步純化單株抗體。可針對與特異性、親合力、半衰期、免疫原性、結合締合、結合解離相關之特性或與用於感染之治療相關之整體功能特性來進一步篩選或最佳化單株抗體。因此，單株抗體可具有CDR之胺基酸序列之變化，包括插入、缺失或用保守性或非保守性胺基酸進行之取代。
可藉由使用非特異性免疫反應刺激劑(稱為佐劑)來增強特定免疫原組合物之免疫原性。可根據實施例使用之佐劑包括(但不限於)IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、-干擾素、GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物，諸如thur-MDP及nor-MDP、CGP (MTP-PE)、脂質A及單磷醯基脂質A (MPL)。例示性佐劑可包括完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)(含有經殺傷之結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之非特異性免疫反應刺激劑)、不完全弗氏佐劑及氫氧化鋁佐劑。除佐劑以外，可能需要共同投與生物反應調節劑(BRM)，諸如(但不限於)西咪替丁(Cimetidine)(CIM；1200 mg/d)(Smith/Kline, PA)；低劑量環磷醯胺(CYP；300 mg/m2 )(Johnson/ Mead, NJ)，細胞介素，諸如β-干擾素、IL-2或IL-12，或編碼涉及免疫輔助功能之蛋白質之基因，諸如B-7。噬菌體呈現系統可用於活體外擴增抗體分子群體。Saiki等人, Nature 324:163 (1986)；Scharf等人, Science 233:1076 (1986)；美國專利案第4,683,195號及第4,683,202號；Yang等人, J Mol Biol. 254:392 (1995)；Barbas, III等人, Methods: Comp. Meth Enzymol. (1995) 8:94；Barbas, III等人, Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991)。 B.          完全人類抗體產生
可獲得用於製備完全人類抗體之方法。使用完全人類抗體可最小化可能由向人類投與非人類單株抗體作為治療劑而引起之免疫原性及過敏反應。在一個實施例中，可在非人類基因轉殖動物中產生人類抗體，例如能夠藉由經歷V-D-J重組及同型轉換而產生針對蛋白質之人類抗體(例如IgG、IgA及/或IgE)之多個同型之基因轉殖小鼠。因此，此態樣適用於抗體、抗體片段及其藥物組合物，但亦適用於非人類基因轉殖動物、B細胞、宿主細胞及產生單株抗體之融合瘤。人類化抗體之應用包括(但不限於)偵測活體內或活體外表現預期蛋白質之細胞、含有本發明之抗體之醫藥製劑及藉由投與抗體來治療病症之方法。
完全人類抗體可藉由使能夠在不產生內源性免疫球蛋白之情況下產生人類抗體譜系之基因轉殖動物(通常為小鼠)免疫來產生。出於此目的，抗原通常具有六個或更多個相鄰胺基酸，且視情況與載體(諸如半抗原)結合。參見例如Jakobovits等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555 (1993)；Jakobovits等人, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermann等人, Year in Immunol. 7:33 (1993)。在一個實例中，如下產生基因轉殖動物：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，且向小鼠基因體中插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座的人類基因體DNA之大型片段。接著，使經部分修飾之動物(其不具有人類免疫球蛋白基因座之完全互補)雜交，以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對該免疫原具免疫特異性，但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於此類方法之其他細節，參見例如國際專利申請公開案第WO 96/33735號及第WO 94/02602號，其以全文引用之方式併入本文中。其他與用於製備人類抗體之基因轉殖小鼠相關之方法描述於美國專利案第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299；及第5,545,806號；國際專利申請公開案第WO 91/10741號及第WO 90/04036號；以及歐洲專利案第EP 546073B1號及第EP 546073A1號中，其皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。
上述基因轉殖小鼠(本文中稱為「HuMab」小鼠)含有編碼未經重排之人類重鏈(µ及?)及?輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座，以及所靶向之使內源性µ及?鏈基因座不活化之突變(Lonberg等人, Nature 368:856-859 (1994))。因此，小鼠呈現降低之小鼠IgM或?鏈之表現且對免疫接種起反應，所引入的人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG ?單株抗體(Lonberg等人, 見上文；Lonberg及Huszar, Intern. Ref. Immunol. 13:65-93 (1995)；Harding及Lonberg, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546 (1995))。HuMAb小鼠之製備詳細描述於Taylor等人, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992)；Chen等人, Int. Immunol. 5:647-656 (1993)；Tuaillon等人, J. Immunol. 152:2912-2920 (1994)；Lonberg等人, 見上文；Lonberg, Handbook of Exp. Pharmacol. 113:49-101 (1994)；Taylor等人, Int. Immunol. 6:579-591 (1994)；Lonberg及Huszar, Intern. Ref. Immunol. 13:65-93 (1995)；Harding及Lonberg, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546 (1995)；Fishwild等人, Nat. Biotechnol. 14:845-851 (1996)中；前述參考文獻以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。亦參見美國專利案第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；第5,770,429號；及第5,545,807號；以及國際專利申請公開案第WO 93/1227號；第WO 92/22646號；及第WO 92/03918號，其揭示內容皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。用於在此等基因轉殖小鼠中製備人類抗體之技術亦揭示於WO 98/24893及Mendez等人, Nat. Genetics 15:146-156 (1997)中，其以引用之方式併入本文中。舉例而言，HCo7及HCo12基因轉殖小鼠品系可用於產生人類抗體。
使用融合瘤技術，可自基因轉殖小鼠(諸如上文所描述之基因轉殖小鼠)產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類化單株抗體。可使用適合的載體及宿主細胞來選殖及表現此類抗體，或可自所培養之融合瘤細胞收集抗體。完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現庫(如Hoogenboom等人, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)；及Marks等人, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)中所揭示)。一種此類技術描述於國際專利申請公開案第WO 99/10494號中(其以引用之方式併入本文中)，其描述使用此類方法分離針對MPL-及msk-受體之高親和力及功能性促效抗體。 C.         抗體片段產生
本文中亦可使用保留識別相關抗原之能力之抗體片段。此項技術中已知多種滿足以下條件之抗體片段：包含能夠呈現完整抗體分子之免疫結合特性之抗原結合位點且接著可由此項技術中已知的方法修飾。亦可使用標準技術(諸如重組產生或免疫球蛋白分子之優先優先蛋白水解分裂)來產生僅包括重鏈及輕鏈之可變區之功能性片段。此等片段稱為Fv。參見例如Inbar等人, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662 (1972)；Hochman等人, Biochem. 15:2706-2710 (1976)；及Ehrlich等人, Biochem. 19:4091-4096 (1980)。
可藉由使編碼DNA (其編碼兩個可變域多肽(VL及VH))之間的肽連接子之DNA融合來製備單鏈可變片段(scFv)。視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定，scFv可形成抗原結合單體或其可形成多聚體(例如二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人, Prot. Eng. 10:423 (1997)；Kort等人, Biomol. Eng. 18:95-108 (2001))。藉由組合不同的包含VL及VH之多肽，可形成結合於不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人, Biomol. Eng. 18:31-40 (2001))。通常藉由熟習此項技術者已知之重組DNA方法產生抗原結合片段。儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由單獨的基因編碼，但其可使用重組方法藉由使得其可形成單鏈多肽之合成連接子來接合(稱為單鏈Fv (sFv或scFv))；參見例如Bird等人, Science 242:423-426 (1988)；及Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)。設計準則包括確定跨越一條鏈之C端與另一條鏈之N端之間的距離之適合的長度，其中連接子通常由不傾向於盤繞或形成二級結構之小型親水性胺基酸殘基形成。適合的連接子通常包含交替的甘胺酸及絲胺酸殘基集合之多肽鏈，且可包括所插入之麩胺酸及離胺酸殘基以增強溶解性。以與完整抗體相同之方式，針對效用來篩選抗原結合片段。此類片段包括由胺基端及/或羧基端缺失獲得之片段，其中剩餘胺基酸序列與所推導之天然存在之序列(例如來自全長cDNA序列) 之相應位置實質上一致。
亦可使用本文中所揭示之抗原決定基決定子之肽類似物產生抗體，該等肽類似物可由具有與模板肽之特性類似的特性之非肽化合物組成。此等非肽化合物類型稱為「肽模仿物(peptide mimetic)」或「肽模擬物(peptidomimetic)」。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)；Veber及Freidinger TINS 第392頁 (1985)；及Evans等人, J. Med. Chem. 30:1229 (1987) Liu等人 (2003)亦描述「抗體樣結合肽模擬物」(ABiP)，其為充當簡化抗體之肽且具有如更長的血清半衰期以及繁瑣性較低之合成方法之某些優點。此等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區之組合。Fauchere, Adv. Drug Res. 15:29 (1986)；Veber及Freidiner, TINS 第392頁 (1985)；及Evans等人, J. Med. Chem. 30:1229 (1987)，其以全文引用之方式併入本文中以用於任何目的。在結構上與治療學上適用之肽類似之肽模擬物可用於產生類似的治療或預防作用。此類化合物通常借助於電腦化分子模型化來研發。通常，本發明之肽模擬物為在結構上與顯示所需生物活性(諸如結合蛋白質之能力)之抗體類似，但具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知的方法由選自以下之鍵置換的肽鍵之蛋白質：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH- (順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。在本發明之某些實施例中，可使用共同序列中之一或多個胺基酸由相同類型之D-胺基酸進行之系統取代(例如D-離胺酸代替L-離胺酸)，以產生更穩定的蛋白質。此外，可藉由此項技術中已知之方法產生包含共同序列或實質上一致的共同序列變化的限制性肽(Rizo及Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)，其以引用之方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵之內部半胱胺酸殘基。
在產生之後，可使用噬菌體呈現庫，使用已知的技術改良Fab分子之免疫結合親和力。參見例如Figini等人, J. Mol. Biol. 239:68 (1994)。可分離或合成選自噬菌體呈現庫之Fab分子之重鏈及輕鏈部分之編碼序列且選殖至任何適合的載體或複製子中以用於表現。可使用任何適合的表現系統。 VII.   獲得經編碼之抗體及多肽
在一些態樣中，存在編碼本發明之抗體多肽(例如重鏈或輕鏈、僅可變域或全長)或其他肽之核酸分子。此等核酸分子可藉由此項技術中已知之方法產生，例如自經免疫及分離之小鼠之B細胞分離，噬菌體呈現，在任何適合的重組表現系統中表現及將其組裝以形成抗體分子。 A.         表現
核酸分子可用於表現大量重組抗體或產生嵌合抗體、單鏈抗體、免疫黏附素、雙功能抗體、突變型抗體及其他抗體衍生物。若核酸分子係來源於非人類、非基因轉殖動物，則核酸分子可用於抗體人類化。 B.          載體
在一些態樣中，涵蓋表現載體，其包含編碼具有所需序列之多肽或其一部分(例如含有一或多個CDR或一或多個可變區域之片段)之核酸分子。包含核酸分子之表現載體可編碼重鏈、輕鏈或其抗原結合部分。在一些態樣中，包含核酸分子之表現載體可編碼融合蛋白質、經修飾之抗體、抗體片段及其探針。除管控轉錄及轉譯之控制序列以外，載體及表現載體亦可含有發揮其他功能之核酸序列。
為了表現抗體或其抗原結合片段，將編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中，使得基因區域可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在一些態樣中，將編碼具有適合的限制位點之功能性完全人類CH或CL免疫球蛋白序列之載體工程改造，使得可容易地插入及表現任何VH或VL序列。通常，任何宿主細胞中使用之表現載體含有用於質體或病毒保持以及用於外源性核苷酸序列之選殖及表現之序列。此類序列，統稱為「側接序列」，通常包括以下可操作地連接之核苷酸序列中之一或多者：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完全內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現之多肽之核酸之多連接子及可選標記元件。此類序列及其使用方法為此項技術中熟知的。 1.      表現系統
存在大量表現系統，其包含至少一部分或所有上文所論述之表現載體。可使用基於原核生物及/或真核生物之系統，以與實施例一起使用以產生核酸序列或其同源多肽、蛋白質及肽。商業上及廣泛可用的系統包括(但不限於)細菌、哺乳動物、酵母及昆蟲細胞系統。不同的宿主細胞具有蛋白質之轉譯後處理及修飾的特徵及特定機制。可選擇適合的細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白質之正確修飾及處理。熟習此項技術者能夠使用適合的表現系統來表現載體，以產生核酸序列或其同源多肽、蛋白質或肽。 2.      基因轉移方法
預期適用於核酸遞送以實現組合物之表現之方法包括幾乎任何可用於將核酸(例如DNA，包括病毒性及非病毒性載體)引入細胞、組織或生物體中之方法，如本文中所描述或如一般熟習此項技術者已知。此類方法包括(但不限於)DNA之直接遞送，諸如藉由注射(美國專利案5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466及5,580,859，其各自以引用之方式併入本文中)，包括顯微注射(Harland及Weintraub, 1985；美國專利案5,789,215，其以引用之方式併入本文中)；藉由電致孔(美國專利案第5,384,253號，其以引用之方式併入本文中)；藉由磷酸鈣沈澱(Graham及Van Der Eb, 1973；Chen及Okayama, 1987；Rippe等人, 1990)；藉由相繼使用DEAE聚葡萄糖及聚乙二醇(Gopal, 1985)；藉由直接音波裝載(Fechheimer等人, 1987)；藉由脂質體介導之轉染(Nicolau及Sene, 1982；Fraley等人, 1979；Nicolau等人, 1987；Wong等人, 1980；Kaneda等人, 1989；Kato等人, 1991)；藉由微彈轟擊(PCT申請案第WO 94/09699號及第95/06128號；美國專利案5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877及5,538,880且各自以引用之方式併入本文中)；藉由用碳化矽纖維進行之攪拌(Kaeppler等人, 1990；美國專利案5,302,523及5,464,765，其各自以引用之方式併入本文中)；藉由農桿菌(Agrobacterium)介導之轉形(美國專利案5,591,616及5,563,055，其各自以引用之方式併入本文中)；或藉由PEG介導之原生質體之轉形(Omirulleh等人, 1993；美國專利案4,684,611及4,952,500，其各自以引用之方式併入本文中)；藉由幹化/抑制介導之DNA攝取(Potrykus等人, 1985)。其他方法包括病毒性轉導，諸如藉由慢病毒或反轉錄病毒轉導進行之基因轉移。 3.      宿主細胞
在另一態樣中，涵蓋其中已引入重組表現載體之宿主細胞之用途。可在多種細胞類型中表現抗體。可根據此項技術中已知的多種方法將編碼抗體之表現構築體轉染至細胞中。可經由習知轉形或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。一些載體可使用允許其在原核及真核細胞兩者中複製及/或表現的控制序列。在某些態樣中，抗體表現構築體可受與T細胞活化有關之啟動子控制，諸如由NFAT-1 (其為可在T細胞活化時活化之轉錄因子)控制之啟動子。抗體表現之控制允許T細胞(諸如靶向腫瘤之T細胞)感測其環境及進行細胞介素信號傳導之即時調節(在T細胞本身中及在周圍內源性免疫細胞中)。熟習此項技術者應瞭解用於培育宿主細胞以對其進行維持且允許載體複製之條件。亦理解及知曉將允許大規模產生載體以及產生由載體編碼之核酸及其同源多肽、蛋白質或肽的技術及條件。
對於哺乳動物細胞之穩定轉染，已知視所用表現載體及轉染技術而定，僅小部分之細胞可將外來DNA整合至其基因體中。為了識別及選擇此等整合體，通常將可選標記物(例如針對對抗生素之抗性)與相關基因一起引入宿主細胞中。可藉由藥物選擇(例如具有所併入之可選標記物基因之細胞將存活，而其他細胞將死亡)及此項技術中已知的其他方法來鑑別由所引入的核酸穩定轉染之細胞。 C.         分離
可自任何產生抗體之來源獲得編碼抗體或其可變區之整個重鏈及輕鏈中之任一者或兩者之核酸分子。分離編碼抗體之mRNA之方法為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人, 見上文。人類重鏈及輕鏈恆定區基因之序列亦為此項技術中已知的。參見例如Kabat等人, 1991, 見上文。接著，可在引入全長重鏈及/或輕鏈之細胞中表現編碼全長重鏈及/或輕鏈之核酸分子且分離抗體。 VIII.     分析方法
本發明亦提供用於篩選及證實適用於本發明之技術之治療劑之方法。
本發明人研發離體原發性腫瘤血管生成分析法以研究治療劑對腫瘤血管生成之作用。分析法利用自腫瘤塊產生之離體原發性腫瘤模型，該腫瘤塊係自原發性腫瘤組織解剖。將所解剖之腫瘤塊(其可符合適用於離體生長之較佳尺寸)包埋於生物基質中，例如在自生物體移出之後數小時、數天或數週內，且在促進內皮細胞自腫瘤塊生長之條件下培養。內皮細胞自腫瘤塊長出且在腫瘤塊周圍形成2維或3維外生長物，提供適用於藥物測試之模型系統。當用候選癌症治療劑處理時，內皮細胞之死亡可有效地指示藥劑對腫瘤內皮細胞之潛在治療功效。在相同的分析法中，可同時評估腫瘤細胞之死亡，以評估試劑是否對腫瘤內皮細胞具有特異性或更一般而言，細胞毒性。
此離體原發性腫瘤血管生成模型之實驗實例提供於實例1中。其他實例描述於2019年2月25日提交之美國臨時專利申請案第62/809,857號中，其內容以引用之方式併入本發明中。
在某些態樣中，本文中提供用於測定測試藥劑是否為PLXDC1及/或PLXDC2之調節劑之方法(例如用於選擇藥劑作為用於治療癌症之潛在治療劑)，其首先藉由形成包含測試藥劑之測試混合物(例如聚核苷酸、小分子、抗體或肽)，將測試混合物與表現PLXDC1及/或PLXDC2受體之細胞一起培育及測定NF-κB活化程度。在一些實施例中，可例如藉由比較用於受體活化之基於細胞培養物之螢光素酶分析法與不具有測試藥劑之對照性混合物來測定NF-κB活化程度。在一些實施例中，與對照性混合物中之NF-κB活化相比，增加或引起NF-κB活化之測試藥劑為PLXDC1及/或PLXDC2受體活性之調節劑。在一些實施例中，測試藥劑為抗體、肽、小分子或聚核苷酸。在一些實施例中，測試藥劑及/或PLXDC1及/或PLXDC2受體連接至可偵測部分。在一些實施例中，PLXDC1及/或PLXDC2受體係異位表現。在一些實施例中，除對照性混合物不包含測試藥劑以外，對照性混合物與測試混合物實質上一致。在一些實施例中，除對照性混合物包含安慰劑以外，對照性混合物與測試混合物實質上一致。
可使用分析法(例如用於篩選調節PLXDC1及/或PLXDC2之候選物或測試化合物之分析法)鑑別本文中所描述之PLXDC1及/或PLXDC2之活化劑。在一些實施例中，可使用分析法及測試藥劑之庫來鑑別活化劑，其中若活化劑富集PLXDC1及/或PLXDC2受體群體或增加PLXDC1及/或PLXDC2受體對腫瘤血管之活性，則測試藥劑為活化劑。舉例而言，用於鑑別調節(亦即，增加)PLXDC1及/或PLXDC2受體之活性之化合物之分析法系統可涉及在足以允許測試藥劑調節PLXDC1及/或PLXDC2受體之條件及時間下製備含有測試藥劑之測試混合物。為了測試藥劑之調節活性，在存在及不存在測試化合物之情況下製備反應混合物。測試化合物可最初包括於反應混合物中，或在稍後的時間後續添加。在不存在測試化合物或存在安慰劑之情況下培育對照性混合物。接著，可評估與PLXDC1及/或PLXDC2相關聯之細胞內信號傳導路徑之增加。測試混合物中之與PLXDC1及/或PLXDC2相關聯的細胞內信號傳導路徑之增加，但對照性混合物中之較小或不存在此類變化指示測試化合物為PLXDC1及/或PLXDC2受體之活化劑。可用經分離之測試藥劑或經合併之測試藥劑進行用於調節PLXDC1及/或PLXDC2活性之化合物之分析法。經合併之測試藥劑包含具有一或多種測試藥劑之測試混合物。可改變測試藥劑之添加順序。
在一些實施例中，測試藥劑為測試藥劑之庫之成員。在一些實施例中，用於鑑別適用於方法中之藥劑之分析法包括PLXDC1及/或PLXDC2受體與一或多種分析法組分之間的反應。其他組分可為測試化合物(例如藥劑)或測試化合物之組合。經由此類分析法鑑別之藥劑可適用於例如預防或治療癌症，或其他PLXDC1及/或PLXDC2相關疾病。在一些態樣中，本文中提供用於治療或預防個體中之癌症之方法，其包含向個體投與使用用於鑑別PLXDC1及/或PLXDC2之調節劑之方法鑑別之測試藥劑。
在一些實施例中，測試藥劑(例如多肽、聚核苷酸、RNA分子或小分子)或PLXDC1及/或PLXDC2受體連接至可偵測部分。如本文中所使用，可偵測部分可包含本發明之測試藥劑或PLXDC1及/或PLXDC2受體，其連接至其在自然界中未連接之不同多肽或部分。舉例而言，可偵測部分可經由肽鍵直接地或經由化學連接子間接地與測試藥劑之N端或C端融合。
適用於本發明之方法中之藥劑可自任何可用的來源獲得，包括天然及/或合成化合物之系統庫。亦可藉由此項技術中已知的組合庫方法中之大量方法中之任一者獲得藥劑，包括：生物學庫；類肽庫(具有肽之官能基，但具有新穎的非肽主鏈之分子之庫，該等分子對酶促降解具有抗性，但仍保持生物活性；參見例如Zuckermann等人, 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85)；空間可定址平行固相或溶液相庫；需要解褶積之合成庫方法；『一珠粒一化合物(one-bead one-compound)』庫方法；及使用親和層析選擇之合成庫方法。生物學庫及類肽庫方法限於肽庫，而其他四種方法適用於肽、非肽寡聚物或化合物之小分子庫(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145)。
用於合成分子庫之方法之實例可見於此項技術中，例如在以下中：DeWitt等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909；Erb等人 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422；Zuckermann等人 (1994). J. Med. Chem. 37:2678；Cho等人 (1993) Science 261:1303；Carrell等人 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell等人 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；及Gallop等人 (1994) J. Med. Chem. 37:1233。
