ES2455544T3 - Vectores de lentivirus pseudotipificados con una glucoproteína de envoltura de virus Sindbis - Google Patents

Abstract

Una partícula de vector lentivírico que comprende: (a) una envoltura que comprende: (i) una glucoproteína E2 de virus Sindbis de la SEC ID Nº: 1 en que 160X está ausente o es un aminoácido distinto de ácido glutámico o una variante de la SEC ID Nº: 1 del mismo que tiene al menos 80% de identidad para la SEC ID Nº: 1 y en que 160X está ausente o es un aminoácido distinto de ácido glutámico, capaz de infectar células dendríticas; en la que E2 no es parte de una proteína de fusión con virus Sindbis E3 y (b) un genoma de vector lentivírico que comprende una o más secuencias de interés.

Description

Vectores de lentivirus pseudotipificados con una glucoproteina de envoltura de virus Sindbis.

Campo tecnico

Esta solicitud de patente se refiere en general a suministro de genes diana y mas en particular al uso de un lentivirus 5 pseudotipificado que comprende una envoltura que fija como objetivo celulas dendriticas y se puede usar asi para vacunacion con celulas dendriticas.

Antecedentes

Las celulas dendriticas (las CD) son celulas presentadoras de antigenos esenciales para la iniciacion y control de respuestas inmunitarias. Las CD pueden capturar y procesar antigenos, migrar de la periferia a un organo linfoide y 10 presentar los antigenos para que queden celulas T en un modo restringido del complejo principal de histocompatibilidad (CPH). Estas celulas proceden de medula osea (MO) y muestran morfologia dendritica y alta movilidad. El descubrimiento de las CD como celulas presentadoras de antigeno especializadas (las CPA) ha impulsado intentos en estrategias de inmunizacion/vacunacion a base de CD que implican cargar las CD in vitro con antigenos especificos (Banchereau y Palucka, A. K. 2.005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, et al. 2.004. Nat.

15 Med. 10: 475-480). Todos estos intentos, sin embargo, implican la trabajosa preparacion de un tratamiento especifico para el paciente que incluye la carga de las CD autologas ex vivo con antigenos especificos, que se administran despues al paciente.

Una estrategia alternativa es utilizar vectores a base de virus recombinantes como un mecanismo para suministrar directamente un gen que codifique un antigeno o antigenos designados a celulas huesped. En este caso, por 20 induccion de una respuesta inmunitaria de adaptacion deseada, el producto genico expresado proporciona beneficio terapeutico. Hay una serie de retos, sin embargo, para conseguir un sistema seguro y eficaz. Algunos de estos retos incluyen diserar un vector que fije como objetivo una serie deseada de celulas huesped, proporcionar un sistema de suministro adecuado, expresar un antigeno deseado para provocar una respuesta inmunitaria eficaz y consecuentemente fabricar una composicion farmaceutica con titulacion suficientemente alta del virus de vector de

25 virus recombinante a fin de que pueda ser utilizado ampliamente por una poblacion de individuos humanos designada. Lo ultimo es un reto particular en el desarrollo de sistemas a escala laboratorio en productos que se pueden producir por la industria farmaceutica.

En el laboratorio, muchos vectores lentiviricos se pseudotipifican con las proteinas de envoltura VSV-G. Esto se usa extensamente como sistema modelo ya que las proteinas de envoltura VSV pueden fijar como objetivo muchos tipos 30 de celulas (una envoltura UpantropicaU) y los sistemas de produccion en general proporcionan un titulo alto.

Las glucoproteinas de envoltura de virus Sindbis y otros alfavirus desvelados en la presente memoria se incorporan a la bicapa lipidica de la membrana de la particula virica. Tipicamente, la membrana virica (envoltura) incluye multiples copias de trimeros de dos heterodimeros de glucoproteinas, E1 y E2, que se producen de escision de una sola proteina precursora. La proteina precursora comprende, desde su N- a C-terminal, las proteinas E3, E2, 6K y

35 E1. La pequera glucoproteina E3 sirve como secuencia seral para traslocacion de la proteina E2 en la membrana y se escinde de E2 por furina o alguna otra serina proteinasa dependiente de Ca2+. La proteina 6K sirve como secuencia seral para traslocacion de la proteina E1 en la membrana y se escinde despues de la proteina precursora.

Las glucoproteinas E1 y E2 tienen cada una regiones de expansion de membrana; E2 tiene un dominio

40 citoplasmatico de aproximadamente 33 restos mientras la cola citoplasmatica de E1 es muy corta (aproximadamente 2 restos). Tanto E1 como E2 tienen acidos palmiticos unidos a o cerca de las regiones de expansion de membrana.

Se cree que los aislados de virus Sindbis descritos en la tecnica infectan celulas via una interaccion con sulfato de heparan (SH). En la patente internacional WO 2008/011636 se describio un sistema de empaquetamiento lentivirico en que la proteina de fusion de envoltura E3/E2 (denominada SVGmu) contiene una serie de modificaciones, 45 destinadas a reducir la union de la proteina a SH pero mantener la union a, e infeccion de, las CD, via la molecula superficial CD-SIGN. En la patente internacional WO 2008/011636, el ADNc para SVG de cepa natural se obtuvo del laboratorio del laboratorio del Dr. J. H. Strauss en el Instituto de Tecnologia de California y se clono en el vector pcDNA3 (Invitrogen) por PCR para generar plasmido pSVG. Se inserto una secuencia tag de diez restos en proteina E2 entre los aminoacidos 71 y 74 por mutagenesis PCR para romper el sitio de union de SH. Se introdujo una

50 supresion adicional en la glucoproteina E3 de SVG para retirar los aminoacidos 61-64. Este SVG modificado se designo como SVGmu (SEC ID N°:11 de la patente internacional WO 2008/011636). El ADNc para SVGmu se clono aguas abajo del activador de CMV en el vector pcDNA3 (designado como pSVGmu, SEC ID N°: 3 de la patente internacional WO 2008/011636).

Algunas realizaciones de la presente invenci6n

55 Aunque las particulas viricas pseudotipificadas SVGmu podian transducir de manera selectiva celulas que expresan el antigeno CD-SIGN, varios aspectos del sistema lo hacen inadecuado para uso terapeutico. Por ejemplo, la

proteina de fusion E3/E2 muestra un epitopo antigenico de hemaglutinina de influenza, el genoma del virus se integra en el cromosoma huesped, que puede activar genes huesped perjudiciales y los presentes autores han encontrado que los titulos del virus fueron bajos comparados con el titulo de particulas pseudotipificadas con una envoltura de VSV-G. De manera significativa, las cepas de virus Sindbis con una mutacion que evita el correcto tratamiento de E3 de la glucoproteina E2 (denominada Umutantes pE2U), tales como SVGmu, crecen de manera deficiente en estirpes celulares permitidas y son atenuadas seriamente en patogenicidad en raton.

Una alineacion de la proteina E3-E2 SVGmu usada en la patente internacional WO 2008/011636 para pseudotipificar un vector lentivirico contra tres variantes de proteina E ejemplares de la presente invencion se muestra en la Figura 1. La numeracion indicada en la Figura 1 es por referencia a la cepa HR de proteinas de envoltura de virus Sindbis. A menos que se indique de otro modo, la numeracion usada en la presente memoria es por referencia a esta cepa de virus Sindbis. Los presentes autores han modificado la proteina SVGmu para proporcionar un sistema de produccion lentivirica mejorado. Las particulas viricas de la invencion se producen en un titulo significativamente mayor que aquellos usando SVGmu y tambien estimulan una respuesta inmunitaria mas fuerte. Ademas, las particulas lentiviricas pseudotipificadas presentan titulo mejorado e infectividad mejorada al tiempo que se mantiene la selectividad para las CD.

En una realizacion, la invencion proporciona una particula de vector lentivirico que comprende: (a) una envoltura que comprende (i) una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico o una variante de la SEC ID N°: 1 del mismo con al menos 80% de identidad para la SEC ID N°: 1 y en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico, capaz de infectar celulas dendriticas; en la que E2 no es parte de una proteina de fusion con virus Sindbis E3 y (b) un genoma de vector lentivirico que comprende una o mas secuencias de interes.

La variante puede ser capaz de unirse a DC-SIGN. Preferiblemente, tambien presenta union reducida a sulfato de heparan comparado con una proteina de referencia de cepa HR. La proteina E2 de la cepa HR se muestra como SEC ID N°: 18.

Preferiblemente, 160X es uno de los aminoacidos pequeros o alifaticos, incluyendo glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina. En un aspecto, 160X esta ausente o es glicina, valina, leucina o isoleucina. En una realizacion, X es glicina.

Una variante de la SEC ID N°: 1 se define como que comprende una secuencia con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1 en que 160X es retenido y como se definio anteriormente. La variante puede tener una o mas de las lisinas y argininas en los restos 50 a 180 de expansion de la region suprimidas o sustituidas independientemente con un aminoacido no basico. En una realizacion, el aminoacido no basico es acido glutamico o acido aspartico.

En un aspecto, el resto X se selecciona de una supresion, glicina, valina, leucina o isoleucina y una o mas de las lisinas y argininas en los restos 50 a 180 de expansion de la region son suprimidas o sustituidas independientemente con un aminoacido no basico.

En otro aspecto, X se selecciona de una supresion, glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina y una o mas de las lisinas y argininas en los restos 50 a 180 de expansion de la region, incluyendo preferiblemente al menos la posicion 159, son suprimidas o sustituidas independientemente con acido glutamico o acido aspartico.

Los aminoacidos cargados positivamente, candidatos, que pueden ser sustituidos o suprimidos, incluyen lisinas en los restos 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149 y 159 y arginina en los restos 65, 92, 128, 137, 157, 170 y 172 (la numeracion se refiere a la SEC ID N°: 1). Cuando se sustituyen, la sustitucion se puede elegir independientemente de acido glutamico o acido aspartico.

En realizaciones particulares, se suprime o sustituye uno o mas de los restos de lisina 70, 76 y 159. Cuando se sustituyen, las sustituciones se pueden elegir independientemente de acido glutamico o acido aspartico.

Como el virus Sindbis presenta un genoma de ARN, las variaciones - incluyendo sustituciones, inserciones o supresiones -ademas de las mencionadas anteriormente se pueden realizar para partes de la secuencia E2 de la SEC ID N°: 1, dentro del alcance de la homologia en porcentaje a la SEC ID N°: 1 definida anteriormente. Por ejemplo, existen variantes de la SEC ID N°: 1 en que la posicion 3 es T o V, 23 es V, 209 es R, 264 es G y 393 es H. Se puede realizar uno o mas de estos cambios u otras variaciones para la SEC ID N°: 1, siempre que la variante mantenga la capacidad para infectar las CD.

En una realizacion, las variantes no contienen inserciones en la region entre los restos 70 y 76 de la SEC ID N°: 1. En esta realizacion, la secuencia de los restos 71-75 de la SEC ID N°: 1 puede ser igual o puede comprender una o dos sustituciones que no afectan a la capacidad de la variante para infectar las CD.

En algunos casos, primero se expresa proteina E2 como una poliproteina en fusion con al menos E3 o en fusion con una secuencia lider. En algunas realizaciones, E2 se expresa como parte de poliproteina E3-E2-6K-E1. El virus Sindbis expresa de manera natural E2 como parte de una poliproteina y las regiones de union para E3/E2, E2/6K y 6K/E1 presentan secuencias reconocidas y escindidas por endopeptidasas. La secuencia de poliproteinas E3/E2 se presenta como SEC ID N°: 20. Normalmente, la union E3/E2 se escinde por furina o una serina endopeptidasa tipo furina entre los restos 65 y 66 de la poliproteina E3/E2. La furina presenta especificidad para restos arginina apareados que estan separados por dos aminoacidos. Para mantener Escision E3/E2 por furina, los restos 62-66

5 (RSKRS; SEC ID N°: 26) deberian mantener los dos restos arginina con separacion de dos aminoacidos y el resto serina.

En una realizacion de la invencion, la poliproteina comprende una secuencia E3 que corresponde a los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20 o una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia para los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20, en la que los

10 restos 62-65 son RSKR (SEC ID N°: 27) y la variante es capaz de incorporarse a una envoltura virica pseudotipificada. Preferiblemente, la parte E2 de la poliproteina es cualquiera de las realizaciones como se definio en la presente memoria anteriormente.

Alternativamente, se puede usar una secuencia de escision diferente en vez de la secuencia de escision de furina E3/E2 o cualquiera de las otras secuencias de escision. Los sitios de reconocimiento y escision se pueden

15 incorporar para endopeptidasas, incluyendo, sin limitacion, endopeptidasas asparticas (por ej., catepsina D, quimosina, proteasa VIH), cisteina endopeptidasas (bromelainas, papaina, calpaina), metaloendopeptidasas, (por ej., colagenasa, termolisina), serina endopeptidasas (por ej., quimotripsina, factor IXa, factor X, trombina, tripsina), estreptocinasas. Las secuencias del sitio de reconocimiento y escision para estas enzimas son conocidas.

En el caso de que se use dicho sitio de escision, se puede introducir en una poliproteina E3 que comprende al

20 menos los restos 1-60, tales como los restos 1-61 o 1-62 de la SEC ID N°: 20 o una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia o al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98% de identidad de secuencia al correspondiente numero de restos de la SEC ID N°: 20, fusionados directamente en el C-terminal a dicha secuencia de escision, que a su vez se fusiona a la parte E2 de la poliproteina. Preferiblemente, la parte E2 de la poliproteina es cualquiera de las realizaciones como se definio en la presente memoria anteriormente.

25 Las secuencias de proteina E2 de la invencion incluyen las variantes de la SEC ID N°: 1 en que la 160X es como se definio en la siguiente Tabla y la proteina es como se presenta en la SEC ID N°: 1 aparte de los siguientes restos 70, 76 y 159 y 160, que son como sigue:

SEC ID N°:

70 76 159 160X

3

E K E G

4

E E E G

5

E K E L

6

E E E L

7

K K E G

8

K K E L

9

K E E G

10

K E E L

11

K E K G

12

K E K L

13

E K K G

14

E K K L

15

E E K G

16

E E K L

Opcionalmente, cada una de las secuencias anteriores puede comprender uno o mas cambios adicionales a la SEC ID N°: 1 con los restos 71-75 de la SEC ID N°: 1 que son iguales o puede tener una o dos sustituciones que no afecten a la capacidad de la variante para infectar las CD, pero no modifiquen el numero de aminoacidos en esta region.

Las secuencias de proteina E2 adicionales de la invencion comprenden la SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 7, SEC ID N°: 9, SEC ID N°: 11, SEC ID N°: 13 o SEC ID N°: 15 en que el resto 160 es Ala, Ile, Leu o Val en vez de Gly. Dichas variantes tambien pueden comprender los restos 71-75 de la SEC ID N°: 1 que son iguales o pueden tener una o dos sustituciones que no afecten a la capacidad de la variante para infectar las CD, pero no modifiquen el numero de aminoacidos en esta region.

Opcionalmente la secuencia E2 de las SEC ID Nos: 3-15 o las variantes adicionales descritas en los dos parrafos anteriores, se pueden variar en otras posiciones para proporcionar una secuencia E2 con al menos 80% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1. UAl menos 80% de identidad de secuenciaU incluye una identidad de secuencia cualquiera de al menos 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 98%.

En las realizaciones anteriores, el primer resto E2, que corresponde a la posicion 66 de la SEC ID N°: 20, puede ser Ser.

Como se indico anteriormente, las secuencias E2 de la invencion, incluyendo cualquiera de las SEC ID Nos: 3-15 y las variantes de las mismas descritas en los tres parrafos precedentes, se pueden expresar a partir de una poliproteina que comprende al menos una secuencia E3/E2 y preferiblemente una secuencia de poliproteinas E3/E2/6K/E1 de Sindbis. La secuencia de poliproteinas E3 en cada una de las realizaciones puede ser la de los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20 o cualquiera de las variantes de la misma descritas anteriormente, incluyendo las variantes con un sitio de escision no natural.

Sumario de la invenci6n

Esta solicitud de patente se refiere a vectores lentiviricos pseudotipificados que comprenden un genoma con una secuencia de interes y una envoltura que comprende una glucoproteina de un arbovirus. La glucoproteina de arbovirus puede ser de virus Sindbis, virus del Dengue y virus de la encefalitis equina venezolana. En particular, cuando la glucoproteina es una proteina E2 de virus Sindbis, la proteina E2 tiene al menos una modificacion de aminoacidos en el resto 160 comparado con una SEC ID N°: 1. La modificacion de aminoacidos puede ser una supresion o un aminoacido distinto de acido glutamico. La glucoproteina E2 puede ser alternativamente una proteina variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1 y tambien presenta una modificacion del resto 160 que es una supresion o un aminoacido distinto de acido glutamico. La glucoproteina facilita la infeccion de celulas dendriticas. En todos los casos la glucoproteina E2 no es parte de una proteina de fusion con virus Sindbis E3. En algunas realizaciones, la glucoproteina E2 o variante se une a CD-SIGN. El vector lentivirico tambien comprende un genoma lentivirico que comprende una secuencia de interes.

En algunas realizaciones, el resto 160 esta ausente o es glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina. En una realizacion, el resto 160 es glicina. Ademas pueden tener lugar otras modificaciones de glucoproteina E2 en combinacion con las modificaciones mencionadas del resto 160. Dicha modificacion es un cambio de un aminoacido para reducir la carga positiva neta de E2. Una manera de reducir la carga positiva neta es cambiar una de las lisinas para un aminoacido que no es basico. En realizaciones particulares, se modifica una o mas de lisina 70, lisina 76 o lisina 159. En algunas realizaciones, se cambia una o mas de estas lisinas a un acido glutamico o un acido aspartico. En realizaciones especificas, la glucoproteina E2 es una de las SEC ID Nos: 3-16. Ejemplos de combinaciones de modificaciones incluyen, sin limitacion, una modificacion de acido glutamico en la posicion 160 y la modificacion de una o mas de lisina 70, lisina 76 o lisina 159 a un resto no basico. Tambien se pueden realizar otras modificaciones, en combinacion con la modificacion del resto 160 y opcionalmente cualquiera de las otras modificaciones desveladas en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de las glucoproteinas E2 mencionadas previamente puede comprender opcionalmente una o mas sustituciones, inserciones o supresiones mas. Como un ejemplo especifico, el sitio de escision de proteinas entre E2 y E3 puede ser la secuencia natural o una secuencia modificada que se escinde por una endopeptidasa diferente. En otras realizaciones, que pueden estar en combinacion con cualquiera de las anteriores, la secuencia de restos 71-75 de la SEC ID N°: 1 es igual o presenta una o dos sustituciones de aminoacidos que no afectan a la capacidad de la variante para infectar las CD.

En algunas realizaciones, el genoma de vector lentivirico de cualquiera de las particulas viricas anteriores comprende una secuencia de interes que codifica un antigeno especifico del tumor o un antigeno derivado de virus, tal como un antigeno de VIH o VIS. En algunas realizaciones, cualquiera de las particulas del vector descritas se produce a un titulo de al menos 105/ml UI.

En otro aspecto, se proporciona un sistema de empaquetamiento de vector lentivirico para producir una particula de vector lentivirico pseudotipificado, que comprende: una primera molecula de acido nucleico que codifica una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que el resto 160 esta ausente o un aminoacido distinto de acido glutamico o una variante de la misma capaz de infectar celulas dendriticas con al menos 80% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1 y en que el resto 160 esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico, una segunda molecula de acido nucleico que codifica proteinas gag y pol; una tercera molecula de acido nucleico que codifica rev y un genoma de vector lentivirico que comprende una secuencia de interes. La glucoproteina E2 o variante del sistema de empaquetamiento presenta una secuencia de aminoacidos como se definio en cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, la proteina pol tiene una integrasa no funcional. En una realizacion particular, la integrasa no funcional tiene una mutacion D64V. En algunas realizaciones, la segunda molecula de acido nucleico es un genoma lentivirico no integrante. En realizaciones particulares, el sitio aff muta o se suprime o el sitio PPT muta o se suprime o ambos. El genoma lentivirico no integrante se puede usar en asociacion con una integrasa no funcional y en combinacion con cualquiera de las proteinas E2 o las variantes. Se prefiere que se produzcan las particulas del vector lentivirico a un titulo de al menos 105 UI/ml. En algunos casos, se transinfecta una celula con las moleculas de acido nucleico primera y cuarta descritas anteriormente. La celula puede comprender ya las moleculas de acido nucleico segunda y tercera, en una transformacion estable.

Se proporciona una molecula de acido nucleico aislada que codifica la glucoproteina como se describio anteriormente o una glucoproteina E3/E2 opcionalmente en la forma de una poliproteina Sindbis E3/E2/6K/E1 o una glucoproteina E3/E2 en la que la secuencia E3 corresponde a los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20 o una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia para los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20, en la que los restos 62-65 son RSKR (SEC ID N°: 27) y la variante es capaz de incorporarse a una envoltura virica pseudotipificada, opcionalmente ademas en la que el resto 1 de la poliproteina E2 es Ser. La glucoproteina E2 puede ser cualquiera de las variantes descritas anteriormente, incluyendo las combinaciones de modificaciones. Ademas, se proporciona un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico, ya que es una celula huesped que comprende el vector de expresion.

