JP2000508893A - プラスモウイルス由来の新規ワクチン - Google Patents

プラスモウイルス由来の新規ワクチン

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サルツマン、ジャン―ルー
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ユニベルシテ・ピエール・エ・マリー・キュリー（パリ・シジエーム）
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Abstract

(57)【要約】 ウイルスに感染した若しくは感染し得る個体から、ベクターまたはベクター類の組み合わせに担持された少なくとも前記ウイルス粒子の構成に必要な構造遺伝子を具備する遺伝子の発現後に、インビボまたはエクスビボで得られる欠陥ウイルス粒子からなるワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】 プラスモウイルス由来の新規ワクチン 本発明は、プラスモウイルス(plasmovirus)に保持される遺伝子の発現後にイ ンビトロで得られるウイルス粒子からなる、予防ワクチンまたは治療ワクチンに 関する。 プラスモウイルスとは、インビボ、インビトロまたはエクスビボにおいて宿主 細胞中で発現された後のウイルス粒子の再構成に必要な、一組の配列を有するプ ラスミド若しくはウイルスベクターとして定義される。換言すれば、プラスモウ イルスを宿主細胞の中に導入すると、該細胞はビリオンを産生するキャプシド封 入細胞に形質転換される。 ウイルス、特にレトロウイルスに対するワクチン接種は複雑な操作である。幾 つかの戦略が、発ガンウイルスに対するワクチンとして大なり小なり有効である ことが立証されているが、レンチウイルスに対するワクチンの試みでは満足な結 果が得られていない。このような事情を説明し得る一つの理由は、ウイルスに対 する免疫感作に導く複数の現象の組み合わせには、おそらく、物理的なウイルス 粒子の存在と、宿主細胞によるこれら粒子の産生とが必要とされるということで ある。そのよりも良い証拠は、ＳＩＶウイルスに対するサルの最良のワクチン接 種が、ワクチン接種したサルにおいて複製する弱毒化したウイルスの使用によっ て得られたことである。不活性化したHIV粒子を用いた治療的ワクチン接種の戦 略が、Salk et al.の論文（Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)）によって開発され た。この戦略は、二つの理由から不十分であることが示された。第一の理由は、 インビトロでHIVウイルスを十分な量で製造するのが困難なことであり、第二の 理由は、前記ウイルスの不活性化法は、それが有効になるために、ウイルス粒子 の免疫原エピトープの一部を破壊することである。 本発明の目的は、野生型ウイルス粒子にできるだけ近似しており、且つ弱毒化 された、即ち、宿主中で複製できないウイルス粒子を、宿主細胞に産生させるこ とである。その発現によりウイルス粒子の形成が導かれるプラスモウイルスを注 入することからなるワクチン接種のアプローチは、ウイルスサブユニットによる ワクチン接種が未だ成功していない場合に特に有利である。このアプローチに包 含されるアイディアは、感染性粒子を再生産する物理的粒子で得られる免疫化よ りも優れた免疫化は存在しないと言うことである。実際のところ、このことが、 多くの病原性物質（特にウイルス）に対するワクチン接種が、弱毒化された形の これらウイルスを用いて行われることの理由である。特に、HIV感染の場合、現 在行われている全ての試みは、異なった病原性ウイルスの攻撃から有効に防御す る弱毒化株を投与することが、マカークザルをHIV感染から有効に防御する唯一 の方法であることを示している。HIVに対するヒトのワクチン接種としては非常 に疑問であるこのようなアプローチは、不完全な不活性化によって、またはトラ ンス補充もしくは突然変異によって再度病原性になり得るといった、不活性化HI Vを用いる方法に付随した種々の問題に直面している。HIV構造について作成、且 つ物理的粒子の再構築を可能にする遺伝子を除く多くの遺伝子を欠失したプラス モウイルス構築物の場合、このようなプラスミドの注入は、当該細胞によって、 感染性ゲノムを欠失した（より望ましくはゼロの）ウイルス粒子の製造に必要な 全てのタンパクの製造を導くはずである。このアプローチによって、弱毒化ウイ ルスではなく、欠損ウイルスをインビボで産生することが可能になるであろう。 遺伝子の接種物は、マウスに注入した後に免疫応答を生じさせ得ることが示さ れているが(B.Wang et al.In Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90;4156(1993)and Ulmer et al.,Science,1993,259:1745-1749)、そこに記載されている反応は抗体の産生 のみである。 本発明は、新規なワクチン接種の手段であって、ウイルスに感染した若しくは 感染し得るヒト個体または動物において、プラスモウイルスの発現後にインビボ で得られた、ウイルスゲノムが存在しないか、または欠失もしくは弱毒化された ウイルスゲノムを含む物理的ウイルス粒子からなるワクチン接種手段に関する。 当該プラスモウイルスは、前記ウイルス粒子の構築のために必要な構造遺伝子を 含むベクターである。 弱毒化されたウイルスゲノムとは、複製が極めて効果的ではないように修飾さ れた如何なるゲノムをも意味する。