藥劑之庫可呈現於溶液(例如Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421)中，或珠粒(Lam, 1991, Nature 354:82-84)、晶片(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細菌及/或孢子(Ladner, USP 5,223,409)、質體(Cull等人, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)上或噬菌體(Scott及Smith, 1990, Science 249:386-390；Devlin, 1990, Science 249:404-406；Cwirla等人, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382；Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310；Ladner, 見上文)上。
可例如使用用於篩選調節PLXDC1及/或PLXDC2受體之活性的候選物或測試化合物之分析法來鑑別適用於本發明之方法中之藥劑。舉例而言，可針對改變表現PLXDC1及/或PLXDC2之細胞群體中之NF-κB信號傳導之能力來篩選候選物或測試化合物。在一些實施例中，PLXDC1及/或PLXDC2係內源性表現。在一些實施例中，PLXDC1及/或PLXDC2係異位表現。如本文中所描述，測試化合物在測試混合物中。
用於鑑別調節PLXDC1及/或PLXDC2受體之活性的化合物之分析法系統之基本原理涉及在足以允許測試藥劑調節PLXDC1及/或PLXDC2受體之條件及時間下製備含有測試藥劑之測試混合物。為了測試藥劑之調節活性，在存在及不存在測試化合物之情況下製備反應混合物。測試化合物可最初包括於反應混合物中，或在稍後的時間後續添加。在不存在測試化合物或存在安慰劑之情況下培育對照性混合物。接著可測試NF-κB信號傳導。測試混合物中之NF-κB信號傳導之變化(諸如信號傳導之增加)，但對照性混合物中之較小的或不存在此類變化指示測試化合物為PLXDC1及/或PLXDC2受體之調節劑。可用經分離之測試藥劑或經合併之測試藥劑進行用於調節PLXDC1及/或PLXDC2之化合物之分析法。經合併之測試藥劑包含具有一或多種測試藥劑之測試混合物。可改變測試藥劑之添加順序。以恆定或變化之濃度添加化學物質或藥劑之混合物。接著，針對對應於NF-κB信號傳導之螢光來分析細胞。 IX.     其他療法  A.       免疫療法
在一些實施例中，方法包含投與癌症免疫療法。癌症免疫療法(有時稱為免疫腫瘤學，簡稱為IO)係使用免疫系統治療癌症。免疫療法可分類為主動、被動或雜交(主動及被動)。此等方法利用以下事實：癌細胞通常在其表面上具有可由免疫系統偵測之分子，稱為腫瘤相關抗原(TAA)；其通常為蛋白質或其他大分子(例如碳水化合物)。主動免疫療法藉由靶向TAA來引導免疫系統攻擊腫瘤細胞。被動免疫療法增強現有抗腫瘤反應且包括使用單株抗體、淋巴細胞及細胞介素。免疫療法為此項技術中已知的且其中一些描述於下文中。 1.        共刺激分子之抑制
在一些實施例中，免疫療法包含共刺激分子之抑制劑。在一些實施例中，抑制劑包含B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD28、ICOS、OX40 (TNFRSF4)、4-1BB (CD137；TNFRSF9)、CD40L (CD40LG)、GITR (TNFRSF18)之抑制劑及其組合。抑制劑包括抑制性抗體、多肽、化合物及核酸。 2.        樹突狀細胞療法
樹突狀細胞療法藉由引起樹突狀細胞向淋巴細胞呈現腫瘤抗原(該等腫瘤抗原活化淋巴細胞)，引起淋巴細胞殺傷其他呈現抗原之細胞來引發抗腫瘤反應。樹突狀細胞為哺乳動物免疫系統中之抗原呈現細胞(APC)。在癌症治療中，其有助於癌症抗原靶向。基於樹突狀細胞之細胞癌症療法之一個實例為西普亮塞-T (sipuleucel-T)。
一種誘導樹突狀細胞呈現腫瘤抗原之方法係藉由用自體腫瘤溶解物或短肽(對應於癌細胞上之蛋白質抗原之蛋白質之小型部分)進行疫苗接種。此等肽通常以與佐劑(高免疫原性物質)之組合形式提供，以增加免疫及抗腫瘤反應。其他佐劑包括蛋白質或其他吸引及/或活化樹突狀細胞之化學物質，諸如粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。
亦可藉由使腫瘤細胞表現GM-CSF來活體內活化樹突狀細胞。此可藉由對腫瘤細胞進行基因工程改造以產生GM-CSF或藉由用表現GM-CSF之溶瘤病毒感染腫瘤細胞來實現。
另一種策略係自患者之血液移出樹突狀細胞且將其在體外活化。在存在腫瘤抗原之情況下活化樹突狀細胞，該等腫瘤抗原可為單一腫瘤特異性肽/蛋白質或腫瘤細胞溶解物(分解之腫瘤細胞之溶液)。輸注此等細胞(具有視情況選用之佐劑)且引發免疫反應。
樹突狀細胞療法包括使用結合於樹突狀細胞表面上之受體之抗體。抗原可添加至抗體中且可誘導樹突狀細胞成熟及提供針對腫瘤之免疫性。已使用諸如TLR3、TLR7、TLR8或CD40之樹突狀細胞受體作為抗體目標。 3.          CAR-T細胞療法
嵌合抗原受體(CAR，亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體或人工T細胞受體)為經工程改造之受體，其將新的特異性與免疫細胞組合以靶向癌細胞。通常，此等受體將單株抗體之特異性移植至T細胞上。受體由於其為來自不同來源之部分之融合物而稱為嵌合。CAR-T細胞療法係指將此類經轉形之細胞用於癌症療法之治療。
CAR-T細胞設計之基本原理涉及組合抗原結合及T細胞活化功能之重組受體。CAR-T細胞之一般前提為人工產生靶向在癌細胞上發現之標記物之T細胞。科學家可自人類移出T細胞，以基因方式改變且將其放回患者中以使其對抗癌細胞。在T細胞經工程改造以變成CAR-T細胞後，其充當「活的藥物」。CAR-T細胞產生細胞外配位體識別域與細胞內信號傳導分子之間的連接，其又活化T細胞。細胞外配位體識別域通常為單鏈可變片段(scFv)。CAR-T細胞療法之安全性之重要態樣為如何確保僅靶向癌性腫瘤細胞且不靶向正常細胞。CAR-T細胞之特異性係由選擇所靶向之分子決定。
例示性CAR-T療法包括替沙津魯(Tisagenlecleucel)(威爾瑞(Kymriah))及阿基侖賽(Axicabtagene ciloleucel)(伊斯卡他(Yescarta))。在一些實施例中，CAR-T療法靶向CD19。
細胞介素療法
細胞介素為由存在於腫瘤內之多種類型之細胞產生之蛋白質。其可調節免疫反應。腫瘤通常使用該等細胞介素以實現自身生長及降低免疫反應。此等免疫調節作用使得其可用作引發免疫反應之藥物。兩種常用的細胞介素為干擾素及介白素。
干擾素係由免疫系統產生。其通常涉及抗病毒反應，但亦具有用於癌症之用途。其分成三個組：I型(IFNα及IFNβ)、II型(IFNγ)及III型(IFNλ)。
介白素具有一系列免疫系統作用。IL-2為例示性介白素細胞介素療法。 4.        授受性T細胞療法
授受性T細胞療法為藉由輸注T細胞(授受性細胞轉移)來進行之被動免疫接種形式。其可見於血液及組織中且通常在其發現外來病原體時活化。特定言之，其在T細胞之表面受體遭遇在表面抗原上顯示一部分外來蛋白質之細胞時活化。此等細胞可為受感染之細胞或抗原呈現細胞(APC)。其可發現於正常組織及腫瘤組織中，其中其被稱為腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。其由存在APC (諸如呈現腫瘤抗原之樹突狀細胞)來活化。儘管此等細胞可對抗腫瘤，但腫瘤內之環境為高免疫抑制性的，阻止免疫介導之腫瘤死亡。[60]
已研發出多種製備及獲得靶向腫瘤之T細胞之方式。可自腫瘤樣品(TIL)移出或自血液過濾對腫瘤抗原具有特異性之T細胞。離體進行後續活化及培養，且重新輸注所得物。活化可經由基因療法或藉由使T細胞暴露於腫瘤抗原來進行。 B.       化學療法
在一些實施例中，其他療法包含化學療法。適合的化學治療劑類別包括(a)烷基化劑，諸如氮芥(例如甲基二(氯乙基)胺、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥)、乙烯亞胺及甲基三聚氰胺(例如六甲三聚氰胺、噻替派(thiotepa))、磺酸烷基酯(例如白消安(busulfan))、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、氯佐替汀(chlorozoticin)、鏈脲菌素)及三𠯤(例如達卡巴𠯤(dicarbazine))、(b)抗代謝物，諸如葉酸類似物(例如甲胺喋呤)、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮雜尿苷)及嘌呤類似物及相關物質(例如6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、噴司他汀(pentostatin))，(c)天然產物，諸如長春花生物鹼(例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine))、表鬼臼毒素(例如依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、抗生素(例如放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)及米托蒽醌(mitoxanthrone))、酶(例如L-天冬醯胺酶)及生物反應調節劑(例如干擾素-α)，及(d)其他藥劑，諸如鉑配位錯合物(例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin))、經取代之尿素(例如羥基脲)、甲基肼衍生物(例如丙卡巴肼(procarbazine))及腎上腺皮質抑制劑(例如紫杉醇(taxol)及米托坦(mitotane))。在一些實施例中，順鉑為尤其適合的化學治療劑。
順鉑已廣泛用於治療癌症，諸如轉移性睪丸或卵巢癌、晚期膀胱癌、頭部或頸部癌症、子宮頸癌、肺癌或其他腫瘤。順鉑不能經口吸收且因此必須經由其他途徑遞送，諸如靜脈內、皮下、瘤內或腹膜內注射。順鉑可單獨或與其他藥劑組合使用，在某些實施例中涵蓋以有效劑量用於臨床應用中，包括每三週約15 mg/m2至約20 mg/m2持續5天歷時總共三個療程。在一些實施例中，與構築體結合遞送至細胞及/或個體之順鉑之量小於在單獨使用順鉑時遞送之量，該構築體包含可操作地連接至編碼治療性多肽之聚核苷酸之Egr-1啟動子。
其他適合的化學治療劑包括抗微管劑，例如太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(「紫杉醇」)及鹽酸阿黴素(doxorubicin hydrochloride)(「小紅莓」)。確定經由腺病毒載體及小紅莓遞送之Egr-1啟動子/TNFα構築體之組合可有效克服對化學療法及/或TNF-α之抗性，其表明用構築體及小紅莓進行之組合治療可克服對小紅莓及TNF-α之抗性。
小紅莓係吸收不充分的且較佳靜脈內投與。在某些實施例中，用於成年人之適合的靜脈內劑量包括在約21天間隔下之約60 mg/m2至約75 mg/m2，或以約3週至約4週間隔重複之在連續2或3天中之每一天的約25 mg/m2至約30 mg/m2，或一週一次約20 mg/m2。當存在由先前化學療法引起之先前骨骼-骨髓抑制或贅生性骨髓侵襲時或當藥物與其他髓細胞生成抑制性藥物組合時，在老年患者中應使用最低劑量。
氮芥為另一種適用於本發明之方法中之適合的化學治療劑。氮芥可包括(但不限於)甲基二(氯乙基)胺(HN2)、環磷醯胺及/或異環磷醯胺、美法侖(L-溶肉瘤素)及苯丁酸氮芥。環磷醯胺(CYTOXAN®)可自Mead Johnson獲得且NEOSTAR®可自Adria獲得，其為另一種適合的化學治療劑。用於成年人之適合的口服劑量包括例如約1毫克/公斤/天至約5毫克/公斤/天，靜脈內劑量包括例如在約2天至約5天時間內的呈分次劑量形式之最初約40 mg/kg至約50 mg/kg，或約每7天至約10天一次約10 mg/kg至約15 mg/kg，或一週兩次約3 mg/kg至約5 mg/kg，或約1.5毫克/公斤/天至約3毫克/公斤/天。由於不利的胃腸道作用，較佳為靜脈內途徑。有時亦肌肉內投與藥物(藉由浸潤或進入體腔)。
其他適合的化學治療劑包括嘧啶類似物，諸如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside))、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)及氟尿苷(氟脫氧尿苷；FudR)。5-FU可以約7.5至約1000 mg/m2之間的任何劑量向個體投與。此外，5-FU給藥時程可持續多種時段，例如長達六週，或如由一般熟習本發明所屬之技術者所測定。
建議使用二磷酸吉西他濱(Gemcitabine diphosphate)(GEMZAR®，Eli Lilly & Co.，「吉西他濱」)，另一種適合的化學治療劑，治療晚期及轉移性胰臟癌，且因此在本發明中亦適用於此等癌症。
向患者遞送之化學治療劑之量可為可變的。在一個適合的實施例中，當化學療法與構築體一起投與時，可以可有效引起宿主中之癌症之遏制或消退之量投與化學治療劑。在其他實施例中，可以比化學治療劑之化學治療有效劑量小2至10,000倍之間的任何量投與化學治療劑。舉例而言，可以比化學治療劑之化學治療有效劑量小約20倍、小約500倍或甚至小約5000倍之量投與化學治療劑。可活體內測試本發明之化學治療劑與構築體之組合之所需治療活性，以及測定有效劑量。舉例而言，在人類中進行測試之前，可在適合的動物模型系統中測試此類化合物，包括(但不限於)大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等。亦可使用活體外測試來測定適合的組合及劑量，如實例中所描述。 C.         放射線療法
在一些實施例中，其他療法或先前療法包含輻射，諸如電離輻射。如本文中所使用，「電離輻射」意謂包含粒子或光子之輻射，該等粒子或光子具有足夠的能量或可經由細胞核相互作用產生足夠的能量以產生電離(電子之增加或損失)。例示性及較佳電離輻射為x-輻射。用於向目標組織或細胞遞送x-輻射之手段為此項技術中熟知的。 D.         手術
約60%的患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括切除，其中以物理方式移除、切除及/或破壞全部或一部分癌組織，且可與其他療法結合使用，諸如本發明之實施例之治療、化學療法、放射線療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代性療法。腫瘤切除係指以物理方式移除腫瘤的至少一部分。除腫瘤切除以外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制之手術(莫氏手術(Mohs' surgery))。
在切除一部分或所有癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌療法對該區域進行灌注、直接注射或局部施用來實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、或12個月重複此類治療。此等治療亦可具有不同的劑量。 X.       治療
本發明提供用於治療病原性血管病症(諸如糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變或癌症)之方法及組合物。治療可經由殺傷腫瘤血管來進行。在一些實施例中，宜由本發明之技術治療之腫瘤患者表現含有叢蛋白域之蛋白質(例如PLXDC1或PLXDC2)。表現可位於腫瘤血液上皮細胞上。
如所述，本發明之技術不僅可抑制新的腫瘤血管之生長，且亦可殺傷現有的腫瘤血管，由此治療腫瘤。因此，在一些實施例中，可受益於本發明之治療之腫瘤患者為具有經歷腫瘤血管生成之腫瘤之患者。在一些實施例中，腫瘤包含血管化腫瘤。在一些實施例中，所治療之腫瘤之直徑大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10 cm (或其中任何可導出之範圍)。在一些實施例中，腫瘤已含有腫瘤血管。
在一些實施例中，腫瘤不具有作為免疫療法之目標的已知的腫瘤表面標記物。在一些實施例中，腫瘤不含有作為腫瘤療法之目標之突變基因。在一些實施例中，本發明之療法不包括誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，本發明之治療劑不誘導ADCC。
在一些實施例中，患者罹患癌症，諸如真性紅血球增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏疾病(Hodgkin's disease)及非霍奇金氏疾病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病，及實體腫瘤，包括(但不限於)肉瘤及癌瘤，諸如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑素瘤、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝腫瘤、膽管癌瘤、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌瘤、小細胞肺癌瘤、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
在一些實施例中，本文中所描述之方法可用於治療任何癌性或癌前腫瘤，諸如實體腫瘤。可藉由本文中所提供之方法及組合物治療之癌症包括(但不限於)來自膀胱、血液、骨骼、骨髓、腦部、乳房、結腸、食道、胃腸道、齒齦、頭部、腎臟、肝臟、肺、鼻咽、頸部、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌部或子宮之癌細胞。此外，癌症可特定地具有(但不限於)以下組織學類型：贅瘤，惡性；癌瘤；癌瘤，未分化；巨細胞及梭狀細胞癌瘤；小細胞癌瘤；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌瘤；基底細胞癌；毛母質癌瘤；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌瘤；肝細胞癌瘤；組合型肝細胞癌瘤及膽管癌瘤；小樑腺癌；腺樣囊性癌症；腺瘤息肉中之腺癌；腺癌，家族性多發性息肉大腸桿菌；實體癌瘤；類癌腫瘤，惡性；細支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；難染細胞癌瘤；嗜酸性癌瘤；嗜氧性腺癌；嗜鹼性球癌瘤；透明細胞腺癌；顆粒狀細胞癌瘤；濾泡腺癌；乳頭狀及濾泡腺癌；無包膜硬化性癌瘤；腎上腺皮層癌瘤；子宮內膜樣癌瘤；皮膚附件癌瘤；頂漿腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；黏液表皮樣癌瘤；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓性癌；小葉癌；發炎性癌瘤；乳房佩吉特氏病(mammary paget's disease)；腺泡細胞癌瘤；腺鱗癌瘤；伴有鱗狀化生之腺癌；惡性胸腺瘤；惡性卵巢基質腫瘤；惡性泡膜細胞瘤；惡性粒層細胞腫瘤；及惡性成神經細胞瘤；塞特利氏細胞癌瘤(sertoli cell carcinoma)；惡性雷迪格細胞腫瘤(malignant leydig cell tumor)；惡性脂質細胞腫瘤；惡性副神經節瘤；惡性乳房外副神經節瘤；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑素瘤；無黑色素性黑素瘤；淺表擴散性黑素瘤；巨型有色斑痣中之惡性黑素瘤；上皮樣細胞黑素瘤；惡性藍色斑痣；肉瘤；纖維肉瘤；惡性纖維組織細胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；齒槽橫紋肌肉瘤；基質肉瘤；惡性混合腫瘤；苗勒氏管混合腫瘤(mullerian mixed tumor)；腎胚細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；惡性間質瘤；惡性布倫納氏瘤(malignant brenner tumor)；惡性葉狀腫瘤；滑膜肉瘤；惡性間皮瘤；無性胚胎瘤；胚胎性癌；惡性畸胎瘤；惡性甲狀腺腫樣卵巢癌；絨毛膜癌；惡性中腎瘤；血管肉瘤；惡性血管內皮瘤；卡堡氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；惡性血管外皮瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；惡性軟骨母細胞瘤；間葉細胞軟骨肉瘤；骨骼巨細胞瘤；尤文氏肉瘤；惡性牙源性腫瘤；成釉細胞牙肉瘤；惡性成釉細胞瘤；成釉細胞纖維肉瘤；惡性松果體瘤；脊索瘤；惡性神經膠質瘤；室管膜瘤；星形細胞瘤；原生質星形細胞瘤；原纖維性星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；寡樹突神經膠質瘤；成寡樹突神經膠質細胞瘤；原始神經外胚層腫瘤；小腦肉瘤；成神經節細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅覺神經性腫瘤；惡性腦膜瘤；神經纖維肉瘤；惡性神經鞘瘤；惡性顆粒狀細胞腫瘤；惡性淋巴瘤；霍奇金氏疾病；霍奇金氏淋巴瘤；類肉芽腫；小型淋巴細胞性惡性淋巴瘤；彌漫性大細胞惡性淋巴瘤；濾泡惡性淋巴瘤；蕈樣黴菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多病；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤或免疫增殖性小腸疾病。
在一些實施例中，個體患有癌症，較佳包含實體腫瘤。可向腫瘤局部投與本文中所揭示之藥劑。在一些實施例中，腫瘤為腺癌、腎上腺腫瘤、肛門腫瘤、膽管腫瘤、膀胱腫瘤、骨腫瘤、血源性腫瘤、腦部/CNS腫瘤、乳房腫瘤、子宮頸腫瘤、大腸直腸腫瘤、子宮內膜腫瘤、食道腫瘤、尤文氏腫瘤、眼部腫瘤、膽囊腫瘤、胃腸道腫瘤、腎臟腫瘤、喉部或下咽腫瘤、肝臟腫瘤、肺腫瘤、間皮瘤腫瘤、多發性骨髓瘤、肌肉腫瘤、鼻咽腫瘤、神經母細胞瘤、口腔腫瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、陰莖腫瘤、垂體腫瘤、原發性腫瘤、前列腺腫瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺腫瘤、軟組織肉瘤、黑素瘤、轉移性腫瘤、基底細胞癌、梅克爾細胞腫瘤(Merkel cell tumor)、睪丸腫瘤、胸腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、子宮腫瘤、陰道腫瘤、外陰腫瘤或威爾姆氏腫瘤。在一些實施例中，本文中所描述之化合物及/或組合物可在腫瘤位點處或附近或在腫瘤位點之遠端非經腸投與。
醫藥組合物中之活性成分之實際劑量含量可變化，以獲得在對患者無毒性之情況下有效實現特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應的活性成分之量。
所選擇之劑量含量將取決於多種因素，包括所使用的特定藥劑之活性；投藥途徑；投藥時間；所使用的特定化合物之排泄或代謝速率；治療持續時間；與所使用之特定化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料；所治療的患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。
一般熟習此項技術之醫師或獸醫易於確定及指定所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可以低於實現所需治療作用所需的含量之含量開立及/或投與醫藥組合物中使用之化合物之劑量，且逐漸增加劑量直至實現所需作用。
如本文中所描述之一或多種化合物之投藥可引起疾病或病狀之一或多種症狀降低至少10% (例如降低至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或甚至100%)，諸如腫瘤尺寸減小。
本文中所描述之化合物可用於用以促效色素上皮衍生因子(PEDF)受體之方法中。本文中所描述之化合物亦可用於用以抑制血管生成之方法中。
已將PEDF受體鑑別為兩種同源膜蛋白質，稱為含有叢蛋白域1 (PLXDC1)及含有叢蛋白域2 (PLXDC2)。其屬於一種新類型之細胞表面受體且為已知的唯一的實現與PEDF之細胞表面結合且將PEDF信號轉導至目標細胞中之蛋白質。與PEDF在致盲性疾病及癌症中抑制病原性血管生成而不影響健康血管之能力一致，PEDF受體在許多疾病中之病原性血管(包括腫瘤血管)及糖尿病性視網膜病變中大量表現。未在健康血管中偵測到PEDF受體。在過去，充分研究一種PEDF受體(TEM7，PLXDC1)作為腫瘤內皮標記物，其在不同類型之人類癌症(包括結腸、肝臟、肺、乳房、胰臟、腦部、膀胱、卵巢、腎臟、食道、胃及子宮內膜癌及卡堡氏肉瘤，脂肪肉瘤及滑膜肉瘤)之腫瘤血管中富集。在致盲性疾病中，PEDF受體TEM7 (PLXDC1)在糖尿病性視網膜病變、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變及脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管生成)之病原性血管中大量富集。此與PEDF抑制此等疾病中之病原性血管生成而不影響健康血管之作用一致。
因此，本文中所描述之化合物及方法可用於治療由PEDF受體介導或與血管生成相關之疾病，諸如癌症、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及年齡相關之黃斑變性。
在某些實施例中，本文中提供用於促效有需要之患者中之色素上皮衍生因子(PEDF)受體之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
在某些實施例中，本文中提供用於抑制有需要之患者中之血管生成之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。在某些實施例中，血管生成為病原性血管生成。
本文中亦提供用於治療有需要之患者中之由PEDF受體介導之疾病或病症之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
本文中亦提供用於治療有需要之患者中之與血管生成相關之疾病或病症之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
本文中亦提供用於治療選自癌症、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及年齡相關之黃斑變性之疾病或病症之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。在某些實施例中，癌症係選自結腸、肝臟、肺、乳房、胰臟、腦部、膀胱、卵巢、腎臟、食道、胃及子宮內膜癌及卡堡氏肉瘤、脂肪肉瘤及滑膜肉瘤。在某些實施例中，疾病為致盲性疾病。在某些實施例中，疾病為糖尿病性視網膜病變、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變或脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管生成)。