Se proporciona un metodo para preparar una particula de vector lentivirico de una cualquiera de las variantes o combinaciones anteriores, que comprende expresar en una celula una primera molecula de acido nucleico que codifica una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que el resto 160 es distinto de acido glutamico

o una variante de la misma capaz de infectar celulas dendriticas con al menos 80% de identidad de secuencia para la SEC ID N°: 1 y en que el resto 160 esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico y (ii) una segunda molecula de acido nucleico en la que se puede transcribir la segunda molecula de acido nucleico y la transcripcion reunida en una particula de vector lentivirico pseudotipificado.

Cualquiera de las particulas de vector lentivirico se puede usar en un metodo de tratamiento de un ser humano o individuo animal. El tratamiento puede ser una vacuna para inmunizacion, en que la vacuna es profilactica o terapeutica. Una vacuna comprende la particula de vector lentivirico con un excipiente farmaceuticamente aceptable. Alternativamente, se pueden administrar particulas de vector lentivirico a celulas in vitro, que comprenden la mezcla de las celulas con cualquiera de las particulas de vector lentivirico anteriores.

Estos y otros aspectos de la presente invencion llegaran a ser evidentes con referencia a la siguiente descripcion detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripci6n de los dibujos

La Figura 1 es una alineacion de secuencias de la proteina de envoltura para cuatro envolturas de virus Sindbis, SVGmu, SIN-Var1, SIN-Var2 y SIN-Var3. La alineacion se muestra relativa a SVGmu, una envoltura de Sindbis descrita previamente. Las principales diferencias para SVGmu incluyen la regeneracion del sitio de escision de proteasas tipo furina (RSKR; SEC ID N°: 27) entre E3 y E2, eliminacion de la etiqueta epitopo de HA y una serie de sustituciones de lisina para reducir union de heparina.

La Figura 2 es un esquema de vectores ejemplares usados en particulas viricas de empaquetado.

La Figura 3 presenta graficos de titulos de sobrenadante bruto de preparaciones de particulas de vector lentivirico en que el genoma del vector se pseudotipifico con tres proteinas diferentes de envoltura de virus Sindbis, SVGmu y SIN-HR. Se generaron sobrenadantes de virus por transinfeccion transitoria usando metodos clasicos y se recogieron 48 horas post transinfeccion. Los titulos se determinaron sobre celulas 293T que expresan CD-SIGN humanas (293T-CD-SIGN). Los titulos se expresan como el numero de unidades que expresan GFP por ml de sobrenadante y son medios de tres transinfecciones independientes. Las barras de error representan la desviacion estandar de la media.

Las Figuras 4A, 4B y 4C son graficos que muestran respuestas inmunologicas de celulas T en ratones despues de administracion de particulas de vector lentivirico pseudotipificado. (A) Se inmunizaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con una de dos dosis (indicado en ng p24) de OVA que codifica un vector lentivirico deficiente de integracion. El numero y la funcion de celulas T CD8 especificas de OVA257 en el bazo se determinaron el dia 9 por multimero CPH-l/peptido y tincion intracelular de citocinas. (B) Se inmunizaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con un intervalo de administracion de OVA que codifica un vector lentivirico deficiente de integracion. El porcentaje de celulas T CD8 especificas de OVA257 en el bazo se determino el dia 11 por tincion de multimero CPH-l/peptido.

(C) Se inmunizaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con un intervalo de administracion de OVA que codifica un vector lentivirico deficiente de integracion. El porcentaje de celulas T CD8 especificas de OVA257 en el bazo se determino el dia 9 por tincion intracelular de citocinas.

La Figura 5A presenta dibujos de genomas lentiviricos ejemplares. La Figura 5B presenta secuencias de la region U3 de tres construcciones de vectores. (A) Los elementos contenidos en todos los vectores lentiviricos se muestran en el genoma del vector ejemplar en la parte superior. Los activadores utilizados incluyen el activador de Ubiquitina-C humana (UbiC), el activador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) o el activador de virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en ingles). Ademas de la region SIN U3 estandar, se muestra una serie de supresiones extendidas. Las alineaciones de secuencias de las regiones U3 de todos los 3 vectores se muestran en (B). La secuencia mostrada incluye el tramo de polipurina (PPT), que es suprimida en la construccion 704 y la supresion U3 extendida presente en ambas construcciones 703 y 704.

Las Figuras 6A y 6B muestran la expresion GFP de vector lentivirico despues de transduccion de celulas 293T. En la Figura 6A, GFP se unio de manera operativa a un activador de UbiC y en la Figura 6B, GFP se unio de manera operativa a un activador de CMV. Se determinaron los niveles de expresion de GFP de vectores lentiviricos deficientes en integrasa 48 h despues de transduccion de CD-SIGN que expresa celulas 293T. La expresion de GFP en celulas transducidas se determino por metodos de flujo citometrico clasicos; un total de 50.000 procesos se recogio de cada mezcla de celulas transducidas para determinar niveles medios de expresion.

La Figura 7 muestra el numero de celulas positivas de GFP durante cinco pases. Las celulas se transdujeron con diferentes preparaciones de vectores y se pasaron cada 72 h. Los titulos GFP relativos se determinaron en cultivos de celulas 293T transducidos con diferentes construcciones NILV. Se empaquetaron vectores usando Integrasa de tipo natural (IN+) o una Integrasa mutante D64V (IN-) y se usaron para transducir CD-SIGN que expresa celulas 293. Despues se pasaron los cultivos de celulas transducidos cada 72 horas durante 15 dias. En cada pase, el numero de celulas GFP+ en el cultivo se determino usando metodos de flujo citometrico clasicos. La perdida de expresion de GFP con el pase indica perdida de episomas de vectores con el tiempo.

La Figura 8 muestra respuesta de celulas T CD8 despues de administracion de vector lentivirico de integracion (lntwt)

o no integracion (lntD64V). Se inmunizaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con 2,5x1010 genomas de vector lentivirico de integracion (lntwt) o no integracion (lntD64V) que codifican el antigeno Gag de virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS). Se determino el numero de celulas T especificas del antigeno en el bazo y su perfil de secrecion de citocinas el dia 10 por tincion intracelular de citocinas.

La Figura 9 presenta graficos que muestran el tamaro de tumores en ratones que reciben vehiculo solo o particulas viricas que codifican un antigeno tumoral (grafica izquierda) y porcentaje de supervivencia (grafica derecha). Se inyectaron ratones BALB/c por via subcutanea con 2x104 celulas de carcinoma de colon CT26. Un dia despues, los ratones se trataron por via subcutanea con vehiculo o 3,2 Ig (capside p24) de vector lentivirico no integrante que fija como objetivo CD (CD-NILV) que codifica el peptido AH1A5 (SPSYAYHQF; SEC ID N°: 25), un epitopo de celulas T CT26 CD8. Se representa el crecimiento tumoral inicial y la supervivencia a largo plazo de ratones vacunados frente al de control.

Descripci6n detallada

La presente descripcion proporciona metodos y composiciones para celulas dendriticas diana (las CD) usando una particula de vector lentivirico (por ej., un virion, una particula lentivirica) para suministrar una secuencia de interes a las CD. La particula de vector lentivirico comprende una variante de glucoproteina de envoltura derivada de virus Sindbis E2 y un genoma que comprende la secuencia de interes y opcionalmente otros componentes. La variante de glucoproteina presenta union reducida a sulfato de heparan comparado con HR, una cepa de virus Sindbis de referencia. La glucoproteina de envoltura facilita la infeccion de celulas dendriticas por las particulas de vector lentivirico. UFacilita U la infeccion, como se usa en la presente memoria, es lo mismo que facilita la transduccion y se refiere a la funcion de la glucoproteina de envoltura, que actua sola o de acuerdo con otras moleculas, en la activacion o mejora de entrada mediada por receptor de una particula de retrovirus o lentivirus pseudotipificada en una celula diana.

En general, las particulas de vector lentivirico se producen por una estirpe celular que contiene uno o mas vectores plasmidos y/o elementos integrados que codifican juntos los componentes necesarios para generar particulas de vector funcionales. Estas particulas de vector lentivirico no son tipicamente competentes para replicacion, es decir, son solo capaces de una sola vuelta de infeccion. Lo mas frecuentemente, se utilizan multiples vectores plasmidos o casetes de expresion individuales integrados de manera estable en el cromosoma celular productor para separar los diversos componentes geneticos que generan las particulas de vector lentivirico, sin embargo, se puede usar un solo vector plasmido con todos los componentes lentiviricos. En una ejemplificacion, la estirpe de empaquetamiento se transinfecta con uno o mas plasmidos que contienen el genoma de vector virico, incluyendo las LTR, una secuencia de empaquetamiento que actua en cis y la secuencia o las secuencias de interes, al menos un plasmido que codifica los componentes enzimaticos y estructurales del virus (por ej., gag y pol) y al menos un plasmido que codifica una glucoproteina de envoltura de Arbovirus. Las particulas viricas brotan a traves de la membrana celular y comprenden un nucleo que incluye tipicamente dos genomas de ARN que contienen la secuencia de interes y una glucoproteina de envoltura de Arbovirus que fija como objetivo celulas dendriticas. Cuando la glucoproteina de Arbovirus es una glucoproteina E2 de virus Sindbis, se logra que la glucoproteina presente union reducida a sulfato de heparan comparado con la HR de la cepa de referencia. Esto normalmente implica al menos un cambio de aminoacidos comparado con la secuencia de glucoproteinas E2 de HR.

Sin desear estar limitados por la teoria, se cree que la union de la particula virica a una superficie celular induce endocitosis, llevando el virus a un endosoma, provocando la fusion de la membrana y permitiendo que el nucleo del virus entre en el citosol. Para ciertas realizaciones, que utilizan la integracion de particulas del vector lentivirico, despues de transcripcion inversa y migracion del producto al nucleo, el genoma del virus se integra en el genoma de la celula diana, incorporando la secuencia o las secuencias de interes en el genoma de la celula diana. Para reducir la posibilidad de mutagenesis por insercion y activar la expresion transitoria de un antigeno o antigenos diserados, sin embargo, otras realizaciones utilizan particulas no integrantes del vector lentivirico, que no se integran en el genoma de la celula diana, pero en su lugar expresan la secuencia o las secuencias de interes de un episoma. De cualquier modo, la CD infectada expresa entonces la secuencia o las secuencias de interes, por ej., un antigeno, una molecula estimuladora. El antigeno puede ser tratado despues por las celulas dendriticas y presentado a celulas T y B, generando una respuesta inmunitaria especifica del antigeno. No se requiere la ruta especifica descrita anteriormente siempre que la celula dendritica sea capaz de estimular una respuesta inmunitaria especifica del antigeno.

Las particulas viricas se pueden administrar a un individuo para proporcionar un efecto profilactico o terapeutico. El producto de la secuencia de interes es tipicamente un antigeno de un agente causante de enfermedad o una celula enferma (por ej., celula tumoral). Despues de la infeccion de las celulas dendriticas y expresion del producto, se genera una respuesta inmunitaria al producto. La respuesta inmunitaria puede ser humoral o celular o ambas.

A. Envoltura del vector virico

Los virus transmitidos por los artropodos (Arbovirus) son virus que son transmitidos a un huesped, tales como seres humanos, caballos o pajaros por un vector de artropodo infectado tal como un mosquito. Los arbovirus se dividen ademas en subfamilias de virus incluyendo alfavirus y flavivirus, que tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva y una envoltura que contiene glucoproteina. Por ejemplo, el virus de la fiebre del dengue, el virus de la fiebre amarilla y el virus del Nilo Occidental pertenecen a la familia del flavivirus y virus Sindbis, el virus del bosque Semiliki y el virus de la Encefalitis Equina Venezolana, son miembros de la familia alfavirus (Wang et al. J. Virol. 66, 4.992 (1.992)). La envoltura de virus Sindbis incluye dos glucoproteinas transmembrana (Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2.005)): E1, se cree que es responsable de la fusion y E2, se cree que es responsable de la union celular. Las glucoproteinas de envoltura del virus Sindbis son conocidas para pseudotipificar otros retrovirus, incluyendo oncoretrovirus y lentivirus.

Como se discutio anteriormente, se puede usar una glucoproteina de envoltura de arbovirus para pseudotipificar un genoma de vector con base lentivirica. Un lentivirus UpseudotipificadoU es una particula lentivirica que tiene una o mas glucoproteinas de envoltura que estan codificadas por un virus que es distinto del genoma lentivirico. La glucoproteina de envoltura se puede modificar, mutar o lograr como se describe en la presente memoria.

La envoltura de virus Sindbis y otros alfavirus se incorpora a la bicapa lipidica de la membrana de la particula virica y tipicamente incluye multiples copias de dos glucoproteinas, E1 y E2. Cada glucoproteina tiene regiones de expansion de membrana; E2 tiene un dominio citoplasmatico de aproximadamente 33 restos mientras la cola citoplasmatica de E1 es muy corta (aproximadamente 2 restos). Tanto E1 como E2 tienen acidos palmiticos unidos a, o cerca de, las regiones de expansion de membrana. E2 se sintetiza inicialmente como una proteina precursora que se escinde por furina u otra Serina proteinasa dependiente de Ca2+ en E2 y una glucoproteina pequera denominada E3. Situada entre las secuencias que codifican E2 y E1 hay una secuencia que codifica una proteina denominada 6K. E3 y 6K son secuencias de seral que sirven para traslocar las glucoproteinas E2 y E1, respectivamente, en la membrana. En el genoma del virus Sindbis, la region codificadora para proteinas de envoltura de Sindbis incluye secuencia que codifica E3, E2, 6K y E1. Como se usa en la presente memoria, la UenvolturaU de un virus arbovirus incluye al menos E2 y tambien puede incluir E1, 6K y E3. Una secuencia ejemplar de glucoproteinas de envoltura de virus Sindbis, cepa HR, se presenta como la SEC ID N°. 17. Las secuencias de glucoproteinas de envoltura para otros arbovirus se pueden encontrar por ej., en GenBank. Por ejemplo, la secuencia que codifica las glucoproteinas del virus del Dengue se puede encontrar en el Acceso GQ252677 (entre otros en GenBank) y en la base de datos de variacion de virus en NCBI y la secuencia que codifican glucoproteinas de envoltura del virus de la encefalitis equina venezolana en el Acceso NP 040824.

Aunque el receptor o los receptores celulares en las celulas dendriticas para alfavirus y virus Sindbis en particular, no se han identificado definitivamente hasta la fecha, un receptor parece ser CD-SIGN (Klimstra et al., J Virol 77: 12.022, 2.003). El uso de los terminos UadhesionU, UunionU, Ufijar como objetivoU y similares se usan indistintamente y no estan destinados a indicar un mecanismo de la interaccion entre glucoproteina de envoltura de virus Sindbis y un componente celular. El CD-SIGN (No Integrina Capturadora de ICAM-3 (Moleculas de Adhesion Intracelular 3) Especifica de Celulas Dendriticas; tambien conocida como CD209) es receptor similar a lectina de tipo C capaz de unirse rapido y endocitosis de materiales (Geijtenbeek, T. B., et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2.004). Parece que E2 fija como objetivo el virus a celulas dendriticas a traves de CD-SIGN. Como se muestra en la presente memoria, las celulas que expresan CD-SIGN son transducidas por particulas del vector virico pseudotipificadas con E2 de virus Sindbis mejor (al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces mejor) que las celulas isogenicas que no expresan CD-SIGN. El mecanismo de como la glucoproteina E2 facilita la infeccion virica parece que implica CD-SIGN, posiblemente a traves de union directa a CD-SIGN o que causa un cambio en la conformacion o algun otro mecanismo. Sin tener en cuenta el mecanismo real, la fijacion como objetivo por E2 es preferente para celulas que expresan CD-SIGN, esto es celulas dendriticas.

Tambien parece que el virus Sindbis se une a celulas via sulfato de heparan (Klimstra et al., J Virol 72: 7.357, 1.998; Burmes y Griffin, J Virol 72: 7.349, 1.998). Debido a que el sulfato de heparan y otros glucosaminoglucanos de superficie celular se encuentran en la superficie de la mayoria de los tipos de celulas, es deseable reducir la interaccion entre sulfato de heparan y glucoproteinas de envoltura Sindbis. Esto se puede llevar a cabo por disminucion de la union de envoltura de virus Sindbis a sulfato de heparan o aumento de la union, por ej., aumentando avidez, de envoltura de virus Sindbis a celulas dendriticas o ambos. Como resultado, la union no especifica a otras moleculas, que se puede expresar por otros tipos de celulas y que puede tener lugar incluso si la envoltura es especifica para CD-SIGN, se reduce, y la especificidad mejorada puede servir para evitar efectos secundarios no deseados, tales como efectos secundarios que pueden reducir la respuesta inmunitaria deseada o los efectos secundarios asociados a transduccion fuera del objetivo de otros tipos de celulas. Alternativamente o ademas de las ventajas de transduccion relativamente especifica de celulas que expresan CD-SIGN, las particulas viricas pseudo-tipificadas con glucoproteina E2 de envoltura de virus Sindbis pueden ofrecer otras ventajas sobre las particulas viricas pseudo-tipificadas con glucoproteinas tales como VSVG. Ejemplos de dichas ventajas incluyen lisis mediada por complemento reducida y/o fijacion como objetivo de neuronas reducida, ambas de las cuales se cree que se asocian a la administracion de particulas viricas pseudo-tipificadas de VSV-G.

En diversas ejemplificaciones, las particulas de vector lentivirico se unen especificamente a celulas que expresan CD-SIGN y presentan union reducida o anulada a sulfato de heparan. Esto es, se puede modificar una glucoproteina E2 de envoltura de virus Sindbis para dirigir preferentemente el virus a celulas dendriticas que expresen CD-SIGN con respecto a otros tipos de celulas. Basandose en la informacion obtenida de estudios estructurales y modelado molecular entre otros estudios, se diseran secuencias de variante de proteinas de envoltura, especialmente glucoproteinas E2 y E1, y se generan de manera que las glucoproteinas mantengan sus funciones como proteinas de envoltura, pero tengan la especificidad de union, avidez o nivel de union deseado. Se pueden crear secuencias de variantes candidatas para cada glucoproteina y ensayar usando los metodos descritos a continuacion u otros metodos conocidos en la tecnica, para identificar glucoproteinas de envoltura con las caracteristicas mas deseables.

Algunas secuencias de variantes de E2 Sindbis presentan al menos una modificacion de aminoacidos en el resto 160 cuando se compara con la SEC ID N°: 1. Se suprime o se cambia el resto 160 a un aminoacido distinto de acido glutamico. Una modificacion es lo mas comunmente una sustitucion de al menos un aminoacido, pero alternativamente puede ser una adicion o supresion de uno o mas aminoacidos. Preferiblemente, todos los aminoacidos adicionales son pocos en numero y no comprenden un epitopo antigenico (por ej., secuencia de tag hemaglutinina), que puede comprometer la seguridad. Cuando hay dos o mas modificaciones, ambas pueden ser del mismo tipo (por ej., sustitucion) o tipos diferentes (por ej., una sustitucion y una supresion). Se pueden dispersar o situar de manera contigua multiples modificaciones en la secuencia proteinica.

En el primer caso, las secuencias de variantes comprenden al menos una modificacion de aminoacidos en la region de aproximadamente el resto 50 a aproximadamente el resto 180. Dentro de esta region son los aminoacidos los que estan implicados en la union a sulfato de heparan. Reduciendo la carga positiva neta de E2, se puede reducir la interaccion electrostatica con sulfato de heparan, dando como resultado union disminuida a sulfato de heparan. Los aminoacidos cargados positivamente candidatos en esta region incluyen lisinas en los restos 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 y arginina en los restos 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172 (Bear et al., Virology 347: 183-190, 2.006). Al menos varios de estos aminoacidos estan implicados directamente en la union de E2 a sulfato de heparan. La carga positiva neta se puede reducir por supresion de lisina o arginina o sustitucion de lisina o arginina con un aminoacido neutro o cargado de manera negativa. Por ejemplo, una o mas de estas lisinas y argininas se pueden reemplazar con acido glutamico o aspartico. Algunas realizaciones presentan al menos una sustitucion de lisina 70, 76 o 159. En los casos en que E2 se expresa como una poliproteina con E3, se mantiene la lisina situada adyacente al sitio de union E3/E2 natural -esto es, la secuencia de reconocimiento y el sitio de escision no se modifican. Alternativamente, la secuencia del sitio de escision de endopeptidasa natural se reemplaza con una secuencia de reconocimiento para una endopeptidasa diferente.

Algunas de las variantes de E2 tambien se pueden modificar de una manera que influya de manera positiva en la union a celulas dendriticas. La modificacion del acido glutamico encontrado en el resto 160 en la secuencia HR de referencia puede mejorar la union a celulas dendriticas (vease Gardner et al., J Virol 74, 11.849, 2.000. las modificaciones, tales como una supresion del resto 160 o sustitucion del resto 160 se encuentran en algunas variantes. En variantes particulares, un aminoacido no cargado es sustituido por Glu, en otras variantes, un aminoacido no acido es sustituido por Glu. Tipicamente, Glu160 se reemplaza con uno de los aminoacidos pequeros o alifaticos, incluyendo glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina.

