KR20120068838A - 신드비스 바이러스 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 - Google Patents

신드비스 바이러스 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종 및 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자가 제공된다. 렌티바이러스 벡터 입자에는 하기가 포함된다: (a) 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 포함하는 외피; 및 (b) 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈 (여기서 E2 당단백질 변종은 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진하며, E2 당단백질 변종은 참조 서열 (HR 균주)에 비해 헤파란 설페이트에 대한 결합이 감소된다).

Description

신드비스 바이러스 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 {LENTIVIRAL VECTORS PSEUDOTYPED WITH A SINDBIS VIRUS ENVELOPE GLYCOPROTEIN}
본 특허 출원은 일반적으로 표적화된 유전자 전달, 보다 구체적으로는 수지상 세포를 표적으로 삼아서 수지상 세포 예방접종에 이용할 수 있는 외피를 포함하는 가성형태화된 렌티바이러스의 용도에 관한 것이다.
수지상 세포 (DC)는 면역 반응의 개시 및 조절을 위한 필수 항원 제시 세포이다. DC는 항원을 포획 및 처리하고, 말초에서 림프 기관으로 이동하고, 주 조직적합 복합체 (MHC)에 한정된 방식으로 항원을 휴지 T 세포에 제시할 수 있다. 이들 세포는 골수 (BM)에서 유래하며, 수지상 형태와 높은 이동성을 나타낸다. 특화된 항원-제시 세포 (APC) 로서의 DC의 발견은 특이적 항원을 시험관 내 DC에 부하하는 것이 관여되는 DC-기반 면역화/예방접종 전략에 대한 시도를 불러 일으켰다 (Banchereau 및 Palucka, A. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306; Figdor 등, 2004. Nat. Med. 10:475-480). 그러나 이들 시도에는 모두 특정 항원을 자가 DC에 생체 외 부하한 후 환자에게 투여하는 것이 포함되는 환자 특이적 치료의 노동 집약적 준비가 관여된다.
대안적인 전략은 지정된 항원(들)을 인코딩하는 유전자를 숙주 세포에 직접 전달하는 기전으로 재조합 바이러스-기반 벡터를 이용하는 것이다. 이러한 경우, 원하는 적응 면역 반응의 유도를 통해 발현된 유전자 산물이 치료적 이득을 제공한다. 그러나 안전하고 효과적인 시스템을 수득하는 데에는 여러 과제가 존재한다. 이들 과제 중 일부에는 원하는 숙주 세포 세트를 표적화하는 벡터의 설계, 적합한 전달 시스템의 제공, 효과적인 면역 반응을 일으키는 원하는 항원의 발현, 및 충분히 높은 역가를 가져서 지정된 인간 개체군에 널리 이용할 수 있는 재조합 바이러스 벡터 약제학적 조성물의 일관된 제조가 포함된다. 후자는 실험실 규모 시스템을 약제학적 산업에서 제조할 수 있는 제품으로 개발하는데 있어서 특히 해당되는 과제이다.
실험실에서 여러 렌티바이러스 벡터가 VSV-G 외피 단백질로 가성형태화된다. VSV 외피 단백질이 여러 세포 유형을 표적화할 수 있고 ("범친화적" 외피), 생산 시스템이 일반적으로 높은 역가를 제공하기 때문에, 이것이 모델 시스템으로 널리 사용된다.
본원에 개시되는 신드비스 바이러스 및 기타 알파바이러스의 외피 당단백질은 바이러스 입자 막의 지질 이중층 내로 도입된다. 전형적으로 바이러스 막 (외피) 에는 하나의 전구체 단백질의 절단으로 제조되는 두 당단백질 이질이합체, E1 및 E2의 삼합체의 여러 복사본이 포함된다. 전구체 단백질은 그 N-말단에서부터 C-말단까지 E3, E2, 6K 및 E1 단백질을 포함한다. 작은 E3 당단백질은 E2 단백질의 막 내로의 전위를 위한 신호 서열로 작용하며, 퓨린 또는 일부 다른 Ca2+-의존적 세린 단백분해효소에 의해 E2에서 절단된다. 6K 단백질은 E1 단백질의 막 내로의 전위를 위한 신호 서열로 작용하며, 이후 전구체 단백질에서 절단된다.
E1 및 E2 당단백질은 각각 막-관통 영역을 가지며; E2는 약 33 개 잔기의 세포질 도메인을 갖는 반면 E1의 세포질쪽 꼬리는 매우 짧다 (약 2 개 잔기). E1 및 E2는 모두 막-관통 영역 내부나 근방에 부착된 팔미트산을 갖는다.
당해분야에 기재된 신드비스 바이러스 단리물은 헤파란 설페이트 (HS) 와의 상호작용을 통해 세포를 감염시키는 것으로 여겨진다. WO 2008/011636 에는, E3/E2 외피 융합 단백질 (SVGmu로 불림)이 HS로의 단백질 결합을 감소시키면서 DC에 대한 결합과 감염은 DC-SIGN 표면 분자를 통해 보유시키려는 여러 개질을 포함하는 렌티바이러스 패키징 시스템이 기재되어 있다. WO 2008/011636 에서, California Institute of Technology의 Dr. J. H. Strauss의 실험실에서는 야생형 SVG의 cDNA를 수득하고 PCR로 pcDNA3 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하여 플라스미드 pSVG를 생성하였다. 10 개-잔기를 갖는 태그 서열을 PCR 돌연변이화에 의해 아미노산 71 및 74 사이에서 E2 단백질 내로 삽입하여 HS 결합 부위를 손상시켰다. SVG의 E3 당단백질에 추가 결실을 도입하여 아미노산 61-64를 제거하였다. 이렇게 개질한 SVG는 SVGmu (WO2008/011636의 서열 번호 11)로 명명하였다. SVGmu의 cDNA를 pcDNA3 벡터의 CMV 프로모터 하류에 클로닝하였다 (pSVGmu로 명명, WO2008/011636의 서열 번호 3).
SVGmu 가성형태화된 바이러스 입자는 DC-SIGN 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 변환시킬 수 있지만, 해당 시스템의 일부 측면으로 인해 치료적 용도에 적합하지 못하다. 예를 들어 E3/E2 융합 단백질은 인플루엔자 헤마글루티닌의 항원 에피토프를 나타내며, 바이러스 게놈이 숙주 염색체 내로 삽입되어 해로운 숙주 유전자를 활성화할 수 있고, 본 발명자들은 해당 바이러스의 역가가 VSV-G 외피로 가성형태화된 입자의 역가에 비해 낮다는 것을 발견하였다. 중요하게는 E2 당단백질로부터 E3의 정확한 처리를 예방하는 돌연변이를 갖는 신드비스 바이러스 균주 (소위 "pE2 돌연변이"), 예컨대 SVGmu는 증식 허용 세포주에서 잘 자라지 않으며, 마우스 병원성이 크게 약화된다.
본 발명의 3 가지 예시적 E 단백질 변종에 대해 렌티바이러스 벡터를 가성형태화하기 위해 WO2008/011636에서 사용된 SVGmu E3-E2 단백질의 정렬을 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타낸 번호 지정은 신드비스 바이러스 HR 균주의 외피 단백질을 기준으로 한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용하는 번호지정은 이 균주의 신드비스 바이러스를 기준으로 한다. 본 발명자들은 SVGmu 단백질을 개질하여 개선된 렌티바이러스 생산 시스템을 제공한다. 본 발명의 바이러스 입자는 SVGmu를 이용한 것에 비해 현저히 더 높은 역가로 생산되며, 또한 더 강한 면역 반응을 자극한다. 또한 가성형태화된 렌티바이러스 입자는 개선된 역가와 개선된 감염성을 가지면서 DC에 대한 선택성을 보유한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스 벡터 입자를 제공한다: (a) 160X가 없거나 비산성 아미노산인 서열 번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질 또는 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열 번호 1의 변종을 포함하는 외피 (여기서 상기 E2 당단백질 또는 이들의 변종은 E3에 융합되지 않는다); 및 (b) 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 게놈.
상기 변종은 DC-SIGN에 결합할 수 있다. 바람직하게는 이것은 또한 HR 균주의 참조 단백질에 비해 헤파란 설페이트에 대한 결합이 감소한다. HR 균주의 E2 단백질은 서열 번호 18로 나타낸다.
바람직하게는 160X는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신을 포함하는 작은 아미노산 또는 지방족 아미노산 중 하나이다. 하나의 측면에 있어서, 160X는 없거나 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신이다. 하나의 구현예에 있어서, X는 글리신이다.
서열 번호 1의 변종은 160X가 보유되고 상기 정의된 바와 같은 서열 번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 또는 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것으로 정의된다. 상기 변종은 잔기 50 내지 180을 관통하는 영역에서 하나 이상의 라이신 및 아르기닌이 독립적으로 결실되거나 비염기성 아미노산으로 치환될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 비염기성 아미노산은 글루탐산 또는 아스파르트산이다.
하나의 측면에 있어서, 잔기 X는 없거나, 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되며, 잔기 50 내지 180을 관통하는 영역에서 하나 이상의 라이신 및 아르기닌이 독립적으로 결실되거나 비염기성 아미노산으로 치환된다.
또 다른 측면에 있어서, X는 없거나, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되며, 바람직하게는 적어도 위치 159를 포함하는 잔기 50 내지 180을 관통하는 영역에서 하나 이상의 라이신 및 아르기닌이 독립적으로 결실되거나 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치환된다.
치환되거나 결실될 수 있는 양으로 하전된 후보 아미노산에는 잔기 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149 및 159의 라이신 및 잔기 65, 92, 128, 137, 157, 170 및 172의 아르기닌이 포함된다 (번호 지정은 서열 번호 1을 기준으로 한다). 치환되는 경우, 치환은 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 잔기 70, 76 및 159 중 하나 이상의 라이신은 결실되거나 치환된다. 치환되는 경우, 치환은 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
신드비스 바이러스는 RNA 게놈을 가지므로, 상술한 것에 부가하여 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 변이를 상기 정의된 서열 번호 1에 대한 상동성 백분율 범위 내에서 서열 번호 1의 E2 서열의 일부에 일으킬 수 있다. 예를 들어, 위치 3 이 T 또는 V이고, 23 이 V이고, 209가 R이고, 264가 G이고, 393 이 H 인 서열 번호 1의 변종이 존재한다. 변종이 DC를 감염시키는 능력을 보유하는 한, 서열 번호 1에 대한 하나 이상의 이들 변경 또는 기타 변이를 일으킬 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 상기 변종은 서열 번호 1의 잔기 70 내지 76의 영역 내에 삽입을 포함하지 않는다. 이 구현예에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 71 ~ 75의 서열이 변경되지 않거나 변종의 DC를 감염시키는 능력에 영향을 주지 않는 하나 또는 두 개의 치환을 포함할 수 있다.