在某些實施例中，本文中提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽前藥之用途，其係用於促效有需要之患者中之色素上皮衍生因子(PEDF)受體之方法中，該方法包含向該患者投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽前藥。
在某些實施例中，本文中提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽前藥之用途，其係用於抑制有需要之患者中之血管生成之方法中，該方法包含向該患者投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。在某些實施例中，血管生成為病原性血管生成。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於治療有需要之患者中之由PEDF受體介導之疾病或病症之方法中，該方法包含向該患者投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於治療有需要之患者中之與血管生成相關之疾病或病症之方法中，該方法包含向該患者投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於治療選自癌症、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及年齡相關之黃斑變性之疾病或病症之方法中，該方法包含向該患者投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。在某些實施例中，癌症係選自結腸、肝臟、肺、乳房、胰臟、腦部、膀胱、卵巢、腎臟、食道、胃及子宮內膜癌以及卡堡氏肉瘤、脂肪肉瘤及滑膜肉瘤。在某些實施例中，疾病為致盲性疾病。在某些實施例中，疾病為糖尿病性視網膜病變、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變或脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管生成)。
在某些實施例中，本文中提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以促效有需要之患者中之色素上皮衍生因子(PEDF)受體之藥劑。
在某些實施例中，本文中提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以抑制有需要之患者中之血管生成之藥劑。在某些實施例中，血管生成為病原性血管生成。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以治療有需要之患者中之由PEDF受體介導之疾病或病症之藥劑。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以治療有需要之患者中之與血管生成相關之疾病或病症之藥劑。
本文中亦提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥之用途，其係用於製造用以治療選自以下之疾病或病症之藥劑：癌症、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及年齡相關之黃斑變性。在某些實施例中，癌症係選自結腸、肝臟、肺、乳房、胰臟、腦部、膀胱、卵巢、腎臟、食道、胃及子宮內膜癌以及卡堡氏肉瘤、脂肪肉瘤及滑膜肉瘤。在某些實施例中，疾病為致盲性疾病。在某些實施例中，疾病為糖尿病性視網膜病變、視網膜閉塞性血管疾病、早產兒視網膜病變或脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管生成)。 XI.     治療性組合物之投藥
本發明亦提供醫藥組合物。在某些實施例中，本文中提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有與醫藥學上可接受之載劑共同調配之至少一種能夠調節本文中所描述之PLXDC1及/或PLXDC2受體之抗體、小分子、聚核苷酸或多肽。在一些實施例中，組合物包括多種(例如，兩種或更多種)藥劑之組合。
本文中所提供之療法可包含投與治療劑之組合，諸如第一癌症療法及第二癌症療法。療法可以此項技術中已知的任何適合的方式投與。舉例而言，第一及第二癌症治療可依序(在不同時間)或並行(在相同時間)投與。在一些實施例中，第一及第二癌症治療係在單獨的組合物中投與。在一些實施例中，第一及第二癌症治療係在相同組合物中。
本發明之實施例係關於組合物及包含治療性組合物之方法。可在一種組合物或超過一種組合物(諸如2種組合物、3種組合物或4種組合物)中投與不同療法。可使用藥劑之各種組合。
本發明之治療劑可藉由相同投藥途徑或不同投藥途徑投與。在一些實施例中，靜脈內、肌肉內、皮下、局部、經口、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、腦室內或鼻內投與癌症療法。在一些實施例中，靜脈內、肌肉內、皮下、局部、經口、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、腦室內或鼻內投與抗生素。可基於所治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及過程、個體之臨床病狀、個體之臨床病史及治療反應以及主治醫師之判斷來確定適合的劑量。
治療可包括各種「單位劑量」。單位劑量定義為含有預定量之治療組合物。所投與之數量以及特定途徑及調配物屬於熟習臨床技術者之確定技能範圍內。單位劑量無需以單次注射形式投與，而是可包含設定時間段內的連續輸注。在一些實施例中，單位劑量包含可單次投與之劑量。
根據治療數目及單位劑量，所投與之數量視所需治療作用而定。應理解，有效劑量係指實現特定作用所需之量。在某些實施例中之實踐中，預期在10 mg/kg至200 mg/kg範圍內之劑量可實現此等藥劑之保護性能力。因此，預期劑量包括約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195及200、300、400、500、1000微克/公斤、毫克/公斤、微克/天或毫克/天之劑量或其中任何可導出之範圍。此外，此類劑量可在一天內多次投與，及/或在數天、數週或數月內投與。
在某些實施例中，醫藥組合物之有效劑量為可提供約1 µM至150 µM之血液含量之劑量。在另一實施例中，有效劑量提供以下血液含量：約4 µM至100 µM；或約1 µM至100 µM；或約1 µM至50 µM；或約1 µM至40 µM；或約1 µM至30 µM；或約1 µM至20 µM；或約1 µM至10 µM；或約10 µM至150 µM；或約10 µM至100 µM；或約10 µM至50 µM；或約25 µM至150 µM；或約25 µM至100 µM；或約25 µM至50 µM；或約50 µM至150 µM；或約50 µM至100 µM (或其中任何可導出之範圍)。在其他實施例中，劑量可提供由向個體投與之治療劑引起之藥劑之以下血液含量：約、至少約或至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 µM或其中任何可導出之範圍。在某些實施例中，向個體投與之治療劑在體內代謝成經代謝之治療劑，在此情況下，血液含量可指藥劑之量。或者，在治療劑不由個體代謝之情況下，本文中所論述之血液含量可指未經代謝之治療劑。
治療組合物之確切量亦取決於醫師之判斷且為每個個體所特有的。影響劑量之因素包括患者之生理及臨床狀態、投藥途徑、所欲治療目標(緩解症狀對比治癒)及效能、特定治療物質或個體可能經歷之其他療法之穩定性及毒性。
熟習此項技術者應理解且瞭解，微克/公斤體重或毫克/公斤體重之劑量單位可轉化及以微克/毫升或mM (血液含量)之類似的濃度單位表示，諸如4 µM至100 µM。亦應理解，攝取為物種及器官/組織依賴性的。可適用的轉化因子及可關於攝取及濃度量測結果作出之生理學假設係熟知的，且將允許熟習此項技術者將一種濃度量測結果轉化成另一種且進行關於本文中所描述之劑量、功效及結果之合理比較且得到結論。 XII.   套組
本發明之某些態樣亦係關於含有本發明之組合物或用於實施本發明之方法之組合物之套組。在一些實施例中，套組可用於評估一或多種生物標記物。在某些實施例中，套組含有、含有至少或含有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000個或更多的探針、引子或引子集、合成分子或抑制劑，或其中任何可導出之值或範圍及組合。在一些實施例中，存在用於評估細胞中之生物標記物活性之套組。
套組可包含組分，其可個別地封裝或置放於容器中，諸如管狀物、瓶子、小瓶、注射器、或其他適合的容器構件。
亦可以濃縮量形式在套組中提供個別組分；在一些實施例中，組分係以與其在具有其他組分之溶液中之濃度相同的濃度個別地提供。組分之濃度可以1倍、2倍、5倍、10倍或20倍或更高倍數提供。
包括用於使用本發明之探針、合成核酸、非合成核酸及/或抑制劑以用於預後或診斷性應用之套組作為本發明之一部分。特定地涵蓋對應於本文中鑑別之任何生物標記物之任何此類分子，其包括與全部或一部分生物標記物一致或互補之核酸引子/引子集及探針，該生物標記物可包括生物標記物之非編碼序列以及生物標記物之編碼序列。
預期本文中所描述之任何方法或組合物可相對於本文中所描述之任何其他方法或組合物來實施且可組合不同的實施例。涵蓋最初提交之申請專利範圍以覆蓋多重依附於任何所提交之申請專利範圍或所提交之申請專利範圍之組合之申請專利範圍。
亦涵蓋本發明之任何藉由名稱來提及特定生物標記物之實施例，以覆蓋涉及其中序列與指定核酸之成熟序列具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%一致性之生物標記物之實施例。
本發明之實施例包括用於藉由評估樣品之生物標記物概況來分析病理學樣品之套組，其在適合的容器構件中包含兩種或更多種生物標記物探針，其中生物標記物探針偵測本文中鑑別之生物標記物中之一或多者。套組可進一步包含用於標記樣品中之核酸之試劑。套組亦可包括標記試劑，包括經胺修飾之核苷酸、聚(A)聚合酶及聚(A)聚合酶緩衝液中之至少一者。標記試劑可包括胺反應性染料。
本文中亦提供包括本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥及適合的封裝之套組。在某些實施例中，套組進一步包括使用說明書。在一個態樣中，套組包括本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥及化合物用於治療本文中所描述之適應症(包括疾病或病狀)之標籤及/或使用說明書。
本文中亦提供一種製品，其包括適合的容器中之本文中所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或前藥。容器可為小瓶、廣口瓶、安瓿、預裝載注射器及靜脈袋。 XIII. 化合物之合成
化合物可使用本文中所揭示之方法及其常規修改(根據本文中之揭示內容將顯而易見)及此項技術中熟知之方法來製備。除本文中之教示內容以外，亦可使用習知及熟知的合成方法。本文中所描述之典型化合物之合成可如以下實例中所描述來實現。若可用，則試劑及起始物質可商購，例如自Sigma Aldrich或其他化學供應商。
應瞭解，當給定典型或較佳處理條件(亦即反應溫度、時間、反應物之莫耳比率、溶劑、壓力等)時，除非另外陳述，否則亦可使用其他處理條件。最佳反應條件可隨所使用之特定反應物或溶劑而變化，但此類條件可由熟習此項技術者藉由常規最佳化程序確定。
此外，可能需要習知保護基以防止某些官能基經歷不合需要的反應。適用於各種官能基之保護基以及適用於保護特定官能基及使特定官能基去保護之條件為此項技術中熟知的。舉例而言，許多保護基描述於Wuts, P. G. M.、Greene, T. W.及Greene, T. W. (2006). Greene's protective groups in organic synthesis. Hoboken, N.J., Wiley-Interscience，及其中所引用之參考文獻中。
此外，本發明之化合物可含有一或多個對掌性中心。因此，若需要，則此類化合物可以純立體異構體(亦即，個別對映異構體或非對映異構體)或立體異構體增濃混合物形式製備或分離。除非另外指示，否則所有此類立體異構體(及增濃混合物)皆包括於本發明之範疇內。純立體異構體(或增濃混合物)可使用例如此項技術中熟知的光學活性起始物質或立體選擇性試劑來製備。或者，此類化合物之外消旋混合物可使用例如對掌性管柱層析、對掌性解析劑及其類似物來分離。
以下反應之起始物質為通常已知之化合物或可藉由已知程序或其明顯修改來製備。舉例而言，許多起始物質可購自商業供應商，諸如Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin, USA)、Bachem (Torrance, California, USA)、Emka-Chemce或Sigma (St. Louis, Missouri, USA)。其他起始物質可藉由描述於標準參考文本中之程序或其明顯修改來製備，該等標準參考文本諸如Fieser及Fieser, Reagents for Organic Synthesis, 第1-15卷(John Wiley, and Sons, 1991)；Rodd, Chemistry of Carbon Compounds, 第1-5卷及增刊(Elsevier Science Publishers, 1989)；organic Reactions, 第1-40卷(John Wiley, and Sons, 1991)；March, Advanced Organic Chemistry,  (John Wiley, and Sons, 第5版, 2001)，及Larock, Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)。 A.       一般合成
流程I說明可用於合成本文中所描述之化合物之通用方法。流程 I
Figure 02_image154
參考流程I，其中R1 、R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 及n係如本文中所描述，適合的起始物質及試劑(諸如化合物I-1)可商購或藉由熟習此項技術者已知的方法或本文中(諸如流程II中)所描述之方法製備。
步驟I-1：化合物I-1與鈉鹽(例如Na2 SO3 )或鈉鹼(例如NaHCO3 )或其混合物在水性溶液中反應，得到化合物I-2。反應可在加熱條件下，諸如在約60℃至約100℃之溫度下進行。反應之實例說明於實例1步驟1-2及實例6步驟6-2中。
步驟I-2：化合物I-2與Lg1 -CH2 C(O)OCH3 反應以產生I-3，其中Lg1 為脫離基，諸如Cl或Br。反應可在溶劑(諸如DMF)中，在加熱條件下，諸如在約60℃至約100℃之溫度下進行。反應之實例說明於實例1步驟1-3中。
步驟I-3：化合物I-3與原甲酸三乙酯及乙酸酐反應以產生化合物I-4。反應可在反射條件下進行。反應之實例說明於實例1步驟1-4中。
步驟I-4：化合物I-4與胺基化合物I-5反應以產生化合物I-6。反應可在溶劑(諸如二苯醚)中，在加熱條件下，諸如在約100℃至約150℃之溫度下進行。接著，將化合物I-6環化成化合物I-7。環化反應可在溶劑(諸如二苯醚)中，在回流條件下進行。反應之實例說明於實例1步驟1-5中。
步驟I-5：化合物I-7與POCl3 反應以產生化合物I-8。反應可在回流條件下進行。視情況地，可使用溶劑，諸如DMF。反應之實例說明於實例1步驟1-6及實例3中。
步驟I-5A：當化合物I-8之R6 為-SR16 (其中R16 係 如本文中所定義)時，可使用1當量氧化劑(諸如mCPBA)將-SR16 基團氧化成-S(O)R16 ，得到化合物I-8，其中R6 為-S(O)R16 。反應可在低於0℃之低溫(諸如約-20℃)下進行。反應之實例說明於實例8步驟8-1中。
步驟I-5B：當化合物I-8之R6 為-SR16 (其中R16 係如本文中所定義)時，可藉由添加過量的量之氧化劑(諸如2當量mCPBA)將-SR16 基團氧化成-S(O)2 R16 ，得到化合物I-8，其中R6 為-S(O)2 R16 。反應可在約0℃之溫度下進行。反應之實例說明於實例9中。
步驟I-6：化合物I-8與化合物R1 -H反應，得到化合物I-9。反應可在溶劑(諸如1,4-二㗁烷及DMF)中，視情況在加熱下，諸如在約30℃至反射之溫度下進行。在某些實施例中，在與化合物I-8反應之前，可添加鹼(諸如NaH)以將化合物R1 -H去質子化。I-6之實例說明於實例1步驟1-7 (I-6A)、實例2 (I-6B)及實例5 (I-6C)中。
步驟I-7：當化合物I-9之R6 為酯-C(O)OR15 (其中R15 係如本文中所定義，但不為H)時，-C(O)OR15 可在水性溶液中由鹼(諸如LiOH)水解成-C(O)OH，得到化合物I-9，其中R6 為-C(O)OH。反應之實例說明於實例3，化合物63轉化成化合物66中。類似地，化合物之其他位置處之酯基可水解成酸基。
步驟I-8：可藉由在醯胺偶合反應條件下與胺HNR15 R15 反應來將其中R6 為-C(O)OH之化合物I-9轉化成其中R6 為-C(O)NR15 R15 之化合物I-9。醯胺偶合反應條件可包括溶劑(諸如NMP、DMF、DCM)、偶合劑(諸如EDCI)、視情況選用之其他試劑(諸如HOBt)及視情況選用之鹼(諸如三乙胺)。反應可在約0℃至室溫下進行。反應之實例說明於實例7中。流程 II
Figure 02_image156
流程II展示自化合物II-1製備流程I中使用之起始物質I-1之方法。
在某些實施例中，化合物II-1與氧氯化磷及濃硫酸反應，得到化合物I-1 (II-A)。反應可在高溫(諸如約60℃至約100℃)下進行。反應之實例說明於實例1步驟1-1中。
在某些實施例中，化合物II-1與氯磺酸反應，得到化合物I-1 (II-B)。反應可在低溫(諸如約-10℃至約10℃)下進行。反應之實例說明於實例6步驟6-1中。流程 III
Figure 02_image158
流程III展示用於製備起始物質II-1之方法。苯酚化合物II-1與Lg2 -R18 反應，得到化合物II-2，其中R2 為-OR18 ，R9 及R18 係如本文中所定義，且Lg2 為脫離基，諸如鹵基。反應可在溶劑(諸如丙酮)中，在存在鹼(諸如K2 CO3 )及相轉移催化劑(諸如碘化四-正丁基銨)之情況下進行。反應之實例說明於實例10中。流程 IV
Figure 02_image160
流程IV展示用於製備中間物(諸如IV-13、IV-14及IV-15)之方法，其中R2 、R5 、R6 、R7 、R8 、R9 、R15 、R16 及n係如本文中所定義。方法之實例說明於實例18中。 XIV. 生物實例
包括以下實例以說明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示本發明人發現在本發明之實踐中運行良好之技術，且因此可視為組成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。 實例1. 藉由靶向PLXDC1/PLXDC2來殺傷病原性血管
病原性血管生成在若干重大人類疾病中起重要作用(Carmeliet, 2005)。除腫瘤生長及轉移以外，血管生成為若干致盲性疾病(包括糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)及早產兒視網膜病變)中之主要病原性驅動力。在美國，AMD及糖尿病性視網膜病變分別為老年人及工作年齡群體中之主要失明原因。早產兒視網膜病變為引起新生兒之視力損失之常見原因。病原性血管為以患病狀態存在之血管，諸如腫瘤中之腫瘤血管及與眼睛中之健康血管不同的AMD或糖尿病性視網膜病變中之新的血管。如圖1中所說明，PLXDC1表現在CNV (雷射誘導之脈絡膜新生血管(CNV))之小鼠模型中之病原性血管(圖1A-D)、局部缺血誘導之視網膜病之小鼠模型中之病原性血管中高度富集，但不在健康視網膜血管中富集(圖1E-H)。
病原性血管與健康血管之不同之處不僅在於組織位置及健康狀態，且亦在於功能方面。病原性血管驅動致病過程。舉例而言，腫瘤血管驅動腫瘤生長且向腫瘤供應其存活所必需的氧及營養物。脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管)由於殺傷健康神經元之滲漏而引起失明。儘管當前存在用於抑制新血管生長之治療策略，諸如抗血管生成療法，但不存在已知的用於破壞已存在的病原性血管之策略。本發明之結合劑可殺傷現有的病原性血管，因此提供對現有抗血管生成療法之改良。
病原性血管之兩種標記物，PLXDC1 (TEM7)及PLXDC2在不同類型之癌症之腫瘤血管(Beaty等人, 2007；Lu等人, 2007；Schwarze等人, 2005；St Croix等人, 2000；van Beijnum等人, 2009)及糖尿病性視網膜病變中之病原性血管(Yamaji等人, 2008)中高度特異性表現。在TEM7 (=腫瘤內皮標記物7)情況下尤其良好地證明病原性血管中之此高度特異性表現，其於2000年首次描述(St Croix等人, 2000)。健康血管中不存在此高度富集(Beaty等人, 2007；Lu等人, 2007；Schwarze等人, 2005；St Croix等人, 2000；van Beijnum等人, 2009)。吾人亦在脈絡膜新生血管(AMD中之病原性血管生成)及局部缺血誘導之視網膜病(早產兒視網膜病變中之病原性血管生成)中發現大量PLXDC1表現(圖1)。若干種疾病中之病原性血管中的PLXDC1之顯著富集概述於下表中：
病原性血管生成 病原性血液中之高特異性表現 參考文獻
不同類型之癌症中之腫瘤血管 是 St Croix等人, 2000 Carson-Walter等人, 2001 Baley等人, 2011
糖尿病性視網膜病變 是 Yamji等人, 2008
脈絡膜新生血管 是 圖1
局部缺血誘導之視網膜病 是 圖1
儘管PLXDC1/PLXDC2為已知的病原性血管之標記物，但尚未知曉如何有效地靶向及殺傷現有病原性血管。實情為，已研發出抗PLXDC1抗體作為潛在的抗血管生成療法。在Bagley等人,Microvasc Res . 2011 Nov;82(3):253-62中，鑑別介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及吞噬作用之抗PLXDC1反抗體。然而，此類癌症免疫療法方法未產生積極的治療結果。此外，色素上皮衍生因子(PEDF)，具有抗血管生成特性之PLXDC1及PLXDC2之天然配位體，未能殺傷現有的表現PLXDC之血管。此實例表明調節PLXDC1/PLXDC2受體之藥劑可有效地殺傷現有血管。 A.       離體腫瘤血管生成模型
研發離體腫瘤血管生成模型以測試抗癌候選藥劑之效力。以下方案描述離體腫瘤血管生成模型。方案： 1. 在實驗前一天，用70%乙醇噴塗所有必需工具且在UV光下滅菌隔夜，包括刀片、解剖剪及微型解剖剪以及二頭肌。將24孔培養皿置放於4℃下以將培養皿預先冷凍且在腫瘤解剖之前24小時將基質膠解凍。 2. 在工作台上噴塗70%乙醇。用10 ml無菌PBS製備兩個無菌皮氏培養皿(petri dish)。以下步驟3及4對於小鼠腫瘤模型為必需的。對於新鮮的人類腫瘤，可略過步驟3及4。 3. 將攜帶腫瘤之小鼠處死。在小鼠上噴塗70%乙醇且使用經滅菌之解剖工具移出腫瘤(避開毛皮)。在皮氏培養皿中用無菌PBS沖洗腫瘤以移除乙醇及毛皮。將腫瘤與PBS一起轉移至新的皮氏培養皿中以用於解剖。將培養皿置放於冰上。 4. 使用預先冷凍的無菌吸管頭在冰上，在24孔培養皿中接種合格的基質膠。在各孔中間滴加基質膠(30 µl)而不觸碰孔之邊緣(避免引入氣泡(若可能))。 5. 使用無菌刀片將腫瘤切成兩半。鑑別及分離未壞死且位於腫瘤囊內之健康腫瘤組織。將健康腫瘤組織切成小塊。舉例而言，腫瘤組織之適合的尺寸為0.5 mm (H)×0.5 mm (L)×0.3 mm (D)且總體積為0.075 mm3 。 6. 將每個腫瘤塊輕緩地轉移及包埋於24孔盤中之基質膠滴中。將經包埋之腫瘤塊置放於各基質膠滴之底部及中部。始終將盤保持在冰上。 7. 在將腫瘤塊接種之後，盤在不具有培養基之37℃細胞培育箱中培育10分鐘以使基質膠凝固。 8. 向各孔中添加內皮生長培養基(0.5 ml)且在37℃下，在5% CO2 下培育。直至新的內皮細胞自腫瘤長出或直徑大於3 mm時才添加治療。對於LL2路易斯肺癌模型(LL2 Lewis lung cancer model)，此通常耗時4天，且對於CT26結腸癌模型，此通常耗時7天。對於人類腫瘤模型，視腫瘤類型而定，生長時間通常為2-3週。在長期培養期間，每4天一次更換培養基。通常，當腫瘤組織生長至直徑為2 mm時，其適合於藥物測試。直徑為約3 mm之尺寸可更易於觀測。 9. 當分析法準備用於分析細胞死亡時(例如，在藥物添加之後48小時)，藉由在埃彭道夫管(Eppendorf tube)中混合6 µl用於染色活細胞之綠色染料(含5 mg/ml之二乙酸螢光素或FDA之DMSO)與30 µl用於染色死細胞之紅色染料(含2.5 mg/ml之碘化丙錠或PI之PBS)來製備染料混合物。FDA染料需要在-20℃冷凍器中冷凍儲存，因為其具有不穩定的酯鍵。 10. 向24孔培養皿之各孔中添加1 µl染料混合物。鑒於獲取圖片所需之時間量(綠色染料不能在細胞中長期穩定)，通常較佳每次處理一個24孔培養皿。 11. 將培養皿溫和地搖盪幾次以混合孔中之染料與培養基且在37℃下培育培養皿10分鐘(培育時間過長會使綠色信號過於強烈)。 12. 用0.5 ml無菌PBS洗滌各孔且接著，向各孔中添加0.5 ml不含酚紅之SFM。或者，可向各孔中添加0.5 ml合格的內皮細胞生長培養基(若此孔需要在實驗之後繼續保留)。 13. 使用倒置顯微鏡，使用2倍物鏡觀測實驗孔中之形態變化。 14. 在紅色及綠色通道中獲取圖片將不僅能夠記錄結果，且亦能夠更精確地定量結果。為了獲取所有孔之圖片，首先挑選具有穩定的紅色及綠色信號之孔。獲取使用最佳設置(記住此設置)之紅色通道處之圖片且接著獲取使用另一種最佳設置(記住此設置)之綠色通道處之圖片。最終圖片為紅色及綠色通道之經合併之圖片。使用相同的設置在各通道中獲取所有其他孔之圖片，使得可比較不同的孔。 B.       結果
使用上文所描述之模型，本發明人設計及測試新穎化合物且針對PLXDC1之單株抗體殺傷病原性血管之能力來篩選該等單株抗體。 1.        殺傷視力疾病中之病原性血管
圖2說明在脈絡膜新生血管之離體模型中，靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物369 (表3)可殺傷內皮細胞(參見例如Shao, Z.等人, PLoS One. 2013年7月26日;8(7):e69552，其以引用之方式併入本文中)而不影響健康組織(脈絡膜及視網膜色素上皮(RPE))。相比之下且如圖3中說明，當前抗血管生成藥物艾力雅(當前最常用的用於此目的之藥物)僅可制止血管生成，但不殺傷來自脈絡膜血管生成之現有內皮細胞(即使在比臨床上使用之濃度高得多的濃度下)。圖3為人類資料之實例，其展示在三年內注射24次抗VEGF藥物艾力雅僅部分抑制病原性血管生長，但不能殺傷病原性血管。 2.        殺傷腫瘤血管