Otras variantes comprenden dos o mas modificaciones de aminoacidos. Tipicamente en estas variantes una de las modificaciones es Glu160 y la modificacion o las modificaciones restantes son cambios de una o mas de las lisinas y argininas en el resto aproximadamente 50 a aproximadamente 180 de expansion de la region. Algunas de las variantes comprenden una modificacion de Glu160 en un resto no acido o supresion y una o mas modificaciones de lisina 70, lisina 76 o lisina 159 con un aminoacido no basico. Algunas variantes especificas comprenden una Glu160 a Gly, Lys 70 a Glu y Lys 159 a Glu; una Glu 160 a Gly, Lys 70, 76 y 159 a Glu; una supresion de Glu 160 y Lys 70 y 159 a Glu y una supresion de Glu 160 y Lys 70, 76 y 159 a Glu.

En algunos casos, la proteina E2 primero se expresa como una poliproteina en fusion con al menos E3 o en fusion con una secuencia lider. Sin tener en cuenta si la secuencia lider es E3 u otra secuencia, E2 en la envoltura virica deberia estar exenta de la E3 u otra secuencia lider. En otras palabras, E2 no es preferiblemente una proteina de fusion E3/E2 (por ej., la proteina de fusion E3/E2 denominada SVGmu). En algunas realizaciones, E2 se expresa como parte de la poliproteina E3-E2-6K-E1. El virus Sindbis se expresa de manera natural E2 como parte de una poliproteina y las regiones de union para E3/E2, E2/6K y 6K/E1 presentan secuencias reconocidas y escindidas por endopeptidasas. Normalmente, la union E3/E2 es escindida por furina o una serina endopeptidasa tipo furina entre los restos 65 y 66. La furina presenta especificidad por restos arginina apareados que estan separados por dos aminoacidos. Para mantener la escision E3/E2 por furina, los restos 62-66 (RSKRS; SEC ID N°: 26) deberian mantener los dos restos arginina con separacion de dos aminoacidos y el resto serina. Alternativamente, se puede usar una secuencia de escision diferente en vez de la secuencia de escision de furina E3/E2 o cualquiera de las otras secuencias de escision. Los sitios de reconocimiento y escision pueden ser incorporados por endopeptidasas, incluyendo, sin limitacion, endopeptidasas asparticas (por ej., catepsina D, quimosina, proteasa VIH), cisteina endopeptidasas (bromelainas, papaina, calpaina), metaloendopeptidasas, (por ej., colagenasa, termolisina), serina endopeptidasas (por ej., quimotripsina, factor IXa, factor X, trombina, tripsina), estreptocinasas. Las secuencias del sitio de reconocimiento y escision para estas enzimas son conocidas.

Tambien se pueden modificar aminoacidos en E2, distintos de los ya mencionados. En general, una secuencia de variante E2 tendra al menos el 80% de identidad de secuencias de aminoacidos para la secuencia de referencia E2

o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95% o al menos 98% de identidad de secuencia. La glucoproteina de la variante deberia presentar funcion biologica, tal como la capacidad para facilitar la infeccion de celulas dendriticas por una particula virica con una envoltura que comprende E2. Los experimentos han identificado regiones de glucoproteinas de envoltura que parecen tener una funcion importante en diversos aspectos de conjunto virico, adhesion a superficie celular e infeccion. Cuando se preparan las variantes, se puede usar la siguiente informacion como directrices. La cola citoplasmatica de E2 aproximadamente los restos 408 a 415 -es importante para el conjunto virico (West et al. J Virol 80: 4.458-4.468,

2.006. Otras regiones estan implicadas en la formacion de estructura secundaria (aproximadamente los restos 3353) y estan implicadas en el transporte y la estabilidad de la proteina (aproximadamente los restos 86-119) (Navaratmarajah et al., J Virol 363: 124-147, 2.007. La variante puede retener caracter hidrofobo de una region que expande la membrana, aproximadamente los restos 370-380. La variante puede retener uno o los dos restos de los sitios de glucosilacion ligados a N NIT (restos 196-198) y NFT (restos 318-320) y puede retener uno o mas de los sitios que estan palmitoilados (C-396, C416 y C417) (Strauss y Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1.994; pags. 499509). Por otra parte, muchas regiones de E2 se pueden modificar sin proceso perjudicial. Por ejemplo, las inserciones de transposones en muchas diferentes posiciones en E2 aun dan como resultado virus viable (Navaratmarajah, ibidem).

En algunas realizaciones, se puede incorporar un peptido con etiqueta a las proteinas E3, 6K o E1. Para algunos fines, se puede incorporar una etiqueta a E2, pero no es deseable una etiqueta para uso en un producto para administracion a pacientes humanos. Se puede usar un peptido con etiqueta, que es una secuencia corta (por ej., 530 aminoacidos), para facilitar la deteccion de expresion de la envoltura y su presencia en particulas viricas. Para los fines de deteccion, una secuencia de etiqueta sera detectable tipicamente por anticuerpos o productos quimicos. Otro uso para una etiqueta es facilitar la purificacion de particulas viricas. Se puede usar un sustrato que contiene una pareja de union para la etiqueta para absorber el virus. La elucion del virus se puede llevar a cabo por tratamiento con un resto que desplaza la etiqueta de la pareja de union o cuando la secuencia de la etiqueta esta ligada con una secuencia escindible, el tratamiento con la endopeptidasa apropiada permitira convenientemente la liberacion de virus. (Vease, por ejemplo, Qiagen catalog, Factor Xa Protease System). La eliminacion del peptido con etiqueta es en general deseable para fines de seguridad del uso de particulas viricas en individuos animales. Si no se retira la etiqueta, puede tener lugar una respuesta inmunitaria a la etiqueta.

Las etiquetas adecuadas incluyen, sin limitacion, FLAG (DYKDDDDK) (Patente de EE.UU. N° 4.703.004, para las que los anticuerpos estan comercialmente disponibles, proteina de union a quitina, proteina de union a maltosa, glutation-S-transferasa, poli(His) (Patente de EE.UU. N° 4.569.794), tiorredoxina, etiqueta de HA (hemaglutinina), entre otros. Poli(His) puede ser adsorbido en medio de afinidad que contiene iones metalicos ligados, por ej., niquel

o cobalto y se eluye con un medio de pH bajo.

Se pueden evaluar las particulas viricas para determinar la especificidad de la glucoproteina de envoltura incorporada al virus que fija como objetivo celulas dendriticas. Por ejemplo, se puede obtener una poblacion mixta de celulas de medula osea de un individuo y cultivar in vitro. Alternativamente, se pueden obtener y usar estirpes celulares isogenicas que expresan o no expresan CD-SIGN. El virus recombinante se puede administrar a la poblacion mixta de celulas de medula osea o estirpes celulares isogenicas y se puede ensayar la expresion de un gen indicador incorporado al virus en las celulas cultivadas. Algunas realizaciones pueden emplear un analisis de dilucion limitante, en que la poblacion mixta de celulas se divide en partes separadas, que se incuban despues por separado con cantidades decrecientes de virus (por ej., 2 veces, 5 veces, 10 veces menos de virus en cada parte). En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 60%, 70%, 80% o 90%, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 95% de celulas infectadas en la poblacion de celulas mixtas son celulas dendriticas que expresan CD-SIGN. En algunas realizaciones, la proporcion de celulas dendriticas infectadas a celulas no dendriticas infectadas (o celulas que no expresan CD-SIGN) es al menos aproximadamente 2:1, al menos aproximadamente 3:1, al menos aproximadamente 4:1, al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 9:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 30:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 50:1, al menos aproximadamente 100:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 500:1, al menos aproximadamente 1.000:1, al menos aproximadamente 5.000:1, al menos aproximadamente 10.000:1 o mas. Para dilucion limitante, se observa mayor selectividad tipicamente a mayores diluciones (es decir, cantidades inferiores) de virus de entrada.

La actividad de particulas viricas pseudotipificadas se puede determinar por cualquiera de una variedad de tecnicas. Por ejemplo, un metodo preferido para medir la eficacia de infectividad (UI, unidades infecciosas) es por administracion de particulas viricas a celulas y medicion de la expresion de un producto codificado en el genoma del vector. Se puede usar cualquier producto que se pueda ensayar. Un tipo de producto conveniente es una proteina fluorescente, tal como proteina fluorescente verde (GFP, por sus siglas en ingles). La GFP y el ensayo se ejemplifican en los Ejemplos, tales como Ejemplo 3. Otros productos que se pueden usar incluyen proteinas expresadas en una superficie celular (por ej., deteccion por union de anticuerpos), enzimas y similares. Si el producto es un antigeno y las celulas son celulas dendriticas, se puede evaluar la infectividad / actividad por determinacion de una respuesta inmunitaria. Ademas, es posible determinar efectos secundarios en un mamifero. La capacidad para fijar como objetivo especificamente celulas dendriticas tambien se puede ensayar directamente, por ejemplo, en cultivo celular como se describe a continuacion.

Tambien se puede preparar y ensayar en particulas viricas su selectividad y/o su capacidad para facilitar la penetracion de la membrana de la celula diana. Las particulas viricas que presentan una envoltura con glucoproteinas no modificadas se pueden usar como controles para comparacion. En pocas palabras, las celulas que expresan un receptor para una glucoproteina de envoltura son infectadas por el virus usando un ensayo de infeccion clasico. Despues de un tiempo especificado, por ejemplo 48 horas post-infeccion, se pueden recoger las celulas y el porcentaje de celulas infectadas por el virus se puede determinar por citometria de flujo, por ejemplo. La selectividad se puede puntuar por calculo del porcentaje de celulas infectadas por virus. De manera similar, el efecto de una glucoproteina de envoltura de la variante sobre el titulo virico se puede cuantificar dividiendo el porcentaje de celulas infectadas por virus que comprende una envoltura de la variante por el porcentaje de celulas infectadas por virus que comprenden la correspondiente glucoproteina de envoltura de cepa natural (no modificada). Una variante adecuada en particular tendra la mejor combinacion de selectividad y titulo infeccioso. Una vez que se selecciona una variante, se pueden realizar ensayos de concentracion virica para confirmar que estos virus se puedan concentrar sin comprometer la actividad. Se recogieron y se concentraron sobrenadantes viricos por ultracentrifugacion. Los titulos de virus se pueden determinar por dilucion limitada de disolucion madre virica e infeccion de celulas que expresan el receptor para la glucoproteina de envoltura, midiendo la expresion de un producto expresado por los virus como se describio anteriormente.

La entrada de una particula de vector lentivirico en una celula diana es otro tipo de evaluacion de actividad. Se ha utilizado proteina de fusion BlaM-Vpr (beta-lactamasa Vpr) para evaluar la penetracion virica VIH-1; se puede usar una fusion de BlaM y una glucoproteina de envoltura de virus Sindbis, tal como E1 o una proteina de fusion E2/E1 para evaluar la eficacia de una proteina de envoltura en facilitar la fusion y la penetracion en una celula diana. Se pueden preparar particulas viricas, por ejemplo, por transinfeccion transitoria de celulas de empaquetamiento con uno o mas vectores que comprende los elementos viricos, BlaM-Vpr, y la envoltura de la variante de interes (y una molecula de afinidad si es apropiado). Los virus resultantes se pueden usar para infectar celulas que expresan una molecula la molecula que se fija como objetivo (o molecula de afinidad) se une especificamente en ausencia o presencia del inhibidor libre de union (tal como un anticuerpo). Despues se pueden lavar las celulas con medio independiente de CO2 y se cargaron con colorante CCF2 (Aurora Bioscience). Despues de incubacion a temperatura ambiente para permitir la terminacion de la reaccion de escision, se pueden fijar las celulas mediante paraformaldehido y se analizaron por citometria de flujo y microscopia. La presencia de celulas azules indica la penetracion de virus en el citoplasma; se esperarian menos celulas azules cuando se arade anticuerpo de bloqueo (Cavrois et al. Nat Biotechnol 20: 1.151-1.154, 2.002).

Para investigar si la penetracion depende de un pH bajo y para identificar glucoproteinas de envoltura con la dependencia del pH deseada, se puede aradir NH4CI u otro compuesto que modifique el pH a la etapa de infeccion (NH4CI neutralizara los compartimentos acidos de los endosomas). En el caso de NH4CI, la desaparicion de celulas azules indicara que la penetracion de virus depende del pH bajo. Ademas, para confirmar que la actividad depende del pH, se pueden aradir agentes lisosomotropicos, tales como cloruro de amonio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina Al, monensina, nigericina, etc., al tampon de incubacion. Estos agentes elevan el pH dentro de los compartimentos endosomales (por ej., Drose y Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1.997). El efecto inhibitorio de estos agentes revelara la funcion de pH para la fusion y la entrada virica. Se pueden comparar las diferentes cineticas de entrada entre los virus que muestran diferentes moleculas fusogenicas y lo mas adecuado se seleccionan para una aplicacion particular.

Se pueden utilizar ensayos de entrada a base de PCR para controlar la transcripcion inversa y medir la cinetica de la sintesis de ADN virica como una indicacion de la cinetica de entrada virica. Por ejemplo, se incuban particulas viricas que comprenden una molecula de proteina de envoltura particular con celulas diana, tales como celulas 293T, las CD o cualquier otra celula que se haya logrado para que exprese o que exprese de manera natural, la pareja de union apropiada (receptor) para la molecula de proteina de envoltura. Inmediatamente o despues de un incremento de tiempo (para permitir que tenga lugar infeccion), se retiran los virus no ligados y se analizan alicuotas de las celulas para acidos nucleicos viricos. Se extrae ADN de estas alicuotas y se someten a analisis de multiplicacion, en general en un ensayo semi-cuantitativo, sensibilizado con cebadores especificos de LTR. La aparicion de productos de ADN especifico de LTR indica el exito de la entrada virica.

B. Genoma del vector lentivirico

La particula del vector virico comprende un genoma, que comprende la secuencia o las secuencias de interes. Se pueden incluir otras secuencias, tales como secuencias que permiten el genoma que se tiene que empaquetar en la particula virica y las secuencias que activan la expresion de la secuencia o las secuencias de interes despues de transduccion de la celula diana. El genoma puede ser derivado de cualquiera de un gran numero de vectores a base de genoma lentiviricos disponibles, adecuados, incluyendo los identificados para aplicaciones de tratamiento de genes humanos, tales como los descritos por Pfeifer y Verma (Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211, 2.001). Por simplicidad, el genoma tambien se refiere como Ugenoma del vector viricoU o Ugenoma del vectorU.

1. Cadena principal

Los genomas de vector lentivirico adecuados incluyen los basados en Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH1), VIH-2, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la anemia infecciosa equina, Virus de la Inmunodeficiencia del Simio (VIS) y virus del maedi/visna. Una caracteristica deseable de los lentivirus es que pueden infectar celulas tanto divisorias como no divisorias, no es necesario que las celulas diana sean divisorias (o estimular que las celulas diana se dividan). En general, el genoma y las glucoproteinas de envoltura se basaran en diferentes virus, de manera que se pseudotipifique la particula de vector virico resultante. Los elementos de seguridad del genoma del vector son incorporados de manera deseable. Los elementos de seguridad incluyen LTR de auto-inactivacion y un genoma no integrante. Se discuten vectores ejemplares ademas en el Ejemplo 5 y la Figura 5 y se pueden usar dichos vectores en realizaciones de la invencion para expresion de antigenos de interes.

En algunas realizaciones ejemplares, el genoma virico del vector comprende secuencias de un genoma lentivirico, tal como el genoma del VIH-1 o el genoma del SIV. La construccion del genoma virico puede comprender secuencias de las LTR 5' y 3' de un lentivirus y en particular puede comprender las secuencias R y U5 de la LTR 5' de un lentivirus y una LTR 3' inactivada o auto-inactivada de un lentivirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de VIH, SIV, VIF o VIB. Tipicamente, las secuencias LTR son secuencias LTR de VIH.

El genoma del vector puede comprender una LTR 3' inactivada o auto-inactivada (Zufferey et al. J Virol 72: 9.873, 1.998; Miyoshi et al., J Virol 72: 8.150, 1.998). Un vector auto-inactivante presenta, en general, una supresion del potenciador y secuencias activadoras de la repeticion terminal larga 3' (LTR, por sus siglas en ingles), que se copia en la LTR 5' durante la integracion del vector. En un caso, el elemento U3 de la LTR 3' contiene una supresion de su secuencia potenciadora, la caja TATA, los sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la LTR 3' auto-inactivante, el provirus que se genera despues de la entrada y transcripcion inversa comprendera una LTR 5' inactivante. La razon es para mejorar la seguridad por reduccion del riesgo de movilizacion del genoma del vector y la influencia de la LTR en activadores celulares proximos. La LTR 3' auto-inactivante se puede construir por cualquier metodo conocido en la tecnica.

Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR 5' lentivirica se puede reemplazar con una secuencia activadora en la construccion virica, tal como una secuencia activadora heterologa. Esto puede aumentar el titulo de virus recuperado de la estirpe celular de empaquetamiento. Tambien se puede incluir una secuencia potenciadora. Se puede usar cualquier combinacion de potenciador/activador que aumente la expresion del genoma virico de ARN en la estirpe celular de empaquetamiento. En un ejemplo, se usa la secuencia potenciadora /activadora de CMV (patente de EE.UU. 5385839 y patente de EE.UU. 5168062).

En algunas realizaciones, se minimiza el riesgo de mutagenesis por insercion por construccion del genoma lentivirico del vector para que la integracion sea deficiente. Se puede seguir una serie de propuestas para producir un genoma no integrante del vector. Estas propuestas implican lograr una mutacion o mutaciones en el componente de enzima integrasa del gen pol, de manera que codifique una proteina con una integrasa inactiva. El propio genoma del vector se puede modificar para evitar la integracion por, por ejemplo, mutacion o supresion de uno o mas sitios de adhesion o preparar el tramo de polipurina proximal (PPT, por sus siglas en ingles) de LTR 3' no funcional a traves de supresion o modificacion. Ademas, estan disponibles propuestas no geneticas; estas incluyen agentes farmacologicos que inhiben una o mas funciones de la integrasa. Las propuestas no son mutuamente excluyentes, esto es, mas de una de ellas se puede usar a la vez. Por ejemplo, tanto la integrasa como los sitios de adhesion pueden ser no funcionales o la integrasa y el sitio PPT pueden ser no funcionales o los sitios de union y el sitio PPT pueden ser no funcionales o todos ellos pueden ser no funcionales.

Como se indico anteriormente, una propuesta es preparar y usar una integrasa no funcional. La integrasa esta implicada en la escision de ADN romo bicatenario virico y union de los extremos a 5'-fosfatos en las dos cadenas de de un sitio diana cromosomico. La integrasa presenta tres dominios funcionales: dominio N-terminal, que contiene una unidad que se une a cinc (HHCC), el nucleo del dominio central, que contiene el nucleo catalitico y una unidad DD35E conservada (D64, D116, E152 en VIH-1) y un dominio C-terminal, que tiene propiedades de union de ADN. Las mutaciones de punto introducidas en la integrasa son suficientes para romper la funcion normal. Se han construido y caracterizado muchas mutaciones de la integrasa (vease, Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy

18: 483, 2.007; Apolonia, Thesis submitted to University College London, Abril 2.009, pags. 82-97; Engelman et al. J Virol 69: 2.729, 1.995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1.121, 2.006). La secuencia que codifica la proteina integrasa puede ser suprimida o mutada para hacer la proteina inactiva, preferiblemente sin debilitar de manera significativa la actividad de la transcriptasa inversa o la fijacion como objetivo nuclear, evitandose de ese modo solo la integracion del provirus en el genoma de la celula diana. Las mutaciones aceptables pueden reducir la catalisis de la integrasa, transferencia de cadenas, union a sitios aff, union a un ADN cromosomico huesped y otras funciones. Por ejemplo, una sola sustitucion de acido aspartico a asparagina en el resto 35 de integrasa de VIH o SIV suprime completamente la integracion de ADN virico. Las supresiones de la integrasa estaran confinadas en general al dominio C-terminal. La supresion de secuencia codificadora para los restos 235-288 da como resultado una integrasa no funcional util (Engelman et al. J Virol 69: 2.729, 1.995). Como ejemplos adicionales, se pueden generar mutaciones, por ejemplo, Asp64 (se proporcionan los numeros de los restos para VIH-1, se pueden determinar facilmente los numeros de los restos correspondientes para la integrasa de otros lentivirus o retrovirus por un experto) (por ej., D64E, D64V), Asp116 (por ej., D116N), Asn120 (por ej., N120K), Glu152, GIn148 (por ej., Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (por ej.,W235E), Lys264 (por ej., K264R), Lys266 (por ej., K266R), Lys273 (por ej., K273R). Se pueden construir otras mutaciones y ensayar para integracion, expresion de transgenes y cualquier otro parametro deseable. Los ensayos para estas funciones son conocidos. Se pueden generar mutaciones por cualquiera de una variedad de tecnicas, incluyendo mutagenesis dirigida y sintesis quimica de secuencia de acidos nucleicos. Se pueden realizar una mutacion o puede ser presente mas de una de estas mutaciones en la integrasa. Por ejemplo, una integrasa puede presentar mutaciones en dos aminoacidos, tres aminoacidos, cuatro aminoacidos, etc.