例えば、散布によってではなく、接触によっ てのみ感染が可能になるような遺伝子の修飾であり、一例を挙げれば、融合性(f usogenic)の膜貫通部分のみを保持するように、env遺伝子の細胞外部分を欠失し たものである。 この弱毒化された特徴をウイルスに与えることができるウイルスゲノムの如何 なる修飾も、細胞培養物における感染性試験によって決定することができる。こ こでは、従来の技術により、培養上清に存在する感染性ウイルスのレベルは顕著 に低下するが、細胞から細胞への感染はこの修飾によって少ししか影響されない 。 ウイルス粒子の再構築を可能にするプラスモウイルスの概念は、最終的薬剤製 品に付与することが望まれる特性に従って、種々の方法で用いることができる。 一組の配列がＤＮＡまたはＲＮＡの形で細胞内に侵入して、その中で発現した後 に物理的ウイルス粒子を再構成する限り、同一のプラスミドまたはベクター、幾 つかの関連したプラスミド類またはベクター類について、種々の態様のプラスモ ウイルスを想定することができる。 関連したプラスミドまたはベクターとは、細胞内におけるその発現が実質的に 同時であり、且つ連結されていない、即ち、共有結合等によって直接的または間 接的に結合されていないプラスミド、ベクターまたは核酸配列を意味する。 次いで、プラスモウイルス構築物から再構成されるビリオンに付与することが 望まれる機能に従って、態様を選択する。 例えば、ウイルスのヌクレオキャプシド構造がレトロウイルスの構造であると きは、一方では、レトロウイルス粒子を産生し、従ってその表面にレトロウイル スに特異的な抗原を有する細胞が体内に存在し、他方では、この細胞外の培地中 に、HIVウイルス粒子に極めて類似したレトロウイルス粒子（唯一の相違は、こ れら粒子が弱毒化され、または複製できないことである）を放出する意味におい て、ウイルスによる生理学的感染に類似した状況を体内に再生するように、プラ スモウイルスの態様が探索される。従って、問題のウイルスに対する十分な免疫 応答を得ることを可能にする一組の要素が体内に同時に存在する。 この態様は種々であり、また安全性、効率性、標的に対する選択性、特定の導 入遺伝子の発現性を有することが好ましく、またはこれら機能を同時に有するこ とが好ましい。 このベクターは、特に、レトロウイルスのgag遺伝子、gagおよびenv遺伝子、 最後にgag、polおよびenv遺伝子を含むことができ、これらの遺伝子は任意に、 独立したおよび／または特異的なプロモータの制御下にあり、並びに問題の導入 遺伝子は、一つまたは他のプロモータまたは独立したプロモータの制御下にある 。プロモータは、それがプラスモウイルスから再構築されるウイルスのプロモー タ（例えばLTR）とは異なるときに、それは特異的または独立的であるとされる 。 本発明によるワクチンの一つの態様は、レトロウイルス、例えばHIVに対する ワクチンであり、宿主の細胞によって、該ウイルスのエンベロープタンパクを有 するが該ウイルスゲノムを欠いているレトロウイルス粒子を発現させるワクチン である。 他の態様において、宿主の細胞は、該細胞によるウイルスの製造に必要な一組 の配列（gag、polおよびenv配列、特にHIV１および／またはHIV２ウイルスの配 列）を有するが、キャプシド封入配列Ψを欠いているプラスモウイルスによって 形質導入される。ここで、前記pol遺伝子は、適切な場合には、INTおよび／また はRTに変異を有し、標的細胞内において、ゲノムのない空の粒子または欠損ゲノ ムを有する粒子の再構築を導く。 他の態様において、宿主細胞は、gagaおよびpol配列を含み、かつ変異若しく は欠損したENV遺伝子を有するプラスモウイルスによって形質導入される。 他の態様は、プラスモウイルスはキャプシド封入配列を有するが、一定の遺伝 子、特に逆転写酵素および／またはインテグラーゼの遺伝子を欠いているもので あり、後者（プラスモウイルス）から体内で複製および／または伝播する能力が 奪われている。 このタイプの構築物の非制限的な例が、図１〜図３に示されている。 当該構築物に遺伝子を挿入するのが有利であることがあり得るが、その遺伝子 の発現は次の何れかのために興味深いものである： ・例えば、細胞タイプの反応および液性タイプの反応の同時発生を高めるこ とによって、免疫原性反応を増大させるための、ワクチン治療それ自体のため； ・当該システムの安全性を増大させるため； ・従来のシステムでは落胆的な結果しか生じないようなエピトープまたは抗 原に対して、免疫反応を発生させるため。 この遺伝子は、gag／polプロモータの制御下に、またはenvプロモータの制御 下に挿入すればよい。その発現がレトロウイルスLTRの制御下にあり、且つヌク レオキャプシド構造がΨ配列を含むならば、この遺伝子は、標的細胞をトランス フェクションした後にビリオンの形に再度組み込まれるであろうし、その発現は 、in situでのビリオンの形成後も継続するであろう。 その発現がワクチン治療に関連して興味深く、または当該システムの安全性に 関連している遺伝子の例は次の通りである。 ａ） 条件的トキシンをコードする遺伝子、例えば、チミジンキナーゼまたは その機能的均等物：ガンシックロビアでの治療に関連した分裂している細胞にお けるこの遺伝子の発現が、細胞のＤＮＡの中にヌクレオシド類縁体を取り込み、 続いて複製を停止した後に、それを含む細胞の死を導くことは現在では周知であ る。この遺伝子をプラスモウイルスに組み込むことの利点は、適切な場合には、 所望のまたは偶然のウイルスの散逸を止めることである。 後者のリン酸化機能を保存する如何なるチジジンキナーゼ誘導体を使用しても よい。これは、例えば、特許出願PCT/FR/95/01098号に記載されている、先端が 切除された誘導体の場合である。