특정 경우에 있어서, E2 단백질은 적어도 E3과 융합하거나 리더 서열과 융합하여 폴리단백질로서 먼저 발현된다. 특정 구현예에 있어서, E2는 E3-E2-6K-E1 폴리단백질의 일부로 발현된다. 신드비스 바이러스는 자연적으로 E2를 폴리단백질의 일부로 발현하며, E3/E2, E2/6K, 및 6K/E1에 대한 접합 영역은 엔도펩티다아제에 의해 인지되고 절단되는 서열을 갖는다. E3/E2 폴리단백질 서열을 서열 번호 20으로 나타낸다. 보통 E3/E2 접합부는 E3/E2 폴리단백질의 잔기 65 내지 66에서 퓨린 또는 퓨린-유사 세린 엔도펩티다아제에 의해 절단된다. 퓨린은 2 개 아미노산으로 구분되는 짝을 형성한 아르기닌 잔기에 대해 특이성을 갖는다. 퓨린에 의한 E3/E2 절단을 유지하기 위해, 잔기 62~66 (RSKRS; 서열 번호 26)은 2 개 아미노산이 분리된 2 개의 아르기닌 잔기 및 세린 잔기를 유지해야 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 폴리단백질은 서열 번호 20의 잔기 1~65에 해당하는 E3 서열, 또는 서열 번호 20의 잔기 1~65에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 또는 98% 서열 동일성을 갖는 이들의 변종을 포함하며, 여기서 잔기 62~65는 RSKR (서열 번호 27)이고, 상기 변종은 가성형태화된 바이러스 외피 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 폴리단백질의 E2 부분은 상기 정의된 바와 같은 구현예 중 어느 하나이다.
대안적으로 E3/E2 퓨린 절단 서열 또는 임의의 다른 절단 서열 대신에 상이한 절단 서열을 사용할 수 있다. 인지 및 절단 부위는 아스파르트 엔도펩티다아제 (예로 카텝신 D, 키모신, HIV 프로테아제), 시스테인 엔도펩티다아제 (브로멜라인, 파파인, 칼파인), 메탈로엔도펩티다아제 (예로 콜라게나아제, 써모라이신), 세린 엔도펩티다아제 (예로 키모트립신, 인자 IXa, 인자 X, 트롬빈, 트립신), 스트렙토키나아제를 비제한적으로 포함하는 엔도펩티다아제를 위해 도입될 수 있다. 이들 효소를 위한 인지 및 절단 부위 서열은 널리 공지되어 있다.
이러한 절단 부위를 이용하는 경우, 이를 상기 절단 서열에 C-말단에서 직접 융합되어 다시 폴리단백질의 E2 부분에 융합된 서열 번호 20의 적어도 잔기 1~60, 예컨대 잔기 1~61 또는 1~62 또는 서열 번호 20의 해당 잔기 번호에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 또는 98% 서열 동일성을 갖는 이들의 변종을 포함하는 E3 폴리단백질 내로 도입할 수 있다. 바람직하게는 폴리단백질의 E2 부분은 상기 본원에 정의된 바와 같은 구현예 중 어느 하나이다.
본 발명의 E2 단백질 서열에는 160X가 하기 표에 정의된 바와 같으며, 단백질은 다음과 같은 하기 잔기 70, 76 및 159 및 160을 제외하고는 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1의 변종이 포함된다:
Figure pct00001
선택적으로, 각각의 상기 서열은 서열 번호 1에 하나 이상의 추가 변경을 포함하지만 변경되지 않은 서열 번호 1의 잔기 71~75를 가지거나 DC를 감염시키는 변종의 능력에는 영향을 미치지 않으면서 이 영역의 아미노산 수를 바꾸지 않는 하나 또는 2 개의 치환을 가질 수 있다.
또한 본 발명의 E2 단백질 서열에는 잔기 160 이 Gly 대신 Ala, Ile, Leu 또는 Val 인 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15가 포함된다. 상기 변종은 또한 변경되지 않은 서열 번호 1의 잔기 71~75를 포함하거나 DC를 감염시키는 변종의 능력에는 영향을 미치지 않으면서 이 영역의 아미노산 수를 바꾸지 않는 하나 또는 2 개의 치환을 가질 수 있다.
선택적으로 상기 두 단락에 기재된 서열 번호 3~15의 E2 서열 또는 추가 변종은 다른 위치가 변이되어 서열 번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 E2 서열을 제공할 수 있다. "적어도 80% 서열 동일성" 에는 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 또는 98% 서열 동일성 중 어느 하나가 포함된다.
상기 구현예에 있어서, 서열 번호 20의 위치 66에 해당하는 첫번째 E2 잔기는 Ser일 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 임의의 서열 번호 3-15 및 상술한 3 개 단락에 기재된 이들의 변종을 포함하는 본 발명의 E2 서열은 적어도 E3/E2 서열을 포함하는 폴리단백질, 바람직하게는 신드비스 E3/E2/6K/E1 폴리단백질 서열로부터 발현될 수 있다. 각 구현예에서의 E3 폴리단백질 서열은 비천연 절단 부위를 갖는 변종을 포함하는 서열 번호 20의 잔기 1~65를 갖는 것 또는 이들의 임의 변종일 수 있다.
발명의 개요
본 특허 출원은 관심 서열을 갖는 게놈 및 아르보바이러스의 당단백질을 포함하는 외피를 포함하는 가성형태화된 렌티바이러스 벡터에 대한 것이다. 아르보바이러스 당단백질은 신드비스 바이러스, 뎅기 바이러스, 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스에서 유래될 수 있다. 특히, 상기 당단백질이 신드비스 바이러스 유래의 E2 단백질인 경우, E2 단백질은 서열 번호 1에 비해 잔기 160에 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 아미노산 변형은 결실 또는 글루탐산 이외의 아미노산일 수 있다. 이와는 달리 E2 당단백질은 서열 번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 잔기 160 이 결실되거나 글루탐산 이외의 아미노산으로 변형된 변종 단백질일 수 있다. 상기 당단백질은 수지상 세포의 감염을 촉진한다. 모든 경우에 있어서, E2 당단백질은 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아니다. 일부 구현예에 있어서, 상기 E2 당단백질 또는 변종은 DC-SIGN에 결합한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 게놈을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 잔기 160은 없거나 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신이다. 하나의 구현예에 있어서, 잔기 160은 글리신이다. 또한, E2 당단백질의 다른 변형은 언급된 잔기 160의 변형과 조합되어 일어날 수 있다. 이러한 변형의 하나는 E2의 전체적 양의 전하를 감소시키는 아미노산의 변경이다. 전체적 양의 전하를 감소시키는 한 방법은 라이신 중 하나를 염기성이 아닌 아미노산으로 변경하는 것이다. 특정 구현예에 있어서, 하나 이상의 라이신 70, 라이신 76 또는 라이신 159 이 변형된다. 특정 구현예에 있어서, 하나 이상의 이들 라이신은 글루탐산 또는 아스파르트산으로 변경된다. 특정 구현예에 있어서, E2 당단백질은 서열 번호 3-16 중 하나이다. 변형의 조합예에는 비제한적으로 위치 160 에서의 글루탐산 변형, 및 하나 이상의 라이신 70, 라이신 76, 또는 라이신 159의 비염기성 잔기로의 변형이 포함된다. 잔기 160의 변형 및 선택적으로 본원에 개시된 임의의 다른 변형과 함께 기타 변형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 앞서 언급된 임의의 E2 당단백질에는 선택적으로 하나 이상의 추가 치환, 삽입 또는 결실이 포함될 수 있다. 하나의 구체예로서, E2 내지 E3 간의 단백질 절단 부위는 상이한 엔도펩티다아제에 의해 절단되는 변형 서열 또는 천연 서열 중 하나일 수 있다. 상기 중 어느 하나와 조합될 수 있는 다른 구현예에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 71~75 서열은 변경되지 않거나 또는 DC를 감염시키는 변종의 능력에 영향을 미치지 않는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 임의의 상기 바이러스 입자의 렌티바이러스 벡터 게놈에는 종양 특이적 항원 또는 바이러스 유래 항원, 예컨대 HIV 또는 SIV 항원을 인코딩하는 관심 서열이 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 임의의 기재된 벡터 입자는 적어도 105/mL의 IU 역가로 제조된다.
또 다른 측면에 있어서, 하기를 포함하는 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자를 제조하기 위한 렌티바이러스 벡터 패키징 시스템이 제공된다: 잔기 160 이 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자, 또는 수지상 세포를 감염시킬 수 있고 잔기 160 이 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 갖는 이들의 변종, gag 및 pol 단백질을 인코딩하는 제 2 핵산 분자; rev를 인코딩하는 제 3 핵산 분자; 및 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈. 패키징 시스템의 E2 당단백질 또는 변종은 임의의 상기 구현예에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, pol 단백질은 비기능적 인테그라아제를 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 비기능적 인테그라아제는 D64V 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 제 2 핵산 분자는 비삽입성 렌티바이러스 게놈이다. 특정 구현예에 있어서, att 부위가 변이 또는 결실되거나, PPT 부위가 변이 또는 결실되거나, 또는 둘 다이다. 비삽입성 렌티바이러스 게놈은 비기능적 인테그라아제와 함께 그리고 임의의 E2 단백질 또는 변종과 함께 사용할 수 있다. 렌티바이러스 벡터 입자를 적어도 105 IU/mL의 역가로 제조하는 것이 바람직하다. 일부 경우에 있어서, 세포는 상술한 제 1 및 제 4 핵산 분자로 전달감염되다. 세포는 안정한 형질전환에 있어서 이미 제 2 및 제 3 핵산 분자를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같은 당단백질 또는 선택적으로 신드비스 E3/E2/6K/E1 폴리단백질의 형태인 E3/E2 당단백질, 또는 E3 서열이 서열 번호 20의 잔기 1~65에 해당하는 E3/E2 당단백질, 또는 잔기 62~65가 RSKR (서열 번호 27)이고 변종이 가성형태화된 바이러스 외피 내로 도입될 수 있고 선택적으로 E2 폴리단백질의 잔기 1이 Ser 인 서열 번호 20의 잔기 1~65에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이들의 변종을 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. E2 당단백질은 변형의 조합을 포함하는 임의의 상술한 변종일 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포와 마찬가지로 제공된다.