Alternativamente o en combinacion con el uso del mutante o los mutantes de la integrasa, los sitios de adhesion (aff) en U3 y U5 tambien pueden ser mutados. La integrasa se une a estos sitios y el dinucleotido 3'-terminal se escinde en los dos extremos del genoma del vector. Un dinucleotido CA esta situado en el extremo 3' retraido; el CA es requerido para el proceso, mutacion de la integracion de los bloques de nucleotidos en el cromosoma huesped. La A del dinucleotido CA es el nucleotido mas critico para integracion y las mutaciones en los dos extremos del genoma proporcionaran los mejores resultados (Brown et al J Virol 73: 9.011 (1.999). En una ejemplificacion, el CA en cada extremo se cambia a TG. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo se cambia a TG en un extremo y GT en el otro extremo. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo se suprime; en otras ejemplificaciones, la A del CA es suprimido en cada extremo.

La integracion tambien se puede inhibir por mutacion o supresion de tramo de polipurina (PPT, por sus siglas en ingles) (patente internacional WO 2009/076524), situado de manera proximal a la LTR 3'. El PPT es una secuencia de polipurina de aproximadamente 15 nucleotidos que puede servir como un sitio de union de cebador para la sintesis de ADN de cadena positiva. En este caso, las mutaciones o supresiones de PPT fijan como objetivo el proceso de transcripcion inversa. Sin desear estar sujeto a un mecanismo, por mutacion o supresion de PPT, la produccion de ADN lineal se reduce radicalmente y esencialmente solo se producen ciclos de ADN de LTR-1. La integracion requiere un genoma del vector de ADN bicatenario lineal y la integracion se elimina esencialmente sin el. Como se indico anteriormente, un PPT se puede hacer no funcional por mutacion o por supresion. Tipicamente, se suprime el PPT completo de aproximadamente 15 nt, aunque en algunas realizaciones, se pueden realizar supresiones mas cortas de 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt y 2 nt. Cuando se realizan mutaciones, tipicamente se realizan multiples mutaciones, especialmente en la mitad 5' del PPT (McWilliams et al., J Virol 77: 11.150, 2.003), aunque las mutaciones sencillas y dobles en las primeras cuatro bases aun reducen la transcripcion. Las mutaciones realizadas en el extremo 3' de PPT tienen en general un efecto mas espectacular (Popozo y Levin J Virol 70: 5.288,1.996).

Estas diferentes propuestas para hacer no integrante un genoma del vector se pueden usar de manera individual o en combinacion. Usar mas de una propuesta se puede usar para construir un vector de seguridad a traves de mecanismos redundantes. Asi, se pueden combinar mutaciones o supresiones de PPT con mutaciones o supresiones del sitio aff o con mutaciones de la Integrasa o se pueden combinar mutaciones o supresiones de PPT con tanto mutaciones o supresiones del sitio aff como de mutaciones de la Integrasa. De manera similar, las mutaciones o supresiones del sitio aff y las mutaciones de la Integrasa se pueden combinar entre si o con mutaciones o supresiones de PPT.

2. Elementos reguladores

Como se discute en la presente memoria, el genoma virico del vector comprende una secuencia de interes que es deseable expresar en celulas diana. Tipicamente, la secuencia de interes esta situada entre las secuencias LTR 5' y LTR 3'. Ademas, la secuencia de interes esta preferiblemente en una relacion funcional con otros elementos geneticos, por ejemplo las secuencias reguladoras de la transcripcion incluyendo activadores o potenciadores, para regular la expresion de la secuencia de interes de un modo particular. En algunos casos, las secuencias utiles reguladoras de la transcripcion son aquellas que estan muy reguladas con respecto a la actividad, tanto de manera temporal como espacial. Los elementos de control de la expresion que se pueden usar para regular la expresion de los componentes son conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, activadores inducibles, activadores constitutivos, serales de secrecion, potenciadores y otros elementos reguladores.

La secuencia de interes y cualquier otra secuencia que se pueda expresar estan tipicamente en una relacion funcional con secuencias reguladoras de activador/potenciador internas. Un activador/potenciador UinternoU es uno que esta situado entre las secuencias LTR 5' y las LTR 3' en la construccion del vector virico y esta unido de manera operable a la secuencia de interes. El activador/potenciador interno puede ser cualquier activador, potenciador o combinacion de activador/potenciador conocida para aumentar la expresion de un gen con que esta en una relacion funcional. Una Urelacion funcionalU y Uunido de manera operableU significan, sin limitacion, que la secuencia esta en la posicion y orientacion correcta con respecto al activador y/o potenciador en que se expresara la secuencia de interes cuando el activador y/o potenciador este en contacto con las moleculas apropiadas.

La eleccion de un activador/potenciador interno se basa en el patron de expresion deseado de la secuencia de interes y las propiedades especificas de activadores /potenciadores conocidos. Asi, el activador interno puede ser activo de manera constitutiva. Ejemplos no limitantes de activadores constitutivos que se pueden usar incluyen el activador para ubiquitina (patente de EE.UU. 5510474; patente internacional WO 98/32869), CMV (Thomsen et al., PNAS 81: 659, 1.984; patente de EE.UU. 5168062), beta-actina (Gunning et al. 1.989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:

4.831 -4.835) y pgk (vease, por ejemplo, Adra et al. 1.987 Gene 60: 65-74; Singer-Sam et al. 1.984 Gene 32: 409417 y Dobson et al. 1.982 Nucleic Acids Res. 10: 2.635-2.637).

Alternativamente, el activador puede ser un activador especifico del tejido. En algunas realizaciones preferidas, el activador es un activador especifico de celulas diana. Por ejemplo, el activador puede ser de cualquier producto expresado por celulas dendriticas, incluyendo CD11c, CD103, las TLR, CD-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, receptor de manosa, Dectin-1, Clec9A, CPH clase ll. Ademas, los activadores se pueden seleccionar para que permitan la expresion inducible de la secuencia de interes. Se conoce una serie de sistemas para expresion inducible en la tecnica, incluyendo el sistema sensible a la tetraciclina, el sistema represor del operador lac, asi como los activadores sensibles a una variedad de cambios medioambientales o fisiologicos, incluyendo choque termico, iones metalicos, tales como activador de metalotioneina, interferones, hipoxia, esteroides, tales como activador de receptores de progesterona o glucocorticoides, radiacion, tal como activador de VEGF. Tambien se puede usar una combinacion de activadores para obtener la expresion deseada del gen de interes. El experto en la materia podra seleccionar un activador basandose en el patron de expresion deseado del gen en el organismo o la celula diana de interes.

El genoma virico puede comprender al menos un activador sensible a la ARN Polimerasa II o III. Este activador puede estar unido de manera operable a la secuencia de interes y tambien puede estar unido a una secuencia de terminacion. Ademas, se puede incorporar mas de un activador de la ARN Polimerasa II o III. Los activadores de la ARN Polimerasa II o III son conocidos para un experto en la materia. Se puede encontrar un intervalo adecuado de activadores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule and White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pags. 1.283-1.298 (2.000). Los activadores de la ARN polimerasa II o III tambien incluyen cualquier fragmento de ADN sintetico o logrado que pueda dirigir la ARN polimerasa II o III para transcribir aguas abajo Secuencias codificadoras de ARN. Ademas, el activador o los activadores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte del genoma del vector virico pueden ser inducibles. Cualquier activador de Pol II o III inducible adecuado se puede usar con los metodos de la invencion. Los activadores de Pol II o III particularmente adecuados incluyen los activadores sensibles a tetraciclina proporcionados en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pags. 577-585 (2.000) y en Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pags. 1.672-1.682 (2.001).

Tambien puede ser presente un potenciador interno en la construccion virica para aumentar la expresion del gen de interes. Por ejemplo, se puede usar el potenciador de CMV (Boshart et al. Cell, 41: 521, 1.985). Se han identificado y caracterizado muchos potenciadores en genomas viricos, tales como VIH, CMV y en genomas de mamiferos (vease GenBank). Un potenciador se puede usar en asociacion con un activador heterologo. Un experto en la materia podra seleccionar el potenciador apropiado basandose en el patron de expresion deseado.

Un genoma del vector virico contendra normalmente un activador que es reconocido por la celula diana y que esta unido de manera operable a la secuencia de interes, componentes viricos y otras secuencias como se discute en la presente memoria. Un activador es un elemento de control de expresion formado por una secuencia de acidos nucleicos que permita la union de la ARN polimerasa y que tenga lugar transcripcion. Los activadores pueden ser inducibles, constitutivos, activos de manera temporal o especificos del tejido. La actividad de los activadores inducibles se induce por la presencia o ausencia de factores bioticos o abioticos. Los activadores inducibles pueden ser una herramienta util en ingenieria genetica debido a que la expresion de los genes a que estan unidos de manera operable se puede activar o desactivar en ciertas fases del desarrollo de un organismo, su fabricacion o en un tejido particular. Los activadores inducibles se pueden agrupar como activadores regulados de manera quimica y activadores regulados de manera fisica. Los activadores regulados de manera quimica tipicos incluyen, pero no se limitan a, activadores regulados por alcohol (por ej., activador del gen de alcohol deshidrogenasa I (alcA)), activadores regulados por la tetraciclina (por ej., activador sensible a la tetraciclina), activador regulado por los esteroides (por ej., activador a base de receptor de glucocorticoides de rata (GR, por sus siglas en ingles), activador a base de receptor de estrogenos humanos (ER, por sus siglas en ingles), activador a base de receptor de ecdisona de polilla y los activadores basados en la superfamilia de receptores de esteroides/retinoides/tiroides), activadores regulados por metales (por ej., activadores a base de gen de metalotioneina) y activadores relacionados con la patogenesis (por ej., activadores a base de proteinas relacionados con patogenos (PR, por sus siglas en ingles) Arabidopsis y del maiz). Los activadores regulados de manera fisica tipicos incluyen, pero no se limitan a, activadores regulados por la temperatura (por ej., activadores de choque termico) y activadores regulados por la luz (por ej., activador de SSU de la soja). Otros activadores ejemplares se describen en otra parte, por ejemplo, en UPromoters used to regulate gene expressionU en el sitio web Patent Lens, accedido el 18 de mayo de 2.009.

Un experto en la materia podra seleccionar un activador apropiado basandose en las circunstancias especificas. Muchos diferentes activadores son conocidos en la tecnica, ya que son metodos para unir de manera operable el activador al gen que se tiene que expresar. Se pueden usar tanto secuencias activadoras naturales como muchos activadores heterologos para dirigir la expresion en la celula de empaquetamiento y celula diana. Se prefieren activadores heterologos, sin embargo, ya que permiten en general mayor transcripcion y mayores rendimientos de la proteina deseada cuando se compara con el activador natural.

Se puede obtener el activador, por ejemplo, de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus 40 del Simio (SV40). El activador tambien puede ser, por ejemplo, un activador de mamiferos heterologo, por ej., el activador de actina o un activador de inmunoglobulina, un activador de choque termico o el activador normalmente asociado a la secuencia natural, siempre que dichos activadores sean compatibles con la celula diana. En una realizacion, el activador es el activador virico que se encuentra en la naturaleza en un sistema de expresion virica. En algunas realizaciones, el activador es un activador especifico de celulas dendriticas. El activador especifico de celulas dendriticas puede ser, por ejemplo, activador CD11c.

La transcripcion se puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector o los vectores. Los potenciadores son tipicamente elementos que actuan en cis de ADN, normalmente aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actuan sobre un activador para aumentar su transcripcion. Muchos secuencias potenciadoras son ahora conocidas de genes de mamiferos (globina, elastasa, albumina, alfa-fetoproteina e insulina) y de virus de celulas eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el ultimo lado del origen de la replicacion (bp 100-270), el potenciador de activador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el ultimo lado del origen de la replicacion y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede ser empalmado al vector en una posicion 5' o 3' a la secuencia de polinucleotido especifica de antigeno, pero se situa preferiblemente en un sitio 5' del activador.

Los vectores de expresion tambien pueden contener secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran con frecuencia en la 5' y ocasionalmente 3', regiones no traducidas de ADN o ADNc de eucariotas o viricos y son conocidos en la tecnica.

El genoma virico del vector tambien puede contener elementos geneticos adicionales. Los tipos de elementos que se pueden incluir en la construccion no estan limitados de ninguna manera y se pueden elegir para conseguir un resultado particular. Por ejemplo, se puede incluir una seral que facilite la entrada nuclear del genoma virico en la celula diana. Un ejemplo de dicha seral es la seral de la solapa del VIH-1. Ademas, se pueden incluir elementos que faciliten la caracterizacion del sitio de integracion de provirus en la celula diana. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia supresora ambar de ARNt en la construccion. Una secuencia aisladora de por ej., tambien se puede incluir �-globina de pollo en la construccion de genoma virico. Este elemento reduce la posibilidad de silenciar un provirus integrado en la celula diana debido a efectos de metilacion y heterocromatinizacion. Ademas, el aislante puede proteger el potenciador interno, activador y gen exogeno de efectos de posicion positivos o negativos de ADN circundante al sitio de integracion en el cromosoma. Ademas, el genoma del vector puede contener uno o mas elementos geneticos diserados para activar la expresion del gen de interes. Por ejemplo, se puede reemplazar un elemento sensible al virus de la hepatitis de la marmota (WRE, por sus siglas en ingles) en la construccion (Zufferey et al. 1.999. J. Virol. 74: 3.668-3.681; Deglon et al. 2.000. Hum. Gene Ther. 11: 179-190.

El genoma virico del vector se construye tipicamente en una forma de plasmido que se puede transinfectar en una estirpe celular de empaquetamiento o productora. El plasmido comprende en general secuencias utiles para la replicacion del plasmido en las bacterias. Dichos plasmidos son conocidos en la tecnica. Ademas, los vectores que incluyen un origen procariota de replicacion tambien pueden incluir un gen cuya expresion confiera un marcador detectable o seleccionable tal como una resistencia a los farmacos. Los productos con resistencia a los farmacos bacterianos tipicos son los que confieren resistencia a la ampicilina o tetraciclina.

Los plasmidos que contienen uno o mas de los componentes descritos en la presente memoria son facilmente construidos usando tecnicas clasicas conocidas en la tecnica. Para analisis para confirmar las secuencias correctas en los plasmidos construidos, se puede replicar el plasmido en E. coli, purificar y analizar por digestion de endonucleasa de restriccion o determinar su secuencia de ADN por metodos convencionales.

Tambien se pueden usar vectores construidos para expresion transitoria en celulas de mamifero. La expresion transitoria implica el uso de un vector de expresion que es capaz de replicacion de manera eficaz en una celula huesped, de manera que la celula huesped acumula muchas copias del vector de expresion y, a su vez, sintetiza altos niveles del polipeptido codificado por el polinucleotido especifico del antigeno en el vector de expresion. Vease Sambrook et al., supra, pags. 16.17-16.22. Otros vectores y metodos adecuados para adaptacion a la expresion de los polipeptidos son conocidos en la tecnica y se adaptan facilmente a las circunstancias especificas.

Usando las explicaciones proporcionadas en la presente memoria, un experto en la materia reconocera que la eficacia de un sistema de expresion particular se puede ensayar por transinfeccion de celulas de empaquetamiento con un vector que comprende un gen que codifica una proteina informadora y midiendo la expresion usando una tecnica adecuada, por ejemplo, midiendo la fluorescencia de un conjugado de proteina fluorescente verde. Son conocidos los genes informadores adecuados en la tecnica.

3. Tipos de secuencias de interes.

La secuencia de interes no esta limitada de ninguna manera e incluye cualquier acido nucleico que un experto desee integrar, transcribir y expresar en la celula diana. El producto puede ser una proteina o un acido nucleico. La secuencia de interes puede codificar una proteina o una molecula de acido nucleico, incluyendo ARNsi, ARNmicro, un ARN bicatenario auto-complementario en que la region complementaria es mayor que aproximadamente 20 ribonucleotidos de longitud o un ARN que es complementario a un ARN mensajero, donde la union de dicho ARN complementario (anti-sentido) al ARN mensajero bloquea su capacidad para que se traduzca en proteina. En algunos casos, la secuencia de interes puede codificar un antigeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. En particular, son deseables antigenos tumorales y antigenos de enfermedades infecciosas de los agentes tales como VIH, SHV, HCV, HPV, malaria o tuberculosis.

En algunos casos, la secuencia de interes puede ser un gen que codifique un ARN inhibidor pequero (ARNsi) o un ARNmicro (ARNmi) de interes que consigue aminorar la expresion de una molecula. Por ejemplo, el gen que codifican un ARNsi o un ARNmicro se puede usar para conseguir aminorar la expresion de reguladores negativos en una celula, incluyendo los que inhiben la activacion o maduracion de celulas dendriticas. Los ARNsi y los ARNmicro son conocidos en la tecnica (Fire et al., Nature 391: 806, 1.998; vease tambien UThe RNA Interference ResourceU de Applied Biosystems, Trang et al. Oncogene Suppl 2: S52, 2.008; Taganov, K., et al. 2.007. Immunity 26: 133-137; Dahlberg, J. E. y E. Lund. 2.007. Sci. STKE 387: pe25; Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2.009). Alternativamente, la secuencia de interes puede codificar un ARN bicatenario auto-complementario en que la region complementaria es mayor que aproximadamente 20 ribonucleotidos de longitud o un ARN anti-sentido que es mayor que aproximadamente 20 ribonucleotidos de longitud. Los expertos en la materia apreciaran que las moleculas ARNsi, ARNmi, ARNds y ARN anti-sentido se pueden expresar de un activador de la ARN polimerasa III o, alternativamente, puede ser un componente de un ARN no codificador que se transcribe de un activador de la ARN polimerasa II.

Ademas, la secuencia de interes puede codificar mas de un producto. En algunas configuraciones, la secuencia que se tiene que suministrar comprende multiples genes que codifican al menos una proteina, al menos una molecula ARNsi, al menos una ARNmicro, al menos una ARNds o al menos una ARN anti-sentido o cualquier combinacion de las mismas. Por ejemplo, la secuencia que se tiene que suministrar puede incluir uno o mas genes que codifiquen uno o mas antigenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. El antigeno o mas antigenos se pueden asociar a una sola enfermedad o trastorno o se pueden asociar a multiples enfermedades y/o trastornos. En algunos casos, se puede incluir un gen que codifique una proteina reguladora inmunitaria junto con un gen que codifique un antigeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria y la combinacion puede provocar y regular la respuesta inmunitaria en la direccion y magnitud deseadas. En otros casos, se puede construir una secuencia que codifica una molecula de ARNsi, ARNmicro, ARNds o ARN anti-sentido con un gen que codifique un antigeno contra el que se desee una respuesta inmunitaria y la combinacion puede regular el alcance de la respuesta inmunitaria. Los productos se pueden producir como un producto de fusion inicial en que la secuencia codificadora esta en relacion funcional con un activador. Alternativamente, los productos se pueden codificar por separado y cada secuencia codificadora en relacion funcional con un activador. Los activadores pueden ser iguales o diferentes.

En algunas configuraciones, los vectores contienen secuencias de polinucleotidos que codifican factores de maduracion/estimuladores de celulas dendriticas. Las moleculas estimuladoras ejemplares incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible por farmacos (iCD40) y similares. Estos polinucleotidos estan tipicamente bajo el control de uno o mas elementos reguladores que dirijan la expresion de las secuencias codificadoras en celulas dendriticas. La maduracion de celulas dendriticas contribuye a vacunacion exitosa (Banchereau, J y Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306 (2.005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15: 138-147 (2.003); Figdor, C. G. et al. Nat. Med. 10: 475-480 (2.004)). La maduracion puede transformar las CD de celulas implicadas de manera activa en captura de antigenos en celulas especializadas para cebado de celulas T. Por ejemplo, el acoplamiento de CD40 por CD40L sobre celulas T colaboradoras con CD4 es una seral critica para maduracion de CD, dando como resultado una potente activacion de celulas T CD8. Dichas moleculas estimuladoras se refieren tambien como factores de maduracion o factores estimuladores de maduracion.

Los puntos de control inmunitarios representan barreras significativas a la activacion de inmunidad celular funcional en cancer y anticuerpos antagonistas especificos para ligandos inhibidores en celulas T incluyendo CTLA4 y muerte programada-1 (PD-1) son ejemplos de agentes diana que se estan evaluando en las clinicas. Un mecanismo de tolerancia significativo en infecciones cronicas y cancer es el agotamiento funcional de las celulas T especificas de Ag que expresan altos niveles de PD-1. Como se ha demostrado que la potencia de inmunizacion terapeutica esta significativamente mejorada por combinacion con control de los puntos de control inmunitarios, como un ejemplo no limitante, se puede apreciar por los expertos en la materia que una propuesta alternativa para inhibir el punto de control inmunitario es inhibir la expresion de los ligandos de muerte (PD) programada uno y dos (PD-L1/L2). Una manera de conseguir la inhibicion es por la expresion de moleculas de ARN tales como las descritas en la presente memoria, que reprimen la expresion de PD-L1/L2 en las CD transducidas con el vector lentivirico que codifica una o mas de las moleculas de ARN. La maduracion de las CD o la expresion de elementos particulares tales como puntos de control inmunitarios, por ejemplo ligandos PD-1, se puede caracterizar por analisis de citometria de flujo de regulacion ascendente de marcador superficial tal como CPH II y el perfil de quimiocinas y citocinas expresadas.