より一般的には、如何なる自殺遺伝子、または その生成物が前記ウイルスに対して異種である物質の作用下において、宿主細胞 またはウイルスに作用することができる如何なる遺伝子も、同じ方法でベクター の中に組み込むことができる。 （ｂ） 免疫調節剤をコードする遺伝子。これらは、例えば下記のものであり 得る： ・サイトカイン遺伝子：プラスモウイルスが静脈ルートで注射されると、細 胞にトランスフェクトされておらず、且つ感染性の物理的粒子の再構成を可能に するプラスモウイルスは、次いで、網内皮系およびサイトカイン類、特にインタ ーロイキン類またはG-SDF、GM-CSFをコードする遺伝子の存在によって捕捉され る。 ・または、MHC（主要組織適合性複合体）タンパクは、抗原提示を促進す るはずである。 ・または、B7-1もしくはB7-2のような共刺激分子(Jenkins MK et al.,1993, Curr.Opin.Immunol.5:361-367)。 このような局部的に分泌された遺伝子産物はまた、免疫反応の刺激を誘導し得 る。 （ｃ） そのための免疫原性をトリガーもしくは増大することが望ましいペプ チド、ポリペプチドまたはタンパクをコードする、遺伝子またはヌクレオチド配 列：これらは例えば、それに対する免疫を生じさせることが望まれる抗原のハプ テンまたはエピトープであり得る；プラスモウイルスから再構成されるウイルス 粒子は、特定の抗原もしくはエピトープに免疫原性を付与するアジュバントまた はキャリアの役割を果たす。後者のケースでは、ウイルス粒子の表面に発現され た特定のエピトープ構造を獲得すると共にエンベロープタンパクの膜外部分の機 能性の保持を可能にするenv遺伝子の領域に、相補的配列を挿入するのが特に有 利である。 全ての場合において、細胞性反応および液性反応を誘起するワクチンとして作 用するのは、インビボで再構成された物理的粒子である。このアプローチは、今 まで如何なるワクチンの開発も可能でなかったようなウイルスに対する防御的ワ クチンを探索する場合に特に有利である。これは、HIV類およびHTLV類、Ｄ型レト ロウイルス類もしくは泡沫ウイルス類の場合に特にそうであり、これらのための ワクチンを開発する全ての試みが、その防御効果に関して不十分であることが立 証されている。従って、本発明においては、プラスモウイルスのウイルスゲノム がレトロウイルスであり、コーディングベクターが少なくとも一つのHIV構造遺 伝子を含む場合に特に有利である。 プラスモウイルス類の特性、従って本発明のワクチンの特性はまた、使用した エンベロープの種類から生じる。実際に、このエンベロープタンパクは、感染性 の成熟粒子の産生効率に関与するだけでなく、この粒子に感染の特異性（親和性 ）を与えることを可能にする。何故なら、ビリオンが膜レセプターを介して細胞 に結合する現象に関与するのはこのタンパクだからであり、それはウイルスと原 形質膜との融合に関与して、感染細胞の原形質中にヌクレオキャプシドを放出す る ことを可能にするからである。最後に、当該エンベロープは、補体による不活性 化に対するベクターの抵抗性において重要な役割を果たす。このようにして、ヌ クレオキャプシド構造上において、エンベロープの遺伝子を修飾することにより ベクターの感染スペクトルを変更することが可能であり、従って、適用が望まれ るワクチン戦略にこれを適用することが可能になる。 例えば、VSV（水疱性口内炎ウイルス）のenv遺伝子を有するベクターは、標的 細胞に対する広範な親和性を有することが観察されており、この普遍的な特性は 、このエンベロープの膜レセプターの性質に由来するものである。対照的に、異 所性ウイルスに由来するenv遺伝子は、遥かに狭い特異性を有するであろう。 ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクヲコードする遺伝子または遺伝子断片 はまた、VALSESIA-WITTMANN et al.,Journal of Vlrology,(1996),pp 2059-2064 に記載されているように、env遺伝子のＮ末端部分に挿入してもよく、これは、 当該ビリオンと標的細胞上のそのレセプターとの間の結合を妨害しない。ウイル ス粒子の再構築の際に、挿入された遺伝子または断片の翻訳から生じるペプチド 又はポリペプチドは、ウイルスエンベロープのＮ末端部分、即ち、当該粒子の細 胞外部分と共有結合されるであろう。 この性質は、プラスモウイルスから再構築された粒子に対して、特に下記の種 々の性質を与えるために活用することができる： （ａ） 細胞媒介性の免疫反応をトリガーする： ペプチド、ポリペプチド又はタンパク（その全てを「挿入物」と呼ぶ）は、再 構成されたウイルス分子の表面に発現され、これは、Ｔ細胞の活性化およびマク ロファージ若しくは抗体産生性Ｂ細胞の同時活性化によって、細胞媒介性免疫の 刺激を導くことができる。従って、この能力は、こうして再構成されたウイルス 粒子の免疫原性を増大するために活用することができる。当該挿入物がワクチン 接種抗原であるとき、プラスモウイルスから再構築された粒子は、該粒子の表面 に発現された抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントになり得る。 （ｂ）ハプテンに対する免疫応答をトリガーする： ハプテンは、それ自身では免疫原としての能力を欠く抗原決定基である。抗原 性反応は、ハプテンをキャリア、たとえばアルブミン、PPD（ツベルクリンの 精製タンパク誘導体）又はKLHに結合することによって、トリガーおよび／また は増強される。一般に、このキャリアはＴリンパ球によって認識されるのに対し て、ハプテンはＢ型細胞と反応する。ポリペプチドハプテンは、従って「挿入物 」の良好な候補である。 （ｃ）ルーティング機能： 標的細胞に特異的なレセプターに対するその親和性の故に「挿入物」が選択さ れるとき、後者が器官に挿入され又は器官から単離されるかどうかにかかわらず 、この「挿入物」を発現するウイルス粒子は、好ましくは所定の標的に向けられ 、その中でその作用を特異的にトリガーする。もし、この作用が単純に、細胞性 免疫反応または体液性免疫反応のトリガーであるならば、ルーティングはＴ細胞 上で直接生じ得る。他方、たとえば図２に示されるように、導入遺伝子がプラス ミドに挿入されるならば、ルーティングは、ウイルス粒子が標的細胞に対する感 染特性を有する限り、最適の免疫原性を得るために細胞内で発現されるべき問題 の遺伝子を特異的にターゲッティングすることを可能にする。 （ｄ）勿論、上記の三つの性質は相互に排除し合うものではなく、増大した免 疫原性および／または特異性を有するワクチン粒子を産生するように相補うもの であり得る。 同様にして、Us11と称される１型単純疱疹ウイルス（HSV-1）タンパクは、レ トロウイルス（特にHIVまたはHTV）のエンベロープ糖タンパクの発現をトランス で活性化できることが示されている(J．Diaz et al．(1996),Nature 379:273)。 レトロウイルスプロモータまたは他のプロモータ（例えばレトロウイルスの構造 遺伝子の転写に用いられるcCMVプロモータ）の制御下に、Us11をコードする遺伝 子をプラスモウイルスの中に含めることは、特に有利である。 有利なことに、発現が望まれる遺伝子または遺伝子断片に従って、ターゲッテ ィングすることが望まれる標的細胞、env遺伝子および挿入の部位を決定するこ とが可能になるであろう。 プラスモウイルス構築物の第一の例は、図１に示されている。このプラスモウ イルス構築物は、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるgagおよびpol遺伝子と； （ｂ）これもまた特異的プロモータの制御下にあるenv遺伝子と； （ｃ）問題のウイルスのLTRとは異なる、SV40、TKまたはHBV等のタイプのポリ アデニル化信号と； （ｄ）適切な場合には、Ψ配列と； （ｅ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータ、ｂ）におけるプ ロモータまたは独立の発現カセットの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝 子断片とを具備している。 この構築物において、ウイルス遺伝子の再構成は、LTR類の不存在下では不可 能である。この戦略は、少数のリーディングフレームしかもたない「単純な」ウ イルスについては適切である。他のバージョンにおいては、必要な夫々のタンパ クを独立した発現カセットの中に配置することができる。HIVのような複雑なウ イルスについては、幾つかのカセットを連続させることができる(gag/pol、env 、tat、rev、nef)。 本発明によるプラスモウイルスのもう一つの例が、図２に示されている。この プラスモウイルスは、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるレトロウイルスのenv遺伝子と； （ｂ）LTR配列、gagおよびpol遺伝子、並びに適切な場合にはPsi配列を含む欠 陥レトロウイルスゲノムと； （ｃ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータまたはｂ）におけ るプロモータの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝子断片と； （ｄ）適切な場合には、HSV由来のUs11遺伝子とを具備する。 この構築物は、従来技術で既に説明したプラスモウイルスの構造に類似してお り、形質導入された細胞による外来遺伝子（例えば免疫刺激剤タンパクをコード する遺伝子）の発現を可能にする。更に、Ψ＋このバージョンの構築物は、感染 性ではあるが欠陥のある粒子を産生する。従って、細胞は感染して、ウイルス粒 子の形成に必要なタンパクを再発現することができる。もし、これらの細胞が抗 原提示細胞であれば、これは特に有利であり得る。 本発明によるベクターのもう一つの態様は、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるレトロウイルスのgag、polおよび／ またはenv遺伝子と； （ｂ）LTR配列およびPsi配列を含む欠陥レトロウイルスゲノムと； （ｃ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータまたはｂ）におけ るプロモータの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝子断片と； （ｄ）適切な場合には、HSV由来のUs11遺伝子とを具備する。 プラスモウイルスのもう一つの例が図３に示されており、これはΨ配列を欠失 した弱毒化ウイルスゲノムを有し、また複製性ウイルスの出現を回避するために 、幾つかの再配列がゲノムに導入されている。３’LTRは異なったポリアデニル 化部位で置換されている；一以上の非構造的タンパク部分（逆転写酵素RT、イン テグラーゼIN）において、変異（点変異、欠失、リーディングフレームの変化等 ）が形成されている。この戦略は、多数のタンパクを有するHIVのような複雑な ゲノムについては特に適切である；その合成は複雑であり、従って、HIV5'LTRの 同種制御下のままである。 全ての構築物（図１，図２、図３）について、免疫応答を促進する遺伝子をコ ードしている一以上の発現カセットを、当該プラスミドに追加することができる 。