先前不存在可藉由殺傷現有腫瘤血管來殺傷腫瘤(引起大規模腫瘤壞死)之藥物(小分子或大分子)。現有的靶向血管之藥物不能實現此治療作用之原因在於其為抗血管生成藥物且經設計以制止新血管生長(及腫瘤生長)。圖4展示頂部的本發明之靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物(例如化合物369)在腫瘤血管生成之離體模型中可殺傷現有的腫瘤內皮細胞。相比之下，當前抗血管生成藥物或抗血管生成因子PEDF不能殺傷現有的腫瘤內皮細胞。
圖5及6展示本發明之靶向人類PLXDC1之抗體在人類腫瘤血管生成之離體模型中可殺傷現有的腫瘤內皮細胞。圖7為活體內實驗，其表明靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物369之全身性投藥可殺傷現有的腫瘤血管及引起顯著的腫瘤死亡。腫瘤由於大規模凝固性壞死而死亡，恰好係由殺傷血管引起之細胞死亡類型。
圖8說明此新機制與抗血管生成藥物之間的差異。血管生成為自現有血管生長新的血管。腫瘤依賴於血管生成來生長及轉移(圖8A)。抗血管生成藥物或因子抑制血管生成及腫瘤生長，但不能殺傷腫瘤，因為其不能有效地殺傷現有腫瘤血管(圖8B)。靶向PLXDC1/PLXDC2之藥物可殺傷現有腫瘤血管，以引起腫瘤死亡(圖8C)。因此，本發明之藥劑及方法能夠殺傷與腫瘤相關之現有血管且因此在腫瘤治療方面更有效。 3.          結合劑/受體相互相用
發現某些小分子藥物候選物及抗PLXDC1單株抗體可靶向PLXDC1以殺傷病原性血管。此外，此等分子可與PLXDC1相互作用而與PEDF結合所需的域B無關(圖10)。
類似地，發現諸如AA02、AA03及AA94之抗體純系可相互作用而與域B無關(圖11)，活化NF-κB (圖12)且亦殺傷腫瘤內皮細胞(圖5B-C，圖6A)。並不意外的是，PLXDC1，其具有大型細胞外域，具有多個用於結合於因子及配位體之位點。
已知許多受體結合於不同配位體。已知PEDF結合於PLXDC1。與所有抗血管生成因子相同，PEDF可抑制血管生成、新血管之生長，但不能殺傷現有血管。相比之下，本發明之靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物可殺傷腫瘤血管。
圖4展示本發明之化合物、PEDF及抗血管生成劑，VEGF捕獲劑之間的直接比較。與本發明之PLXDC1/PLXDC2調節劑相比，PEDF，其與PLXDC1之域B相互作用，不殺傷病原性血管。總而言之，發現本發明之抗體及化合物能夠殺傷病原性血管，而PEDF (PLXDC1/PLXDC2之天然配位體)及一些當前抗血管生成療法不能夠實現此作用。此資料例示此新穎治療策略在殺傷血管方面之重要性且區分此對策與當前阻止新血管發育之抗血管生成策略。 實例2. 結腸癌之小鼠模型中小分子之測試
此實例證實實例1中所描述之離體腫瘤血管生成模型可有效篩選能夠殺傷腫瘤血管之藥劑。 在以下實例中測試來自下表之選擇化合物。
使用實例1中描述之方法使來自結腸癌之異種移植小鼠模型之腫瘤(CT26.CL25)生長，以建立腫瘤血管生成之離體模型。直至新的腫瘤內皮細胞生長7天才開始治療。在進行兩天藥物治療之後，使用二乙酸螢光素(綠色染料)及碘化丙錠(紅色染料)之混合物，藉由雙色分析法來評估細胞存活率。綠色細胞表示活細胞。紅色細胞表示死細胞。橙色細胞表示活細胞與死細胞之混合物。
根據紅色區域與總內皮細胞區域之比來計算細胞死亡百分比。
測試化合物之活性提供於以下表 4 中。在欄「48小時」下提供在48小時之後的形態觀測結果，其中：「0」指示所有細胞具有正常內皮細胞形態(細胞為細長的且連接至相鄰細胞)；「*」指示50%或更少的細胞在細胞形狀方面發生血管化；「**」指示超過50%，但小於100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化；「***」指示100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化；「****」指示100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化且看起來在形態方面發生扁平化(指示細胞體之崩解)。在細胞形狀方面發生血管化指示內皮細胞不再具有細長形狀且不再連接至相鄰細胞。表 4
化合物編號 腫瘤血管生成之結腸CT26 離體模型
48 小時 細胞死亡 濃度(µm)
42 0 0% 40
43 *** 90% 40
44 0 0% 40
45 0 0% 40
46 **** 100% 40
47 0 10% 40
48 0 10% 40
49 0 10% 40
50 *** 100% 40
51 *** 20% 40
52 0 0% 40
54 0 10% 40
55 0 50% 40
56 0 30% 40
57 * 60% 40
58 * 50% 40
59 0 50% 40
60 0 5% 40
61 0 20% 40
62 ** 70% 40
63 *** 70% 40
64 *** 100% 40
65 0 0% 40
66 0 0% 40
67 0 0% 40
68 ** 50% 40
69 0 0% 40
70 0 10% 40
71 0 0% 40
72 0 0% 40
73 0 0% 40
74 *** 100% 40
75 0 0% 40
76 ** 100% 40
77 0 40% 40
78 0 0% 40
79 *** 100% 10
80 *** 100% 10
81 0 0% 40
82 0 10% 40
84 * 100% 40
85 0 50% 40
86 *** 100% 10
87 0 0% 40
88 *** 60% 40
89 *** 100% 10
90 0 0% 40
91 *** 100% 10
92 0 0% 40
93 *** 100% 10
94 0 0% 40
95 0 0% 40
96 0 0% 10
97 *** 100% 10
98 *** 50% 10
99 0 0% 40
100 **** 100% 40
101 * 50% 20
102 0 5% 40
110 ** 10% 40
112 ** 10% 40
116 * 50% 20
117 *** 100% 20
118 *** 100% 20
119 0 50% 20
121 *** 40% 40
123 0 20% 40
124 0 20% 40
128 0 10% 40
129 0 0% 40
130 0 40% 40
131 ** 50% 40
132 * 40% 40
135 0 30% 40
136 0 30% 40
137 0 40% 40
138 0 20% 40
139 0 40% 40
140 ** 60% 40
144 0 30% 40
145 0 30% 40
146 0 0% 40
147 0 0% 40
148 0 0% 40
149 * 20% 40
150 0 10% 40
151 **** 100% 40
152 ** 30% 40
153 * 20% 40
154 * 30% 40
155 *** 20% 40
156 0 0% 40
157 **** 60% 40
158 **** 100% 40
159 **** 100% 40
160 **** 100% 40
161 **** 100% 40
162 ***    40
163 **** 100% 40
164 **** 100% 40
165 0 10% 40
166 *** 60% 40
191 0 10% 40
192 0 10% 40
201 * 10% 40
202 0 10% 40
206 **** 100% 40
207 **** 100% 40
208 0 20% 40
209 *** 90% 40
210 *** 70% 40
211 **** 100% 40
212 0 10% 40
214 **** 100% 40
215 0 20% 40
216 **** 100% 40
218 *** 90% 40
219 *** 90% 40
220 **** 100% 40
221 **** 100% 40
238 0 10% 10
241 0 0% 10
253 *** 80% 10
254 ** 40% 10
255 0 0% 10
256 *** 90% 10
257 **** 100% 10
258 *** 100% 10
259 *** 100% 20
實例3. 小鼠肺癌模型中化合物之測試
此實例在小鼠肺癌模型中測試實例2之化合物。
使用實例1中所描述之方法使來自肺癌之異種移植小鼠模型之腫瘤(LL/2)生長，以建立腫瘤血管生成之離體模型。直至新的腫瘤內皮細胞生長5天才開始治療。在進行兩天藥物治療之後，使用二乙酸螢光素(綠色染料)及碘化丙錠(紅色染料)之混合物，藉由雙色分析法來評估細胞存活率。綠色細胞表示活細胞。紅色細胞表示死細胞。橙色細胞表示活細胞與死細胞之混合物。根據紅色區域與總內皮細胞區域之比來計算細胞死亡百分比。
測試化合物之活性提供於以下表 5 中。在欄「48小時」下提供在48小時之後的形態觀測結果，其中：「0」指示所有細胞具有正常內皮細胞形態(細胞為細長的且連接至相鄰細胞)；「*」指示50%或更少的細胞在細胞形狀方面發生血管化；「**」指示超過50%，但小於100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化；「***」指示100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化；「****」指示100%的內皮細胞在細胞形狀方面發生血管化且看起來在形態方面發生扁平化(指示細胞體之崩解)。在細胞形狀方面發生血管化指示內皮細胞不再具有細長形狀且不再連接至相鄰細胞。表 5
編號 腫瘤血管生成之肺LL2 離體模型
48小時 細胞死亡 濃度(µm)
42 0 30% 40
43 *** 100% 40
44 ** 50% 40
45 ** 10% 40
46 **** 100% 40
47 0 50% 40
48 ** 60% 40
49 0 30% 40
50 *** 90% 40
51 **** 100% 40
52 ** 50% 40
54 0 50% 40
55 ** 70% 40
56 * 20% 40
57 0 40% 40
58 0 50% 40
59 0 40% 40
61 0 50% 40
62 *** 30% 40
63 ** 50% 40
64 *** 100% 40
65 0 10% 40
66 0 10% 40
67 0 10% 40
68 *** 80% 40
69 0 20% 40
70 *** 40% 40
71 * 10% 40
72 0 20% 40
73 0 10% 40
74 *** 60% 40
75 ** 80% 40
76 0 20% 40
77 ** 80% 40
78 0 40% 40
79 ** 20% 20
80 *** 100% 20
81 0 0% 40
82 0 60% 40
83 0 20% 40
84 ** 100% 40
85 0 80% 40
86 *** 100% 20
87 0 0% 40
88 0 70% 40
89 *** 100% 20
90 0 10% 40
91 *** 80% 20
92 0 10% 20
93 *** 100% 20
94 0 20% 40
95 0 10% 40
96 0 0% 20
97 ** 50% 20
98 ** 10% 20
99 0 10% 40
100 **** 100% 40
101 *** 100% 20
102 0 20% 20
103 0 10% 20
104 0 20% 20
105 0 0% 20
106 0 5% 20
107 0 0% 20
108 0 0% 20
109 0 0% 20
110 *** 95% 20
111 0 30% 20
112 *** 70% 20
113 0 10% 20
114 0 5% 20
115 0 10% 20
116 *** 100% 20
117 *** 100% 20
118 *** 100% 20
119 *** 100% 20
120 0 5% 20
121 ** 50% 40
122 0 10% 20
125 * 10% 20
126 0 10% 20
133 ** 10% 20
134 ****    20
141 **** 90% 20
142 ****    20
143 0 40% 40
151 **** 100% 40
152 * 20% 20
154 * 30% 40
155 *** 80% 40
156 ** 30% 40
157 *** 100% 40
158 **** 100% 40
159 **** 100% 40
160 **** 100% 40
161 **** 90% 40
162 *** 70% 40
163 **** 95% 40
164 **** 95% 40
165 * 10% 40
166 0 10% 40
167 0 40% 20
168 0 10% 20
169 0 40% 20
170 0 10% 20
171 0 40% 40
172 **** 100% 40
173 ** 50% 40
174 0 30% 40
175 0 30% 40
176 *** 100% 40
177 **** 100% 40
178 **** 100% 40
179 *** 60% 10
180 *** 70% 10
181 **** 100% 40
182 **** 100% 40
183 **** 100% 10
184 0 5% 10
185 * 30% 10
186 **** 90% 10
187 0 30% 40
191 0 30% 40
192 *** 60% 40
193 0 30% 40
195 0    40
196 0 30% 40
197 0 20% 40
198 0 30% 40
199 0 30% 40
200 0 30% 40
201 0 30% 40
202 ** 30% 40
206 0 30% 20
207 **    20
208 0 50% 40
209 * 60% 40
210 0 50% 40
211 **** 100% 40
212 0 50% 40
213 0 30% 40
214 **** 100% 40
215 0 30% 40
216 **** 100% 40
217 0 30% 40
218 **** 100% 40
219 **** 60% 40
220 **** 100% 40
221 **** 100% 40
223 *** 30% (rim) 40
225 0 40% 40
226 * 10% 40
227 0 10% 40
228 0 5% 40
229 0 30% 40
230 *** 100% 40
231 *** 100% 40
232 0 10% 40
233 0 5% 40
234 *** 100% 40
235 0 10% 40
236 0 5% 40
237 *** 100% 40
238 *** 100% 40
239 0 40% 40
240 0 30% 40
241 0 40% 40
242 0 30% 40
243 0 20% 40
244 0 20% 40
245 0 40% 40
246 *** 95% 20
247 *** 60% 20
248 * 60% 20
249 *** 60% 20
250 *** 90% 20
251 *** 60% 20
253 **** 100% 20
254 *** 100% 20
255 * 10% 20
256 **** 100% 20
257 **** 100% 20
258 **** 100% 20
259 *** 95% 20
262 0 20% 10
263 **** 100% 10
264 * 20% 10
265 * 20% 10
266 0 5% 10
267 0 5% 10
268 *** 50% 20
269 **** 100% 20
270 * 50% 20
271 *** 60% 20
272 * 20% 20
273 *** 60% 20
274 0 10% 20
275 0 5% 20
276 *** 100% 20
277 ** 60% 10
278 * 50% 10
279 **** 100% 20
280 *** 100% 20
281 ** 50% 20
282 0 10% 10
283 0 5% 10
284 0 10% 10
285 *** 60% 10
286 0 (24小時) 0% (24小時) 20
287 * (24小時) 40% (24小時) 20
288 *** 50% 10
289 ** 20% 20
290 *** 50% 10
291 * (24小時) 10% (24小時) 20
292 * (24小時) 10% (24小時) 20
294 * 50% 40
296 0 20% 40
300 0 20% 40
302 0 70% 40
306 0 40% 40
308 0 20% 40
310 0 10% 40
311 0 30% 40
312 **** 100% 40
317 0 30% 40
318 0 30% 40
320 0 30% 40
321 0 40% 40
322 0 30% 40
323 0 30% 40
324 0 60% 40
325 * 30% 40
326 0 30% 40
327 0 20% 40
328 0 30% 40
329 *** 40% 40
330 *** 50% 40
331 0 10% 40
332 0 0% 40
333 0 0% 40
336 0 0% 40
339 ** 50% 20
340 *** 60% 20
341 *** 80% 20
342 *** 60% 20
343 *** 50% 20
344 * 10% 20
345 *** 50% 20
346 * 20% 20
347 *** 30% 20
348 * 20% 20
350 0 20% 40
351 *** 100% 40
352 *** 100% 40
353 0 0% 40
354 0 0% 40
355 0 0% 40
356 0 0% 40
357 0 0% 40
358 0 0% 40
359 0 20% 40
360 0 20% 40
362 *** 20% 20
363 *** 30% 20
364 *** 30% 20
365 *** 20% 20
366 0 10% 20
367 0 5% 20
368 ** 20% 20
369 * 20% 20
370 ** 20% 20
371 *** 30% 20
372 ** 20% 20
373 * 20% 20
374 ** 20% 20
375 * 50% 20
376 0 10% 20
377 0 10% 20
378 *** 30% 20
本文中所描述之某些其他化合物亦在其他血管生成分析法中展示引起內皮細胞死亡之活性。 實例4. 產生PLXDC活化抗體
此實例描述結合及活化PLXDC蛋白質之單株抗體之產生。
據本發明人所知，不存在可活化細胞表面受體之抗體藥物。所有現有的抗體藥物皆為制止配位體/受體相互相用之中和抗體，諸如修美樂(抑制TNF-α，一種配位體)、阿瓦斯汀(抑制VEGF，一種配位體)、赫賽汀(抑制HER2，一種受體)及克珠達(抑制PD-1，一種受體)。因此，出人意料的是，實例1中測試之抗體能夠活化PLXDC1，一種簡單的跨膜細胞表面受體。此實例設計及測試一種用於獲得大量高效活化抗體之程序。
在第一步驟中，創建定製人類抗體庫，其含有約100億種抗體純系。為了自此庫篩選活化抗體，在存在活化小分子化合物(例如表3之化合物369)之情況下，用人類PLXDC1蛋白質(以約2.7之生物素/PLXDC1比率生物素化)建立篩選分析法。
藉由此方法鑑別約100種人類抗體純系，其優先結合於小分子活化之PLXDC1。所選擇的抗體純系之VH/VL序列及相應的CDR序列呈現於下表中。表 6. 選擇 PLXDC1 活化抗體
名稱 序列 SEQ ID NO:
1-A1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISAGGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYNSYFDSWGQGTLVTVSS 4
1-A1_VL QSTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRSLSGWVFGGGTKLTVL 5
1-A5_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGYAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISHSGSNKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLAGWEVYPFDVWGQGTLVTVSS 6
1-A5_VL QSTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGFDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDYSLRVWVFGGGTKLTVL 7
1-H10_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRYWYTKLISYTYGMDVWGQGTLVTVSS 8
1-H10_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGATYDVHWYQQLPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAWVFGGGTKLTVL 9
2-B4_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYHGRNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDDQDAFDPWGQGTLVTVSS 10
2-B4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSAPYTFGQGTKVEIK 11
2-B5_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSDYDMHWVRQAPGKGLEWVAVISHSGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSVYLYYGYHYYEGFDVWGQGTLVTVSS 12
2-B5_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDLPLTFGQGTKVEIK 13
2-F7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYTSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRYFDHWGQGTLVTVSS 14
2-F7_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRNNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYTWPRTFGQGTKVEIK 15
2-F8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGRGERTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSVVWSYAFDYWGQGTLVTVSS 16
2-F8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 17
2-G4_VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYYWGWIRQPPGKGLEWIGSVYYTGRTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARVFPYGAVDVWGQGTLVTVSS 18
2-G4_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGGSLPYTFGQGTKVEIK 19
2-H2_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSEGSGFDVWGQGTLVTVSS 20
2-H2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSPPYTFGQGTKVEIK 21
2-H9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTDYSLYYQFDYWGQGTLVTVSS 22
2-H9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIK 23
3-A7_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDEDGFDVWGQGTLVTVSS 24
3-A7_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRPPYTFGQGTKVEIK 25
3-A9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSITGSGEYTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVADYWDGGVYYYYDGGFDVWGQGTLVTVSS 26
3-A9_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGRSAPITFGQGTKVEIK 27
3-B3_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGTGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDHYSGYAFDLWGQGTLVTVSS 28
3-B3_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 29
3-C4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGGGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAEVDDYWYLYMDVWGQGTLVTVSS 30
3-C4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTFPLTFGQGTKVEIK 31
3-C6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTDHYSYYVMDYWGQGTLVTVSS 32
3-C6_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDCATYYCQQSYSFPLTFGQGTKVEIK 33