Se puede incluir una secuencia que codifica un producto detectable, normalmente una proteina, para permitir la identificacion de celulas que expresan el producto deseado. Por ejemplo, se incorpora una proteina de marcador fluorescente, tal como proteina fluorescente verde (GFP), a la construccion junto con una secuencia de interes (por ej., que codifique un antigeno). En otros casos, la proteina puede ser detectable por un anticuerpo o la proteina puede ser una enzima que actue sobre un sustrato para proporcionar un producto detectable o un producto que permita la seleccion de una celula diana transinfectada o transducida, por ejemplo confiera resistencia a los farmacos, tal como resistencia a la higromicina. Los genes de seleccion tipicos codifican proteinas que confieren resistencia a los antibioticos u otras toxinas adecuadas para uso en celulas eucariotas, por ej., neomicina, metotrexato, blasticidina, entre otros conocidos en la tecnica o deficiencias auxotropicas complemento o suministro de nutrientes criticos retenidos del medio. El marcador seleccionable puede estar presente opcionalmente en un plasmido separado e introducido por co-transinfeccion.

Se puede utilizar una o mas unidades de expresion multicistronicas que incluyan dos o mas de los elementos (por ej., secuencia(s) de interes, la molecula de envoltura, factores de maduracion de CD) necesarios para la produccion del virus deseado en celulas de empaquetamiento. El uso de vectores multicistronicos reduce el numero total de moleculas de acido nucleico requeridas y asi evita las posibles dificultades asociadas a la coordinacion de la expresion de multiples genoma de vectores. En un vector multicistronico los diversos elementos que se tienen que expresar se unen de manera operable a uno o mas activadores (y otros elementos de control de la expresion cuando sea necesario). En algunas configuraciones, un vector multicistronico comprende una secuencia de interes, una secuencia que codifica un producto informador y elementos viricos. La secuencia de interes codifica tipicamente un antigeno y opcionalmente, un factor de maduracion de CD. A veces, el vector multicistronico comprende un gen que codifica un antigeno, un gen que codifica un factor de maduracion de CD y elementos viricos.

Cada componente que se tenga que expresar en un vector multicistronico de expresion se puede separar, por ejemplo, por un elemento del sitio interno de entrada en el ribosoma (IRES, por sus siglas en ingles) o un elemento virico 2A, para permitir separar la expresion de las diversas proteinas del mismo activador. Los elementos de IRES y los elementos 2A son conocidos en la tecnica (Patente de EE.UU. N° 4.937.190; de Felipe et al. 2.004. Traffic 5: 616-626). En una realizacion, los oligonucleotidos que codifican las secuencias del sitio de escision de furina (RAKR) (Fang et al. 2.005. Nat. Biotech 23: 584-590, unidos a las secuencias de tipo 2A de virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV, por sus siglas en ingles), virus de la rinitis equina A (ERAV, por sus siglas en ingles) y virus del asigna de thosea (TaV, por sus siglas en ingles) (Szymczak et al. 2.004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) son usados para separar elementos geneticos en un vector multicistronico. La eficacia de un vector multicistronico particular se puede ensayar facilmente por deteccion de la expresion de cada uno de los genes usando protocolos clasicos.

En una ejemplificacion especifica, el genoma virico del vector comprende: una secuencia potenciador /activador de citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de la LTR 5' de VIH; una secuencia de empaquetamiento ( \); la seral de la solapa de VIH-1; un potenciador interno; un activador interno; un gen de interes; el elemento responsable del virus de la hepatitis de la marmota; una secuencia supresora ambar de ARNt; un elemento U3 con una supresion de su secuencia potenciadora; el aislante de -globina de pollo y las secuencias R y U5 de la LTR 3' del VIH. En algunas ejemplificaciones, el genoma del vector comprende una LTR 5' lentivirica intacta y una LTR 3' autoinactivante. (Iwakuma et al. Virology 15: 120, 1.999).

La construccion del genoma del vector se puede llevar a cabo usando cualquier tecnica de ingenieria genetica adecuada conocida en la tecnica, incluyendo, sin limitacion, las tecnicas clasicas de digestion de endonucleasa de restriccion, ligadura, transformacion, purificacion de plasmido y secuenciacion de ADN, por ejemplo como se describe en Sambrook et al. (1.989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

N. Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1.997)) y URNA Viruses: A Practical ApproachU (Alan J. Cann, Ed. Oxford University Press, (2.000)).

4. Produccion de particulas viricas.

Se puede usar cualquiera de una variedad de metodos ya conocidos en la tecnica para producir particulas lentiviricas infecciosas cuyo genoma comprende una copia de ARN del genoma virico del vector. En un metodo, el genoma virico del vector es introducido en una estirpe celular de empaquetamiento que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar ARN genomico virico, transcrito del genoma de vector virico, en particulas viricas. Alternativamente, el genoma virico del vector puede comprender uno o mas genes codificadores de componentes viricos ademas de una o mas secuencias de interes. Para prevenir la replicacion del genoma en la celula diana, sin embargo, se retiraran normalmente los genes viricos endogenos requeridos para la replicacion y se proporcionaran por separado en la estirpe celular de empaquetamiento.

En general, las particulas de vector lentivirico se producen por una estirpe celular que se transinfecta con uno o mas vectores plasmidos que contienen los componentes necesarios para generar las particulas. Estas particulas de vector lentivirico no son tipicamente competentes para la replicacion, �s d�cir, son solo capaces de una sola vuelta de infeccion. Lo mas frecuentemente, se utilizan multiples vectores plasmidos para separar los diversos componentes geneticos que generan las particulas de vector lentivirico, principalmente para reducir la posibilidad de procesos de recombinacion que podian de otro modo generar replicacion de virus competentes. Se puede usar un solo vector de plasmido con los componentes lentiviricos si se desea, sin embargo. Como un ejemplo de un sistema que emplea multiples vectores de plasmidos, se transinfecta una estirpe celular con al menos un plasmido que contiene el genoma virico del vector (es decir, el plasmido del genoma del vector), incluyendo las LTR, la secuencia de empaquetamiento que actua en cis y la secuencia o las secuencias de interes, que con frecuencia se unen de manera operable a un activador heterologo, al menos un plasmido que codifica los componentes enzimaticos y estructurales del virus (es decir, el plasmido de empaquetamiento que codifica componentes tales como, Gag y Pol), y al menos un plasmido de envoltura que codifica una glucoproteina de envoltura de Arbovirus. Se pueden usar plasmidos adicionales para mejorar la produccion de particulas de retrovirus, por ej., plasmidos de expresion de Rev, como se describe en la presente memoria y se conoce en la tecnica. Las particulas viricas brotan a traves de la membrana celular y comprenden un nucleo que incluye un genoma que contiene la secuencia de interes y una glucoproteina de envoltura de Arbovirus que fija como objetivo celulas dendriticas. Cuando la glucoproteina de Arbovirus es glucoproteina E2 de virus Sindbis, se logra que la glucoproteina presente union reducida a sulfato de heparan comparado con la cepa de HR de referencia.

La transinfeccion de celulas de empaquetamiento con vectores plasmidos de la presente invencion se puede llevar a cabo por metodos conocidos y el metodo que se tiene que usar no esta limitado de ningun modo. Se conoce una serie de sistemas de suministro no viricos en la tecnica, incluyendo por ejemplo, electroporacion, sistemas de suministro a base de lipidos incluyendo liposomas, suministro de ADN UdesnudoU y suministro usando compuestos de policiclodextrina, tales como los descritos en Schatzlein AG. (2.001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad). Se emplean tipicamente metodos de tratamiento de lipidos o sales cationicos, vease, por ejemplo, Graham et al. (1.973. Virol. 52: 456; Wigler et al. (1.979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1.373-76)). El metodo de precipitacion de fosfato de calcio es lo mas usado con frecuencia. Sin embargo, tambien se pueden usar otros metodos para introducir el vector en celulas, incluyendo microinyeccion nuclear y fusion de protoplastos bacterianos.

La estirpe celular de empaquetamiento proporciona los componentes, incluyendo proteinas reguladoras y estructurales viricas, que son requeridas en fra�s para el empaquetamiento del ARN genomico virico en particulas del vector lentivirico. La estirpe celular de empaquetamiento puede ser cualquier estirpe celular que sea capaz de expresar proteinas lentiviricas y producir particulas del vector lentivirico funcionales. Algunas estirpes celulares de empaquetamiento adecuadas incluyen celulas 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430). La estirpe celular de empaquetamiento puede expresar de manera estable las proteinas viricas necesarias. Dicha estirpe celular de empaquetamiento se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 6.218.181. Alternativamente, se puede transinfectar de manera transitoria una estirpe celular de empaquetamiento con moleculas de acido nucleico que codifiquen una o mas proteinas viricas necesarias junto con el genoma del vector virico. Las particulas viricas resultantes se recogieron y se usaron para infectar una celula diana. El gen o los genes que codifican la glucoproteina o las glucoproteinas de envoltura se clonan normalmente en un vector de expresion, tal como pcDNA3 (Invitrogen, CA USA). Los vectores de expresion de celulas eucariotas son conocidos en la tecnica y estan disponibles en una serie de fuentes comerciales. Las celulas de empaquetamiento, tales como las celulas 293T se co-transinfectan despues con el genoma virico del vector que codifica una secuencia de interes (tipicamente que codifica un antigeno), al menos un plasmido que codifica componentes de empaquetamiento de virus y un vector para la expresion de la molecula diana. La envoltura se expresa sobre la membrana de la celula de empaquetamiento y se incorpora al vector virico.

En un caso hipotetico, se usa uno o mas vectores para introducir secuencias de polinucleotidos en una estirpe celular de empaquetamiento para la preparacion de una particula de vector lentivirico pseudotipificado con una glucoproteina de envoltura de virus Sindbis tal como E2, como se describe en la presente memoria. Los vectores pueden contener secuencias de polinucleotidos que codifican los diversos componentes del virus incluyendo la envoltura del virus Sindbis, una secuencia o secuencias de interes (que codifican tipicamente un antigeno) y cualquier componente necesario para la produccion del virus que no se proporcione por la celula de empaquetamiento.

En otros casos hipoteticos mas, las celulas de empaquetamiento se co-transinfectan con un genoma del vector virico que codifica un antigeno y uno o mas vectores adicionales. Por ejemplo, ademas del vector virico que codifica un antigeno, un segundo vector soporta preferiblemente los genes que codifican una envoltura de virus Sindbis modificada (tambien denominado una variante). En algunas situaciones, el genoma virico del vector que codifica un antigeno tambien incluye una secuencia de polinucleotidos que codifica un factor de modulacion inmunitaria seleccionado, incluyendo ejemplos no limitantes de una quimiocina, una citocina, un factor de maduracion de CD o un factor que regula los mecanismos de los puntos de control inmunitarios. En otras situaciones, la secuencia de polinucleotidos que codifica un factor de modulacion inmunitaria seleccionado esta contenida en un tercer vector que se co-transinfecta con el vector virico que codifica un antigeno y uno o mas vectores adicionales en las celulas de empaquetamiento.

La produccion de virus se mide como se describe en la presente memoria y se expresa como UI por volumen. UI es unidad infecciosa o alternativamente unidades de transduccion (UT); UI y UT se pueden usar indistintamente como una medida cuantitativa del titulo de una preparacion de particulas de vector virico. Como se describe en la presente memoria, el virus se produce en el que el genoma puede expresar un producto que es facilmente medible. Se prefiere una proteina fluorescente, proteina fluorescente verde. El vector lentivirico es tipicamente de no integracion. El virus se administra despues a celulas diana y se determina el numero de celulas diana que expresa GFP, tal como por citometria de flujo (vease el Ejemplo 3). Se calcula despues el titulo. El titulo es preferiblemente tan alto como sea posible, pero al menos 1 x 105 UI / ml, al menos 3 x 105 UI / ml, al menos 1 x 106 UI / ml, al menos 3 x 106 UI / ml o al menos 1 x 107 UI / ml de sobrenadante de celulas (antes de cualquier concentracion). Alternativamente, el titulo es al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 100% del titulo del mismo vector lentivirico pseudotipificado en las mismas celulas con envoltura VSV-G.

C. Suministro del Virus.

El virus se puede suministrar a una celula diana de cualquier manera que permita que el virus se ponga en contacto con las celulas dendriticas diana (las CD) en que se desea el suministro de un polinucleotido de interes. A veces, se introducira una cantidad adecuada de virus en un ser humano u otro animal directamente (in vivo), por ej., por inyeccion en el cuerpo. Los animales adecuados incluyen, sin limitacion, caballos, perros, gatos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, conejos, pollos u otras aves. Las particulas viricas se pueden inyectar por una serie de vias, tales como cavidad intravenosa, intradermica, subcutanea, intranodal, intra-peritoneal o mucosal. El virus se puede suministrar usando un dispositivo de inyeccion subdermica tal como los dispositivos desvelados en las Patentes de EE.UU. Nos. 7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499. Otras locaciones de inyeccion tambien son adecuadas, tales como directamente en organos que comprenden celulas diana. Por ejemplo, se puede usar inyeccion intra-ganglio linfatico, inyeccion intra-bazo o inyeccion intramedula osea para suministrar virus al ganglio linfatico, el bazo y la medula osea, respectivamente. Dependiendo de las circunstancias particulares y la naturaleza de las celulas diana, la introduccion se puede realizar a traves de otros medios incluyendo por ejemplo, inhalacion o contacto directo con tejidos epiteliales, por ejemplo aquellos en el ojo, la boca o la piel.

Alternativamente, se proporcionan celulas diana y se ponen en contacto con el virus in vitro, tal como en placas de cultivo. Las celulas diana son tipicamente poblaciones de celulas que comprenden celulas dendriticas obtenidas de un individuo sano o un individuo con necesidad de tratamiento o en que se desea estimular una respuesta inmunitaria a un antigeno. Los metodos para obtener celulas de un individuo son conocidos en la tecnica e incluyen flebotomia, escision quirurgica y biopsia. Tambien se pueden generar las CD humanas por obtencion de progenitores hematopoyeticos humanos CD34a+ y usando un metodo de cultivo in vitro como se describe en otra parte (por ej., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2.001)).

El virus se puede suspender en medio y aradir a los pozos de una placa de cultivo, tubo u otro envase. Los medios que contienen el virus se pueden aradir previamente a cultivo directo en placas de las celulas o despues de que se haya puesto en placas las celulas. Se incubaron las celulas tipicamente en una cantidad apropiada de medio para proporcionar viabilidad y permitir concentraciones adecuadas de virus en el medio de manera que tenga lugar transduccion de la celula huesped. Las celulas se incuban preferiblemente con el virus durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el virus infecte las celulas. Preferiblemente, las celulas se incuban con virus durante al menos 1 hora, al menos 5 horas o al menos 10 horas.

En suministro tanto in vivo como in vitro, se puede usar una alicuota de particulas viricas que contenga suficiente numero para infectar las celulas diana deseadas. Cuando se tiene que cultivar la celula diana, la concentracion de las particulas viricas es en general al menos 1 UI/Il, mas preferiblemente al menos 10 UI/Il, incluso mas preferiblemente al menos 300 UI/Il, incluso mas preferiblemente al menos 1X104 UI/Il, incluso mas preferiblemente al menos 1X105 UI/Il, incluso mas preferiblemente al menos 1X106 UI/Il o incluso mas preferiblemente al menos 1X107 UI/Il.

Despues de la infeccion con el virus in vitro, se pueden introducir celulas diana (o re-introducir) en un ser humano u otro animal. Las celulas pueden ser introducidas en la dermis, debajo de la dermis o en el torrente circulatorio periferico. Las celulas introducidas en un animal son preferiblemente celulas derivadas de ese animal, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. Tambien se pueden usar celulas derivadas de un donador con un antecedente inmunitario similar. Otras celulas que tambien se pueden usar incluyen las designadas para evitar una respuesta

inmunologica adversa.

Se pueden analizar celulas diana para integracion, transcripcion y/o expresion de la secuencia o el gen o los genes de interes, el numero de copias del gen integrado y la posicion de la integracion, para ejemplos. Dicho analisis se puede realizar en cualquier momento y se puede realizar por cualquier metodo conocido en la tecnica.

En los individuos en que se administra un virus o celulas dendriticas infectadas por virus se puede analizar la posicion de celulas infectadas, la expresion del polinucleotido suministrado por virus o gen de interes, estimulacion de una respuesta inmunitaria y se controlaron los sintomas asociados a una enfermedad o trastorno por cualquier metodo conocido en la tecnica.

Los metodos de infeccion de celulas desvelados anteriormente no dependen de las caracteristicas especificas del individuo de las celulas. Como resultado, se extienden facilmente a una variedad de especies animales. En algunos casos, se suministran particulas viricas a un ser humano o a celulas dendriticas humanas y en otros casos se suministran a un animal tal como un raton, caballo, perro, gato o raton o a aves. Como se discute en la presente memoria, el genoma virico del vector es pseudotipificado para conferirle una amplia serie de huespedes asi como especificidad de celulas diana. Un experto en la materia tambien conoceria activadores internos apropiados y otros elementos para conseguir la expresion deseada de una secuencia de interes en una especie animal particular. Asi, un experto en la materia podra modificar el metodo de infeccion de celulas dendriticas de cualquier especie.

D. Inmunizaciones terapeuticas y profilacticas.

Las celulas dendriticas pueden ser infectadas con una particula de vector lentivirico como se describe en la presente memoria para la prevencion de, o el tratamiento de, una enfermedad o un trastorno, en particular aquellos para los que la activacion de una respuesta inmunitaria en un paciente seria beneficiosa. Muchas de esas enfermedades son conocidas. Por ejemplo, las enfermedades o los trastornos que son susceptibles de tratamiento o prevencion por los metodos de la presente invencion incluyen, sin limitacion, tumores malignos, enfermedades autoinmunitarias e infecciones, incluyendo infecciones viricas, bacterianas, fungicas y parasitarias. En un metodo, una enfermedad se trata mediante particulas viricas descritas en la presente memoria para suministrar una secuencia de interes a celulas dendriticas, en la que la expresion de la secuencia de interes produce un antigeno especifico de la enfermedad y conduce a estimulacion de respuestas inmunitarias celulares especificas de antigeno y respuestas inmunitarias humorales. En general, la secuencia de interes codifica un antigeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria, pero no se expresa normalmente en una celula dendritica. El antigeno se expresa y se presenta por la celula dendritica. El genoma virico del vector puede codificar ademas un factor de maduracion de CD.

En un uso tipico, las particulas viricas suministran a celulas dendriticas secuencias que codifican un antigeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. El suministro se puede conseguir poniendo en contacto celulas dendriticas con el virus in vitro, despues de lo cual las celulas dendriticas infectadas son proporcionadas a un paciente. Otras veces, el suministro se puede conseguir suministrando el virus a un individuo para infectar celulas dendriticas in vivo. Las celulas dendriticas estimulan despues celulas T o celulas B especificas de antigeno en un paciente para inducir respuestas inmunitarias celulares y humorales al antigeno expresado. De tales formas, un paciente que padece una enfermedad o trastorno se trata por generacion de celulas inmunitarias con una especificidad deseada.

Cualquier antigeno que este asociado a una enfermedad o trastorno se puede suministrar a celulas dendriticas usando las particulas viricas como se describe en la presente memoria. Un antigeno que esta asociado a la enfermedad o trastorno se identifica para la preparacion de una particula virica que fije como objetivo celulas dendriticas. Los antigenos asociados a muchas enfermedades y trastornos son conocidos en la tecnica. Se puede conocer previamente que un antigeno este asociado a la enfermedad o trastorno o se puede identificar por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, se puede conocer un antigeno para un tipo de cancer que este padeciendo un paciente, tal como un antigeno asociado al tumor o se puede identificar del propio tumor por cualquiera de una variedad de metodos conocidos en la tecnica.