更に、該プラスミドの発現を促進する要素、例えば、AAV ITR、プラスミドの 複製を促進できる配列（SV40またはEBV複製起源、Ｔ抗原またはebna発現カセッ ト）等を加えてもよい。 本発明はまた、免疫原性組成物、特に、感染した個体またはウイルスに感染し 得る個体の予防および／または治療のためのワクチンであって、少なくとも一つ の上記プラスモウイルスを含有する組成物に関する。 関係のある患者または対象はヒトおよび動物であり、この免疫原性組成物また はワクチンは、ヒトもしくは家畜のための医薬に属するであろう。 この組成物は免疫原性であり、特に、欠陥ウイルスゲノムを有するベクターの 注射によって、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答を誘起できる物理的 粒子の再構成が可能になる意味において免疫原性である。 欠陥ウイルスゲノムおよびウイルスエンベロープの再構成を可能にする遺伝子 をコードしている配列は、一つまたは二つのベクターに担持させることができ、 これらは当業者に公知の手段、特にWO 95/26411に記載されている手段によっ て連結すればよい。この場合、プラスモウイルスの用語は、免疫原の能力を増大 させるため、システムの安全性を高めるため、更にはウイルスエンベロープタン パクのより良い発現を可能にするために、この欠陥ウイルスゲノムに特異的な配 列および構造タンパク（類）をコードする配列、並びに適切な場合には、上記の 異種遺伝子をコードする配列を同時に担持する一つのベクターにも同様に適用さ れ得る。 当該免疫原組成物はまた、活性成分として、上記のプラスモウイルスまたは ベクターを予めインビトロでトランスフェクトされた細胞を含有していてもよい 。この場合、当該組成物の注射は、宿主細胞のインビボでの移植およびウイルス 粒子の再構成を可能にし、次いで、該粒子は所望の免疫応答をトリガーすること ができる。 当該免疫原組成物は、適切な場合には、プラスモウイルス、ワクチン接種アジ ュバントと組み合わせてもよい。このアジュバントは、幾つかのタイプであり得 る;MDPまたはその種々の誘導体(例えば、CRS Critical Reviews in Immunology, 1998,Vol.8,pp.83-100に記載されているもの）のようなペプチドと組み合わせた Ｎ−アセチル−ムラミル型のアジュバントのような幾つかのものは、従来の免疫 応答を促進する。核酸配列の細胞内への侵入を促進するような、他のタイプのア ジュバントも想定することができる；最後に、当該免疫原組成物中のプラスモウ イルスを、T-依存性の配列、またはリポソームに連結もしくは封入することが公 知または推定される配列に連結してもよい。また、当該組成物は、「ペレット」（ 該生成物を含む生分解性ポリマー）および／またはミクロポンプによる放出系の 移植により、水性または油性媒質中の組成物として、皮下、筋肉内または静脈内 注射で投与してもよい。単独またはレクチン（EP 445-710）と組み合わせたPAO 、または水酸化アルミニウム（Al(OH)3）と組み合わせたZN(OH)もしくはHBW538 （Drug experimental Clinical research（1991）17(9):445450）のような他の アジュバントを、共有結合等によって、当該組成物の活性成分に結合してもよい 。活性成分のうちの一つがプラスモウイルスである免疫原組成物もまた、前記ウ イルスの増殖を停止することが望ましいときは、適切であればガンシクロビアを 追加することによってシステムの安全性を可能にするように、欠陥ウイル スゲノムが自殺遺伝子を担持することを特徴とする。 本発明の免疫原性組成物において、前記プラスモウイルスは裸のＤＮＡもしく は被覆ＤＮＡ、または細胞と組み合わされた裸のＤＮＡの何れであってもよく、 この細胞はパッケージ細胞、或いは、例えば3T3株のような繊維芽細胞株、また はミエローマ細胞、Vero細胞もしくはMRC5細胞のような懸濁液中で培養できる株 から選択される株化細胞である。この場合、当該免疫原組成物は、プラスモウイ ルスおよび宿主細胞の組み合わせであり、この場合、該細胞は細胞移植片として 作用し、該細胞自身がワクチン反応を誘起するウイルス粒子の産生を可能にする 。 本発明の免疫原組成物は、一回投与量当たり0.1〜1000μｇ、好ましくは10〜5 00μｇの、前記ベクターを構成する核酸を含有することを特徴とする。これらの 投与量は、ヒトを目的とした一回投与量であると理解される。 本発明の免疫原組成物において、前記プラスモウイルスはまた、欠陥を有し且 つレトロビリオンの再構成に必要な全ての配列を有するアデノウイルスまたはAA V（アデノ関連ウイルス）であってもよい；即ち、このレトロウイルス配列を有 する欠陥ウイルスは、好ましくターゲッティングされるべき細胞に対するキャリ アの役割を果たす。 例えば、AAVは、強力な免疫原能を有する筋肉細胞に対して特別の親和性を有 している；このタイプの細胞の中に、レトロウイルス配列を有するゲノムを導入 することにより、そのワクチン接種効果を増大することができる。 この態様において、当該プラスモウイルス組成物は、好ましくはヒトを目的と した一回投与量当たり、100〜106の欠陥ウイルス粒子を含んでいる。 本発明はまた、ウイルス感染に対して個体を能動免疫化する方法に関し、この 方法は、ウイルス粒子の再構成に必要な構造遺伝子を有するプラスモウイルスを 個体に注射することからなる。 注射されたプラスモウイルスは、更に、ウイルスゲノムまたはレトロウイルス ゲノムを有することができ、該ゲノムは、好ましくは欠陥を有し、且つウイルス またはレトロウイルスの非コーディング配列および／または調節配列、並びに適 切な場合にはキャプシド封入配列を有する。