3-C8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTAYSYPYVYFDFWGQGTLVTVSS 34
3-C8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 35
3-C9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGGGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSYYGVYDGYYYGMDVWGQGTLVTVSS 36
3-C9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISRYLNWHQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKVEIK 37
3-C11_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYASGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLKLYHAAFDIWGQGTLVTVSS 38
3-C11_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 39
3-C12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVDHVHGYAFDYWGQGTLVTVSS 40
3-C12_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPPTFGQGTKVEIK 41
3-D3_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYESGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVESYGYGEYITYNYYGFDVWGQGTLVTVSS 42
3-D3_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVATGYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYESSPPFTFGQGTKVEIK 43
3-D6_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTSYGIHWVRQAPGQGLEWMGRIVPILGTTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPAVTLDTYVYADHGFDVWGQGTLVTVSS 44
3-D6_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPLTFGQGTKVEIK 45
3-D7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISEGGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPPKYGAYSYYGYGFDPWGQGTLVTVSS 46
3-D7_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK 47
3-D12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISVSGAGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYVRGVSFDVWGQGTLVTVSS 48
3-D12_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYETSPPVTFGQGTKVEIK 49
3-E2_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGWEYQAFDYWGQGTLVTVSS 50
3-E2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK 51
3-E5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITAGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIAGLFDGFDVWGQGTLVTVSS 52
3-E5_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYASLPLTFGQGTKVEIK 53
3-E7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISASGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSRYGDTFDVWGQGTLVTVSS 54
3-E7_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASLSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNLPLTFGQGTKVEIK 55
3-E8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISVSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYAHHTYYYGGFDYWGQGTLVTVSS 56
3-E8_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHNWPPTFGQGTKVEIK 57
3-E9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGTGEDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYFWSPRGSIYDYDYFDVWGQGTLVTVSS 58
3-E9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFSAPYTFGQGTKVEIK 59
3-F5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISVSGAGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYVRGVSFDVWGQGTLVTVSS 60
3-F5_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPAVTFGQGTKVEIK 61
3-F6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGWSYYGLWIYYYYMDVWGQGTLVTVSS 62
3-F6_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGASPQTFGQGTKVEIK 63
3-F12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARKLGGFDENYTYGMDVWGQGTLVTVSS 64
3-F12_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPEYTFGQGTKVEIK 65
3-G4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISAGGGARTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVHHFGYYSLDVWGQGTLVTVSS 66
3-G4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 67
3-G5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDPRYQLDVWGQGTLVTVSS 68
3-G5_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 69
3-G6_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSRKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYSDGFDVWGQGTLVTVSS 70
3-G6_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKTGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK 71
3-G7_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTEYISWVRQAPGQGLEWMGRIIPVLGITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHLGPPYLVTYSHGFDVWGQGTLVTVSS 72
3-G7_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLGTNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYEAPPTFGQGTKVEIK 73
3-G8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLKYGFYQFDYWGQGTLVTVSS 74
3-G8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNYLNWYEQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 75
3-H1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYAGGARTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 76
3-H1_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTVPLTFGQGTKVEIK 77
3-H4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKKYGSAGYTVGFDSWGQGTLVTVSS 78
3-H4_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNAPITFGQGTKVEIK 79
4-A7_VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGNIYYTGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIKVPWYYSSYYFDYWGQGTLVTVSS 80
4-A7_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNKNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSAWVFGGGTKLTVL 81
4-A8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRWGAFDYWGQGTLVTVSS 82
4-A8_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNRNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLKTWVFGGGTKLTVL 83
4-B1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISRGGARTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYLFGHYMDWGQGTLVTVSS 84
4-B1_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDGRLGVSVFGGGTKLTVL 85
4-B2_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISHSGSTKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRGWRGFDSWGQGTLVTVSS 86
4-B2_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAYVVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDRTLSSYVFGGGTKLTVL 87
4-B11_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISHHGSYKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGADVGYFYSTFYYYMDVWGQGTLVTVSS 88
4-B11_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAAFDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNYNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVWVFGGGTKLTVL 89
4-D12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISRGGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 90
4-D12_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYANNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDYSLSGWVFGGGTKLTVL 91
4-F4_VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSRGYYWAWIKQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLVSYGAYYVFDYWGQGTLVTVSS 92
4-F4_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNRNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTRLSAWVFGGGTKLTVL 93
4-G12_VH EVQLLESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDKRLTYWGQGTMVTVSS 94
4-G12_VL QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSARVFGGGTKVTVL 95
5-C9_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGRIIPLLETADYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREWPGEYFDVWGQGTLVTVSS 96
5-C9_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSQLTFGQGTKVEIK 97
5-E2_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYHGRNEYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYGDDFDVWGQGTLVTVSS 98
5-E2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKTGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK 99
5-E12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGRTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTPIPSYYPYIYSYYFDVWGQGTLVTVSS 100
5-E12_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGNYPPTFGQGTKVEIK 101
6-G4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSSGANTYYADSGKGRFTISRDNSKNILYLQMNSLRAEDTAVYYCARSVVTWVTYAFDYWGQGTLVTVSS 102
6-G4_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSGLSGWVFGGGTKLTVL 103
6-H5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISATGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSVRERYTYYMDYWGQGTLVTVSS 104
6-H5_VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDVSLGVWVFGGGTKLTVL 105
8-A2_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYYISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGVAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYPGEYFDYWGQGTLVTVSS 106
8-A2_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGGSPGYTFGQGTKVEIK 107
8-A4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYAGGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 108
8-A4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFTFPLTFGQGTKVEIK 109
8-A6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSGGVRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLVSFRGYAFDYWGQGTLVTVSS 110
8-A6_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTIPPTFGQGTKVEIK 111
8-A7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGGGINTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRSYSGPGYFDYWGQGTLVTVSS 112
8-A7_VL EIVMTQSPATLSVSPGDRATLSCRASRSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPLTFGQGTKVEIK 113
8-A8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGSGARTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARISPHYDFDVWGQGTLVTVSS 114
8-A8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPITFGQGTKVEIK 115
8-A9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREARVLGYSLDYWGQGTLVTVSS 116
8-A9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 117
8-C4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLRYGFYQFDYWGQGTLVTVSS 118
8-C4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNYLNWYEQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 119
8-C6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSSGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYPLHSYAFDHWGQGTLVTVSS 120
8-C6_VL DIQMTQSHSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPLTFGQGTKVEIK 121
8-C9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKSYAMSWVRQAPGKGLEWVSLISSSGENTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRFGYGSWRYRKYMDVWGQGTLVTVSS 122
8-C9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIATYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK 123
8-C10_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISASGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYSYYYYSFDYWGQGTLVTVSS 124
8-C10_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRYPLTFGQGTKVEIK 125
8-C11_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYVGGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGWSWGFDPWGQGTLVTVSS 126
8-C11_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 127
8-D11_VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSITEGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVWHTDDYYEGFDVWGQGTLVTVSS 128
8-D11_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTTPQTFGQGTKVEIK 129
8-D4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGSGARTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 130
8-D4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGQGTKVEIK 131
8-D7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISTSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVGRAVFDIWGQGTLVTVSS 132
8-D7_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAALPITFGQGTKVEIK 133
8-E2_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDEAIHWVRQAPGQGLEWMGRIIPVLGIASYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLSRKAFYFDYWGQGTLVTVSS 134
8-E2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRYPYTFGQGTKVEIK 135
8-E3_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYRGAGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDASWYGPFSYYYYYGFDVWGQGTLVTVSS 136
8-E3_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYTNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPLTFGQGTKVEIK 137
8-E9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSIITESGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPSVGSASRSYYFDVWGQGTLVTVSS 138
8-E9_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYSAPLTFGQGTKVEIK 139
8-F1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGVGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEYGSSIAYSYYYGFDVWGQGTLVTVSS 140
8-F1_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPYTFGQGTKVEIK 141
8-F2_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREARVLGYSLDYWGQGTLVTVSS 142
8-F2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRIGKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 143
8-F4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIRGGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPLRLYGFDYWGQGTLVTVSS 144
8-F4_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 145
8-F6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVRHDSYYYYYYSGMDVWGQGTLVTVSS 146
8-F6_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSDYPFTFGQGTKVEIK 147
8-F11_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAINWVRQAPGQGLEWMGRIIPTLGIANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAAYFAGPAARYGYFDIWGQGTLVTVSS 148
8-F11_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAYAPWTFGQGTKVEIK 149
8-G12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISVSGAGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYVRGVSFDVWGQGTLVTVSS 150
8-G12_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPAVTFGQGTKVEIK 151
8-H7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLRYGFYQFDYWGQGTLVTVSS 152
8-H7_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNYLNWYEQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 153
9-A6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSGGVRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLVSFRGYAFDYWGQGTLVTVSS 154
9-A6_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTIPPTFGQGTKVEIK 155
9-B3_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSRKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYSDGFDVWGQGTLVTVSS 156
9-B3_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRMTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYAPPYTFGQGTKVEIK 157
9-B10_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISESGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVPWQLAFDVWGQGTLVTVSS 158
9-B10_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYYWPITFGQGTKVEIK 159
9-C2_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVRHDSYYYYYYSGMDVWGQGTLVTVSS 160
9-C2_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSDYPFTFGQGTKVEIK 161
9-D8_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSEAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPISGRPNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREASYYVAGYYRYYGFDVWGQGTLVTVSS 162
9-D8_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASRSLSNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNAWPYTFGQGTKVEIK 163
9-E4_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVRHDSYYYYYYSGMDVWGQGTLVTVSS 164
9-E4_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYNNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSDYPFTFGQGTKVEIK 165
9-E5_VH QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKIEGGTTDYAPPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDPTWYVSGHYYGFDVWGQGTLVTVSS 166
9-E5_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIANYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFSTPPTFGQGTKVEIK 167
9-G1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISAGGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGWYPILYYAFDYWGQGTLVTVSS 168
9-G1_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYTIPLTFGQGTKVEIK 169
9-G3_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAYPLGSYYGFDPWGQGTLVTVSS 170
9-G3_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIATYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPVTFGQGTKVEIK 171
9-H9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYGSGVRTYYADGVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGWIPHSFYAFDYWGQGTLVTVSS 172
9-H9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFTAPVTFGQGTKVEIK 173
2-C8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGISTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPGPGYWYAFDVWGQGTLVTVSS 174
2-C8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPITFGQGTKVEIK 175
8-D9_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDEAIHWVRQAPGQGLEWMGRIIPVLGIASYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLSRRAFYFDYWGQGTLVTVSS 176
8-D9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRYPYTFGQGTKVEIK 177
10-A9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGISTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPGPGYWYAFDVWGQGTLVTVSS 178
10-A9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPITFGQGTKVEIK 179
10-B2_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSGGVRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLVSFKGYAFDYWGQGTLVTVSS 180
10-B2_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTIPPTFGQGTKVEIK 181
10-B5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGAGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARISHGWGFDVWGQGTLVTVSS 182
10-B5_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 183
10-C1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGSGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVASSYHYAFDYWGQGTLVTVSS 184
10-C1_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTFPLTFGQGTKVEIK 185
10-C3_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEDTSYYGMDYWGQGTLVTVSS 186
10-C3_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGIYLNWYQQKPGKAPTLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTYPLTFGQGTKVEIK 187
10-C9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLEAGFYSLDIWGQGTLVTVSS 188
10-C9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPLTFGQGTKVEIK 189
10-C11_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSGVVGALDIWGQGTLVTVSS 190
10-C11_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPYTFGQGTKVEIK 191
10-D7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 192
10-D7_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTVPLTFGQGTKVEIK 193
10-E1_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYSGGVRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLVSFKGYAFDYWGQGTLVTVSS 194
10-E1_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTIPPTFGQGTKVEIK 195
10-E6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTEYDGYFDVWGQGTLVTVSS 196
10-E6_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDGFPPTFGQGTKVEIK 197
10-E7_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEDSHYSFDVWGQGTLVTVSS 198
10-E7_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTVPWTFGQGTKVEIK 199
10-F11_VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFSDYAMHWLRQAPGKGLEWVAVISYDGNIEYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRIGSSTYYGYYNGFDVWGQGTLVTVSS 200
10-F11_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDYPLTFGQGTKVEIK 201
10-F12_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIKGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYLWLDPWGQGTLVTVSS 202
10-F12_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPLTFGQGTKVEIK 203
10-G5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGTYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRISGYGPGYFGGFDVWGQGTLVTVSS 204
10-G5_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVYSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSNWPLTFGQGTKVEIK 205
11-B6_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSIISGTGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIDTFAYYYSLYRAFDLWGQGTLVTVSS 206
11-B6_VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGGNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPLTFGQGTKVEIK 207
11-D8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISEGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTKRYFAGGSYYWMDVWGQGTLVTVSS 208
11-D8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQSYSYPITFGQGTKVEIK 209
11-D10_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGGSGHTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGGGRFAMDVWGQGTLVTVSS 210
11-D10_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYESPITFGQGTKVEIK 211
11-D11_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIYGITYDGYTYYDGMDVWGQGTLVTVSS 212
11-D11_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYNYLNWHQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDSPPWTFGQGTKVEIK 213
11-G2_VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYYISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGVAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYPGEYFDYWGQGTLVTVSS 214
11-G2_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGGSPGYTFGQGTKVEIK 215
11-G5_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGSGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHHDIAPSWIYYFDYWGQGTLVTVSS 216
11-G5_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRARQSVPSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYSSPLTFGQGTKVEIK 217
11-G9_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIYAGGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLTRHYGYSFDHWGQGTLVTVSS 218
11-G9_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTFPLTFGQGTKVEIK 219
11-H8_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVASSAEYAFDHWGQGTLVTVSS 220
11-H8_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKSGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTVPLTFGQGTKVEIK 221
11-H11_VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISEGGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPPKYGAYSYYGYGFDPWGQGTLVTVSS 222
11-H11_VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSSSPTYTFGQGTKVEIK 223
表 7. 抗體之 CDR 序列 (Kabat)
名稱 CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO:
1-A1_VH SYAMS 224 AISAGGGYTYYADSVKG 248 YDYNSYFDS 341
1-A5_VH SYGMH 225 VISHSGSNKYYANSVKG 249 GLAGWEVYPFDV 342
1-H10_VH NYAMS 226 TISGGGTYYADSVKG 250 SRYWYTKLISYTYGMDV 343
2-B4_VH NYGMH 227 VISYHGRNEYYADSVKG 251 GDDQDAFDP 344
2-B5_VH DYDMH 228 VISHSGSNKYYADSVKG 252 DRSVYLYYGYHYYEGFDV 345
2-F7_VH DYAMS 229 SIYTSGGRTYYADSVKG 253 GYRYFDH 346
2-F8_VH NYAMS 226 TIYGRGERTYYADSVKG 254 VSVVWSYAFDY 347
2-G4_VH SSNYYWG 230 SVYYTGRTYYNPSLKS 255 VFPYGAVDV 348
2-H2_VH DYGMH 231 VISYEGSNEYYADSVKG 256 GSEGSGFDV 349
2-H9_VH TYAMS 232 SIYGSGGKTYYADSVKG 257 TDYSLYYQFDY 350
3-A7_VH NYGMH 227 VISFDGSNKYYANSVKG 258 GGDEDGFDV 351
3-A9_VH NYAMS 226 SITGSGEYTNYADSVKG 259 EVADYWDGGVYYYYDGGFDV 352
3-B3_VH SYAMS 224 TISGTGGRTYYADSVKG 260 VDHYSGYAFDL 353
3-C4_VH SYAMS 224 TIYGGGSYTYYADSVKG 261 AEVDDYWYLYMDV 354
3-C6_VH TYAMS 232 TIYGSGGRTYYADSVKG 262 TDHYSYYVMDY 355
3-C8_VH DYAMS 229 AIYGSGSYTYYADSVKG 263 TAYSYPYVYFDF 356
3-C9_VH NYAMS 226 VISGGGTNTYYADSVKG 264 SDSYYGVYDGYYYGMDV 357
3-C11_VH SYAMS 224 TIYASGATTYYADSVKG 265 LKLYHAAFDI 358
3-C12_VH DYAMS 229 TIYGSGSRTYYADSVKG 266 VDHVHGYAFDY 359
3-D3_VH NYAMS 226 TIYESGGYTYYADSVKG 267 VESYGYGEYITYNYYGFDV 360
3-D6_VH SYGIH 233 RIVPILGTTNYAQKFQG 268 DPAVTLDTYVYADHGFDV 361
3-D7_VH NYAMS 226 GISEGGANTYYADSVKG 269 EPPKYGAYSYYGYGFDP 362
3-D12_VH GYAMS 234 SISVSGAGTYYADSVKG 270 YVRGVSFDV 363
3-E2_VH NYAMS 226 AIGGSGGGTYYADSVKG 271 YGWEYQAFDY 364
3-E5_VH NYAMS 226 GITAGGGNTYYADSVKG 272 IAGLFDGFDV 365
3-E7_VH NYAMS 226 GISASGGGTYYADSVKG 273 SSRYGDTFDV 366
3-E8_VH DYAMS 229 GISVSGGYTYYADSVKG 274 GLYAHHTYYYGGFDY 367
3-E9_VH SYAMS 224 TIYGTGEDTYYADSVKG 275 DYFWSPRGSIYDYDYFDV 368
3-F5_VH GYAMS 234 SISVSGAGTYYADSVKG 270 YVRGVSFDV 363
3-F6_VH DYAMS 229 AISSSGGTTYYADSVKG 276 DAGWSYYGLWIYYYYMDV 369
3-F12_VH DYAMS 229 GISGSGGYTYYADSVKG 277 KLGGFDENYTYGMDV 370
3-G4_VH TYAMS 232 GISAGGGARTYYADSVKG 278 VHHFGYYSLDV 371
3-G5_VH SYAMS 224 VIYGSGGRTYYADSVKG 279 HDPRYQLDV 372
3-G6_VH DYGMH 231 VISYDGSRKYYANSVKG 280 GSYSDGFDV 373
3-G7_VH TEYIS 235 RIIPVLGITNYAQKFQG 281 HLGPPYLVTYSHGFDV 374
3-G8_VH NYAMS 226 AIYGSGGKTYYADSVKG 282 LKYGFYQFDY 375
3-H1_VH NYAMS 226 VIYAGGARTYYADSVKG 283 WGGDGFYAMDY 376
3-H4_VH NYAMS 226 AISGSGGTTYYADSVKG 284 IKKYGSAGYTVGFDS 377
4-A7_VH SSSYYWG 236 NIYYTGTTYYNPSLKS 285 IKVPWYYSSYYFDY 378
4-A8_VH NYAMS 226 AISASGGYTYYADSVKG 286 GRWGAFDY 379
4-B1_VH DYAMS 229 GISRGGARTYYADSVKG 287 YLFGHYMD 380
4-B2_VH RYAMH 237 VISHSGSTKYYANSVKG 288 SRGWRGFDS 381
4-B11_VH GYGMH 238 VISHHGSYKYYANSVKG 289 GGADVGYFYSTFYYYMDV 382