Son conocidos los antigenos asociados a tumores para una variedad de tumores malignos incluyendo, por ejemplo, carcinoma de celulas renales, cancer de prostata, melanoma y cancer de mama. En algunos tumores malignos de mama, por ejemplo, el receptor de Her-2 se sobreexpresa en la superficie de celulas cancerosas. Los antigenos de tumores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, MAGE, BAGE, RAGE y NY-ESO-1, que son antigenos no mutados expresados en las areas privilegiadas inmunitarias de los ensayos y en una variedad de celulas tumorales; antigenos de tumores especificos del linaje tales como antigenos del linaje de melanocitos-melanoma MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, proteina tirosinasa y relacionada con la tirosinasa, carcinoma de celulas renales 5T4, SM22-alfa, anhidrasas carbonicas I y IX (tambien conocidas como G250), factores inducibles por hipoxia (por ej., HIF-1 alfa y HIF-2alfa), VEGF o antigeno de membrana especifico de la prostata (PSMA, por sus siglas en ingles), antigeno especifico de la prostata (PSA, por sus siglas en ingles), fosfatos acidos prostaticos y antigeno epitelial de seis dominios transmembrana (STEAP, por sus siglas en ingles), NKX3.1, que son antigenos expresados en celulas normales y neoplasicas derivadas del mismo tejido; proteinas/peptidos de epitopos derivados de genes mutados en celulas tumorales o genes transcritos a diferentes niveles en el tumor comparado con celulas normales,

tales como enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reorganizacion de bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado

o de cepa natural, citocromo P450 1B1 y secuencias de intrones expresadas anormalmente tales como Nacetilglucosaminiltransferasa-V; reordenaciones clonicas de genes de inmunoglobulina que generan idiotipos unicos en el mieloma y linfomas de celulas B; proteinas/peptidos de epitopos derivados de procedimientos oncoviricos, tales como proteinas del virus del papiloma humano E6 y E7; proteinas oncofetales no mutadas con una expresion selectiva del tumor, tal como antigeno carcinoembrionico y alfa-fetoproteina. Se ha revisado una serie de antigenos asociados al tumor (vease, por ejemplo, UTumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes,U Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1.994; UA listing of human tumor antigens recognized by T cells,U Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 de marzo de 2.001).

El antigeno tambien puede ser un antigeno asociado a una enfermedad infecciosa, tal como, por ejemplo, VIH/SIDA. El antigeno puede ser, por ejemplo, gp120 (Klimstra, W. B. et al. 2.003. J Virol 77: 12.022-12.032; Bernard, K. A., et al. 2.000. Virology 276: 93-103; Byrnes, A. P., et al. 1.998. J Virol 72: 7.349-7.356). Otros antigenos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: gag, pol, env, tat, nef y rev (Lieberman, J. et al. 1.997. AIDS Res Hum Retroviruses 13 (5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al. 1.998. Viral Immunol 11 (4): 167-181).

Los ejemplos de antigenos viricos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, por ej., un antigeno de la capside de calicivirus, polipeptidos de coronavirus, polipeptidos de virus del distemper, polipeptidos de virus de Ebola, polipeptidos de enterovirus, polipeptidos de flavivirus, polipeptidos de virus de la hepatitis (AE), por ej., un antigeno del nucleo o de superficie de la hepatitis B o una glucoproteina E1 o E2 del virus de la hepatitis C, proteinas de nucleo o no estructurales, polipeptidos de herpesvirus, por ej., una glucoproteina de virus de herpes simple o de virus de varicela zoster, polipeptidos de virus de inmunodeficiencia, por ej., la envoltura o proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptidos de virus de peritonitis infecciosa, polipeptidos de virus de la influenza, por ej., una hemaglutinina de la influenza A, neuraminidasa o nucleoproteina, polipeptidos de virus de la leucemia, polipeptidos de virus de Marburg, polipeptidos de ortomixovirus, polipeptidos de virus de papiloma, polipeptidos de virus de parainfluenza, por ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipeptidos de paramixovirus, polipeptidos de parvovirus, polipeptidos de pestivirus, polipeptidos de virus de picorna, por ej., un polipeptido de capside de poliovirus, polipeptidos de pox virus, por ej., un polipeptido de virus vaccinia, polipeptidos del virus rabies, por ej., una glucoproteina G del virus rabies, polipeptidos de reovirus, polipeptidos de retrovirus y polipeptidos de rotavirus.

Los ejemplos de antigenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de Actinomyces, polipeptidos de Bacillus, polipeptidos de Bacteroides, polipeptidos de Bordetella, polipeptidos de Bartonella, polipeptidos de Borrelia, por ej., OspA de B. burgdorferi, polipeptidos de Brucella, polipeptidos de Campylobacter, polipeptidos de Capnocytophaga, polipeptidos de Chlamydia, polipeptidos de Clostridium, polipeptidos de Corynebacterium, polipeptidos de Coxiella, polipeptidos de Dermatophilus, polipeptidos de Enterococcus, polipeptidos de Ehrlichia, polipeptidos de Escherichia, polipeptidos de Francisella, polipeptidos de Fusobacterium, polipeptidos de Haemobartonella, polipeptidos de Haemophilus, por ej., proteina de la membrana externa de H. influenzae tipo b, polipeptidos de Helicobacter, polipeptidos de Klebsiella, polipeptidos de bacterias en forma de L, polipeptidos de Leptospira, polipeptidos de Listeria, polipeptidos de Mycobacteria, polipeptidos de Mycoplasma, polipeptidos de Neisseria, polipeptidos de Neorickettsia, polipeptidos de Nocardia, polipeptidos de Pasteurella, polipeptidos de Peptococcus, polipeptidos de Peptostreptococcus, polipeptidos de Pneumococcus, polipeptidos de Proteus, polipeptidos de Pseudomonas, polipeptidos de Rickettsia, polipeptidos de Rochalimaea, polipeptidos de Salmonella, polipeptidos de Shigella, polipeptidos de Staphylococcus, polipeptidos de Streptococcus, por ej., proteinas M de S. pyogenes, polipeptidos de Treponema y polipeptidos de Yersinia, por ej., antigenos de Y. pestis F1 y V.

Los ejemplos de antigenos fungicos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de Absidia, polipeptidos de Acremonium, polipeptidos de Alternaria, polipeptidos de Aspergillus, polipeptidos de Basidiobolus, polipeptidos de Bipolaris, polipeptidos de Blastomyces, polipeptidos de Candida, polipeptidos de Coccidioides, polipeptidos de Conidiobolus, polipeptidos de Cryptococcus, polipeptidos de Curvalaria, polipeptidos de Epidermophyton, polipeptidos de Exophiala, polipeptidos de Geotrichum, polipeptidos de Histoplasma, polipeptidos de Madurella, polipeptidos de Malassezia, polipeptidos de Microsporum, polipeptidos de Moniliella, polipeptidos de Mortierella, polipeptidos de Mucor, polipeptidos de Paecilomyces, polipeptidos de Penicillium, polipeptidos de Phialemonium, polipeptidos de Phialophora, polipeptidos de Prototheca, polipeptidos de Pseudallescheria, polipeptidos de Pseudomicrodochium, polipeptidos de Pythium, polipeptidos de Rhinosporidium, polipeptidos de Rhizopus, polipeptidos de Scolecobasidium, polipeptidos de Sporothrix, polipeptidos de Stemphylium, polipeptidos de Trichophyton, polipeptidos de Trichosporon y polipeptidos de Xylohypha.

Los ejemplos de antigenos de parasitos protozoarios incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de Babesia, polipeptidos de Balantidium, polipeptidos de Besnoitia, polipeptidos de Cryptosporidium, polipeptidos de Eimeria, polipeptidos de Encephalitozoon, polipeptidos de Entamoeba, polipeptidos de Giardia, polipeptidos de Hammondia, polipeptidos de Hepatozoon, polipeptidos de Isospora, polipeptidos de Leishmania, polipeptidos de Microsporidia, polipeptidos de Neospora, polipeptidos de Nosema, polipeptidos de Pentatrichomonas, polipeptidos de Plasmodium, por ej., P. falciparum circumsporozoite (PfCSP), proteina 2 de superficie de sporozoite (PfSSP2), termino carboxilo de antigeno 1 del estado del higado (PfLSA1 c-term) y proteina 1 exportada (PfExp-1), polipeptidos de Pneumocystis, polipeptidos de Sarcocystis, polipeptidos de Schistosoma, polipeptidos de Theileria, polipeptidos de Toxoplasma y polipeptidos de Trypanosoma.

Los ejemplos de antigenos de parasitos helminticos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de Acanthocheilonema, polipeptidos de Aelurostrongylus, polipeptidos de Ancylostoma, polipeptidos de Angiostrongylus, polipeptidos de Ascaris, polipeptidos de Brugia, polipeptidos de Bunostomum, polipeptidos de Capillaria, polipeptidos de Chabertia, polipeptidos de Cooperia, polipeptidos de Crenosoma, polipeptidos de Dictyocaulus, polipeptidos de Dioctophyme, polipeptidos de Dipetalonema, polipeptidos de Diphyllobothrium, polipeptidos de Diplydium, polipeptidos de Dirofilaria, polipeptidos de Dracunculus, polipeptidos de Enterobius, polipeptidos de Filaroides, polipeptidos de Haemonchus, polipeptidos de Lagochilascaris, polipeptidos de Loa, polipeptidos de Mansonella, polipeptidos de Muellerius, polipeptidos de Nanophyetus, polipeptidos de Necator, polipeptidos de Nematodirus, polipeptidos de Oesophagostomum, polipeptidos de Onchocerca, polipeptidos de Opisthorchis, polipeptidos de Ostertagia, polipeptidos de Parafilaria, polipeptidos de Paragonimus, polipeptidos de Parascaris, polipeptidos de Physaloptera, polipeptidos de Protostrongylus, polipeptidos de Setaria, polipeptidos de Spirocerca, polipeptidos de Spirometra, polipeptidos de Stephanofilaria, polipeptidos de Strongyloides, polipeptidos de Strongylus, polipeptidos de Thelazia, polipeptidos de Toxascaris, polipeptidos de Toxocara, polipeptidos de Trichinella, polipeptidos de Trichostrongylus, polipeptidos de Trichuris, polipeptidos de Uncinaria y polipeptidos de Wuchereria.

Los ejemplos de antigenos de ectoparasitos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos (incluyendo antigenos protectores asi como alergenos) de pulgas; garrapatas, incluyendo garrapatas duras y garrapatas blandas; moscas, tales como quirnomidos, mosquitos, moscas de la arena, simulidos, tabanos, moscas de los cuernos, moscas del venado, moscas tsetse, moscas de los establos, moscas causantes de miasis y mosquitos mordedores; hormigas; araras, piojos; acaros y chinches verdaderas, tales como chinches y chinches besuconas.

Una vez que se ha identificado y seleccionado un antigeno, se identifica una secuencia que codifica el antigeno deseado. Preferiblemente, la secuencia comprende un ADNc. Despues de la infeccion virica, la secuencia de interes (por ej., una que codifique el antigeno) se expresa por las celulas dendriticas diana. Si se ponen en contacto ex vivo, las celulas dendriticas diana se tienen que volver a transferir despues al paciente, por ejemplo por inyeccion, donde interaccionan con celulas inmunitarias que sean capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el antigeno deseado. En realizaciones preferidas, se inyecta el virus recombinante al paciente donde transduce las celulas dendriticas diana in situ. Las celulas dendriticas expresan entonces el antigeno particular asociado a una enfermedad o trastorno que se tiene que tratar y el paciente puede incrementar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o el trastorno.

El genoma virico del vector puede contener una secuencia de polinucleotidos que codifique mas de un antigeno y en la transduccion de una celula dendritica diana, genera respuestas inmunitarias a la multitud de antigenos suministrados a la celula. En algunas realizaciones, los antigenos se relacionan con una sola enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, los antigenos se relacionan con multiples enfermedades o trastornos.

En algunos de los virus, los factores de maduracion de CD que activan y/o estimulan la maduracion de las CD se suministran junto con la secuencia de interes. En alternativas, las CD se activan por suministro de factores de maduracion de CD previamente a, de manera simultanea con o despues de suministro del virus. Los factores de maduracion de CD pueden ser proporcionados por separado de la administracion del virus.

Como se describe en la presente memoria, uno o mas factores de modulacion inmunitaria o de maduracion de CD pueden ser codificados por una o mas secuencias que esten contenidas en el genoma virico y se expresan despues de que el virus infecta a la celula dendritica. Las secuencias que codifican los factores de modulacion inmunitarios tambien pueden ser proporcionadas en un vector separado que se co-transinfecta con el vector virico que codifica uno o mas antigenos en una estirpe celular de empaquetamiento.

Los metodos descritos en la presente memoria se pueden usar para inmunotratamiento adoptivo en un paciente. Como se describio anteriormente, se identifica un antigeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria. Se obtiene un polinucleotido que codifica el antigeno deseado y se empaqueta en un virus recombinante. Se obtienen celulas dendriticas diana del paciente y se transducen con un virus recombinante que contiene un polinucleotido que codifica el antigeno deseado. Las celulas dendriticas se transfieren de nuevo despues al paciente.

Las particulas viricas se pueden inyectar in vivo, donde infectan las CD y suministran una secuencia de interes, codificando tipicamente un antigeno. La cantidad de particulas viricas es al menos 3X106 UI y puede ser al menos 1X107 UI, al menos 3X107UI, al menos 1X108 UI, al menos 3X108 UI, al menos 1X109 UI o al menos 3X109 UI. En intervalos seleccionados, las CD de los organos linfoides del receptor se pueden usar para medir la expresion, por ejemplo, observar la expresion de marcador, tal como GFP o luciferasa. Las tecnicas de control de acido nucleico y las mediciones de actividad de la transcriptasa inversa (TI) tambien se pueden usar para analizar la biodistribucion de particulas viricas. Las celulas T de celulas mononucleares de sangre periferica, ganglios linfaticos, bazos o tejido infectado con patogenos malignos o diana de receptores tratados con particulas de vector lentivirico se pueden medir de la magnitud y durabilidad de la respuesta a estimulacion de antigenos. En las celulas de tejido distintas de las CD, tales como celulas epiteliales y celulas linfoides, se puede analizar la especificidad de suministro de genes in vivo.

Esta ampliamente convenido que el metodo potencial mas eficaz para terminar la epidemia de SIDA (y otras enfermedades viricas) es una vacuna preventiva eficaz. Hasta la fecha, ningun metodo de vacunacion contra VIH ha pasado con exito una prueba de fase III. Asi, hay una urgente necesidad de nuevas estrategias de vacunacion eficaces. Una estrategia es la vacunacion de las CD. En esta implantacion, una secuencia que codifique una proteina virica, tal como la descrita anteriormente, se clona en un vector virico. Los pacientes son infectados con virus construidos como se describe en la presente memoria. En un modelo animal, se pueden usar virus informadores de VIH clonado de manera molecular (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) y aislados clinicos para provocar a los animales por inyeccion en la vena de la cola. Se puede controlar la evidencia de infeccion con el tiempo en los esplenocitos, ganglios linfaticos y sangre periferica. La multiplicacion PCR para VIH-proteina gag y citometria de flujo para HAS en el virus informador se puede usar para ensayar la integracion y replicacion viricas. La vacunacion de CD in situ productiva puede aumentar la resistencia a una provocacion de VIH.

Las vacunas con frecuencia incluyen un adyuvante. Las particulas de vector lentivirico descritas en la presente memoria tambien se pueden administrar junto con un adyuvante. El adyuvante se puede administrar con las particulas de virus recombinante, antes de las particulas de virus recombinante o despues de las particulas de virus recombinante. Si se administra con las particulas de virus, los adyuvantes deseables no rompen de manera significativa la integridad de las particulas de virus, de manera que se rompa la membrana virica que contiene las glucoproteinas de envoltura.

Se puede usar una variedad de adyuvantes en asociacion con el virus para provocar una respuesta inmunitaria al antigeno codificado en el genoma de vector virico. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrinseca a un antigeno sin causar cambios conformaciones en el antigeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, monofosforil lipido A 3 Des-O-acilado (MPL, por sus siglas en ingles) (vease la patente britanica GB 2220211). QS21 es un glucosido de triterpeno o saponina aislados de la corteza del arbol Quillaja Saponaria Molina encontrado en America del Sur (vease Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Popozo and Newman, Plenum Press, NY, 1.995); Patentes de EE.UU. N° 5.057.540). Otros adyuvantes son aceite en emulsiones acuosas (tal como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinacion con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lipido A (vease Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1.997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1.998). Alternativamente, A se puede acoplar a un adyuvante. Por ejemplo, una version de lipopeptido de A� se puede preparar por acoplamiento de acido palmitico u otros lipidos directamente al N-terminal de A , como se describe para vacunacion de antigeno de la hepatitis B (Livingston, J. Immunol. 159, 1.383-1.392 (1.997)). Sin embargo, dicho acoplamiento no deberia cambiar sustancialmente la conformacion de A� a fin de afectar a la naturaleza de la respuesta inmunitaria al mismo. Se pueden administrar adyuvantes como componente de una composicion terapeutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, al mismo tiempo con o despues de administracion del agente terapeutico.

Una clase de adyuvantes son sales de aluminio (alumbre), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores especificos tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoacidos polimericos o monomericos tales como acido poliglutamico o polilisina. Otra clase de adyuvantes son formulaciones de emulsion de aceite-en-agua. Dichos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores especificos tales como muramil peptidos (por ej., Nacetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn- -glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida.TM.) u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite-en-agua incluyen (a) MF59 (patente internacional WO 90/14837), que contienen 5% de Escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formulado en particulas de submicrometro usando un microfluidizador tal como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, que contiene 10% de Escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polimero L121 bloqueado con pluronico y thr-MDP, microfluidizado en una emulsion en submicrometros o sometido a agitador vorticial para generar una emulsion de tamaro de particula mayor y (c) sistema adyuvante de Ribi (RAS, por sus siglas en ingles), (Ribi Inmunicen, Hamilton, Monte.) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en: monofosforilipido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS, por sus siglas en ingles), preferiblemente MPL+CWS (Detox™). Otra clase de adyuvantes preferidos son adyuvantes de saponina, tales como Stimulon. TM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o particulas generadas alli de tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen Adyuvante de Freund Completo (CFA, por sus siglas en ingles) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA, por sus siglas en ingles). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de colonias de macrofagos (M-CSF, por sus siglas en ingles), factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en ingles).

Otro adyuvante que se puede usar con las composiciones en la presente memoria se identifica por la formula quimica (I):

en la que los restos A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de: hidrogeno, fosfato y sales de fosfato. Sodio y potasio son contraiones ejemplares para las sales de fosfato. Los restos R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo con 3 a 23 carbonos, representado por C3-C23. Para mas claridad se explicara que cuando un resto se Uselecciona independientemente deU un grupo especificado con multiples miembros, se deberia entender que el miembro elegido para el primer resto no impacta o limita de ningun modo la eleccion del miembro seleccionado para el segundo resto. Los atomos de carbono a que se unen R1, R3, R5 y R6 son asimetricos, y asi pueden existir en cualquier estereoquimica R o S. En una realizacion, todos esos atomos de carbono estan en la estereoquimica R, mientras en otra realizacion todos esos atomos de carbono estan en la estereoquimica S.

UHidrocarbiloU se refiere a un resto quimico formado completamente por hidrogeno y carbono, donde la disposicion de los atomos de carbono puede ser cadena lineal o ramificada, no ciclica o ciclica, y el enlace entre atomos de carbono adyacentes puede ser completamente enlaces sencillos, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo saturado o puede haber enlaces dobles o triples presentes entre dos cualesquiera atomos de carbono adyacentes, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo insaturado y el numero de atomos de carbono en el grupo hidrocarbilo esta entre 3 y 24 atomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un alquilo, donde los alquilos de cadena lineal representativos incluyen: metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras los alquilos ramificados incluyen: isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Los hidrocarbilos ciclicos saturados representativos incluyen: ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras los hidrocarbilos ciclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares. Hidrocarbilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre atomos de carbono adyacentes (referido como un UalqueniloU o UalquiniloU, respectivamente, si el hidrocarbilo es no ciclico y cicloalqueni y cicloalquinilo, respectivamente, si el hidrocarbilo es al menos parcialmente ciclico). Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen: etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3dimetil-2-butenilo y similares; mientras los alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen: acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo y similares.

El adyuvante de formula (I) se puede obtener por metodos sinteticos conocidos en la tecnica, por ejemplo, la metodologia sintetica desvelada en la Publicacion de Patente Internacional PCT N° WO 2009/035528, asi como las publicaciones identificadas en la Patente Internacional WO 2009/035528. Algunos de los adyuvantes tambien se pueden obtener comercialmente. Un adyuvante preferido es el Producto N° 699800 como se identifica en el catalogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, vease E1 en combinacion con E10, a continuacion.

En diversas realizaciones de la invencion, el adyuvante tiene la estructura quimica de formula (I) pero los restos A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de subconjuntos de las opciones proporcionadas previamente para estos restos, donde estos subconjuntos se identifican a continuacion por E1, E2, etc.

E1: A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrogeno.

E2: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C3-C21 y R2 y R4 son hidrocarbilo C5-C23.

E3: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C5-C17 y R2 y R4 son hidrocarbilo C7-C19.

E4: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C15 y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C17.

E5: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C13 y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C15.

E6: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C15 y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C17.

E7: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C13 y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C15.

E8: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20 y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20.

E9: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 y R2 y R4 son hidrocarbilo C13.

E10: R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.

En algunas opciones, cada uno de E2 a E10 se combina con la realizacion E1 y/o los grupos hidrocarbilo de E2 a E9 son grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo de cadena lineal.