当該ワクチン接種法において好まし いレトロウイルスゲノムは、レンチウイルス、発癌ウイルス、泡沫ウイルスまた はＤ型レトロウイルスのゲノムである。この場合も同様に、ウイルス粒子の構築 に必要な構造遺伝子は、好ましくはgagおよび／またはenvである。このenv遺伝 子はプラスモウイルスに与えられた目的に従って選択され、その種々の例は上記 に列記されている。このenv遺伝子は、当該ビリオンの標的細胞のレポータおよ びenv分子内の挿入物のレポータに結合する機能をもったキメラを産生するよう に組み替えられる。上記で述べたように、HSV１ Us11遺伝子をプラスモウイルス に付加し、構造タンパクの合成を刺激することも有利であろう。 当該ワクチン接種に用いるベクターの種々の態様は、上記で既に述べた。 また、ワクチン接種の方法は、感染した個体または感染し得る個体を、本発明 のベクターで予めトランスフェクトとされた宿主細胞、特に、3T3繊維芽細胞株 、またはミエローマ細胞もしくはVero細胞のような懸濁液中で培養された細胞株 により処置することからなっていてもよい。 レトロウイルスゲノムがキャプシド封入配列を欠いていれば、再構成された物 理的粒子はゲノムを欠いている。逆に、ウイルスゲノムがこのキャプシド封入配 列を有しているときは、レトロウイルスプロモータの制御下に問題の遺伝子を付 加してシステムの安全性を高め、またはワクチンの免疫応答性を増大するように 、ベクターを構築するのが有利であろう。 この免疫感作は、上記の免疫原組成物を経皮的、皮下的、筋肉内または静脈内 に注射した後に得られる。これらのプラスモウイルスはまた、免疫原組成物、特 にウイルス感染を予防または治療するためのワクチンの製造に使用することがで き、この用途は本発明の一部を形成する。 核酸の調製および保存は、完全なウイルス粒子の製造および保存よりも容易に 実施できるから、プラスモウイルスの使用は有利である。 欠陥ウイルス粒子の形成は、培養細胞の中においてインビトロで、または筋肉 内、静脈内または皮下注射の後にインビボで、または形質転換細胞を注射した後 にエクスビボで誘導することができる。 最後に、再構成された好ましくは欠陥を有するウイルス粒子からなる生ワクチ ンの製造プロセスは、本発明の一部を形成する；このプロセスは、細胞を上記の ベクターで形質転換することを具備し、該ベクターは、ウイルス粒子の再構成に 必要な構造遺伝子を有する一方、欠陥レトロウイルスゲノムを有し、前記ウイル スの構造遺伝子は、特異的プロモータまたはウイルスプロモータの何れかの制御 下にある。 本発明のプロセスにおける形質転換細胞は、インビトロで形質転換された培養 細胞、またはインビボ若しくはエクスビボで形質転換された個体の細胞の何れか である。 このプロセスは、一方では経済的観点から、他方では安全性の観点から特に有 利である。実際、プラスモウイルスの製造は簡単であり、安全性および再現性は 薬物製造の制限により一層合致している。更に、このプロセスによって、弱毒化 または不活性化した全ウイルスを用いた生ワクチンの製造プロセスの一つの段階 における、ウイルス粒子の取り扱い（これは危険であろう）を回避することが可 能になる。 当業者は、ケースバイケースで、一つの細胞タイプまたは他の細胞タイプのト ランスフェクションに最も適した技術を使用する方法を熟知しているであろう。 以下の実施例、並びに脚注を付した図面は本発明を例証するものであり、その範 囲を限定するものではない。 以下の実施例および比較例は、ワクチンのアプローチの効率を動物モデルで示 している。 この実施例において、図４は、Mo-MuLV 5'LTRプロモータの制御下にあるHSV1- KT遺伝子を含むプラスミドpＢＭＣ-3を示している。 図５は、プラスミドpNP-2を表している。 図６は、これらの構築物を補助としてワクチン接種し、ネズミ骨髄増殖性白血 病ウイルスに感染した動物の体重変化を示している。試験の日数はｘ軸に、動物 の体重変化はｙ軸に示されている。 Ｉ．使用した実験モデル： 使用した実験モデルは、マウスにおける骨髄巨核球性白血病を示している。 この白血病は、MPLV型の病原性レトロウイルスでマウスを感染させることにより 誘導される。MPLVウイルスは、フレンド型のネズミ白血病ウイルスから 誘導される。後者は、モロニー型ウイルスから区別されるLTR配列を有するが、 極端に類似した構造タンパク配列を有している。従って、モロニーウイルスから 誘導されたタンパクを使用して、MPLVに対してワクチン接種することが可能であ る。 このようなウイルスは、v-mpl発ガン遺伝子を有しており、これはサイモポイ エチンのリガンドである。このようなウイルスに感染した後、該マウスは数週間 以内に巨核球性白血病を発症する。この疾患は、巨脾腫症および肝腫を特徴とす る：より詳しくは、ウイルス感染の後、極めて多数のリンパ球が脾臓に集積する 。従って、ワクチン接種の効果は、病原ウイルスを抗原投与した後に、脾臓、肝 臓または全動物の重量増加がないことによって評価することができる。 ＩＩ．このモデルに使用したプラスモウイルス： 三つの異なったプラスモウイルスでワクチン接種を行い、続いて下記のよう に行った： ・図５に示すプラスミドpNP-2は、10,380塩基対のプラスミドである。このプ ラスミドにおいて、モロニーから誘導されたプロウイルスのenv遺伝子の最初のA TGコドンは、重なったpol遺伝子における対応コドンの方向を保持するように点 突然変異を受けた。pol遺伝子の停止コドンから数塩基対だけ下流にHSVI-TK遺伝 子が挿入され、この導入遺伝子の停止コドンと3'におけるLTRのポリプリン画分 との間のenv遺伝子から、如何なる配列も除去した。