잔기 160 이 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자, 또는 서열 번호 1과 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 잔기 160 이 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 이들의 변종; 및 (ii) 전사될 수 있고 전사물이 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자로 조립되는 제 2 핵산 분자를 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는 임의의 한 변종 또는 상기 조합의 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법이 제공된다.
인간 또는 동물 피험체의 치료 방법에 임의의 렌티바이러스 벡터 입자를 사용할 수 있다. 상기 치료는 예방적 또는 치료적인 면역화용 백신일 수 있다. 백신에는 렌티바이러스 벡터 입자와 약제학적으로 허용가능한 부형제가 포함된다. 대안적으로, 세포와 임의의 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 혼합하는 것을 포함하여, 렌티바이러스 벡터 입자를 시험관 내에서 세포에 투여할 수 있다.
본 발명의 이들 및 기타 측면은 하기 상세한 설명과 첨부 도면을 참조하여 자명해질 것이다. 또한 2009.07.24.자로 출원한 U.S. 출원 번호 61/228,491의 전문이 모든 목적으로 본원에 참조함으로써 통합된다.
도 1은 4 가지 신드비스 바이러스 외피의 외피 단백질인 SVGmu, SIN-VaM, SIN-Var2, 및 SIN-Var3에 대한 서열 정렬이다. 상기 정렬을 전술한 신드비스 외피인 SVGmu에 대해 나타낸다. SVGmu에 대한 주요 차이에는 E3 내지 E2 사이 퓨린 유사 프로테아제 절단 부위 (RSKR; 서열 번호 27)의 생성, HA 에피토프 태그의 제거 및 헤파린 결합을 감소시키는 일련의 라이신 치환이 포함된다.
도 2는 바이러스 입자 패키징에 사용되는 벡터의 도식예이다.
도 3은 벡터 게놈이 3 개의 상이한 신드비스 바이러스 외피 단백질, SVGmu 및 SIN-HR로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자 제조물의 조생성 상청액 역가 그래프를 나타낸다. 바이러스 상청액은 표준 방법을 이용한 일시적 전달감염으로 생성되며, 전달감염 48 시간 후에 수집되었다. 인간 DC-SIGN (293T-DC-SIGN)을 발현하는 293T 세포 상에서 역가를 결정하였다. 역가는 상청액 ml 당 GFP 발현 단위수로 표시되며, 3 가지 독립적 전달감염의 수단이다. 오차 막대는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 4a, 4b, 및 4c는 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자의 투여 후 마우스에서 T 세포의 면역학적 반응을 나타내는 그래프이다. (A) C57BL/6 마우스에 OVA를 인코딩하는 삽입이 결핍된 렌티바이러스 벡터의 2 개 용량 중 하나 (p24의 ng으로 나타냄)로 피하 면역시켰다. 비장 내 OVA257 특이적 CD8 T 세포의 수 및 기능을 MHC-1/펩티드 다합체 및 세포내 시토카인 염색으로 9 일째에 결정하였다. (B) C57BL/6 마우스를 OVA를 인코딩하는 삽입이 결핍된 렌티바이러스 벡터의 용량 범위로 피하 면역시켰다. 비장 내 OVA257 특이적 CD8 T 세포의 백분율을 MHC-1/펩티드 다합체 염색으로 11 일째에 결정하였다. (C) OVA를 인코딩하는 삽입이 결핍된 렌티바이러스 벡터의 용량 범위로 C57BL/6 마우스를 피하 면역시켰다. 비장 내 OVA257 특이적 CD8 T 세포의 백분율을 세포 내 시토카인 염색으로 9 일째에 결정하였다.
도 5a는 렌티바이러스 게놈의 예시도를 나타낸다. 도 5b는 3 개 벡터 구축물의 U3 영역 서열을 나타낸다. (a) 모든 렌티바이러스 벡터에 포함된 요소를 예시적 벡터 게놈의 상부에 나타낸다. 사용된 프로모터에는 인간 유비퀴틴-C 프로모터 (UbiC), 사이토메갈로바이러스 조기 발현 프로모터 (CMV), 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터가 포함된다. 표준 SIN U3 영역에 부가하여, 일련의 연장된 결실을 나타낸다. 모든 3 개 벡터의 U3 영역의 서열 정렬을 (b)에 나타낸다. 나타낸 서열에는 구축물 704에 결실된 폴리퓨린 트랙 (PPT)이 포함되며, 연장된 U3 결실이 703 및 704 구축물 모두에 포함된다.
도 6a 및 6b는 293T 세포의 형질도입 후 렌티바이러스 벡터로부터의 GFP 발현을 나타낸다. 도 6a에서 GFP는 UbiC 프로모터에 작동가능하게 연관되며, 도 6b에서 GFP는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연관된다. GFP 발현 수준은 DC-SIGN을 발현하는 293T 세포의 형질도입 48 hr 후 인테그라아제 결핍 렌티바이러스 벡터로부터 결정되었다. 형질도입된 세포 내의 GFP 발현은 표준 흐름 세포측정 방법으로 결정하였다; 각각의 형질도입된 세포 풀로부터 총 50,000 회 수집하여 평균 발현 수준을 결정하였다.
도 7은 5 회 계대 동안 GFP 양성 세포의 수를 나타낸다. 세포를 상이한 벡터 제조물로 형질도입하고 매 72 hr 마다 계대 배양하였다. 상이한 NILV 구축물로 형질도입된 293T 세포 배양물에서 상대 GFP 역가를 결정하였다. 벡터를 야생형 인테그라아제 (IN+) 또는 D64V 돌연변이 인테그라아제 (IN-) 중 하나를 이용하여 패키징하고 DC-SIGN을 발현하는 293 세포를 형질도입하는데 사용하였다. 이어서 형질도입된 세포 배양물을 15 일 동안 매 72 시간마다 계대 배양하였다. 각 계대 시, 배양물 내 GFP+ 세포의 수를 표준 흐름 세포측정 방법으로 결정하였다. 계대와 함께 일어나는 GFP 발현의 소실은 경시적인 벡터 에피좀의 소실을 나타낸다.
도 8은 삽입성 (Intwt) 또는 비삽입성 (IntD64V) 렌티바이러스 벡터 투여 후 CD8 T 세포 반응을 나타낸다. C57BL/6 마우스를 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV) 유래의 Gag 항원을 인코딩하는 삽입성 (Intwt) 또는 비삽입성 (IntD64V) 렌티바이러스 벡터의 2.5x1010 게놈으로 피하 면역시켰다. 비장 내 항원 특이적 T 세포의 수 및 이들의 시토카인 분비 프로필을 세포 내 시토카인 염색으로 10 일째에 결정하였다.
도 9는 담체 단독 또는 종양 항원을 인코딩하는 바이러스 입자를 투여한 마우스에서의 종양 크기 (좌측 그래프) 및 생존 백분율 (우측 그래프)을 나타내는 그래프를 나타낸다. BALB/c 마우스에 2x104 개 CT26 결장암종 세포를 피하 주사하였다. 1 일 후, 마우스에 담체 또는 개질된 CT26 CD8 T 세포 에피토프인 AH1A5 펩티드 (SPSYAYHQF; 서열 번호 25)를 인코딩하는 DC-표적화 비삽입성 렌티바이러스 벡터 (DC-NILV) 3.2 ㎍ (p24 캡시드)을 피하 처리하였다. 초기 종양 성장 및 예방접종한 마우스 대 대조 마우스의 장기 생존을 나타낸다.
본 명세서에서는 렌티바이러스 벡터 입자 (예로 비리온, 렌티바이러스 입자)를 이용하여 수지상 세포 (DC)를 표적화하여 관심 서열을 DC로 전달하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 렌티바이러스 벡터 입자는 신드비스 바이러스 E2 유래의 외피 당단백질 변종 및 관심 서열을 포함하는 게놈, 그리고 선택적으로 기타 성분을 포함한다. 당단백질 변종은 참조 신드비스 바이러스 균주인 HR에 비해 헤파란 설페이트에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 외피 당단백질은 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진한다. 본원에서 사용되는 감염을 "촉진한다" 라는 것은 형질도입을 촉진하는 것과 동일하며, 가성형태화된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자의 표적 세포로의 수용체 매개 도입의 촉진 또는 증강에서 단독으로 또는 다른 분자와 함께 작용하는 외피 당단백질의 역할을 나타낸다.
일반적으로 렌티바이러스 벡터 입자는 하나 이상의 플라스미드 벡터 및/또는 함께 기능적 벡터 입자를 생성하는데 필요한 성분을 인코딩하는 삽입된 요소를 포함하는 세포주에 의해 제조된다. 이들 렌티바이러스 벡터 입자는 전형적으로 복제 적격이 아니다, 즉 이들은 단회 감염만 가능하다. 가장 빈번하게는 제조 세포 염색체 내로 안정적으로 삽입되는 다중 플라스미드 벡터 또는 개별 발현 카세트를 이용하여 렌티바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전적 성분을 분리하지만, 모든 렌티바이러스 성분을 갖는 하나의 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 하나의 예시에 있어서, 패키징 세포주는 LTR, c/s-작용 패키징 서열, 및 관심 서열(들)을 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 하나 이상의 플라스미드, 바이러스 효소 및 구조 성분 (예로 gag 및 pol)을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 및 아르보바이러스 외피 당단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드로 전달감염된다. 바이러스 입자는 세포막을 통해 나오며, 관심 서열을 포함하는 전형적으로 2 개의 RNA 게놈을 포함하는 코어 및 수지상 세포를 표적화하는 아르보바이러스 외피 당단백질을 포함한다. 아르보바이러스 당단백질이 신드비스 바이러스 E2 당단백질인 경우, 상기 당단백질을 조작하여 참조 균주 HR에 비해 헤파란 설페이트에 대한 결합이 감소된다. 여기에는 보통 HR E2 당단백질 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 변경이 관여된다.