El adyuvante de formula (I) se puede formular en una composicion farmaceutica, opcionalmente con un coadyuvante, cada uno como se discute a continuacion. Con respecto a esto se hace referencia a la Publicacion de Patente de EE.UU. N° 2008/0131466 que proporciona formulaciones, por ej., formulacion acuosa (FA) y formulaciones de emulsion estables (ES) para adyuvante GLA, donde se pueden utilizar estas formulaciones para cualquiera de los adyuvantes de formula (I).

Se puede administrar un adyuvante con el virus de la invencion como una unica composicion o se puede administrar antes, al mismo tiempo o despues de la administracion del virus recombinante de la invencion. Se puede empaquetar y suministrar inmunogeno y adyuvante en el mismo vial o se puede empaquetar en viales separados y mezclar antes de su uso. Inmunogeno y adyuvante se empaquetan tipicamente con una etiqueta que indica la aplicacion terapeutica deseada. Si se empaquetan por separado inmunogeno y adyuvante, el empaquetamiento incluye tipicamente instrucciones para mezclarlos antes de uso. La eleccion de un adyuvante y/o portador depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, la via de administracion, el plan de dosificacion, la eficacia del adyuvante para las especies que se vacunan y, en los seres humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que ha sido homologado o se puede homologar para administracion a seres humanos por los organos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante de Freund Completo no es adecuado para administracion a seres humanos. Se prefieren alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, se pueden usar dos o mas adyuvantes diferentes de manera simultanea, tal como alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21 y alumbre, QS21 y MPL juntos. Tambien, se puede usar adyuvante de Freund Incompleto (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1.998)), opcionalmente en combinacion con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.

E. Composiciones farmaceuticas y estuches.

Tambien se consideran en la presente memoria composiciones farmaceuticas y estuches que contienen un virus proporcionado en la presente memoria y uno o mas componentes. Las composiciones farmaceuticas pueden incluir particulas del vector virico como se proporciona en la presente memoria y un portador farmaceutico. Los estuches pueden incluir las composiciones farmaceuticas y/o combinaciones proporcionadas en la presente memoria y uno o mas componentes, tales como instrucciones para uso, un dispositivo para administracion de un compuesto a un individuo y un dispositivo para administracion de un compuesto a un individuo.

Se proporcionan en la presente memoria composiciones farmaceuticas que contienen particulas viricas como se proporcionan en la presente memoria y un portador farmaceutico adecuado. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden estar en diversas formas, por ej., en forma solida, liquida, polvo, acuosa o liofilizada. Los ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados son conocidos en la tecnica. Dichos portadores y/o aditivos se pueden formular por metodos convencionales y se pueden administrar al individuo en una dosis adecuada. Los agentes estabilizantes tales como lipidos, inhibidores de la nucleasa, polimeros y agentes quelantes pueden conservar las composiciones de degradacion en el cuerpo.

Las particulas del vector virico proporcionadas en la presente memoria se pueden empaquetar como estuches. Los estuches pueden incluir opcionalmente uno o mas componentes tales como instrucciones para uso, dispositivos y reactivos adicionales y componentes, tales como tubos, envases y jeringas para practica de los metodos. Los estuches ejemplares pueden incluir los virus proporcionados en la presente memoria y pueden incluir opcionalmente instrucciones para uso, un dispositivo para detectar un virus en un individuo, un dispositivo para administracion del virus a un individuo y un dispositivo para administracion de un compuesto a un individuo.

Los estuches que comprenden polinucleotidos que codifican un gen de interes (tipicamente un antigeno) tambien se consideran en la presente memoria. El estuche puede incluir al menos un plasmido que codifique componentes de empaquetamiento de virus y variante de glucoproteina E2 de virus Sindbis codificador del vector. Algunos estuches contendran al menos componentes de empaquetamiento de un plasmido codificador de virus, una variante de glucoproteina E2 de virus Sindbis codificador del vector y un vector codificador de al menos un factor de maduracion de CD.

Los estuches que comprenden un vector virico codificador de una secuencia de interes (tipicamente un antigeno) y opcionalmente, una secuencia de polinucleotidos codificadora de un factor de maduracion de CD tambien se consideran en la presente memoria. En algunos estuches, el estuche incluye al menos componentes de empaquetamiento de un plasmido que codifica el virus y una variante de glucoproteina E2 de virus Sindbis codificador del vector.

Un estuche tambien puede contener instrucciones. Las instrucciones incluyen tipicamente una expresion tangible que describe el virus y opcionalmente otros componentes incluidos en el estuche y metodos para administracion, incluyendo metodos para determinar el estado apropiado del individuo, la cantidad de dosis apropiada y el metodo de administracion apropiado, para administracion del virus. Las instrucciones tambien pueden incluir la guia para controlar al individuo por la duracion del tiempo de tratamiento.

Los estuches proporcionados en la presente memoria tambien pueden incluir un dispositivo para administracion de un virus a un individuo. Se puede incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la tecnica para administracion de medicamentos o vacunas en los estuches proporcionados en la presente memoria. Los dispositivos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, un dispositivo de inyeccion sin aguja, un inhalador y un dispensador liquido, tal como un gotero. Tipicamente, el dispositivo para administracion de un virus del estuche sera compatible con el virus del estuche; por ejemplo, se puede incluir un dispositivo de inyeccion sin aguja tal como un dispositivo de inyeccion a alta presion en estuches con virus no darados por inyeccion a alta presion, pero tipicamente no se incluye en estuches con virus darados por inyeccion a alta presion.

Los estuches proporcionados en la presente memoria tambien pueden incluir un dispositivo para administracion de un compuesto, tal como un activador o estimulator de CD, a un individuo. Se puede incluir cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la tecnica para administracion de medicamentos a un individuo en los estuches proporcionados en la presente memoria. Los dispositivos ejemplares incluyen una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, una inyeccion sin aguja, pero no se limitan a, una aguja hipodermica, una aguja intravenosa, un cateter, un dispositivo de inyeccion sin aguja, un inhalador y un dispensador liquido tal como un gotero. Tipicamente el dispositivo para administracion del compuesto del estuche sera compatible con el metodo de administracion deseado del compuesto.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustracion y no como manera de limitacion.

Ejemplos

Ejemplos 1

Ingenieria de una variante de envoltura de virus Sinbis.

El virus Sindbis (VS)--un miembro del genero Alphavirus y la familia Togaviridae --es capaz de infectar las CD, probablemente a traves de CD-SIGN (Klimstra, W. B., et al. 2.003. J. Virol. 77: 12.022-12.032, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad). El receptor virico canonico para la cepa de laboratorio de VS sin embargo, es sulfato de heparan de superficie celular (SH), que se encuentra en muchos tipos de celulas (Strauss, J. H., et al. 1.994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A. P., y D. E. Griffin. 1.998. J. Virol. 72: 7.349-7.356. Para intentar reducir la union de sulfato de heparan, se construyo una envoltura de E2 mutante (denominado SVGmu) por Wang et al. (Patente de EE.UU. 2008/0019998). Parte de su estrategia implicaba la supresion de cuatro aminoacidos en la union de pro-proteina E3/E2 y una supresion de dos aminoacidos con una adicion posterior de una secuencia de 10 aminoacidos de hemaglutinina (veanse las Figuras 1A y 1B). La proteina E2 resultante se expresa como una fusion de E3 y E2 (tambien conocida como pE2) debido a que se rompio la secuencia de escision natural y tambien muestra un epitopo extraro (hemaglutinina). Como se muestra a continuacion, SVGmu experimenta bajos niveles de expresion entre otros problemas.

Usando una estrategia diferente, los autores han logrado la glucoproteina E2 de virus Sindbis para disminuir la union a sulfato de heparan, aumentar la especificidad con celulas dendriticas y mejorar la expresion. Una propuesta general para conseguir estas caracteristicas es aumentar la infectividad de celulas dendriticas cambiando el resto 160 de E2 (restos 233 en la Figura 1) a un aminoacido no acido, especialmente un aminoacido distinto de alanina o suprimirlo, para disminuir la union de heparina por reduccion de la carga neta positiva de la proteina, para retirar el epitopo de HA (hemaglutinina) y restablecer un sitio de escision en el N-terminal de E2, en este caso un sitio de escision de furina. Como parte de una envoltura virica, estas glucoproteinas E2 pueden mediar la infeccion de las CD asi como han reducido o anulado la infeccion de otros tipos de celulas.

Despues de estos principios, se diseraron diversas secuencias de variante de E2 y se muestran en la siguiente tabla. El tipo de letra en negrita indica un cambio de la secuencia de envoltura de virus Sindbis de la cepa HR (GenBank NC 001547.1).

SEC ID N°: 70 76 159 160

3 E K E G

4 E E E G

5 E K

6 E E E

7 K K E G

8 K K E

9 K E E G

10 K E E

11 K E K G

12 K E K

13 E K K G

14 E K K

15 E E K G

16 E E K

Se sintetizaron secuencias de acidos nucleicos que codifican algunas de las variantes (vease tambien la Figura 1), incluyendo secuencias de acidos nucleicos que estan optimizadas en el codon para seres humanos. Los ADN para las variantes se clonaron en un vector de expresion, tal como pcDNA3.

Ejemplo 2

5 Preparacion de una particula de vector virico que comprende una variante de glucoproteina de envoltura E2 de virus Sindbis.

Se prepara un virus pseudotipificado de envoltura Sindbis por transinfeccion clasica transitoria mediada por fosfato de calcio de celulas 293T con un vector lentivirico, tal como FUGW o sus derivados, plasmidos de empaquetamiento que codifican gag, pol y rev, y una secuencia de envoltura de virus Sindbis de la variante. FUGW es un vector

10 lentivirico auto-inactivante que soporta el activador de ubiquitina-C humana para conducir la expresion de un gen informador de GFP (Lois, C., et al. 2.002. Science 295: 868-872). Los vectores lentiviricos de transferencia (FUGW y sus derivados) son vectores lentiviricos a base VIH de tercera generacion (vease en general, Cockrell and Kafri Mol. Biotechnol. 36: 184, 2.007), en que se suprime la mayor parte de la region U3 de la LTR 3', dando como resultado una LTR 3' auto-inactivante.

15 Se realizo la produccion de vectores lentiviricos recombinantes por transinfeccion transitoria mediada por fosfato de calcio (CaPO4) de celulas 293T (estirpe celular 293LTV; CELL BIOLABS INC, LTV-100). Se transinfectaron celulas 293T con cuatro plasmidos precipitados junto con CaPO4. Los siguientes cuatro plasmidos se usaron para producir preparaciones de vector lentivirico se muestran de manera esquematica en la Figura 3 y corresponden a lo siguiente: i) vector lentivirico; ii) plasmido que codifica Rev de VIH; iii) plasmido que codifica Gag/Pol de VIH y, iv)

20 plasmido que codifica la envoltura. Los vectores lentiviricos pueden codificar los antigenos deseados o elementos inmunomoduladores y contienen supresiones fijadas como objetivo particulares para prevenir la integracion en el cromosoma huesped de las celulas infectadas. Mas ejemplos de plasmidos alternativos que pueden ser utilizados para transinfeccion transitoria incluyen los que codifican una holoenzima polimerasa que alberga una mutacion en su integrasa haciendola anormal, tal como la mutacion D64V descrita en la presente memoria. Para ciertos fines, el

25 plasmido que codifica la envoltura puede codificar una envoltura pantropica que no fija como objetivo CD tal como VSV-G.

Para los experimentos descritos en la presente memoria, las precipitaciones de CaPO4 que contienen 120 Ig de vector y 60 Ig de cada uno de los plasmidos Gag/Pol y Rev y 240 Ig de plasmido de la envoltura que se filtraron a traves de un filtro de tamaro de poro 0,45 Im y se aradieron a aproximadamente 6 x 107 celulas 293T cultivadas en 30 frascos rotativos y que contenian 75 ml de medio DMEM enriquecido con suero fetal bovino al 10%. A las 6 horas post-transinfeccion, se reemplazo el medio con 100 ml de medio fresco y se recogio a las 36 horas posttransinfeccion. Se centrifugaron los sobrenadantes del cultivo a baja velocidad (126 rad/s (1.200 rpm)) para

sedimentar particulas celulares seguido por filtracion a traves de filtros de 0,45 Im. El liquido filtrado que contiene la preparacion de vector lentivirico se concentro opcionalmente por centrifugacion a 17.700 x g durante 5 horas a 20quot;C. El vector lentivirico sedimentado se resuspendio despues en PBS en un volumen deseado. Este procedimiento proporciono tipicamente ; 5 x 105 Ul/ml usando la envoltura de glucoproteina de virus Sindbis descrita en la presente memoria o 5 x 107 UI totales para cada cultivo de frasco rotativo. Mas tipicamente este procedimiento proporciono al menos 1 x 108 UI totales para cada cultivo de frasco rotativo.

Con mas detalle, el dia -4, se aradieron 150 ml de medio de cultivo celular a Frascos Rotativos (RB, por sus siglas en ingles) que se ponen en una incubadora de estante rotativo a 37quot;C (0,02 rad/s (0,2 rpm)) durante -1 h. En cada RB se pasan platos de 15 cm confluentes. El dia -2, se aspira medio de los RB y se reemplazan con 100 ml de medio precalentado. El dia -1, se siembran las celulas en la preparacion para transinfeccion. Los RB se precalientan con 100 ml de medio de cultivo celular durante -1 h. Se aspira el medio y se araden 10-12 ml de PBS. Los RB se ponen en su lado y rotados dos veces alrededor para recubrir las celulas. Se aspira el PBS y se araden 10-12 ml de disolucion de tripsina. Se ponen de nuevo los RB sobre sus lados y se rotan dos veces alrededor para recubrir las celulas. Se aspira la disolucion de tripsina y los RB se ponen en la incubadora durante 5 min. A los RB, se araden 10 ml de medio calentado y se rotan vigorosamente los RB una vez alrededor para desunir las celulas. Usando una pipeta de 10 ml, se pipetean celulas arriba y abajo durante por ej., 10 veces para asegurar una unica suspension celular. Se retiran las celulas a un nuevo envase y se diluyen con medio (40 ml de medio por RB). Se cuentan las celulas y se siembran en RB frescos a 7x107/ml y se mantienen en la incubadora durante la noche.

El dia 0, a aproximadamente 22 h post-siembra, se preparo la disolucion de plasmido como sigue. Para cada RB, se mezcla junto una disolucion de plasmido (120 Ig de vector, 60 Ig de Gag/Pol, 60 Ig de Rev, 60 Ig de envoltura), 2,5 ml de CaCI2 1,25 M y agua esteril filtrada a 12,5 ml de volumen final. Se araden 2,7 ml de tampon 2xHBS (HEPES 50 mM, KCl 10 mM, dextrosa 12 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4.7H2O 1,5 mM, pH 7,0, filtrado esteril) en un tubo de 50 ml (un tubo / RB).

Se araden 12,7 ml de mezcla de agua-CaCI2-ADN gota a gota a 12,7 ml de 2xHBS mientras se somete a agitacion vorticial a ajuste medio. Se tapa el tubo y se continua con agitacion vorticial (max. velocidad) durante 5-10 segundos. Se retiran 25 ml de medio de RB y se arade precipitado (25 ml) a RB. Se incuba 6 h, despues se separa por aspiracion del medio y se araden 100 ml de medio de cultivo celular precalentado, fresco. Se vuelve a poner en incubadora a 37quot;.

A 36 a 48 h post-transinfeccion, los sobrenadantes de RB se recogieron en un tubo conico de 250 ml y se trataron como sigue. Se centrifugaron los sobrenadantes durante 10 min a 209 rad/s (2.000 rpm). Se filtraron los sobrenadantes a traves de un filtro de 0,45 Im. Se centrifugaron los sobrenadantes en un tubo de 500 ml durante 5 h a 105 rad/s (10.000 rpm) a 20quot;C. Se resuspendio vector en PBS o HBSS a la concentracion deseada y se almaceno a -80quot;C.

Los vectores viricos pseudotipificados resultantes se refieren a partir de ahora como FUGW/V1, FUGW/V2, etc. Los genomas de vectores viricos envueltos con la glucoproteina VSV-G se refieren a partir de ahora como FUGW/VSV-

G.

Ejemplo 3

Produccion de particulas de vector lentivirico que comprenden glucoproteinas de envoltura de virus Sindbis.

En este ejemplo, se determinaron los titulos para los vectores lentiviricos pseudotipificados con diferentes envolturas de virus Sindbis. Las glucoproteinas E2 usadas fueron SIN-Var1 (SEC ID N° 3), SIN-Var2 (SEC ID N° 4), SIN-Var3 (SEC ID N° 5), SVGmu (SEC ID N° 2), HR (SEC ID N° 18).

Se generaron particulas de vector lentivirico pseudotipificadas de glucoproteinas de virus Sindbis por transinfeccion de celulas 293T como se describe en el Ejemplo 2. Se recogieron los sobrenadantes brutos 48 horas posttransinfeccion y se usaron para transducir celulas 293T que expresan CD-SIGN humana (293-CDSIGN) que se habian puesto en placas de 6 pozos el dia anterior en 2E5 celulas/pozo. Se determino el titulo despues de una incubacion de 72 h a 37quot;C analizando las celulas transducidas en un citometro Guava Easy-Cyte (Millipore). Se contaron 25.000 procesos totales para determinar el porcentaje de celulas transducidas GFP+, que se uso a su vez para calcular el titulo GFP (UI, unidades infecciosas) para cada virus.

Para facilitar el estudio de transduccion fijada como objetivo, se construyen estirpes celulares que expresan CD-SIGN humanas. Las estirpes celulares son generadas por transduccion estable de celulas 293T parentales con un lentivector pseudotipificado VSVG que contiene la secuencia codificadora para CD-SIGN humana. Se multiplica ADNc para CD-SIGN humana de plasmidos pUNO-hCDSIGN1Aa (InvivoGene) y se clono aguas abajo del activador de ubiquitina-C humana en el plasmido lentivirico FUW para generar FUW-hCDSIGN. Alternativamente, se generan estirpes celulares por transduccion estable de celulas 293T parentales con un vector (no lentivirico) anfotropico pseudotipificado de VSVG que contiene la secuencia codificadora para CD-SIGN, para facilitar mejor el analisis de transduccion basado en acidos nucleicos aguas abajo por particulas del vector lentivirico. Los lentivectores o vectores anfotropicos se pseudotipifican despues con VSVG y se usan para transducir celulas 293T. Alternativamente, se generan estirpes celulares por transduccion estable de celulas 293T parentales con un plasmido que codifica CD-SIGN humana. Las celulas resultantes se someten a tincion con anticuerpos (anticuerpo CD-SIGN anti-humano (BD Biosciences) y clasificacion de celulas para proporcionar una poblacion uniforme de estirpes celulares de CD-SIGN+.

En tres experimentos independientes, el vector lentivirico pseudotipificado con envoltura SIN-Var1 presento titulos

5 aproximadamente 10 veces mayores que los titulos pseudotipificados con SVGmu o con la cepa HR de virus Sindbis (Figura 3, grafica superior). En un estudio posterior, se comparo la productividad de tres variantes de envoltura Sindbis. Se muestra un resultado representativo. Las envolturas Sin-Var1, Sin-Var2 y SIN-Var3 generan particulas del vector lentivirico con similar titulo total.

La especificidad de las particulas del vector virico que comprenden una glucoproteina E2 de la variante de virus

10 Sindbis se evalua por transduccion del 293T.hCD-SIGN o las celulas 293T parentales y la medicion de la expresion de un marcador visible (por ej., GFP) en las estirpes celulares.

Se sembraron celulas diana (293T.hCD-SIGN o celulas 293T) en una placa de cultivo de 24 pozos (0,2X106 celulas por pozo) y se transdujeron con sobrenadantes viricos (1 ml por pozo) centrifugando las placas a 262 rad/s (2.500 rpm) y 30quot;C durante 90 min. Con posterioridad, los sobrenadantes son reemplazados con medio de cultivo fresco y

15 se incubaron durante 3 dias a 37quot;C. El porcentaje de celulas que expresan el marcador se mide por citometria de flujo.

Como se muestra en la tabla a continuacion, tanto la variante 1 de E2 como la variante 3 de E2 fijaron como objetivo preferentemente celulas (son especificas para las celulas) que expresan hCD-SIGN.

Tabla 1

Envoltura

Tipo de Celula GFU/ml Relacion

VSV-G

hCD-SIGN 1,35E+08 1,19

293T

1,13E+08

Sin-Var3 (Exp 1)

293-hCD-SIGN 4,2E+07 35,4

293T

1,2E+06

Sin-Var3 (Exp 2)

hCD-SIGN 8,12E+07 11,09

293T

7,33E+06

Sin-Var2

293-hCD-SIGN 1,7E+08 18,2

293T

9,1E+06

Sin-VAR-1

hCD-SIGN 2,93E+08 13,75

293T

2,13E+07

Sin-HR

293-hCD-SIGN 6,4E+06 9,4

293T

6,8E+05

SVGmu (Exp 1)

293-hCD-SIGN 3,4E+06 27,0

293T

1,3E+05

SVGmu (Exp 2)

hCD-SIGN 4,65E+06 12,24

293T

3,80E+05

20 Ejemplo 4

Inmunogenicidad de particulas de vector lentivirico que comprende glucoproteinas de envoltura de virus Sindbis.