4-D12_VH NYAMS 226 AISRGGGYTYYADSVKG 290 WGGDGFYAMDY 376
4-F4_VH SRGYYWA 239 SIYYSGSTYYNPSLKS 291 LVSYGAYYVFDY 383
4-G12_VH SYAMS 224 AISGSGGSTYYADSVKG 292 DKRLTY 384
5-C9_VH SYAIN 240 RIIPLLETADYAQKFQG 293 EWPGEYFDV 385
5-E2_VH DYGMH 231 VISYHGRNEYYANSVKG 294 GAYGDDFDV 386
5-E12_VH NYAMS 226 TISGGGRTTNYADSVKG 295 STPIPSYYPYIYSYYFDV 387
6-G4_VH DYAMS 229 SISSSGANTYYADSGKG 296 SVVTWVTYAFDY 388
6-H5_VH NYAMS 226 AISATGGATYYADSVKG 297 SVRERYTYYMDY 389
8-A2_VH NYYIS 241 GIIPVFGVAHYAQKFQG 298 GYPGEYFDY 390
8-A4_VH SYAMS 224 SIYAGGGRTYYADSVKG 299 WGGDGFYAMDY 376
8-A6_VH DYAMS 229 TIYSGGVRTYYADSVKG 300 GLVSFRGYAFDY 391
8-A7_VH NYAMS 226 SISGGGINTYYADSVKG 301 VRSYSGPGYFDY 392
8-A8_VH NYAMS 226 VIYGSGARTYYADSVKG 302 ISPHYDFDV 393
8-A9_VH NYAMS 226 AISGGGSRTYYADSVKG 303 EARVLGYSLDY 394
8-C4_VH NYAMS 226 AIYGSGGRTYYADSVKG 304 LRYGFYQFDY 395
8-C6_VH DYAMS 229 TIYSSGHRTYYADSVKG 305 LYPLHSYAFDH 396
8-C9_VH SYAMS 224 LISSSGENTYYADSVKG 306 VRFGYGSWRYRKYMDV 397
8-C10_VH SYAMS 224 TISASGATYYADSVKG 307 GPYSYYYYSFDY 398
8-C11_VH SYAMS 224 TIYVGGHRTYYADSVKG 308 VGWSWGFDP 399
8-D11_VH NAWMS 242 RIKSITEGGTTDYAAPVKG 309 VWHTDDYYEGFDV 400
8-D4_VH SYAMS 224 TIYGSGARTYYADSVKG 310 WGGDGFYAMDY 376
8-D7_VH SYAMS 224 GISTSGGTTYYADSVKG 311 VVGRAVFDI 401
8-E2_VH DEAIH 243 RIIPVLGIASYAQKFQG 312 GLSRKAFYFDY 402
8-E3_VH NYAMS 226 TIYRGAGTYYADSVKG 313 DASWYGPFSYYYYYGFDV 403
8-E9_VH DYAMS 229 IITESGVNTYYADSVKG 314 HPSVGSASRSYYFDV 404
8-F1_VH DYAMS 229 GISGSGGVGTYYADSVKG 315 GEYGSSIAYSYYYGFDV 405
8-F2_VH NYAMS 226 AISGGGSRTYYADSVKG 303 EARVLGYSLDY 394
8-F4_VH GYAMS 234 AIRGGGGTYYADSVKG 316 VGPLRLYGFDY 406
8-F6_VH SYAMS 224 VISGSGGNTYYADSVKG 317 EVRHDSYYYYYYSGMDV 407
8-F11_VH NYAIN 244 RIIPTLGIANYAQKFQG 318 AAYFAGPAARYGYFDI 408
8-G12_VH GYAMS 234 SISVSGAGTYYADSVKG 270 YVRGVSFDV 363
8-H7_VH NYAMS 226 AIYGSGGRTYYADSVKG 304 LRYGFYQFDY 395
9-A6_VH DYAMS 229 TIYSGGVRTYYADSVKG 300 GLVSFRGYAFDY 391
9-B3_VH DYGMH 231 VISYDGSRKYYANSVKG 280 GSYSDGFDV 373
9-B10_VH SYAMS 224 GISESGGGTYYADSVKG 319 LVPWQLAFDV 409
9-C2_VH SYAMS 224 VISGSGGNTYYADSVKG 317 EVRHDSYYYYYYSGMDV 407
9-D8_VH SEAIS 245 RIIPISGRPNYAQKFQG 320 EASYYVAGYYRYYGFDV 410
9-E4_VH SYAMS 224 VISGSGGNTYYADSVKG 317 EVRHDSYYYYYYSGMDV 407
9-E5_VH NAWMS 242 RIKSKIEGGTTDYAPPVKG 321 DPTWYVSGHYYGFDV 411
9-G1_VH NYAMS 226 TISAGGSRTYYADSVKG 322 GWYPILYYAFDY 412
9-G3_VH SYAMS 224 TIYRSGGRTYYADSVKG 323 GAYPLGSYYGFDP 413
9-H9_VH NYAMS 226 TIYGSGVRTYYADGVKG 324 GWIPHSFYAFDY 414
2-C8_VH NYAMS 226 SISGSGISTYYADSVKG 325 GPGPGYWYAFDV 415
8-D9_VH DEAIH 243 RIIPVLGIASYAQKFQG 312 GLSRRAFYFDY 416
10-A9_VH NYAMS 226 SISGSGISTYYADSVKG 325 GPGPGYWYAFDV 415
10-B2_VH DYAMS 229 TIYSGGVRTYYADSVKG 300 GLVSFKGYAFDY 417
10-B5_VH SYAMS 224 AIYGAGGKTYYADSVKG 326 ISHGWGFDV 418
10-C1_VH NYAMS 226 VIYGSGTRTYYADSVKG 327 VASSYHYAFDY 419
10-C3_VH NYAMS 226 VIYGSGGRTYYADSVKG 279 VEDTSYYGMDY 420
10-C9_VH NYAMS 226 AIYGSGGRTYYADSVKG 304 LEAGFYSLDI 421
10-C11_VH SYAMS 224 VISSGGSYTYYADSVKG 328 VSGVVGALDI 422
10-D7_VH NYAMS 226 TIYSSGSRTYYADSVKG 329 WGGDGFYAMDY 376
10-E1_VH DYAMS 229 TIYSGGVRTYYADSVKG 300 GLVSFKGYAFDY 417
10-E6_VH SYAMS 224 AIYGSGGDTYYADSVKG 330 TEYDGYFDV 423
10-E7_VH DYAMS 229 VIYGSGGRTYYADSVKG 279 VEDSHYSFDV 424
10-F11_VH DYAMH 246 VISYDGNIEYYANSVKG 331 DRIGSSTYYGYYNGFDV 425
10-F12_VH NYAMS 226 AIKGSGGGTYYADSVKG 332 GGYLWLDP 426
10-G5_VH NYAMS 226 AISGSGTYTYYADSVKG 333 VRISGYGPGYFGGFDV 427
11-B6_VH RYAMS 247 IISGTGGNTYYADSVKG 334 IDTFAYYYSLYRAFDL 428
11-D8_VH DYAMS 229 SISEGGGSTYYADSVKG 335 TKRYFAGGSYYWMDV 429
11-D10_VH SYAMS 224 VISGGSGHTTYYADSVKG 336 HGGGRFAMDV 430
11-D11_VH TYAMS 232 SISGSGGKTYYADSVKG 337 DIYGITYDGYTYYDGMDV 431
11-G2_VH NYYIS 241 GIIPVFGVAHYAQKFQG 298 GYPGEYFDY 390
11-G5_VH NYAMS 226 TISGSGANTYYADSVKG 338 HHDIAPSWIYYFDY 432
11-G9_VH DYAMS 229 TIYAGGGRTYYADSVKG 339 GLTRHYGYSFDH 433
11-H8_VH NYAMS 226 SIYGSGHRTYYADSVKG 340 VASSAEYAFDH 434
11-H11_VH NYAMS 226 GISEGGANTYYADSVKG 269 EPPKYGAYSYYGYGFDP 362
名稱 CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO:
1-A1_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 GNNNRPS 497 QSYDRSLSGWV 517
1-A5_VL TGSSSNIGAGFDVH 436 DNTNRPS 498 QSYDYSLRVWV 518
1-H10_VL TGSSSNIGATYDVH 437 VNNNRPS 499 QSYDSSLRAWV 519
2-B4_VL RASQSISNYLN 438 AASSLQS 500 QQSFSAPYT 520
2-B5_VL RASQSVYNNLA 439 GASTRAT 501 QQYNDLPLT 521
2-F7_VL RASQSVRNNLA 440 GASTRAT 501 QQYYTWPRT 522
2-F8_VL RASQDISTYLN 441 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
2-G4_VL RASQSVSGSYLA 442 GASSRAT 502 QQYGGSLPYT 524
2-H2_VL RASQRISNYLN 443 AASSLQS 500 QQSYSPPYT 525
2-H9_VL RASQSISRYLN 444 AASSLQS 500 QQSYSYPVT 526
3-A7_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYRPPYT 527
3-A9_VL RASQSVSSNYLA 446 GASSRAT 502 QQYGRSAPIT 528
3-B3_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
3-C4_VL RASQDIGNYLN 447 AASSLQS 500 QQSYTFPLT 529
3-C6_VL RASQSISKYLN 448 SASSLQS 503 QQSYSFPLT 530
3-C8_VL RASQTITSYLN 449 AASSLQS 500 QQSYTYPLT 531
3-C9_VL RASQTISRYLN 450 AASSLQS 500 QQTYSTPWT 532
3-C11_VL RASQDISSYLN 451 TASSLQS 504 QQSYSYPLT 523
3-C12_VL RASQSISKYLN 448 AASSLQS 500 QQSYSFPPT 533
3-D3_VL RASQSVATGYLA 452 GASSRAT 502 QQYESSPPFT 534
3-D6_VL RASQSVYNNLA 439 GASTRAT 501 QQYNDWPLT 535
3-D7_VL RASQSVGSNYLA 453 GASSRAT 502 QQYGSSPYT 536
3-D12_VL RASQSVSSSYLA 454 GASSRAT 502 QQYETSPPVT 537
3-E2_VL RASQSISRYLN 444 AASSLQS 500 QQSYSTPWT 538
3-E5_VL RASQSVRSSYLA 455 GASSRAT 502 QQYASLPLT 539
3-E7_VL RASLSVGSNLA 456 GASTRAT 501 QQYNNLPLT 540
3-E8_VL RASQSVGSNLA 457 GASTRAT 501 QQYHNWPPT 541
3-E9_VL RASQSISRYLN 444 SASSLQS 503 QQYFSAPYT 542
3-F5_VL RASQSVSSNYLA 446 GASSRAT 502 QQYGSSPAVT 543
3-F6_VL RASQSVRSNYLA 458 GASSRAT 502 QQYGASPQT 544
3-F12_VL RASQSVSSSYLA 454 GASSRAT 502 QQYGSSPEYT 545
3-G4_VL RASQTISNYLN 459 AASSLQS 500 QQSYTYPLT 531
3-G5_VL RASQSIGSYLN 460 TASSLQS 504 QQSYTYPLT 531
3-G6_VL RASQSISRYLN 444 GASSLQS 505 QQSYSTPYT 546
3-G7_VL RASQSLGTNLA 461 GASTRAT 501 QQYYEAPPT 547
3-G8_VL RASQSIRNYLN 462 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
3-H1_VL RASQTISTYLN 463 AASILQS 506 QQSYTVPLT 548
3-H4_VL RASQSVGSYLA 464 GASTRAT 501 QQYYNAPIT 549
4-A7_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 GNKNRPS 507 QSYDTSLSAWV 550
4-A8_VL TGSSSNIGSGYDVH 465 GNRNRPS 508 QSYDSSLKTWV 551
4-B1_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 GNTNRPS 509 QSYDGRLGVSV 552
4-B2_VL TGSSSNIGAYVVH 466 GNTNRPS 509 QSYDRTLSSYV 553
4-B11_VL TGSSSNIGAAFDVH 467 DNYNRPS 510 QSYDSSLSVWV 554
4-D12_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 ANNNRPS 511 QSYDYSLSGWV 555
4-F4_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 GNRNRPS 508 QSYDTRLSAWV 556
4-G12_VL SGSSSNIGNNYVS 468 DNNKRPS 512 GTWDSSLSARV 557
5-C9_VL RASQSVASSYLA 469 GASSRAT 502 QQYGSSQLT 558
5-E2_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYSAPYT 559
5-E12_VL RASQSVSNNLA 470 GASTRAT 501 QQYGNYPPT 560
6-G4_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 DNTNRPS 498 QSYDSGLSGWV 561
6-H5_VL TGSSSNIGAGYDVH 435 DNTNRPS 498 QSYDVSLGVWV 562
8-A2_VL RASQSVSSSYLA 454 AASSRAT 513 QHYGGSPGYT 563
8-A4_VL RASQTISNYLN 459 GASSLQS 505 QQSFTFPLT 564
8-A6_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYTIPPT 565
8-A7_VL RASRSVSSNLA 471 GASTRAT 501 QQYYNWPLT 566
8-A8_VL RASQTISKYLN 472 AASSLQS 500 QQSYSYPIT 567
8-A9_VL RASQRIGKYLN 473 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
8-C4_VL RASQSIRNYLN 462 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
8-C6_VL RASQSISRYLN 444 AASSLQS 500 QQSYSVPLT 568
8-C9_VL RASQSIATYLN 474 GASSLQS 505 QQSYSTPLT 569
8-C10_VL RASQTISTYLN 463 AASSLQS 500 QQSYRYPLT 570
8-C11_VL RASQTISKYLN 472 SASSLQS 503 QQSYTYPLT 531
8-D11_VL RASQSVSGSYLA 442 DASSRAT 514 QQYGTTPQT 571
8-D4_VL RASQSIYTYLN 475 AASSLQS 500 QQSYSFPLT 530
8-D7_VL RASQSVSSTYLA 476 AASSRAT 513 QQYAALPIT 572
8-E2_VL RASQTIGNYLN 477 VASSLQS 515 QQSYRYPYT 573
8-E3_VL RASQSVYTNLA 478 DASTRAT 516 QQYNDWPLT 535
8-E9_VL RASQSVGSSYLA 479 AASSRAT 513 QQYYSAPLT 574
8-F1_VL RASQSVYNNLA 439 DASTRAT 516 QQYNDWPYT 575
8-F2_VL RASQRIGKYLN 473 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
8-F4_VL RASQSISNYLN 438 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
8-F6_VL RASQSVYNNLA 439 DASTRAT 516 QQYSDYPFT 576
8-F11_VL RASQSVRSNYLA 458 DASSRAT 514 QQYAYAPWT 577
8-G12_VL RASQSVSSNYLA 446 GASSRAT 502 QQYGSSPAVT 543
8-H7_VL RASQSIRNYLN 462 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
9-A6_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYTIPPT 565
9-B3_VL RASQSISNYLN 438 AASSLQS 500 QQSYAPPYT 578
9-B10_VL RASQSVYNNLA 439 DASTRAT 516 QQYYYWPIT 579
9-C2_VL RASQSVYNNLA 439 DASTRAT 516 QQYSDYPFT 576
9-D8_VL RASRSLSNNLA 480 DASTRAT 516 QQYNAWPYT 580
9-E4_VL RASQSVYNNLA 439 DASTRAT 516 QQYSDYPFT 576
9-E5_VL RASQSIANYLN 481 AASSLQS 500 QQYFSTPPT 581
9-G1_VL RASQSIGNYLN 482 SASSLQS 503 QQTYTIPLT 582
9-G3_VL RASQSIATYLN 474 AASSLQS 500 QQSYTYPVT 583
9-H9_VL RASQSISSYLN 445 GASSLQS 505 QQSFTAPVT 584
2-C8_VL RASQTISRYLN 450 AASSLQS 500 QQSYTYPIT 585
8-D9_VL RASQTIGNYLN 477 VASSLQS 515 QQSYRYPYT 573
10-A9_VL RASQTISRYLN 450 SASSLQS 503 QQSYTYPIT 585
10-B2_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYTIPPT 565
10-B5_VL RASQDISNYLN 483 AASSLQS 500 QQSYTYPLT 531
10-C1_VL RASQSISTYLN 484 AASSLQS 500 QQSYTFPLT 529
10-C3_VL RASQTIGIYLN 485 AASSLQS 500 QQSYTYPLT 531
10-C9_VL RASQTIGTYLN 486 AASSLQS 500 QQSYSYPLT 523
10-C11_VL RASQSVSNNLA 470 GASTRAT 501 QQYNNWPYT 586
10-D7_VL RASQSISTYLN 484 AASSLQS 500 QQSYTVPLT 548
10-E1_VL RASQSISSYLN 445 AASSLQS 500 QQSYTIPPT 565
10-E6_VL RASQDIYNYLN 487 GASSLQS 505 QQSDGFPPT 587
10-E7_VL RASQSISNYLN 438 AASSLQS 500 QQSYTVPWT 588
10-F11_VL RASQSVSSNLA 488 GASTRAT 501 QQYNDYPLT 589
10-F12_VL RASQSISSNLA 489 DASTRAT 516 QQYYNWPLT 566
10-G5_VL RASQSVYSNLA 490 GASTRAT 501 QQYSNWPLT 590
11-B6_VL RASQSVGGNLA 491 DASTRAT 516 QQYNDWPLT 535
11-D8_VL RASQRISSYLN 492 AASSLQS 500 QQSYSYPIT 567
11-D10_VL RASQSVASPYLA 493 GASSRAT 502 QQYYESPIT 591
11-D11_VL RASQSIYNYLN 494 AASSLQS 500 QQSDSPPWT 592
11-G2_VL RASQSVSSSYLA 454 AASSRAT 513 QHYGGSPGYT 563
11-G5_VL RARQSVPSNYLA 495 GASSRAT 502 QQYYSSPLT 593
11-G9_VL RASQTISSYLN 496 SASSLQS 503 QQSYTFPLT 529
11-H8_VL RASQSISNYLN 438 AASSLQS 500 QQSYTVPLT 548
11-H11_VL RASQSVSSSYLA 454 GASSRAT 502 QQYSSSPTYT 594
實例5. 在存在結合化合物之情況下，抗體優先結合於PLXDC1
此實例展示本發明之化合物結合於PLXDC之細胞外域。此外，由小分子化合物進行之此類結合充當用於評估及篩選活化PLXDC蛋白質以殺傷腫瘤內皮細胞之抗體之有效及特異性方式。
化合物346 (表3)與PLXDC1之細胞外域(PLXDC1-ECD)之間的高親和力相互相用。化合物346以劑量依賴性方式抑制PLXDC1-ECD之內源性色胺酸螢光(圖15A-B)。圖15A呈現在添加不同濃度之化合物之後，PLXDC1-ECD之色胺酸螢光之原始資料，如在螢光計中量測，且圖15B展示色胺酸螢光之抑制之劑量依賴性曲線。將在未添加化合物之情況下的色胺酸螢光定義為1。所估計的Kd值為50 nM。
亦測試抗體(3-G7及8-C9)與表現於活細胞上之PLXDC之結合。在N端上用抗原決定基標籤標記人類PLXDC1及PLXDC2蛋白質。針對抗原決定基標籤之抗體之結合表明人類PLXDC1 (圖16A，左圖)及人類PLXDC2 (圖16A，中間圖)在其經轉染之細胞中之表現，而其不結合於未經轉染之細胞(圖16A，右圖)。
抗體3-G7與經人類PLXDC1轉染之細胞之結合展示於圖16A-B，左圖中。此抗體不結合於人類PLXDC2 (中間圖)或未經轉染之對照性細胞(右圖)。類似地，圖16D-E展示抗體8-C9與經人類PLXDC1轉染之細胞之結合(左圖)且此抗體不結合於人類PLXDC2 (中間圖)或未經轉染之對照性細胞(右圖)。
為了證實活化抗體在其活化狀態下優先結合於PLXDC1蛋白質，藉由將經純化之PLXDC1-ECD蛋白質塗佈於孔上且添加抗體之連續稀釋物來量測結合。向樣品中添加化合物346 (表3)。如圖17A中所示，抗體3-G7在存在化合物346之情況下以高親合力(9.6 nM)結合於PLXDC1-ECD。當添加化合物346時，親合力增加至1.5 nM。類似地，如圖17B中所示，抗體8-C9在不存在化合物346之情況下以高親合力(1.9 nM)結合於PLXDC1-ECD，當添加化合物時，親合力增加至0.9 nM。
因此，此實例驗證使用化合物活化之PLXDC蛋白質之抗體篩選方法。 實例6. 藉由PLXDC活化化合物及抗體殺傷腫瘤內皮細胞
此實例研究化合物及抗體用於殺傷腫瘤內皮細胞之機制且證明其殺傷活性。
借助於由PLXDC1活化化合物殺傷之表現PLXDC1之內皮細胞之RNAseq分析，此例示在PLXDC1介導之細胞殺傷期間特異性誘導之稱為Gfi1b之轉錄因子。藉由將其啟動子連接至螢光素酶報導基因，此實例研發PLXDC1受體活化分析法。PLXDC1活化化合物346及342 (表3，分別標記為A-化合物-1及A-化合物-2)高度活化PLXDC1表現細胞中之啟動子活性，但不活化不具有PLXDC1之細胞中之啟動子活性(圖18A)。類似地，此等化合物活化PLXDC2表現細胞中之啟動子活性，不活化不具有PLXDC2之細胞中之啟動子活性(圖18B)。
因此，圖18展示化合物活化PLXDC1及PLXDC2且與PLXDC2相比，其優先活化PLXDC1。一種化合物，A-Com-2，明顯區分兩種受體。作為對照物，氟尿嘧啶，一種藉由細胞凋亡來殺傷分裂細胞之化學治療劑，不活化此啟動子。此資料表明由PLXDC1活化介導之細胞死亡與化學治療劑引發之細胞凋亡不同。
由抗體進行之PLXDC1之活化說明於圖19中。如所展示，PLXDC1活化抗體3-G7及8-C9 (分別標記為A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2)活化PLXDC1表現細胞中之啟動子活性，但不活化不具有PLXDC1之細胞中之啟動子活性。
在圖20中觀測由化合物進行之表現人類PLXDC1之內皮細胞之殺傷。上面三張圖表示對照細胞且下面三張圖表示經化合物處理之細胞，展示光學顯微圖(圖20A，左側)、活細胞(中間)及死細胞染色(右側)。活細胞使用二乙酸螢光素(綠色信號)染色且死細胞使用碘化丙錠(紅色信號)染色。由化合物及抗體(抗體3-G7及8-C9，分別標記為A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2)進行之表現人類PLXDC1之內皮細胞之殺傷之定量展示於圖20B中。化合物及抗體之培育時間為24小時。