이론에 구애되지 않고, 바이러스 입자의 세포 표면으로의 결합은 세포 내 이입을 유도하여 바이러스를 엔도좀 내로 가져가 막 융합을 일으키고 바이러스 코어를 세포질로 들어가도록 한다고 여겨진다. 삽입성 렌티바이러스 벡터 입자를 이용하는 특정 구현예에 있어서, 역전사 및 산물의 핵으로의 이동 후, 바이러스 게놈은 표적 세포 게놈 내로 들어가서 관심 서열(들)을 표적 세포의 게놈 내로 삽입한다. 그러나 삽입 돌연변이의 확률을 감소시키고 지정 항원(들)의 일시적 발현을 촉진하기 위해서, 다른 구현예는 표적 세포 게놈 내로 도입되지 않고 대신 에피좀으로부터 관심 서열(들)을 발현하는 비삽입성 렌티바이러스 벡터 입자를 이용한다. 어느 방식이든 감염된 DC는 관심 서열(들), 예로 항원, 자극성 분자를 발현한다. 이어서 상기 항원은 수지상 세포에 의해 처리되고 T 및 B 세포로 제시되어, 항원 특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다. 수지상 세포가 항원 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 한 상술한 특이적 경로는 필요하지 않다.
예방적 또는 치료적 효과를 제공하기 위해서 바이러스 입자를 피험체에 투여할 수 있다. 관심 서열의 산물은 전형적으로 질환 요인 제제 또는 질환에 걸린 세포 (예로 종양 세포)의 항원이다. 수지상 세포의 감염 및 산물의 발현 후, 산물에 대해 면역 반응이 생성된다. 면역 반응은 체액성 또는 세포성 또는 둘 모두일 수 있다.
A. 바이러스 벡터 외피
절지동물 매개 바이러스 (아르보바이러스)는 감염된 절지동물 벡터, 예컨대 모기에 의해 숙주, 예컨대 인간, 말 또는 새로 전파되는 바이러스이다. 아르보바이러스는 양의 극성을 갖는 단일쇄 RNA 게놈과 당단백질 함유 외피를 갖는 알파바이러스 및 플라비바이러스를 포함하는 바이러스 서브패밀리로 세분된다. 예를 들어 뎅기열 바이러스, 황열 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스는 플라비바이러스 패밀리에 속하며, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스는 알파바이러스 패밀리의 일원이다 (Wang 등, J. Virol. 66, 4992 (1992)). 신드비스 바이러스의 외피에는 2 개의 막 통과 당단백질이 포함되며 (Mukhopadhyay 등, Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)): E1은 융합에 관여하는 것으로 여겨지고, E2는 세포 결합에 관여하는 것으로 여겨진다. 신드비스 바이러스 외피 당단백질은 종양레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하는 다른 레트로바이러스를 가성형태화하는 것으로 알려져 있다.
앞서 논의된 바와 같이, 아르보바이러스 외피 당단백질을 이용하여 렌티바이러스-기반 벡터 게놈을 가성형태화할 수 있다. "가성형태화된" 렌티바이러스는 렌티바이러스 게놈과 구별되는 바이러스에 의해 인코딩되는 하나 이상의 외피 당단백질을 갖는 렌티바이러스 입자이다. 외피 당단백질은 본원에 기재된 바와 같이 개질, 변이 또는 가공할 수 있다.
신드비스 바이러스 및 다른 알파바이러스의 외피는 바이러스 입자막의 지질 이중층 내로 삽입되며, 전형적으로 두 당단백질 E1 및 E2의 여러 복사본을 포함한다. 각각의 당단백질은 막-관통 영역을 갖는다; E2는 약 33 개 잔기의 세포질 도메인을 갖는 반면, E1의 세포질쪽 꼬리는 매우 짧다 (약 2 개 잔기). E1 및 E2는 모두 막-관통 영역 내부나 근방에 부착된 팔미트산을 갖는다. E2는 초기에 퓨린 또는 다른 Ca2+-의존적 세린 단백분해효소에 의해 E2 및 E3으로 불리는 작은 당단백질로 절단되는 전구체 단백질로 합성된다. 6K로 불리는 단백질을 인코딩하는 서열이 E2 및 E1을 인코딩하는 서열 사이에 위치한다. E3 및 6K는 E2 및 E1 당단백질을 각각 막 내로 전위시키는 작용을 하는 신호 서열이다. 신드비스 바이러스 게놈에 있어서, 신드비스 외피 단백질에 대한 코딩 영역에는 E3, E2, 6K, 및 E1을 인코딩하는 서열이 포함된다. 본원에서 사용되는 아르보바이러스 바이러스의 "외피" 에는 적어도 E2가 포함되며, 또한 E1, 6K 및 E3 이 포함될 수 있다. 신드비스 바이러스 균주 HR의 외피 당단백질의 예시적 서열을 서열 번호 17로 나타낸다. 다른 아르보바이러스에 대한 외피 당단백질의 서열은 예로 GenBank에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어 뎅기 바이러스 당단백질을 코딩하는 서열은 접근번호 GQ252677 (GenBank의 다른 것들 가운데) 및 NCBI의 바이러스 변이 데이터베이스 (GenBank 접근번호 및 바이러스 변이 데이터베이스는 외피 당단백질 서열에 대한 참조함으로써 통합된다) 에서, 그리고 베네주엘라 말 뇌염 바이러스의 외피 당단백질을 인코딩하는 서열은 접근번호 NP 040824 (외피 당단백질 서열에 대하여 참조함으로써 통합됨)에서 찾아볼 수 있다.
알파바이러스, 특히 신드비스 바이러스에 대한 수지상 세포 상의 세포 수용체(들)는 아직까지 확실히 동정되지는 않았지만, 한 수용체가 DC-SIGN 인 것으로 드러났다 (Klimstra 등, J Virol 77: 12022, 2003). "부착", "결합", "표적화" 등의 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 신드비스 바이러스 외피 당단백질 및 세포 성분 간 상호작용의 기전을 나타내려는 것은 아니다. DC-SIGN (수지상 세포 특이적 ICAM-3 (세포 내 접착 분자 3)-그래빙 논인테그린; CD209 로도 알려져 있음)은 신속한 결합 및 물질의 세포 내 이입이 가능한 C-형 렉틴 유사 수용체이다 (Geijtenbeek, T. B. 등, Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004). E2는 DC-SIGN을 통해 바이러스를 수지상 세포로 표적화하는 것으로 나타났다. 본원에서 사용되는 DC-SIGN을 발현하는 세포는 DC-SIGN을 발현하지 않는 동종 세포에 비해 신드비스 바이러스 E2로 가성형태화된 바이러스 벡터 입자에 의해 더 잘 형질도입된다 (적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 6 배, 적어도 7 배, 적어도 8 배, 적어도 9 배, 또는 적어도 10 배 더). E2 당단백질이 바이러스 감염을 촉진하는 기전은 아마도 DC-SIGN 으로의 직접적 결합을 통해 또는 입체형태 변경 또는 일부 다른 기전을 일으켜서 DC-SIGN 이 관여되는 것으로 나타난다. 실제 기전과는 무관하게, E2에 의한 표적화는 DC-SIGN을 발현하는 세포, 즉 수지상 세포를 더 선호한다.
신드비스 바이러스는 또한 헤파란 설페이트를 통해 세포에 결합하는 것으로 나타난다 (Klimstra 등, J Virol 72: 7357, 1998; Burmes 및 Griffin, J Virol 72: 7349, 1998). 헤파란 설페이트 및 다른 세포 표면 글리코스아미노글리칸은 대부분의 세포 유형의 표면에서 발견되므로, 헤파란 설페이트 및 신드비스 외피 당단백질 간의 상호작용을 감소시키는 것이 바람직하다. 이는 신드비스 바이러스 외피의 헤파란 설페이트에 대한 결합을 감소시키거나 결합, 예로 신드비스 바이러스 외피의 수지상 세포로의 결합력을 증가시켜, 혹은 둘 모두에 의해 달성할 수 있다. 그 결과, 다른 세포 유형에 의해 발현될 수 있고 외피가 DC-SIGN에 대해 특이적인 경우에도 일어날 수 있는 다른 분자에 대한 비특이적 결합이 감소되며, 개선된 특이성이 원하지 않는 부작용, 예컨대 원하는 면역 반응을 감소시킬 수 있는 부작용 또는 다른 세포 유형의 표적을 벗어난 형질도입과 연관된 부작용을 회피하는 작용을 할 수 있다. 대안적으로 또는 DC-SIGN을 발현하는 세포의 상대적으로 특이적인 형질도입의 장점에 부가하여, 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질로 가성형태화된 바이러스 입자는 당단백질, 예컨대 VSVG로 가성형태화된 바이러스 입자에 비해 다른 장점을 제공할 수 있다. 이러한 장점의 예에는 둘 다 VSV-G로 가성형태화된 바이러스 입자의 투여와 연관된 것으로 여겨지는 감소된 보체 매개 용해 및/또는 감소된 신경 세포 표적화가 포함된다.
다양한 예시에 있어서, 렌티바이러스 벡터 입자는 DC-SIGN을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하며, 헤파란 설페이트에 대한 결합이 감소되거나 없어진다. 즉 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질을 개질하여 다른 세포 유형에 비해 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포로 바이러스를 우선적으로 보낼 수 있다. 다른 연구 가운데 구조 연구 및 분자적 모델링으로부터 수득한 정보에 근거하여, 외피 단백질, 특히 E2 및 E1 당단백질의 변종 서열을 상기 당단백질이 외피 단백질로서의 이들의 기능은 유지하면서 원하는 결합 특이성, 결합력, 또는 결합 수준을 갖도록 설계 및 생성한다. 후보 변종 서열을 각각의 당단백질에 대해 생성하고 후술되는 방법 또는 당해분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 분석하여, 가장 바람직한 특징을 갖는 외피 당단백질을 동정할 수 있다.
신드비스 E2의 특정 변종 서열은 서열 번호 1에 비해 잔기 160에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 잔기 160은 결실되거나 글루탐산 이외의 아미노산으로 변경된다. 변형은 가장 일반적으로는 적어도 한 아미노산의 치환이지만, 대안적으로는 하나 이상의 아미노산의 첨가 또는 결실일 수 있다. 바람직하게는 임의의 추가적 아미노산은 수가 적으며, 안전성을 상쇄시킬 수 있는 항원성 에피토프 (예로 헤마글루티닌 태그 서열)는 포함하지 않는다. 2 개 이상의 변형이 있는 경우, 동일한 유형 (예로 치환) 또는 상이한 유형 (예로 치환 및 결실)일 수 있다. 여러 변형이 단백질 서열에 분산되어 있거나 또는 인접해 위치할 수 있다.