En este Ejemplo, se evalua la inmunogenicidad para vectores lentiviricos pseudotipificados con diferentes envolturas de virus Sindbis. Mas especificamente, la cantidad de celulas T CD8 especificas del antigeno y se determinaron sus perfiles de secrecion de citocina. Las glucoproteinas E2 usadas fueron SIN-Var1 (SEC ID N° 3), SIN-Var2 (SEC ID

25 N° 4), SIN-Var3 (SEC ID N° 5), SVGmu (SEC ID N° 2).

El genoma virico comprende secuencia que codifica Ovalbumina (OVA). Se generaron particulas del vector lentivirico por transinfeccion de celulas 293T como se describe en el Ejemplo 2. Se recogieron los sobrenadantes y la cantidad de p24 determinada usando un estuche ELISA (Advanced Bioscience Labs, Kensington MD). La proteina p24 es una proteina de nucleo de VIH encontrada en los viriones pseudotipificados y un producto del gen gag. Los ratones C57BL/6 (5 ratones por grupo) se inmunizaron por via subcutanea con lentivector deficiente de integracion que codifica ovalbumina OVA. El numero y la funcion de celulas T CD8 especificas de peptido de OVA257 (SIINFEKL) (SEC ID N° 24) y los perfiles de secrecion de citocina en el bazo se determinaron el dia 9 por multimero CPH-l/peptido y tincion intracelular de citocinas.

En pocas palabras, se extrajeron y se homogeneizaron bazos por presion a traves de un filtro de nailon de 70 IM. Se lisaron los globulos rojos por choque hipotonico por exposicion breve a agua destilada y restablecimiento inmediato a un entorno isotonico con adicion de PBS x10. Se tireron aproximadamente 5x106 esplenocitos por muestra con pentamero H-2Kb/OVA257 marcado con PE (Prolmmune) a 25quot;C en PBS con FCS al 2% y EDTA 2 mM (tampon de FACS). Se lavaron despues dos veces las celulas y se tireron con el colorante de viabilidad LIVE/DEAD Infrarrojo Cercano (L/D NIR; Invitrogen) y los siguientes anticuerpos marcados con fluorocromo: Azul Pacifico CD44 FITC, CD19 PerCP-Cy5.5 y CD8 (eBioscience) a 4quot;C. Se recogieron datos en un citometro de flujo BD LSR II

(50.000 procesos CD8+) y se analizaron con el programa informatico FlowJo (TreeStar). La estrategia de regulacion para identificar celulas TCD8 fue como sigue: linfocitos (dispersion delantera baj-med, dispersion lateral baj), celulas solas (area dispersion lateral = altura dispersion lateral), celulas vivas (L/D NIR-), celulas T CD8 (CD8+ CD19-). Se determino el porcentaje de celulas que expresan IFN-y en la ventana CD8+ y se represento en la Figuras 4A y 4B. La linea horizontal representa valores medios. Se determino la tincion con IFN-y no especifico en celulas de bazo de ratones inyectados con vehiculo (HBSS) en que se estimularon las celulas in vitro con peptido. La tincion con IFN-y estuvo por debajo de 0,2% para todas las muestras cultivadas sin peptido (no mostrado). Ademas de la fraccion de celulas T CD8 que produce IFN-y, tambien se representa la fraccion de celulas de IFN-y+ que producen tambien TNFa y/o IL-2, como se indica en la clave.

En una serie de experimentos, la cantidad de virus usada contenia 2.500 ng o 125 ng de p24. La Figura 4A ilustra que los lentivectores pseudotipificados con envolturas de la variante de Sindbis presentan similar actividad in vivo. Como se muestra en el panel mas a la izquierda, la media de celulas T CD8 especificas del antigeno es esencialmente la misma en dos cantidades de dosis diferentes. Ademas, el porcentaje medio de celulas IFN-y es tambien similar. Los patrones de secrecion de citocina, especificamente la fraccion de celulas positivas gamma-IFN que tambien expresa IL-2 o TNF-alfa, son tambien similares, con el mayor porcentaje de celulas I IFN-y que es negativo para IL-2 y TNF-a.

En otra serie de experimentos, los grupos de 5 ratones recibieron una dosis de dilucion en serie de virus o vehiculo. El virus se pseudotipifico con SinVar1 o SVGmu. El porcentaje de celulas con un fenotipo de pentamero CD44hi H2Kb/OVA257 se represento en la Figura 4B. La linea de conexion representa valores medios. Como se muestra en la Figura 4B, LV pseudotipificado con SinVar1 indujo expansion sustancialmente mayor de celulas T CD8 especificas del antigeno que SVGmu. Por otra parte, los lentivectores pseudotipificados con SinVar1 indujeron una respuesta de celulas T CD8 funcional mayor que SVGmu (Figura 4C). Se determino la tincion de IFN-y no especifica en ratones inyectados con HBSS (vehiculo) reestimulado con peptido. La tincion con IFN-y estuvo por debajo de 0,2% para todas las muestras cultivadas sin peptido (no mostrado).

Ejemplo 5

Construccion de vectores lentiviricos de no integracion (NILV).

Se construyo una variedad de vectores lentiviricos de no integracion. Se muestra un esquema de los vectores lentiviricos ejemplares en la Figura 5A. El dibujo superior muestra un vector en una forma de provirus. Todos los vectores contienen donadores de empalme, seral de empaquetamiento (psi), un elemento sensible a Rev (RRE), donador de empalme, receptor de empalme, tramo de polipurina central (cPPT) y elemento WPRE. Ademas, todas las construcciones de vectores contienen un activador para la expresion en celulas de mamifero y una secuencia de interes, marcada UantigenoU en la construccion ejemplar. Los activadores utilizados en los Ejemplos incluyen el activador de ubiquitina C humana (UbiC), el activador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) y el activador de virus de sarcoma de Rous (RSV).

Una vista con zoom de la region U3 se muestra a continuacion como una caja abierta con el PPT (tramo de polipurina) secuencia inmediatamente aguas arriba. A continuacion se muestran tres diferentes regiones U3 en forma esquematica; sus secuencias se muestran en la Figura 5B y las SEC ID Nos: 21-23. Las construcciones contienen supresiones en las regiones U3. La construccion SIN presenta una supresion de aproximadamente 130 nucleotidos en la U3 (Miyoshi, et al. J Virol 72: 8.150, 1.998; Yu et al. PNAS 83: 3.194, 1.986), que elimina la caja TATA, que suprime la actividad de activador LTR. Las supresiones en las construcciones 703 y 704 aumentan la expresion de los vectores lentiviricos (Bayer et al. Mol Therapy 16: 1.968, 2.008). Ademas, la construccion 704 contiene una supresion del PPT 3', que disminuye la integracion del vector (patente internacional WO 2009/076524). Las secuencias de la region U3 de todas las construcciones se muestran en la figura 5B. La PPT 3' empieza en la posicion 3 y se muestran las supresiones extendidas relativas al vector suprimido de SIN.

Ejemplo 6

Expresion en celulas dendriticas despues de transduccion con particulas de vector lentivirico.

Este Ejemplo muestra el nivel de expresion de GFP (proteina fluorescente verde) en celulas dendriticas generadas a partir de vectores con supresiones U3 extendidas.

Se produjo una serie de virus por transinfeccion de celulas 293T como se describio anteriormente. Todos los virus comprendian una envoltura SIN-Var1, un genoma del vector que contiene un activador de UbiC o de CMV en union operativa con un transgen de GFP, y una integrasa deficiente debido a que contiene una mutacion D64V. Se recogieron sobrenadantes brutos 48 horas post-transduccion y se usaron volumenes equivalentes de cada sobrenadante para transducir celulas 293T-CDSIGN. La expresion de GFP se determino 72 horas post-transduccion usando un citometro de flujo GUAVA Easy-Cyte. Se conto un total de 50.000 procesos para cada poblacion de celulas transducidas. Se analizaron datos usando el programa informatico de analisis citometrico FlowJo.

Se obtuvieron resultados similares con los dos activadores UbiC (Figura 6, panel A) y CMV (Figura 6, panel B). Los vectores lentiviricos que contienen supresiones de U3 extendidas (703 y 704) mostraron una expresion de transgenes total mayor respecto a vectores con SIN suprimido. La supresion del PPT en la construccion 704 disminuyo la expresion ligeramente con respecto a la construccion 703.

Ejemplo 7

Los vectores con grandes supresiones en U3 son de no integracion.

Este ejemplo demuestra la eficacia de integracion relativa de vectores pseudotipificados SIN-Var1 que contienen combinaciones de diferentes supresiones de vector con integrasa deficiente o de tipo natural despues de transduccion de celulas 293-CD-SIGN.

Se generaron stocks de vectores con una serie de diferentes combinaciones de genes de Integrasa y supresiones U3. Los vectores con las supresiones U3 (veanse las Figuras 5A y 5B), SIN, 703 y 704 se transinfectaron como anteriormente con gen integrasa de tipo natural o un gen de integrasa mutante. Los vectores en estos experimentos contienen un transgen GFP-2A-Neo que codifica resistencia tanto de GFP como de G418. Los marcos de lectura se unen via un peptido de auto-escision 2A para generar proteinas individuales. Los titulos de GFP para todos los stocks de vectores se determinaron usando metodos de flujo citometrico clasicos. Se usaron despues stocks de vectores para infectar celulas 293-CD-SIGN puestas en placas el dia previo en placas de 6 pozos a 5 X 105 celulas/pozo. Despues de transduccion, las celulas se trataron con tripsina cada 72 horas. En cada pase, se volvieron a poner en placas 2 X 105 celulas en placas de 6 pozos en 2 ml de DMEM + FBS al 10%. Las celulas restantes se usaron para determinar el numero de celulas GFP+ por citometria de flujo.

En la Figura 7, el titulo GFP relativo se presenta como una fraccion del titulo observada en el pase uno. La perdida de expresion de GFP refleja la perdida del transgen de GFP, que es una consecuencia de la perdida de integracion en la etapa de transduccion inicial. Como se espera, se encontro que todos los virus que contenian una integrasa (IN-) de mutante D64V eran de no integracion. Ademas, se encontro que los virus que contenian una supresion de PPT (704) eran deficientes en integracion incluso en la presencia de un gen IN de tipo natural. Esto muestra que la supresion del PPT 3' proporciona un mecanismo de seguridad redundante en combinacion con una mutacion de integrasa.

Ejemplo 8

Los vectores lentiviricos de integracion y de no integracion son inmunogenicos de manera equivalente.

En este Ejemplo, se evaluan las respuestas de celulas T CD8 despues de inmunizacion con virus de integracion o de no integracion.

Se inmunizaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con 2,5x1010 genomas de lentivector de integracion (Intwt) o no integracion (lntD64V) que codifica el antigeno Gag de virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV). El numero y la funcion de celulas T CD8 especificas de Gag de SIV en el bazo se determino el dia 10 por tincion intracelular de citocinas, como se describio anteriormente, con la excepcion de que el peptido derivado de Gag de SIV AAVKNWMTQTL se uso para reestimulacion. La Figura 8 ilustra que los lentivectores de no integracion puedan provocar una respuesta de celulas T CD8 equivalente para lentivectores de integracion. Por otra parte, el patron de expresion de citocina es similar.

Ejemplo 9

La inmunizacion con DC-NILV proporciona efecto terapeutico.

En este Ejemplo, los ratones que han recibido celulas tumorales se tratan por inmunizacion con DC-NILV que expresa un antigeno tumoral.

Se inyectaron a ratones BALB/c por via subcutanea 2x104 celulas de carcinoma de colon CT26. Un dia despues, los ratones se trataron por via subcutanea con vehiculo o una preparacion de particulas de vector lentivirico pseudotipificado con SINvar1 que contenia 3,2 Ig de proteina de capside p24. La envoltura del vector virico comprende una variante de E2 de virus Sindbis como se describio anteriormente y el vector es de no integracion y 5 codifica el peptido AH1A5 (SPSYAYHQF; SEC ID N° 25), un epitopo de celulas T CD8 gp70 de MMTV modificado que es un antigeno de rechazo relevante para celulas tumorales CT26. Se representa el crecimiento tumoral inicial asi como la supervivencia a largo plazo de ratones de inmunizados frente a los de control. La Figura 9 muestra que el tumor crecio mas lentamente en ratones que recibieron DC-NILV y ademas, la tasa de supervivencia (medido por 75 dias) fue sustancialmente mejor (60% de supervivencia comparado con 20%). Por lo tanto, los lentivectores no

10 integrantes que fijan como objetivo CD (DC-NILV) son eficaces en el tratamiento terapeutico de tumores.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una particula de vector lentivirico que comprende:

   (a)

   una envoltura que comprende:

   (i)

   una glucoproteina E2 de virus Sindbis de la SEC ID N°: 1 en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico o una variante de la SEC ID N°: 1 del mismo que tiene al menos 80% de identidad para la SEC ID N°: 1 y en que 160X esta ausente o es un aminoacido distinto de acido glutamico, capaz de infectar celulas dendriticas; en la que E2 no es parte de una proteina de fusion con virus Sindbis E3 y

   (b)

   un genoma de vector lentivirico que comprende una o mas secuencias de interes.

2. 2.

   La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1, en la que el 160X esta ausente o es glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina, tal como seleccionada de glicina, valina, leucina o isoleucina.

3. 3.

   La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la variante de la glucoproteina E2 tiene al menos un aminoacido modificado para reducir su carga positiva neta.

4. 4.

   La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 3, en la que al menos un aminoacido que se tiene que modificar para reducir la carga positiva neta se elige de: lisina 70, lisina 76 o lisina 159 de la SEC ID N°:1 y preferiblemente en la que las sustituciones se eligen independientemente de acido glutamico o acido aspartico.

5. 5.

   La particula de vector lentivirico segun la reivindicacion 1, en la que la secuencia de la variante de E2 son los restos de aminoacido 66 a 488 de la SEC ID N°: 3, los restos de aminoacido 66 a 488 de la SEC ID N°: 4 o los restos de aminoacido 66 a 486 de la SEC ID N°: 5 (variantes 1, 2 y 3).

6. 6.

   La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que es una variante en que la secuencia de los restos 71-75 de la SEC ID N°: 1 es igual o tiene una o dos sustituciones que no afectan a la capacidad de la variante para infectar las CD, pero no modifica el numero de aminoacidos en esta region.

7. 7.

   La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de interes expresa un producto que es un antigeno de un agente causante de enfermedad o una celula enferma.

8. 8.

   La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de interes codifica un antigeno especifico del tumor, opcionalmente NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, un antigeno de linaje de melanocito-melanoma, tal como gp100, gp75, mda-7, tirosinasa o proteina relacionada con tirosinasa; antigeno de carcinoma de celulas renales, 5T4, SM22-alfa, anhidrasa carbonica I, anhidrasa carbonica IX (tambien conocida como G250), factores inducibles por hipoxia (opcionalmente, HIF-1 alfa o HIF-2alfa), VEGF o antigeno de membrana especifico de la prostata (PSMA), antigeno especifico de la prostata (PSA), fosfatos acidos prostaticos, antigeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata (STEAP), NKX3.1, proteinas/peptidos de epitopos derivados de genes mutados en celulas tumorales o genes transcritos a diferentes niveles en el tumor comparado con celulas normales, tales como enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, reorganizacion de bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado o de cepa natural, citocromo P450 1B1, secuencias de intrones expresadas anormalmente tales como N-acetilglucosaminiltransferasa-V; reordenaciones clonicas de genes de inmunoglobulina que generan idiotipos unicos en el mieloma o linfomas de celulas B; proteinas/peptidos de epitopos derivados de procedimientos oncoviricos, tales como proteinas del virus del papiloma humano E6 o E7 o proteinas oncofetales no mutadas con una expresion selectiva del tumor, tal como antigeno carcinoembrionico o alfa-fetoproteina.

9. 9.

   La particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en la que la secuencia de interes codifica un antigeno derivado de virus, tal como un antigeno de VIH o VIS, polipeptidos de adenovirus, polipeptidos de alfavirus, polipeptidos de calicivirus, por ej., un antigeno de la capside de calicivirus, polipeptidos de coronavirus, polipeptido de virus del distemper, polipeptido de virus de Ebola, polipeptido de enterovirus, polipeptido de flavivirus, polipeptido de virus de la hepatitis (AE), por ej., un antigeno del nucleo o de superficie de la hepatitis B o una glucoproteina E1 o E2 del virus de la hepatitis C, proteinas de nucleo o no estructurales, polipeptido de herpesvirus, por ej., una glucoproteina de virus de herpes simple o de virus de varicela zoster, polipeptido de virus de inmunodeficiencia, por ej., la envoltura o proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipeptido de virus de peritonitis infecciosa, polipeptido de virus de la influenza, por ej., una hemaglutinina de la influenza A, neuraminidasa

   o nucleoproteina, polipeptido de virus de la leucemia, polipeptido de virus de Marburg, polipeptido de ortomixovirus, polipeptido de virus de papiloma, polipeptido de virus de parainfluenza, por ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipeptido de paramixovirus, polipeptido de parvovirus, polipeptido de pestivirus, polipeptido de virus de picorna, por ej., un polipeptido de capside de poliovirus, polipeptido de pox virus, por ej., un polipeptido de virus vaccinia, polipeptido del virus rabies, por ej., una glucoproteina G del virus rabies, polipeptido de reovirus, polipeptido de retrovirus o polipeptido de rotavirus.

10. 10.

    Una composicion que comprende una particula de vector lentivirico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 9, en la que la composicion tiene una UI de al menos 105/ml.

11. 11.

    Un sistema de empaquetamiento de vector lentivirico para producir una particula de vector lentivirico pseudotipificado segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, que comprende:

    (i)

    una primera molecula de acido nucleico que codifica la glucoproteina E2 del virus Sindbis segun la reivindicacion 1(a)(i) y

    (ii)

    una segunda molecula de acido nucleico que codifica proteinas gag y pol,

    (iii) una tercera molecula de acido nucleico que codifica rev;

    (iv)

    un genoma de vector lentivirico que comprende una secuencia de interes y

    (v)

    una celula de empaquetamiento.

12. 12. El sistema de empaquetamiento de vector lentivirico segun la reivindicacion 11, en la que:

    (a)

    la proteina pol presenta una integrasa no funcional y/o

    (b)

    la proteina pol presenta una integrasa no funcional con una mutacion D64V y/o

    (c)

    el genoma de vector lentivirico es un genoma lentivirico no integrante y/o

    (d)

    la celula de empaquetamiento se transforma de manera estable con (ii) y (iii) y/o

    (e)

    la celula de empaquetamiento se transinfecta con (i) y (iv).

13. 13.

    Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la glucoproteina E2 o variante segun la reivindicacion 1(a)(i) o una cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

14. 14.

    La molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 13, en la que la proteina es una poliproteina E3/E2/6K/E1 de Sindbis que se trata de manera que la proteina E2 no sea parte de una proteina de fusion con E3 cuando se incorpora a una envoltura virica.

15. 15.

    La molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 14, en la que la secuencia E3 corresponde a (a) restos 165 de la SEC ID N°: 20 o (b) una variante de la misma con al menos 80% de identidad de secuencia para los restos 1-65 de la SEC ID N°: 20, en la que los restos 62-65 son RSKR (SEC ID N°: 27) y la variante es capaz de incorporarse a una envoltura virica pseudotipificada.

16. 16.

    Un metodo para preparar una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, que comprende cultivar la celula de empaquetamiento segun la reivindicacion 11.

17. 17.

    La particula lentivirica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, en la que el genoma del vector lentivirico:

    (a)

    tiene una repeticion terminal larga 3' (LTR) inactivada o auto-inactivada y/o

    (b)

    comprende un elemento U3 que carece de al menos uno de: (i) una secuencia potenciadora; (ii) una caja TATA

    (iii) un sitio Sp1 (iv) un sitio NK-kappa B y (v) un tramo de polipurina (PPT) y/o

    (c)

    comprende la secuencia de nucleotidos de la SEC ID N°: 21, 22 o 23 y/o

    (d)

    comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un factor de maduracion/estimulacion de celulas dendriticas.

18. 18.

    Una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, para uso en un metodo de tratamiento de un individuo, ser humano o animal, que comprende opcionalmente suministrar particulas de vector lentivirico a celulas dendriticas ex vivo.

19. 19.

    Una particula de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10, para uso en la induccion de una respuesta inmunitaria especifica del antigeno, opcionalmente una respuesta humoral y/o respuesta celular.

20. 20.

    Una vacuna terapeutica o profilactica que comprende las particulas de vector lentivirico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composicion segun la reivindicacion 10 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

21. 21.

    La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 20, que comprende ademas un adyuvante.

22. 22.

    La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 21, en la que el adyuvante es un adyuvante de la

    formula (I):

    (I)

    en la que A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo de: hidrogeno, fosfato y sales de fosfato y los restos 5 R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo con 3 a 23 carbonos, representados por C3-C23.
23. 23. La vacuna terapeutica o profilactica segun la reivindicacion 22, en la que:

    (a)

    A1 es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrogeno y

    (b)

    (i) R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20 y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20 o

    10 (ii) R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11 y R2 y R4 son hidrocarbilo C13 o

    (iii) R1, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.