亦離體測試人類腫瘤內皮細胞之殺傷。藉由實例1中說明之腫瘤血管生成之離體模型，在腫瘤內皮細胞自腫瘤長出之後添加抗體(圖21，在中間標記)。圖片表示在抗體添加之後第一天且右圖表示在抗體添加之後第8天。人類肺腫瘤內皮細胞與對照性IgG (500 nM)一起培育不會引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(圖21，綠色信號)。人類肺腫瘤內皮細胞與PLXDC1活化IgG 3-G7/A-TEM7-Ab-1 (500 nM)一起培育可引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(圖21B，綠色信號)，如藉由比較第1天與第8天之腫瘤內皮細胞信號可顯而易見。人類肺腫瘤內皮細胞與PLXDC1活化IgG 8-C9/A-TEM7-Ab-2 (500 nM)一起培育亦可引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(綠色信號)，如藉由比較第1天與第8天之腫瘤內皮細胞信號可顯而易見。 實例7. 局部缺血誘導之視網膜病變/腫瘤中之病原性血管之特異性殺傷
此實例檢驗在不同疾病中，PLXDC蛋白質在病原性血管及正常健康血管上之表現，且證實本發明之化合物及抗體特異性殺傷病原性血管。
檢驗局部缺血誘導之視網膜病變之病原性血管中的PLXDC1之表現且展示於圖1中，其證實PLXDC1不在健康血管中表現。接著，證明化合物(例如化合物346)在局部缺血誘導之視網膜病變中活體內特異性抑制病原性血管而不影響健康血管(圖22)。圖22A包括用於局部缺血誘導之視網膜病變之實驗設計之示意圖。高氧環境引起血管損失(血管堵塞)。在室內空氣中，血管損失引起異常血管生成，其在視網膜頂部產生病原性血管(在圖22D中以黃色標記)。藉由皮下注射在恢復至室內空氣期間施用治療。圖22A中之下圖展示對照物(n=10)與經治療之視網膜(n=10)之間的健康血管、血管堵塞及病原性血管之定量。
由PLXDC1活化化合物(化合物346/A-化合物-1)進行之治療顯著抑制病原性血管(兩個星號)，同時改良健康血管(一個星號)之量。圖22B包括平坦安裝之對照性視網膜(上面兩個影像)及來自經化合物治療之小鼠之視網膜(下面兩個影像)之代表性影像。B中之具有血管堵塞區域之相同視網膜以白色標記(圖22C)。此等影像說明經化合物治療之視網膜經歷與對照性視網膜類似的血管堵塞。B中之具有病原性血管之相同視網膜以黃色標記(圖22D)。此等影像說明與對照性視網膜相比，經化合物治療之視網膜具有顯著減少之病原性血管。
藉由活體內腫瘤樣品進一步證明殺傷活性。在腫瘤動物模型中，在第0天藉由靜脈內推注化合物346來進行治療。圖23A用圖表示對照組中之小鼠之腫瘤生長曲線之原始資料。圖23B呈現治療組中之小鼠之腫瘤生長曲線之原始資料。圖23C比較對照組及治療組之組合生長資料。與對照組不同，化合物346使腫瘤顯著縮小。
檢驗由PLXDC1活化化合物進行之治療引起的活動物中之腫瘤形態變化。圖25中描述之實驗中的完整動物之圖展示在第1天及第3天之腫瘤形態及顏色變化(圖24)。由於腫瘤血管之破壞及腫瘤中血液之積聚，治療組中之腫瘤之顏色在第1天變得更深。治療組中之腫瘤之顏色在第3天開始變得更黃，符合由缺乏腫瘤血管而引起發生腫瘤壞死。
圖25呈現完整動物之圖片，其展示在第7天之腫瘤形態及顏色變化。對照組中之腫瘤生長至大型尺寸，但治療組中之腫瘤之尺寸顯著縮小且顏色變成黃色。
圖26展示由化合物進行之治療引起的經解剖之腫瘤之形態變化。經解剖之腫瘤之圖展示在第7天之腫瘤形態及顏色變化。儘管對照組中之腫瘤之顏色為淡紅色，但治療組中之腫瘤之尺寸顯著縮小且顏色變成黃色，符合腫瘤血管不足及腫瘤壞死。因此，此等資料說明PLXDC1活化化合物可活體內殺傷腫瘤血管，以引起明顯的腫瘤壞死及縮小。 實例8. 活化抗體以與PEDF不同之方式與PLXDC1相互作用
此實例展示PLXDC1活化抗體3-G7及8-C9 (分別標記為A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2)不需要結合於PLXDC1之域B，而PEDF結合於該域B。
實例1已表明，即使在域B缺失時，抗體AA02、AA03及AA94仍與PLXDC1相互作用(圖11)。本文中進一步表明，抗體A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2亦不經由域B結合於PLXDC1 (圖27A-B)。此與依賴於域B來結合於PLXDC1之PEDF明顯不同。本發明之小分子及抗體不依賴於域B來結合於PLXDC1之事實可區分區分此等新穎配位體與PEDF，且符合PEDF不能發揮的此等新的配位體之不同活性(腫瘤內皮細胞之殺傷)。 *  *  *
本文中所揭示及主張之所有方法可在無根據本發明之不當的實驗的情況下進行及執行。儘管已根據較佳實施例描述了本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應顯而易見的是，變化可在不偏離本發明之概念、精神及範疇的情況下應用於本文中所描述之方法以及方法之步驟或步驟順序中。更特定言之，顯而易知在化學上及生理學上相關之某些藥劑可取代本文中所描述之藥劑，同時獲得相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易知的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定的本發明之精神、範疇及概念內。 參考文獻
以下參考文獻特定地以引用的方式併入本文中，以致其對本文所闡述之彼等提供例示性程序或其他細節補充。
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以下圖式形成本說明書之一部分且包括在本說明書內以進一步說明本發明之某些態樣。藉由參考此等圖式中之一或多者與本文中呈現之特定實施例之詳細描述之組合可更好地理解本發明。
圖1A-H. 脈絡膜新生血管(CNV)及局部缺血誘導之視網膜病中之PLXDC1在病原性血管中之表現。紅色通道展示血管標記物Griffonia Simplicifolia Lectin I-同工凝集素B4。綠色通道展示抗PLXDC1信號。A-D. CNV (雷射誘導之CNV)之小鼠模型中，病原性血管中之高度富集的PLXDC1表現。A及B，視網膜部分。箭頭指示對PLXDC1信號(在B中)呈陰性之正常內部視網膜血管(在A中)之實例。C及D，在平坦安裝之眼杯上進行染色。E-H. 局部缺血誘導之視網膜病之小鼠模型中，PLXDC1在病原性血管中之大量表現，但在健康視網膜之血管中並非如此。E及F. 局部缺血誘導之視網膜病之P17視網膜(E及F分別為由內皮細胞標記物及PLXDC1抗體染色之相同部分)。表現PLXDC1之病原性血管之實例由白色箭頭指示。G及H. P17健康視網膜(G及H分別為由內皮細胞標記物及PLXDC1抗體染色之相同部分)。展示不可偵測之PLXDC1表現的健康血管之實例由G中之白色箭頭指示(H中不存在相應的PLXDC1信號)。CH，脈絡膜。ON，外核層。IN，內核層。GC，神經節細胞層。
圖2A-E. 脈絡膜血管生成之離體模型中化合物369 (表3)與當前抗血管生成藥物之比較。A. 實驗之時間框之示意圖。在脈絡膜血管生成發生7天後開始治療。治療持續至細胞死亡之前兩天且分析存活率。B. 在第7天進行不使用任何藥物治療之對照實驗。中間的白色環描繪經包埋以起始新生血管之脈絡膜/RPE之片狀物。C. 脈絡膜新生血管之最常用藥物(艾力雅(Eylea))可抑制脈絡膜內皮細胞生長(如關於抗血管生成藥物所預期)。以10 μM添加艾力雅。D. 靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物369可殺傷脈絡膜血管生成中之新的內皮細胞。脈絡膜及RPE在治療之後仍存活，表明治療之高特異性。以10 μM添加化合物。在B-D中，綠色細胞為活細胞且紅色細胞為死細胞。E. 實驗之定量描述於B-D中。未經處理之對照物中之新的內皮細胞之量定義為100%。
圖3A-B. 藉由常用的抗VEGF藥物(艾力雅)治療之AMD患者中之脈絡膜新生血管。在2015年與2018之間的24次注射之後，病原性血管仍略微生長且未被治療殺傷。展示2015年(A)及2018年(B)時病原性血管之底部圖片。
圖4A-F. 腫瘤血管生成之離體模型中抗VEGF藥物PEDF與兩種靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物之間的比較。PEDF可抑制腫瘤內皮細胞生長(如關於抗血管生成因子所預期)，但兩種靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物可殺傷腫瘤內皮細胞。由於培養基中存在其他血管生成因子，諸如bFGF及EGF，因此抗VEGF藥物(VEGF捕獲劑)在此實驗中並非十分有效。使腫瘤內皮細胞生長5天，接著歷時2天添加測試試劑。綠色細胞為活細胞且紅色細胞為死細胞。
圖5A-C. 藉由針對人類PLXDC1之抗體殺傷人類腫瘤內皮細胞。在人類腫瘤內皮細胞之3D離體模型中，抗人類PLXDC1單株抗體純系AA03及AA94殺傷人類腫瘤內皮細胞。腫瘤係來自人類結腸癌。綠色細胞表示活細胞。紅色細胞表示死細胞。
圖6A-B. 藉由針對人類PLXDC1之抗體殺傷人類腫瘤內皮細胞。在人類腫瘤內皮細胞之3D離體模型中，抗人類PLXDC1單株抗體純系AA02 (但其為對照抗體)殺傷人類腫瘤內皮細胞。腫瘤係來自人類肝癌。綠色細胞表示活細胞。紅色細胞表示死細胞。
圖7A-D. 靶向PLXDC1及PLXDC2之化合物之全身性投藥殺傷現有腫瘤血管且引起大規模腫瘤壞死。A. 接受全身性媒劑治療之對照小鼠具有活腫瘤，其展示淡紅色外觀，指示豐富的血液供應。B. 接受由靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物369進行的全身性治療之小鼠具有死腫瘤，其展示淺黃色外觀，指示無血液供應之死組織。治療之高特異性由覆蓋死的黃色腫瘤之健康皮膚血管說明。C. 將A中之來自對照小鼠之腫瘤切開以展示其富含腫瘤血管且為活腫瘤。D. 將B中之來自經化合物治療之小鼠之腫瘤切開以展示不具有腫瘤血管及具有黃色乳酪狀外觀之壞死腫瘤(凝固性壞死)。凝固性壞死恰好為所期待的治療結果，其可殺傷現有腫瘤血管以阻斷對腫瘤之主要血液供應。用於藉由壞死來引起大規模腫瘤死亡的腫瘤血管之精確及有效殺傷不能由任何現有藥物或已知的抗血管生成因子實現，但其可由靶向PLXDC1/PLXDC2之化合物369實現。
圖8A-C. 抗血管生成治療與藉由靶向PLXDC1/PLXDC2來殺傷現有腫瘤血管之間的比較。血管生成為自現有血管生長新的血管。A. 腫瘤依賴於血管生成來生長及轉移。B. 抗血管生成藥物或因子抑制血管生成及腫瘤生長，但不能殺傷腫瘤，因為其不能有效地殺傷現有腫瘤血管。C. 靶向PLXDC1/PLXDC2之藥物可殺傷現有腫瘤血管，以引起腫瘤死亡。此治療作用超越抗血管生成，抗血管生成意謂抑制新血管生長。
圖9A-C. 用於偵測化合物369與PLXDC1之結合的實驗策略之示意圖。A. 化合物結構之示意圖。化合物經設計以具有白蛋白結合結構及負責PLXDC1相互相用之結構。B. 化合物與生物素化人類白蛋白之結合(生物素-HSA-化合物)之示意圖。C. 用於偵測生物素-HSA-化合物與PLXDC1之細胞外域之結合的策略之示意圖。在結合之後，藉由抗生素蛋白-鹼性磷酸酶來偵測複合物中之生物素。
圖10A-D. 殺傷表現PLXDC1之內皮細胞之化合物與PLXDC1相互作用而與域B無關。左圖. PLXDC1中之各域(細胞外側上之域A至E、跨膜域及細胞內域)及此實驗中使用之構築體之示意圖。人類PLXDC1之各域定義為：域A (20至127)、域B (128至242)、域C (243至292)、域D (293至359)及域E (360-427)。殘基係根據全長PLXDC1在無分泌信號之情況下編號。此實驗中之所有構築體包括N端處之抗原決定基標籤(標記為「R」)。R-PLXDC1=全長人類PLXDC1；R-AB-Del=域A-B缺失型人類PLXDC1。A-D. 生物素化HSA (生物素-HSA)或生物素化HAS-化合物複合物(生物素-HSA-化合物)與經構築體轉染之HEK293細胞之結合。紫色表示結合信號。A=全長人類PLXDC1轉染細胞；B=對照性未經轉染之細胞；C=全長人類PLXDC1轉染細胞；D=域A-B缺失型人類PLXDC1轉染細胞。向B-D中添加生物素-HSA-化合物，而向A中添加生物素-HSA。
圖11A-B. 殺傷表現PLXDC1之內皮細胞之單株抗體與PLXDC1相互作用而與域B無關。A. PLXDC1中之各域(細胞外側上之域A至E、跨膜域及細胞內域)及此實驗中使用之構築體之示意圖。人類PLXDC1之各域定義為：域A (20至127)、域B (128至242)、域C (243至292)、域D (293至359)及域E (360-427)。殘基係根據全長PLXDC1在無分泌信號之情況下編號。此實驗中之所有構築體包括N端處之抗原決定基標籤(標記為「R」)。R-PLXDC1=全長人類PLXDC1；R-AB-Del=域A-B缺失型人類PLXDC1；R-PLXDC2=全長人類PLXDC2。B. 使用不同抗體之經構築體轉染的HEK293細胞之活細胞染色。紅色信號為免疫染色信號。藍色信號為指示細胞核之DNA染料。R抗體識別所有構築體上之R抗原決定基。單株抗體AA02及AA03能夠殺傷表現PLXDC1之內皮細胞。其識別除人類PLXDC2以外的所有構築體，表明其結合於PLXDC1而與域B無關。
圖12展示單株抗體活化PLXDC1。受體誘導之NF-κB活化之分析法。添加抗人類PLXDC1單株抗體Ab-AA02、Ab-AA03及Ab-AA94可刺激PLXDC1誘導之NF-κB活化。Ab-AA02及Ab-AA03識別PLXDC1之域E。PLXDC1表現細胞中之基礎NF-κB活化定義為1。
圖13說明稍微不同的殺傷腫瘤之策略。
圖14A-B展示在用本文中所描述之化合物治療後的腫瘤縮小及壞死。圖14A展示在注射之後3天，所有腫瘤皆縮小。圖14B展示在注射之後6天，腫瘤縮小仍保持。
圖15A-B展示PLXDC1活化化合物與PLXDC1之細胞外域(PLXDC1-ECD)之間的高親和力相互相用。A. 在添加不同濃度之化合物之後的PLXDC1-ECD之色胺酸螢光之原始資料，如在螢光計中量測。B. 色胺酸螢光之抑制之劑量依賴性曲線。將在未添加化合物之情況下的色胺酸螢光定義為1。所估計的Kd值為50 nM。
圖16A-E展示PLXDC1活化抗體與活細胞上表現之人類PLXDC1之特異性結合。A. 針對抗原決定基標籤之抗體之結合表明人類PLXDC1 (左圖)及人類PLXDC2 (中間圖)在其經轉染之細胞中之表現，而其不結合於未經轉染之細胞(右圖)。綠色信號為抗體結合信號。B及C. 受體活化抗體(3-G7/A-TEM7-Ab-1)與經人類PLXDC1轉染之細胞(左圖)之結合。此抗體不結合於人類PLXDC2 (中間圖)或未經轉染之對照細胞(右圖)。B及C中之綠色信號為抗體結合信號。C中之藍色信號表示由DNA染料DAPI染色之細胞核。D及E. 受體活化抗體(8-C9/A-TEM7-Ab-2)與經人類PLXDC1轉染之細胞(左圖)之結合。此抗體不結合於人類PLXDC2 (中間圖)或未經轉染之對照細胞(右圖)。D及E中之綠色信號為抗體結合信號。E中之藍色信號表示由DNA染料DAPI染色之細胞核。
圖17A-B展示PLXDC1受體活化抗體與PLXDC1細胞外域(PLXDC1-ECD)之結合親合力。A. PLXDC1受體活化抗體3-G7 (A-TEM7-Ab-1)以高親合力(9.6 nM)結合於PLXDC1-ECD。在存在可活化PLXDC1之小分子(化合物)之情況下，親合力增加至1.5 nM。B. PLXDC1受體活化抗體3-G7 (A-TEM7-Ab-1)以高親合力(1.9 nM)結合於PLXDC1-ECD。在存在可活化PLXDC1之小分子(化合物)之情況下，親合力增加至0.9 nM。
圖18A-B展示由小分子進行之PLXDC1及PLXDC2之活化。借助於由PLXDC1活化化合物殺傷之表現PLXDC1的內皮細胞之RNAseq分析，發現在PLXDC1介導之細胞殺傷期間誘導稱為Gfi1b之轉錄因子。藉由將其啟動子連接至螢光素酶報導基因，此實例研發一種PLXDC1受體活化分析法，其說明受體由其配位體進行之活化。A. PLXDC1活化化合物(A-Com-1及A-Com-2)高度活化PLXDC1表現細胞中之啟動子活性。B. A-Com-1及A-Com-2亦活化PLXDC2表現細胞中之啟動子活性。然而，與PLXDC2相比，兩種化合物皆優先活化PLXDC1。A-Com-2更強地區分兩種受體。所有化合物治療進行1天。將PLXDC1表現細胞之基礎啟動子活性定義為1。氟尿嘧啶(Fluorouracil；FU)，一種藉由細胞凋亡來殺傷分裂細胞之化學療法藥物，不活化此啟動子。
圖19展示由抗體進行之PLXDC1之活化。PLXDC1活化抗體(A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2)活化PLXDC1細胞中之啟動子活性，但在不含PLXDC1之細胞中不進行此活化。將PLXDC1表現細胞之基礎啟動子活性定義為1。PLXDC1表現細胞(對照物)之基礎活性高於不含PLXDC1之細胞，由不具有配位體之受體之異位表現進行之恆定啟動子活化。
圖20A-B展示由PLXDC1活化小分子及抗體進行之表現PLXDC1之內皮細胞之殺傷。A. 由PLXDC1活化小分子(化合物)進行之殺傷表現人類PLXDC1之內皮細胞之觀測。上面三張圖表示對照細胞且下面三張圖表示經化合物處理之細胞，展示光學顯微圖(左側)、活細胞(中間)及死細胞染色(右側)。活細胞使用二乙酸螢光素染色(綠色信號)且死細胞使用碘化丙錠染色(紅色信號)。B. 由PLXDC1活化小分子(A-化合物-1及A-化合物-2)及抗體(A-TEM7-Ab-1及A-TEM7-Ab-2)進行之表現人類PLXDC1之內皮細胞之殺傷之定量。化合物及抗體之培育時間為24小時。將對照細胞之細胞存活率定義為100%。
圖21A-C展示由針對PLXDC1之受體活化抗體進行之表現人類PLXDC1之人類腫瘤內皮細胞之殺傷。圖表示在IgG添加之後第一天且右圖表示在IgG添加之後第8天。A. 人類肺腫瘤內皮細胞與對照性IgG (500 nM)一起培育不會引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(綠色信號)。B. 人類肺腫瘤內皮細胞與PLXDC1活化IgG A-TEM7-Ab-1 (500 nM)一起培育可引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(綠色信號)，如藉由比較第1天與第8天之腫瘤內皮細胞信號可顯而易見。C. 人類肺腫瘤內皮細胞與單獨的PLXDC1活化IgG A-TEM7-Ab-2 (500 nM)一起培育亦可引起表現PLXDC1之腫瘤內皮細胞之死亡(綠色信號)，如藉由比較第1天與第8天之腫瘤內皮細胞信號可顯而易見。
圖22A-D展示在局部缺血誘導之視網膜病中，PLXDC1活化化合物活體內特異性抑制病原性血管而不會影響健康血管。A. 上圖：用於局部缺血誘導之視網膜病之實驗設計之示意圖。高氧環境引起血管損失(血管堵塞)。在室內空氣中，血管損失引起異常血管生成，其在視網膜頂部產生病原性血管(D中以黃色標記)。藉由皮下注射在恢復至室內空氣期間施用治療。下圖：對照物(n=10)與經治療之視網膜(n=10)之間的健康血管、血管堵塞及病原性血管之定量。由PLXDC1活化化合物(A-化合物-1)進行之治療顯著抑制病原性血管(兩個星號)，同時改良健康血管(一個星號)之量。B. 平坦安裝之對照性視網膜(上面兩個影像)及來自經化合物治療之小鼠之視網膜(下面兩個影像)之代表性影像。紅色信號為血管標記物。C. B中之具有血管堵塞區域之相同視網膜以白色標記。此等影像說明經化合物治療之視網膜經歷與對照性視網膜類似的血管堵塞。D. B中之具有病原性血管之相同視網膜以黃色標記。此等影像說明與對照性視網膜相比，經化合物治療之視網膜具有顯著減少之病原性血管。
圖23A-C展示PLXDC1活化化合物活體內引起腫瘤縮小。在第0天藉由靜脈內推注來進行治療。A. 對照組中之小鼠之腫瘤生長曲線之原始資料。B. 治療組中之小鼠之腫瘤生長曲線之原始資料。C. 對照組及治療組之組合生長資料之比較。
圖24展示由PLXDC1活化化合物進行之治療引起的活動物之腫瘤形態變化。圖11中所描述之實驗中的所有動物之圖展示在第1天及第3天時的腫瘤形態及顏色變化。在第0天進行治療。由於腫瘤血管之破壞及腫瘤中血液之積聚，治療組中之腫瘤之顏色在第1天變得更深。治療組中之腫瘤之顏色在第3天開始變得更黃，符合由腫瘤血管不足引起之腫瘤壞死。
圖25A-B展示由PLXDC1活化化合物進行之治療引起的活動物之腫瘤形態變化。圖11中所描述之實驗中的所有動物之圖展示在第7天時的腫瘤形態及顏色變化。在第0天進行治療。儘管對照組中之腫瘤生長至大型尺寸，但治療組中之腫瘤之尺寸顯著縮小且顏色變成黃色。
圖26A-B展示由PLXDC1活化化合物進行之治療引起的經解剖之腫瘤之形態變化。圖11中所描述之實驗中的經解剖之腫瘤之圖展示在第7天時的腫瘤形態及顏色變化。儘管對照組中之腫瘤之顏色為淡紅色，但治療組中之腫瘤之尺寸顯著縮小且顏色變成黃色，符合腫瘤血管不足及腫瘤壞死。
圖27A-B展示PLXDC1活化抗體結合於PLXDC1而與域B無關。此特性與依賴於域B來結合於PLXDC1之PEDF不同。A. PLXDC1活化抗體(A-TEM7-Ab-1)與經全長PLXDC1 (左圖)、域B缺失型PLXDC1 (中間圖)轉染之細胞或未經轉染之對照性細胞(右圖)之結合。綠色(如所展示，灰色)信號為抗體結合信號。B. PLXDC1活化抗體(A-TEM7-Ab-2)與經全長PLXDC1 (左圖)、域B缺失型PLXDC1 (中間圖)轉染之細胞或未經轉染之對照性細胞(右圖)之結合。綠色信號為抗體結合信號。
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Claims (32)

  1. 一種用於治療患者中之病症之方法，其中該病症之特徵在於病原性血管且該方法包含活化該患者之病原性血管中表現的含有叢蛋白域(PLXDC)之蛋白質。
  2. 如請求項1之方法，其中該PLXDC蛋白質包含PLXDC1或PLXDC2。
  3. 如請求項1或2之方法，其中活化該PLXDC蛋白質包含投與結合於該PLXDC蛋白質之藥劑。
  4. 如請求項3之方法，其中該藥劑為小分子或多肽。
  5. 如請求項4之方法，其中該藥劑為抗PLXDC抗體或其抗原結合片段。
  6. 如請求項5之方法，其中該抗體或其抗原結合片段不能介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
  7. 如請求項5之方法，其中與不存在結合及活化該PLXDC蛋白質之小分子化合物之情況相比，該抗體或其抗原結合片段在存在該小分子化合物之情況下以更高的親和力結合於該PLXDC蛋白質。
  8. 如請求項5之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PLXDC1之域A、C、D或E。
  9. 如請求項8之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PLXDC1之域A。
  10. 如請求項8之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PLXDC1之域C。
  11. 如請求項8之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PLXDC1之域D。
  12. 如請求項8之方法，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PLXDC1之域E。
  13. 如請求項5至12中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段不結合於PLXDC1之域B。
  14. 如請求項5至13中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段為選自表6之抗體或其抗原結合片段；包括選自表6之抗體之互補決定區(CDR)VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之抗體或其抗原結合片段；或與選自表6之抗體競爭結合於PLXDC1之抗體或其抗原結合片段。
  15. 如請求項3至14中任一項之方法，其中該藥劑結合於在基礎狀態下未暴露之PLXDC之胺基酸殘基。
  16. 如請求項3至15中任一項之方法，其中該藥劑為小分子化合物。
  17. 如請求項16之方法，其中該化合物為式I化合物。
  18. 如請求項3至16中任一項之方法，其中該藥劑不為色素上皮衍生因子(PEDF)或其模擬物。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該病症係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變、癌症及其組合。
  20. 如請求項19之方法，其中該病症為腫瘤。
  21. 如請求項20之方法，其中該腫瘤包含實體腫瘤。
  22. 如請求項20之方法，其中該腫瘤之直徑大於2 cm。
  23. 一種對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該VH包含VH互補決定區(CDR) CDR1、VH CDR2、VH CDR3，該VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含選自表6之抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
  24. 一種對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與選自表6之抗體競爭結合於PLXDC1。
  25. 一種對人類含有叢蛋白域1 (PLXDC1)之蛋白質具有特異性之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合於與選自表6之抗體結合之PLXDC1上之抗原決定基。
  26. 一種組合物，其包含如請求項23至25中任一項之抗體或抗原結合片段。
  27. 一或多種核酸，其編碼如請求項23至25中任一項之抗體或抗原結合片段。
  28. 一種宿主細胞，其包含如請求項23至25中任一項之抗體或如請求項27之一或多種核酸。
  29. 一種用於治療患者中之病症之方法，其中該病症之特徵在於病原性血管且該方法包含向該患者投與如請求項23至25中任一項之抗體。
  30. 一種用於鑑別PLXDC蛋白質之活化劑之方法，其包含使候選分子與該PLXDC蛋白質在存在參考PLXDC活化劑之情況下接觸且偵測該候選分子與該PLXDC蛋白質之間的結合親和力，藉此在所偵測之結合親和力大於在不存在該參考PLXDC活化劑之情況下，該候選分子與該PLXDC蛋白質之間的參考結合親和力時，將該候選分子鑑別為PLXDC活化劑。
  31. 如請求項30之方法，其中該候選分子為抗體或抗原結合片段。
  32. 如請求項30或31之方法，其中該參考PLXDC活化劑為小分子化合物。
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