제 1 경우에 있어서, 변종 서열은 약 잔기 50 내지 약 잔기 180의 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 이 영역 내에는 헤파란 설페이트로의 결합에 관여하는 아미노산이 존재한다. E2의 전체적 양 전하를 감소시킴으로써 헤파란 설페이트와의 정전기적 상호작용을 감소시켜 헤파란 설페이트에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. 이 영역 내의 양으로 하전된 후보 아미노산에는 잔기 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159의 라이신 및 잔기 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172의 아르기닌이 포함된다 (Bear 등, Virology 347: 183-190, 2006). 이러한 아미노산의 적어도 일부는 헤파란 설페이트로의 E2 결합에 직접 시사된다. 전체적인 양의 전하는 라이신 또는 아르기닌의 결실 또는 라이신 또는 아르기닌의 중성 또는 음으로 하전된 아미노산으로의 치환에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 이들 라이신 및 아르기닌을 글루탐산 또는 아스파르트산으로 대체할 수 있다. 특정 구현예에는 적어도 하나의 라이신 70, 76 또는 159의 치환이 있다. E2가 E3과의 폴리단백질로 발현되는 경우, 천연 E3/E2 절단 부위에 인접해 위치하는 라이신은 유지된다-즉, 인지 서열 및 절단 부위는 변경되지 않는다. 대안적으로 천연 엔도펩티다아제 절단 부위 서열은 상이한 엔도펩티다아제에 대한 인지 서열로 대체된다.
E2의 특정 변종을 또한 수지상 세포에 대한 결합에 긍정적으로 영향을 미치는 방식으로 개질한다. 참조 HR 서열에서 잔기 160에서 발견되는 글루탐산의 변형은 수지상 세포로의 결합을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다 (그 전문이 도입되는 Gardner 등, J Virol 74, 11849, 2000 참고). 변형, 예컨대 잔기 160의 결실 또는 잔기 160의 치환이 특정 변종에서 확인된다. 특정 변종에서는 비하전 아미노산이 Glu에 대해 치환되며, 다른 변종에서는 비산성 아미노산이 Glu에 대해 치환된다. 전형적으로, Glu160은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신을 포함하는 작은 아미노산 또는 지방족 아미노산 중 하나로 대체된다.
다른 변종에는 2 개 이상의 아미노산 변형이 포함된다. 전형적으로 이들 변종에 있어서, 하나의 변형은 Glu160 이며, 나머지 변형(들)은 잔기 약 50 내지 약 180의 관통 영역 내 하나 이상의 라이신 및 아르기닌의 변경이다. 특정한 변종에는 Glu160의 비산성 잔기로의 변형 또는 결실 및 하나 이상의 라이신 70, 라이신 76, 또는 라이신 159의 비염기성 아미노산으로의 변형이 포함된다. 일부 특이적 변종에는 Glu160의 Gly 으로, Lys 70의 Glu 으로, 및 Lys 159의 Glu 으로; Glu160의 Gly 으로, Lys 70, 76 및 159의 Glu 으로; Glu 160의 결실 및 Lys 70 및 159의 Glu 으로; 및 Glu 160의 결실 및 Lys 70, 76, 및 159의 Glu 으로의 변형이 포함된다.
특정 경우에 있어서, E2 단백질은 적어도 E3과 융합하거나 리더 서열과 융합하여 폴리단백질로서 먼저 발현된다. 리더 서열이 E3 또는 다른 서열인지 여부와 무관하게, 바이러스 외피 내의 E2는 E3 또는 다른 리더 서열이 없어야 한다. 즉 E2는 바람직하게는 E3/E2 융합 단백질 (예로 SVGmu로 불리는 E3/E2 융합 단백질)이 아니다. 특정 구현예에 있어서, E2는 E3-E2-6K-E1 폴리단백질의 일부로 발현된다. 신드비스 바이러스는 자연적으로 E2를 폴리단백질의 일부로 발현하며, E3/E2, E2/6K, 및 6K/E1에 대한 접합 영역은 엔도펩티다아제에 의해 인지되고 절단되는 서열을 갖는다. 보통 E3/E2 접합부는 잔기 65 내지 66에서 퓨린 또는 퓨린-유사 세린 엔도펩티다아제에 의해 절단된다. 퓨린은 2 개 아미노산으로 구분되는 짝을 형성한 아르기닌 잔기에 대해 특이성을 갖는다. 퓨린에 의한 E3/E2 절단을 유지하기 위해, 잔기 62~66 (RSKRS; 서열 번호 26)은 2 개 아미노산으로 분리된 2 개의 아르기닌 잔기 및 세린 잔기를 유지해야 한다. 대안적으로 E3/E2 퓨린 절단 서열 또는 임의의 다른 절단 서열 대신에 상이한 절단 서열을 사용할 수 있다. 인지 및 절단 부위는 아스파르트 엔도펩티다아제 (예로 카텝신 D, 키모신, HIV 프로테아제), 시스테인 엔도펩티다아제 (브로멜라인, 파파인, 칼파인), 메탈로엔도펩티다아제 (예로 콜라게나아제, 써모라이신), 세린 엔도펩티다아제 (예로 키모트립신, 인자 IXa, 인자 X, 트롬빈, 트립신), 스트렙토키나아제를 비제한적으로 포함하는 엔도펩티다아제를 위해 도입될 수 있다. 이들 효소를 위한 인지 및 절단 부위 서열은 널리 공지되어 있다.
이미 언급된 것들 이외의 E2 내의 아미노산이 또한 변경될 수 있다. 일반적으로 변종 E2 서열은 참조 E2 서열에 대해 적어도 80% 서열 아미노산 동일성을 가지거나 또는 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 변종 당단백질은 생물학적 기능, 예컨대 E2를 포함하는 외피를 갖는 바이러스 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진하는 능력을 나타내야 한다. 실험을 통해 바이러스 조립, 세포 표면으로의 부착 및 감염의 다양한 측면에 중요한 역할을 하는 것으로 나타나는 외피 당단백질 영역을 동정하였다. 변종을 만드는 경우, 하기 정보를 가이드라인으로 이용할 수 있다. E2의 세포질쪽 꼬리-대략 잔기 408 내지 415-가 바이러스 조립에 중요하다 (West 등, J Virol 80: 4458-4468, 2006; 그 전문이 도입됨). 다른 영역은 2차 구조의 형성 (대략 잔기 33-53)에 관여하며; 수송 및 단백질 안정성에 관여한다 (대략 잔기 86-119) (Navaratmarajah 등, J Virol 363: 124-147, 2007; 그 전문이 도입됨). 변종은 막을 통과하는 대략 잔기 370-380 영역의 소수성 특징을 보유할 수 있다. 변종은 하나 또는 둘 모두의 N-연관 당쇄화 부위 잔기 NIT (잔기 196-198) 및 NFT (잔기 318-320)를 보유할 수 있으며, 팔미토일화된 하나 이상의 부위를 보유할 수 있다 (C-396, C416 및 C417) (Strauss 및 Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1994; pp. 499-509가 도입됨). 반면 E2의 여러 영역이 해로운 영향 없이 변경될 수 있다. 예를 들어 E2 내 여러 상이한 위치에서 트랜스포존의 삽입은 여전히 생활성 바이러스를 만들어 낸다 (Navaratmarajah, 상동).
특정 구현예에 있어서, 태그 펩티드를 E3, 6K, 또는 E1 단백질 내로 도입할 수 있다. 일부 목적을 위해 태그를 E2 내로 도입할 수 있지만, 태그를 인간 환자로의 투여를 위한 제품에 사용하는 것은 바람직하지 않다. 짧은 서열 (예로 5-30 개 아미노산) 인 태그 펩티드를 이용하여 바이러스 입자 내 외피의 발현 및 그 존재의 검출을 촉진시킬 수 있다. 검출 목적을 위해, 태그 서열은 전형적으로 항체 또는 화학제에 의해 검출가능할 것이다. 태그의 또 다른 용도는 바이러스 입자의 정제를 촉진하는 것이다. 태그에 대한 결합 파트너를 포함하는 기질을 이용하여 바이러스를 흡착할 수 있다. 결합 파트너로부터 태그를 치환시키는 부분으로의 처리에 의해 바이러스를 용출할 수 있거나, 또는 태그 서열이 절단가능 서열과 연관된 경우에는 적절한 엔도펩티다아제로의 처리가 바이러스를 편리하게 방출시킬 것이다 (예를 들어 Qiagen 카탈로그, 인자 Xa 프로테아제 시스템 참고). 태그 펩티드의 제거는 일반적으로 동물 피험체에서 바이러스 입자 사용의 안전성 목적을 위해 바람직하다. 태그가 제거되지 않은 경우, 태그에 대한 면역 반응이 일어날 수 있다.
적합한 태그에는 다른 것들 중에서도 그 항체가 시판되는 FLAG (DYKDDDDK) (U.S. 특허 번호 4,703,004, 그 전문이 도입됨), 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, 글루타치온-S-트랜스퍼라아제, 폴리(His) (U.S. 특허 번호 4,569,794, 그 전문이 도입됨), 티오레독신, HA (헤마글루티닌)-태그가 비제한적으로 포함된다. 폴리(His)는 결합 금속 이온, 예로 니켈 또는 코발트를 포함하는 친화도 매질 상에 흡착되어 저 pH 매질로 용출될 수 있다.
바이러스 입자를 평가하여 수지상 세포를 표적화하는 바이러스 내로 도입된 외피 당단백질의 특이성을 결정할 수 있다. 예를 들어 혼합된 골수 세포군을 피험체로부터 수득하여 시험관 내에서 배양할 수 있다. 대안적으로, DC-SIGN을 발현하거나 발현하지 않는 동종 세포주를 수득하여 이용할 수 있다. 재조합 바이러스를 혼합된 골수 세포군 또는 동종 세포주군에 투여하고 바이러스 내로 도입된 리포터 유전자의 발현을 배양된 세포에서 분석할 수 있다. 특정 구현예는 혼합된 세포군을 별도 부분으로 나눈 후 별도로 감소하는 양의 바이러스 (예로 각 부분에서 2 배, 5 배, 10 배 미만의 바이러스)와 인큐베이션하는 제한 희석 분석을 채용할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 혼합된 세포군에서 감염된 세포의 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 70%, 80% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%는 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포이다. 특정 구현예에 있어서, 감염된 수지상 세포 대 감염된 비수지상 세포 (또는 DC-SIGN을 발현하지 않는 세포)의 비는 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 200:1, 적어도 약 500:1, 적어도 약 1000:1, 적어도 약 5000:1, 적어도 약 10,000:1, 또는 그 이상이다. 제한 희석에 있어서, 입력 바이러스의 더 높은 희석도에서 (즉 더 낮은 양에서) 전형적으로 더 큰 선택성이 나타난다.