このような構築物において 、gagおよびpol遺伝子は未切断ゲノムＲＮＡから得られたのに対して、導入遺伝 子は野生型プロウイルスのドナーおよびアクセプタースプライス部位を用いてス プライスされたＲＮＡから転写された。次いで、感染性ウイルスを生じる組換え の可能性を低減するように、env遺伝子の発現のためのカセットが構築された； 図４に示すpBMC-3は、プラスミドpNP-2と同じであるが、更にエコトロピック なenv遺伝子を有している； ここでは示さないが、ヒト遺伝子を組み込み且つenv遺伝子を欠くプラスミドp BPXT4を対照として用いた。 ＩＩＩ．動物モデルにおけるプラスモウイルスの防御的予防効果： Ulmer et al.,Science,1993 259:1745-1749に記載されているようにして、 成体マウスに筋肉内注射を行う。 Qiagenによって調製されたプラスミドの、マウス当たり100μｇの比率での注 射を１週間間隔で３回繰り返す。 ワクチン接種の効果についてのコントロール群として、MPLVウイルスに対して 完全に外来性であるプラスミドＤＮＡをマウスに注射する。 免疫感作手順の最後において、動物に対し、MPLVウイルスを産生する細胞株の 培養上清を静脈注射する。 この未希釈の上清は、66,152 CPM／106細胞の逆転写酵素(ＲT）活性を有して いる。この上清を100倍に希釈し、200マイクロリットルをマウスに静脈注射した 。この注射時点は、図６の曲線上の時間０に対応する。 四群の動物を処置した；実験の開始時、即ち、最初のワクチン接種時において 、夫々の群は10匹の４週齢dBA/2マウスからなっていた。 MPLV粒子を注射した後の種々の時点において、動物が生存しているときはその 体重を計測し、および／または致死させて脾臓および肝臓の重量をそれぞれ計測 する。測定およびサンプル取り出しの時点は、７日，１４日，２１日，２８日お よび３５日である。 ＩＶ．結果 図６は、MPLV粒子を抗原投与した後の種々の時点における体重の変化を表し ている。白丸は、プラスミドpBMC-3をワクチン接種した後に得られた結果を表し ている。黒丸は、pNP-2をワクチン接種した後に得られた結果を表している。白 の四角は、pBXT4（ヒトCD4のcDNAを与えるプラスミド）で得られた結果を表し、 黒の四角は、ウイルス粒子の注射の前にワクチン接種しなかった対照を表してい る。 下記の表は、ウイルス粒子の注射の２１日後に、取り出された脾臓および肝臓 の重量をそれぞれ示している。 結論 上記の結果は、pBMC-3でのワクチン接種では、マウス、脾臓、または肝臓の何 れにおいても重量増加がないから、有効であることを明瞭に示している。対照的 に、他の三つのプラスモウイルスの使用は、少なくとも10倍の脾臓重量増加を導 き、病気の発症およびワクチン接種が有効でないことを示している。この結果は 、組成物に組み込まれたプラスモウイルスが、ウイルス感染の病原性効果を防止 できる活性な薬剤を生じることを明瞭に示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 38/00 39/21 39/21 Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． ウイルスに感染した若しくは感染し得る個体において、ベクターまたは ベクター類の組み合わせに担持された少なくとも前記ウイルス粒子の構成に必要 な構造遺伝子を具備する遺伝子の発現後に、インビボまたはエクスビボで得られ る欠陥ウイルス粒子からなるワクチン。 ２． 請求項１に記載のワクチンであって、前記ベクターは更に、非コーディ ング配列および／または調節配列、適切な場合にはキャプシド封入配列を有し、 且つ前記ウイルス粒子の少なくとも一つの構造タンパクをコードする領域を欠い た欠陥ウイルスゲノムまたは欠陥レトロウイルスゲノムを具備することを特徴と するワクチン。 ３． 請求項１または２に記載のワクチンであって、前記ウイルス粒子はレト ロウイルス粒子であり、前記ベクターは、少なくとも前記対応するレトロウイル スのgag遺伝子および適切な場合にはenv遺伝子を具備することを特徴とするワク チン。 ４． 請求項１〜３の何れか１項に記載のワクチンであって、前記ベクターが 更に、HSV１由来のUs11遺伝子を含むことを特徴とするワクチン ５． 請求項１〜４の何れか１項に記載のワクチンであって、前記ベクターが 、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるgagまたはgag／pol遺伝子と； （ｂ）これもまた特異的プロモータの制御下にあるenv遺伝子と； （ｃ）問題のウイルスのLTRとは異なる、SV40、TKまたはＨBV等のタイプのポ リアデニル化信号と； （ｄ）適切な場合には、Ψ配列と； （ｅ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータ、ｂ）におけるプ ロモータまたは独立の発現カセットの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝 子断片とを具備することを特徴とするワクチン。 ６． 請求項１〜５の何れか１項に記載のワクチンであって、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるレトロウイルスのgag、polおよび／ま たはenv遺伝子と； （ｂ）LTR配列およびPsi配列を含む欠陥レトロウイルスゲノムと； （ｃ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータまたはｂ）におけ るプロモータの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝子断片と； （ｄ）適切な場合には、HSV由来のUs11遺伝子とを具備することを特徴とする ワクチン。 ７． 請求項１〜５の何れか１項に記載のワクチンであって、前記ベクターは 、Ψ配列を欠くレトロウイルスゲノムを具備し、且つpolまたはINTのような非構 造的タンパクをコードする遺伝子において突然変異が行われることを特徴とする ワクチン。 ８． 請求項５〜７の何れか１項に記載のワクチンであって、前記問題の遺伝 子は、HSV1-TKのような条件的トキシンをコードすることを特徴とするワクチン 。 ９． 請求項５〜７の何れか１項に記載のワクチンであって、前記問題の遺伝 子または遺伝子断片は、免疫応答を刺激できる遺伝子、特にサイトカイン、MHC またはB7分子であることを特徴とするワクチン。 １０． 請求項５〜７の何れか１項に記載のワクチンであって、前記問題の遺 伝子または遺伝子断片は、前記env遺伝子に組み込まれることを特徴とするワク チン。 １１． 請求項５〜７の何れか１項に記載のワクチンであって、前記問題の遺 伝子または遺伝子断片は、ポリペプチドハプテンをコードすることを特徴とする ワクチン。 １２． 請求項１〜１１の何れか１項に記載のワクチンであって、前記ウイル スは、レンチウイルス、オンコルナウイルス、泡沫ウイルスまたはＤ型レトロウ イルスから選択されるレトロウイルスであることを特徴とするワクチン。 １３． 請求項１〜１２の何れか１項に記載のワクチンであって、ペプチド、 ポリペプチドまたはタンパクをコードする配列が、前記env配列の5'末端に挿入 されているワクチン。 １４． 請求項１に記載のワクチンの製造に使用することができるベクターで あって、 （ａ）特異的プロモータの制御下にあるレトロウイルスのgag遺伝子と； （ｂ）LTR配列、gagおよびpol遺伝子、並びに適切な場合にはPsi配列を含む欠 陥レトロウイルスゲノムと； （ｃ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータまたはｂ）におけ るプロモータの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝子断片と； （ｄ）適切な場合には、HSV由来のUs11遺伝子とを具備するベクター。 １５． 請求項１に記載のワクチンの製造に使用することができるベクターで あって： （ａ）特異的プロモータの制御下にあるレトロウイルスのgag、polおよび／ま たはenv遺伝子と； （ｂ）Psi配列を伴うか又は伴わないLTR配列を含む欠陥レトロウイルスゲノム と； （ｃ）適切な場合には、その発現がａ）におけるプロモータ、ｂ）におけるプ ロモータ、又は独立の発現カセットの何れかに依存する問題の遺伝子または遺伝 子断片と； （ｄ）適切な場合には、HSV由来のUs11遺伝子とを具備するベクター。 １６． 請求項１４または１５に記載のベクターであって、ペプチド、ポリペ プチドまたはタンパクヲコードする配列が、前記env遺伝子の中に挿入されてい ることを特徴とするベクター。 １７． 請求項１２〜１６の何れか１項に記載のベクターであって、前記問題 の遺伝子は、HSV1-TK由来のチミジンキナーゼの遺伝子であることを特徴とする ベクター。 １８． 請求項１２〜１６の何れか１項に記載のベクターであって、前記問題 の遺伝子は、免疫応答を刺激できる遺伝子、特に、サイトカイン、MHCまたはB7 タンパクの遺伝子であることを特徴とするベクター。 １９． ウイルスに感染した若しくは感染し得る個体の予防および／または治 療のための免疫原組成物であって、請求項１４〜１８の何れか１項に記載の少な くとも一つのベクターを含有することを特徴とする組成物。 ２０． 請求項１８または１９に記載の免疫原組成物であって、前記ウイルス はレトロウイルス、特にHIVもしくはHTLV、泡沫ウイルス、またはＤ型レト ロウイルスであることを特徴とする組成物。 ２１． 請求項１８〜２０の何れか１項に記載の免疫原組成物であって、一回 投与量当たり0.1〜1000μｇの、前記ベクターを構成する核酸を含有することを 特徴とする組成物。 ２２． 請求項１８〜２１の何れか１項に記載の免疫原組成物であって、それ がワクチン、特にレトロウイルスに対するワクチンを構成することを特徴とする 組成物。 ２３． 免疫原組成物、特に、ウイルス感染の予防または治療を目的としたワ クチンの製造における、インビボまたはエクスビボでウイルス粒子の形成を誘導 できるベクターの使用。 ２４． 請求項２３に記載の使用であって、前記ウイルス感染がレトロウイル ス感染であることを特徴とする使用。 ２５． 請求項２４に記載の使用であって、前記免疫原組成物は、HIV、HTLV 、泡沫ウイルスまたはＤ型レトロウイルスに対するワクチンであることを特徴と する使用。 ２６． 欠陥ウイルス粒子からなる生ワクチンの製造方法であって、インビボ またはエクスビボにおいて、請求項１２〜１７の何れか１項に記載のベクターで 細胞を形質転換することを具備した方法。 ２７． 請求項２６に記載の方法であって、前記欠陥ウイルス粒子はレトロウ イルス粒子であることを特徴とする方法。 ２８． ハプテンに対する能動免疫を誘導できる組成物の製造における、請求 項１４または１５の何れか１項に記載のベクターの使用。 ２９． 免疫原組成物をターゲッティングする方法であって、請求項１４〜１ ８の何れか１項に記載のベクターのenv遺伝子の中に、細胞レセプターに特異的 な親和性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を挿入すること を具備することを特徴とする方法。
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