가성형태화된 바이러스 입자의 활성은 임의의 다양한 기법으로 결정할 수 있다. 예를 들어 감염 효율 (IU, 감염 단위)을 측정하는 바람직한 방법은 바이러스 입자를 세포에 투여하고 벡터 게놈에서 인코딩되는 산물의 발현을 측정하는 것이다. 분석할 수 있는 임의 산물을 이용할 수 있다. 하나의 편리한 유형의 산물은 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. GFP 및 분석을 실시예, 예컨대 실시예 3에 예시한다. 이용할 수 있는 다른 산물에는 세포 표면에서 발현된 단백질 (예로 항체 결합에 의한 검출), 효소 등이 포함된다. 산물이 항원이고 세포가 수지상 세포인 경우, 감염성/활성은 면역 반응을 결정하여 평가할 수 있다. 또한, 포유류에서의 부작용을 확인할 수 있다. 수지상 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 또한 예를 들어 후술되는 바와 같은 세포 배양물에서 직접 평가할 수 있다.
또한 바이러스 입자를 제조하고 이들의 선택성 및/또는 표적 세포막의 침투를 촉진하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 미개질 당단백질을 갖는 외피를 갖는 바이러스 입자를 비교를 위한 대조군으로 이용할 수 있다. 외피 당단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포는 표준 감염 분석을 이용하여 바이러스로 감염된다. 명시된 시간 후, 예를 들어 감염 48 시간 후 세포를 수집하여 바이러스로 감염된 세포 백분율을 예를 들어 흐름 세포측정으로 결정할 수 있다. 선택성은 바이러스로 감염된 세포의 백분율을 계산하여 스코어를 결정할 수 있다. 유사하게 바이러스 역가에 대한 변종 외피 당단백질의 효과는 변종 외피를 포함하는 바이러스로 감염된 세포의 백분율을 대응하는 야생형 (미개질) 외피 당단백질을 포함하는 바이러스로 감염된 세포의 백분율로 나누어 정량할 수 있다. 특히 적합한 변종은 선택성과 감염 역가에 대해 최적 조합을 가질 것이다. 일단 변종을 선택하면, 바이러스 농도 분석을 수행하여 이들 바이러스가 활성을 상쇄시키지 않고 농축될 수 있는지를 확인할 수 있다. 바이러스 상청액을 수집하여 초원심분리로 농축한다. 바이러스 역가는 바이러스 원액의 제한 희석에 의해, 외피 당단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포를 감염시키고, 상술한 바와 같이 바이러스에 의해 발현된 산물의 발현을 측정함으로써 결정할 수 있다.
표적 세포 내로의 렌티바이러스 벡터 입자의 도입은 또 다른 활성 평가 유형이다. BlaM-Vpr (베타-락타마아제 Vpr) 융합 단백질을 이용하여 HIV-1 바이러스 침투를 평가할 수 있다; BlaM 및 신드비스 바이러스 외피 당단백질, 예컨대 E1 또는 E2/E1 융합 단백질의 융합을 이용하여 표적 세포 내로의 융합 및 침투를 촉진하는 외피 단백질의 효능을 평가할 수 있다. 바이러스 입자는, 예를 들어 바이러스 요소 BlaM-Vpr 및 관심 변종 외피 (및 적절한 경우 친화도 분자)를 포함하는 하나 이상의 벡터를 이용해 패키징 세포를 일시적 전달감염에 의해 제조할 수 있다. 생성 바이러스를 이용하여 자유 결합 저해제 (예컨대 항체)의 부재 또는 존재 하에 특이적으로 결합하는 표적화 분자 (또는 친화도 분자)를 발현하는 세포를 감염시킬 수 있다. 이어서 세포를 CO2-비의존적 배지로 세척하고 CCF2 염료 (Aurora Bioscience)를 로딩할 수 있다. 실온에서 인큐베이션하여 절단 반응을 종료시킨 후, 세포를 파라포름알데히드로 고정하고 흐름 세포측정 및 현미경으로 분석할 수 있다. 청색 세포의 존재는 세포질 내로의 바이러스 침투를 나타낸다; 차단 항체를 첨가할 경우 청색 세포가 더 적을 것으로 예측된다 (Cavrois 등, Nat Biotechnol 20: 1151-1154, 2002; 그 전문이 통합됨).
침투가 낮은 pH에 의존하는지 여부를 조사하고 원하는 pH 의존성을 갖는 외피 당단백질을 동정하기 위해, pH를 변경하는 NH4cl 또는 다른 화합물을 감염 단계에 첨가할 수 있다 (NH4cl은 엔도좀의 산성 구획을 중화시킬 것이다). NH4cl의 경우, 청색 세포의 소실은 바이러스의 침투가 낮은 pH-의존적이라는 것을 나타낼 것이다. 또한 활성이 pH-의존적이라는 것을 확인하기 위해 라이소좀 자극제, 예컨대 염화암모늄, 클로로퀸, 콘카나마이신, 바필로마이신 A1, 모네신, 니게리신 등을 인큐베이션 완충액에 첨가할 수 있다. 이들 제제는 엔도좀 구획 내 pH를 상승시킨다 (예로 Drose 및 Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). 이들 제제의 저해 효과는 바이러스 융합 및 도입을 위한 pH의 역할을 드러낼 것이다. 상이한 융합생성 분자를 나타내는 바이러스 간의 상이한 도입 역학을 비교하여 특정 용도를 위해 가장 적합한 것을 선택할 수 있다.
PCR-기반 도입 분석을 이용하여 역전사를 모니터링하고 바이러스 도입의 역학 지표로서 바이러스 DNA 합성의 역학을 측정할 수 있다. 예를 들어 특정 외피 단백질 분자를 포함하는 바이러스 입자를 외피 단백질 분자에 대해 적절한 결합 파트너 (수용체)를 자연적으로 발현하거나 발현하도록 조작된 표적 세포, 예컨대 293T 세포, DC, 또는 임의의 다른 세포와 인큐베이션한다. 곧바로 또는 약간의 시간을 둔 후 (감염이 일어날 수 있도록), 미결합 바이러스를 제거하고 세포 분취물을 바이러스 핵산에 대해 분석한다. 이들 분취물에서 DNA를 추출하고 LTR 특이적 프라이머를 이용하여 일반적으로 반정량적 분석인 증폭 분석을 수행한다. LTR 특이적 DNA 산물의 출현은 바이러스 도입이 성공하였음을 나타낸다.
B. 렌티바이러스 벡터 게놈
바이러스 벡터 입자는 관심 서열(들)을 포함하는 게놈을 포함한다. 다른 서열, 예컨대 게놈이 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있도록 하는 서열 및 표적 세포의 형질도입 후 관심 서열(들)의 발현을 촉진하는 서열이 포함될 수 있다. 게놈은 인간 유전자 치료 용도로 동정된 것들, 예컨대 Pfeifer 및 Verma가 기술한 것들 (Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001; 본원에 그 전문이 참조함으로써 통합됨)을 포함하여 다수의 적합한 이용가능 렌티바이러스 게놈 기반 벡터에서 유래될 수 있다. 간단히 하기 위해, 상기 게놈을 또한 "바이러스 벡터 게놈" 또는 "벡터 게놈"으로 부른다.
1. 골격
적합한 렌티바이러스 벡터 게놈에는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1), HIV-2, 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV) 및 매디/비스나 바이러스 기반 벡터 게놈이 포함된다. 렌티바이러스의 바람직한 특징은 이들이 분할 및 비분할 세포 모두를 감염시킬 수 있다는 것이며, 표적 세포가 분할하고 있을 (또는 표적 세포가 분할하도록 자극할) 필요가 없다. 일반적으로 게놈 및 외피 당단백질은 생성 바이러스 벡터 입자가 가성형태화되도록 상이한 바이러스에 기반하게 될 것이다. 벡터 게놈의 안전성 특징이 바람직하게 포함된다. 안전성 특징에는 자가 비활성 LTR 및 비삽입성 게놈이 포함된다. 예시적 벡터는 실시예 5 및 도 5에서 추가 논의되며, 이러한 벡터를 관심 항원의 발현을 위해 본 발명의 구현예에 이용할 수 있다.
일부 예시적 구현예에 있어서, 바이러스 벡터 게놈은 렌티바이러스 게놈, 예컨대 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈 유래 서열을 포함한다. 바이러스 게놈 구축물은 렌티바이러스의 5' 및 3' LTR 서열을 포함할 수 있으며, 특히 렌티바이러스의 5' LTR 유래 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스 유래 비활성화 또는 자가 비활성 3' LTR을 포함할 수 있다. LTR 서열은 임의 종의 임의 렌티바이러스 유래 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어 이들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV 유래 LTR 서열일 수 있다. 전형적으로 LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
벡터 게놈은 비활성화 또는 자가-비활성 3' LTR을 포함할 수 있다 (Zufferey 등, J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi 등, J Virol 72:8150, 1998; 둘 다 그 전문이 포함됨). 자가-비활성 벡터는 일반적으로 벡터 삽입 동안 5' LTR로 복사되는 3'의 긴 말단 반복서열 (LTR)로부터 인핸서 및 프로모터 서열이 결실되어 있다. 한 예에서, 3' LTR의 U3 요소에는 그 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 부위의 결실이 포함된다. 자가-비활성 3' LTR로 인해, 도입 및 역전사 후 생성되는 프로바이러스는 비활성화 5' LTR을 포함할 것이다. 이 논리는 벡터 게놈의 변동으로 인한 위험성 및 근처 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 감소시켜 안전성을 개선하려는 것이다. 자가-비활성 3' LTR은 당 분야에 공지된 임의 방법으로 구축될 수 있다.
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR 유래 U3 서열은 바이러스 구축물 내의 프로모터 서열, 예컨대 이종성 프로모터 서열로 대체할 수 있다. 이는 패키징 세포주에서 회수되는 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열도 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 모든 인핸서/프로모터 조합을 이용할 수 있다. 하나의 예에 있어서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다 (US 5385839 및 US 5168062, 그 각각의 전문이 통합됨).
특정 구현예에 있어서, 렌티바이러스 벡터 게놈을 도입 결핍으로 구축함으로써 삽입 돌연변이화의 위험을 최소화한다. 비삽입성 벡터 게놈을 제조하기 위한 다양한 접근법을 사용할 수 있다. 이러한 접근법에는 비활성 인테그라아제를 갖는 단백질을 인코딩하도록 하는 pol 유전자의 인테그라아제 효소 성분 내 돌연변이(들)의 조작이 포함된다. 벡터 게놈 자체를 개질하여, 예를 들어 하나 또는 두 부착 부위를 모두 변이 또는 결실시키거나, 3' LTR-근방 폴리퓨린 트랙 (PPT)을 결실 또는 개질을 통해 비기능적으로 만들어서 삽입을 예방할 수 있다. 또한 비유전자적 접근법도 이용 가능하다; 여기에는 인테그라아제의 하나 이상의 기능을 저해하는 약리학적 제제가 포함된다. 이 접근법들은 상호 배타적인 것이 아니다, 즉 이들 중 둘 이상을 동시에 사용할 수 있다. 예를 들어 인테그라아제 및 부착 부위 모두가 비기능적일 수 있으며, 또는 인테그라아제 및 PPT 부위가 비기능적일 수 있고, 또는 부착 부위 및 PPT 부위가 비기능적일 수 있고, 또는 이들 모두가 비기능적일 수 있다.
상기 언급된 바와 같이 하나의 접근법은 비기능적 인테그라아제를 제조하고 이용하는 것이다. 인테그라아제는 바이러스의 이중쇄 블런트 말단 DNA를 절단하고 그 말단을 염색체 표적 부위의 2 가닥 5'-포스페이트에 결합시키는데 관여한다. 인테그라아제는 3 개의 기능적 도메인을 갖는다: 아연-결합 모티브 (HHCC)를 포함하는 N-말단 도메인, 촉매 코어 및 보존된 DD35E 모티브 (HIV-1 에서는 D64, D116, E152)를 포함하는 중심 도메인 코어, 및 DNA 결합 특성을 갖는 C-말단 도메인. 인테그라아제 내로 도입된 점 돌연변이는 정상적인 다른 기능을 손상시키기에 충분하다. 여러 인테그라아제 돌연변이가 구축 및 분석되어 있다 (Philpott 및 Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, University College London에 제출한 논문, April 2009, pp, 82-97; Engelman 등, J Virol 69: 2729, 1995; Nightingale 등, Mol Therapy, 13: 1121, 2006 참고; 전체 전문이 도입됨). 인테그라아제 단백질을 인코딩하는 서열을 결실 또는 변이시켜 바람직하게는 역전사효소 활성 또는 핵 표적화를 크게 손상시키지 않으면서 단백질을 비활성화하여 표적 세포 게놈 내로의 프로바이러스 도입만을 예방할 수 있다. 허용가능한 돌연변이는 인테그라아제 촉매작용, 가닥 전달, att 부위로의 결합, 숙주 염색체 DNA로의 결합 등을 감소시킬 수 있다. 예를 들어 HIV 또는 SIV 인테그라아제의 잔기 35에서 아스파르트산의 아스파라긴으로의 단일 치환으로 바이러스 DNA 도입이 완전히 소멸된다. 인테그라아제의 결실은 일반적으로 C-말단 도메인에 한정될 것이다. 잔기 235~288의 코딩 서열 결실은 유용한 비기능적 인테그라아제를 만들어 낸다 (Engelman 등, J Virol 69:2729, 1995). 추가 예로서, 예를 들어 Asp64 (잔기 번호는 HIV-1에 대해 나타내며, 다른 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유래의 인테그라아제에 대한 대응 잔기 번호는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다) (예로 D64E, D64V), Asp116 (예로 D116N), Asn120 (예로 N120K), Glu152, Gln148 (예로 Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (예로 W235E), Lys264 (예로 K264R), Lys266 (예로 K266R), Lys273 (예로 K273R)과 같은 돌연변이를 생성할 수 있다. 도입, 유전자삽입 발현, 및 임의의 다른 바람직한 매개변수에 대해 다른 돌연변이를 구축 및 평가할 수 있다. 이러한 기능에 대한 분석도 널리 공지되어 있다. 돌연변이는 부위 지정 돌연변이화 및 핵산 서열의 화학적 합성을 포함하는 다양한 임의 기법으로 생성할 수 있다. 하나의 돌연변이를 제조할 수도 있고, 이들 돌연변이 중 둘 이상이 인테그라아제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 인테그라아제는 2 개 아미노산, 3 개 아미노산, 4 개 아미노산 등에 돌연변이를 가질 수 있다.
대안적으로 또는 인테그라아제 돌연변이(들)의 사용과 함께, U3 및 U5의 부착 부위 (att)를 또한 돌연변이화할 수 있다. 인테그라아제는 이들 부위에 결합하며, 3'-말단 디뉴클레오티드는 벡터 게놈의 양단에서 절단된다. CA 디뉴클레오티드는 오목해진 3' 말단에 위치한다; CA는 조작을 위해 필요하며, 상기 뉴클레오티드의 돌연변이는 숙주 염색체 내로의 도입을 차단한다. CA 디뉴클레오티드의 A가 도입을 위해 가장 중요한 뉴클레오티드이며, 게놈 양단에서의 돌연변이가 가장 좋은 결과를 낼 것이다 (Brown et al J Virol 73:9011 (1999)). 하나의 예시에 있어서, 각 말단의 CA를 TG로 변경한다. 다른 예에 있어서, 각 말단의 CA를 한 말단은 TG 로, 다른 말단은 GT로 변경한다. 다른 예에 있어서, 각 말단의 CA는 결실된다; 다른 예에 있어서, CA의 A는 각 말단에서 결실된다.
또한 3' LTR 근방에 위치한 폴리퓨린 트랙 (PPT)의 돌연변이 또는 결실에 의해서도 도입이 저해될 수 있다 (WO 2009/076524; 그 전문이 도입됨). PPT는 + 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위로 작용할 수 있는 약 15 개 뉴클레오티드의 폴리퓨린 서열이다. 이 경우, PPT의 돌연변이 또는 결실은 역전사 절차를 표적으로 한다. 기전에 구애되지 않고 PPT를 돌연변이 또는 결실시킴으로써, 선형 DNA의 제조가 급격히 감소되고 본질적으로 1-LTR DNA 원형구조체만 제조된다. 도입에는 선형 이중쇄 DNA 벡터 게놈이 필요하며, 이것 없이는 도입이 본질적으로 배제된다. 상기 언급된 바와 같이, PPT를 돌연변이에 의해 또는 결실에 의해 비기능적으로 만들 수 있다. 전형적으로 전체 약 15 개 nt의 PPT가 결실되지만, 일부 구현예에 있어서 14 개 nt, 13 개 nt, 12 개 nt, 11 개 nt, 10 개 nt, 9 개 nt, 8 개 nt, 7 개 nt, 6 개 nt, 5 개 nt, 4 개 nt, 3 개 nt 및 2 개 nt의 더 짧은 결실을 일으킬 수 있다. 돌연변이를 일으킨 경우, 전형적으로 다중 돌연변이를, 특히 PPT의 5' 절반부분에 일으킬 수 있지만 (McWilliams 등, J Virol 77:11150, 2003), 첫번째 4 개 염기에서의 단일 및 이중 돌연변이도 여전히 전사를 감소시킨다. PPT의 3' 말단에 만들어 낸 돌연변이는 일반적으로 더 현저한 효과를 갖는다 (Powell 및 Levin J Virol 70:5288, 1996).
벡터 게놈을 비삽입성으로 만들기 위한 이러한 상이한 접근법을 개별적으로 또는 조합으로 이용할 수 있다. 둘 이상의 접근법을 이용하여 반복 기전을 통해 실패없이 안전한 벡터를 구축할 수 있다. 따라서 PPT 돌연변이 또는 결실을 att 부위 돌연변이 또는 결실과 조합하거나 인테그라아제 돌연변이와 조합할 수 있고, 또는 PPT 돌연변이 또는 결실을 att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라아제 돌연변이 모두와 조합할 수 있다. 유사하게 att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라아제 돌연변이를 각각 또는 PPT 돌연변이 또는 결실과 조합할 수 있다.
2. 조절 요소
본원에서 논의되는 바이러스 벡터 게놈은 표적 세포에서의 발현이 바람직한 관심 서열을 포함한다. 전형적으로, 관심 서열은 5' LTR 내지 3' LTR 서열에 위치한다. 또한 관심 서열은 다른 유전적 요소, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 전사 조절 요소와의 기능적 상호관계에 있어서 바람직하여 특정 방식으로 관심 서열의 발현을 조절한다. 특정 예에 있어서, 유용한 전사 조절 서열은 시간적으로 및 공간적으로 모두 활성에 대해 고도로 조절되는 것들이다. 성분의 발현을 조절하는데 이용할 수 있는 발현 조절 요소는 당해분야에 공지되어 있으며, 비제한적으로 유도가능한 프로모터, 항상적 프로모터, 분비 신호, 인핸서 및 기타 조절 요소가 포함된다.
관심 서열 및 임의의 다른 발현가능한 서열은 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과 기능적 상관관계에 있는 것이 전형적이다. "내부" 프로모터/인핸서는 바이러스 벡터 구축물의 5' LTR 내지 3' LTR 서열 사이에 위치하며 관심 서열에 작동가능하게 연관된 것이다. 내부 프로모터/인핸서는 기능적으로 서로 상관관계를 갖는 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 임의의 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다. "기능적 상관관계" 및 "작동가능하게 연관된" 이란 비제한적으로 해당 서열이 프로모터 및/또는 인핸서에 대해 정확한 위치 및 배향으로 있어서 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉하는 경우 관심 서열이 발현될 것임을 의미한다.
내부 프로모터/인핸서의 선택은 관심 서열의 원하는 발현 패턴 및 공지된 프로모터/인핸서의 특이적 특성에 근거한다. 따라서 내부 프로모터는 항상적으로 활성인 것일 수 있다. 사용할 수 있는 항상적 프로모터의 비제한적 예에는 유비퀴틴 (US 5510474; WO 98/32869, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨), CMV (Thomsen 등, PNAS 81:659, 1984; US 5168062, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨), 베타-액틴 (Gunning 등, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨) 및 pgk (예를 들어 전문이 본원에 참조함으로써 통합되는 Adra 등, 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam 등, 1984 Gene 32:409-417; 및 Dobson 등, 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637 참고)에 대한 프로모터가 포함된다.
대안적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에 있어서, 프로모터는 표적 세포 특이적 프로모터이다. 예를 들어 프로모터는 CD11c, CD103, TLR, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, 만노오스 수용체, 덱틴-1, Clec9A, MHC 클래스 II를 포함하여 수지상 세포가 발현하는 임의 산물에서 유래될 수 있다. 또한, 프로모터는 관심 서열의 유도가능한 발현을 일으키도록 선택될 수 있다. 테트라사이클린 반응성 시스템, lac 작동인자-억제인자 시스템을 포함하는 유도가능한 발현을 위한 여러 시스템 뿐만 아니라, 열 충격, 금속 이온을 포함하는 다양한 환경 또는 생리적 변경에 반응하는 프로모터, 예컨대 메탈로티오나인 프로모터, 인터페론, 저산소증, 스테로이드, 예컨대 프로게스테론 또는 글루코코르티코이드 수용체 프로모터, 방사선, 예컨대 VEGF 프로모터가 당해분야에 공지되어 있다. 또한 프로모터 조합을 이용하여 관심 유전자의 원하는 발현을 얻을 수 있다. 당업자는 관심 개체 또는 표적 세포에서 유전자의 원하는 발현 패턴에 근거하여 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.
바이러스 게놈은 적어도 하나의 RNA 폴리머라아제 II 또는 III 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 이 프로모터는 관심 서열에 작동가능하게 연관될 수 있으며 또한 종료 서열에 연관될 수 있다. 또한 둘 이상의 RNA 폴리머라아제 II 또는 III 프로모터가 포함될 수 있다. RNA 폴리머라아제 II 및 III 프로모터는 당해분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 적합한 범위의 RNA 폴리머라아제 III 프로모터는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합된 [Paule 및 White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)]에서 찾아볼 수 있다. RNA 폴리머라아제 II 또는 III 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 II 또는 III을 하류의 RNA 코딩 서열을 전사하도록 지시할 수 있는 임의의 합성 또는 조작된 DNA 절편을 포함한다. 또한 RNA 폴리머라아제 II 또는 III (Pol II 또는 III) 프로모터 또는 바이러스 벡터 게놈의 일부로 사용되는 프로모터를 유도할 수 있다. 임의의 적합한 유도가능 Pol II 또는 III 프로모터를 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있다. 구체적으로 적합한 Pol II 또는 III 프로모터에는 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합된 [Ohkawa 및 Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000)] 및 [Meissner 등, Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)]에 제공된 테트라사이클린 반응성 프로모터가 포함된다.
내부 인핸서가 또한 바이러스 구축물에 존재하여 관심 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, CMV 인핸서 (Boshart 등, Cell, 41:521, 1985; 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨)를 이용할 수 있다. 바이러스 게놈, 예컨대 HIV, CMV, 및 포유류 게놈에서 여러 인핸서가 동정 및 특징분석되었다 (GenBank 참고). 인핸서는 이종성 프로모터와 함께 이용할 수 있다. 당업자는 원하는 발현 패턴에 근거하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있을 것이다.
바이러스 벡터 게놈은 보통 표적 세포에 의해 인지되고 관심 서열, 바이러스 성분, 및 본원에서 논의된 기타 서열에 작동가능하게 연관된 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제의 결합을 허용하고 전사가 일어나도록 하는 핵산 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 프로모터는 유도가능하거나, 항상 활성이거나, 일시적으로 활성이거나 또는 조직 특이적일 수 있다. 유도가능 프로모터의 활성은 생물 또는 비생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유도가능 프로모터는 이들이 작동가능하게 연관된 유전자의 발현을 개체의 특정 발달 단계, 그 제조 또는 특정 조직에서 켜거나 끌 수 있기 때문에 유전자 조작에서 유용한 도구가 될 수 있다. 유도가능 프로모터는 화학적으로 조절되는 프로모터 및 물리적으로 조절되는 프로모터로 그룹화시킬 수 있다. 전형적인 화학적으로 조절되는 프로모터에는 비제한적으로 알코올 조절 프로모터 (예로 알코올 탈수소효소 I (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절 프로모터 (예로 테트라사이클린-반응성 프로모터), 스테로이드 조절 프로모터 (예로 rat 글루코코르티코이드 수용체 (GR)-기반 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체 (ER)-기반 프로모터, 나방 탈피호르몬 수용체-기반 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/타이로이드 수용체 수퍼패밀리 기반 프로모터), 금속 조절 프로모터 (예로 메탈로티오나인 유전자-기반 프로모터), 및 발병기전 관련 프로모터 (예로 애기장대 및 옥수수 병원체 관련 (PR) 단백질-기반 프로모터)가 포함된다. 전형적인 물리적으로 조절되는 프로모터에는 비제한적으로 온도 조절 프로모터 (예로 열 충격 프로모터), 및 빛 조절 프로모터 (예로 대두 SSU 프로모터)가 포함된다. 다른 예시적 프로모터는 다른 곳들, 예를 들어 ["Promoters used to regulate gene expression" on Patent Lens 웹사이트, 2009. 05. 18. (본원에 그 전문이 참조함으로써 통합됨)]에 기재되어 있다.
당해분야의 숙련자는 특정 상황에 근거하여 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 여러 상이한 프로모터가 발현될 유전자에 프로모터를 작동가능하게 연관시키는 방법과 마찬가지로 당해분야에 널리 공지되어 있다. 천연 프로모터 서열 및 여러 이종성 프로모터 둘 다를 이용하여 패키징 세포 및 표적 세포에서 발현을 일으킬 수 있다. 그러나 이종성 프로모터는 일반적으로 천연 프로모터에 비해 원하는 단백질을 더 크게 전사시키고 더 높은 수율을 제공하므로 바람직하다.
프로모터는, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 새 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B 형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득할 수 있다. 프로모터는 또한, 이러한 프로모터가 표적 세포와 상용성인 한, 예를 들어 이종성 포유류 프로모터, 예로 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열 충격 프로모터, 또는 천연 서열과 일반적으로 연관된 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 프로모터는 바이러스 발현 시스템의 천연 생성 바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에 있어서, 프로모터는 수지상 세포 특이적 프로모터이다. 수지상 세포 특이적 프로모터는, 예를 들어 CD11c 프로모터일 수 있다.
전사는 인핸서 서열을 벡터(들) 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그 전사를 증가시키는, 보통 약 10 내지 300 bp 길이의 전형적인 DNA의 cis-작용 요소이다. 현재 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 알파-태아성단백질, 및 인슐린)로부터 및 진핵세포 바이러스로부터 여러 인핸서 서열이 공지되어 있다. 예에는 복제 기원의 뒤쪽 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 발현 프로모터 인핸서, 복제 기원의 뒤쪽 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 항원 특이적 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 잘려 들어갈 수 있지만, 바람직하게는 프로모터의 5' 부위에 위치한다.
발현 벡터는 또한 전사를 종료시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 종종 5' 에서, 그리고 때때로 진핵 또는 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 3' 미번역 영역에서 발견되며 당해분야에 널리 공지되어 있다.
바이러스 벡터 게놈은 또한 추가적인 유전 요소를 포함할 수 있다. 구축물 내에 포함될 수 있는 요소의 유형은 어떠한 방식으로든 제한되지 않고 특정 결과를 성취하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 내에서 바이러스 게놈의 핵 내 도입을 촉진하는 신호가 포함될 수 있다. 그러한 신호의 예에는 HIV-1 플랩 신호가 있다. 또한 표적 세포에서 프로바이러스 도입 부위의 특징분석을 촉진하는 요소가 포함될 수 있다. 예를 들어, tRNA 앰버 억제인자 서열이 구축물 내에 포함될 수 있다. 예로 닭의 β-글로빈 유래의 격리인자 서열이 또한 바이러스 게놈 구축물 내에 포함될 수 있다. 이러한 요소는 메틸화 및 이종 염색사응축 효과로 인해 표적 세포 내에서 삽입된 프로바이러스의 침묵화 확률을 감소시킨다. 또한, 격리인자는 염색체 상 도입 부위에서 내부 인핸서, 프로모터 및 외인성 유전자를 주변 DNA로부터의 양성 또는 음성 위치적 효과로부터 차단할 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 관심 유전자의 발현을 증강시키도록 고안된 하나 이상의 유전 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마못 간염 바이러스 반응성 요소 (WRE)를 구축물 내에 위치시킬 수 있다 (Zufferey 등, 1999. J. Virol. 74:3668-3681 ; Deglon 등, 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨).
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 제조 세포주 내로 전달감염될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 플라스미드는 일반적으로 박테리아 내에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 이러한 플라스미드는 당해분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 원핵세포의 복제 기원을 포함하는 벡터는 또한 그 발현으로 검출가능하거나 선별가능한 마커, 예컨대 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 산물은 앰피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것들이다.
본원에 기재된 하나 이상의 성분을 포함하는 플라스미드는 당해분야에 널리 공지된 표준 기법을 이용하여 쉽게 구축된다. 구축된 플라스미드 내의 서열이 정확한지를 확인하기 위해, 플라스미드를 대장균에서 복제시키고 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 소화로 분석하거나 그 DNA 서열을 통상적 방법으로 결정할 수 있다.
포유류 세포에서 일시적 발현을 위해 구축한 벡터를 또한 사용할 수 있다. 일시적 발현에는 숙주 세포가 발현 벡터의 여러 복사본을 축적하고, 이는 다시 발현 벡터 내에서 항원 특이적 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 고수준의 폴리펩티드를 합성하도록 숙주 세포 내에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용이 관여된다. [Sambrook 등, 상동, pp. 16.17-16.22]을 참고하라. 폴리펩티드의 발현에 적용하기 적합한 다른 벡터 및 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있으며 특이적 상황에 쉽게 적용된다.
본원에 제공되는 기법을 이용하여, 당해분야의 숙련자는 패키징 세포를 리포터 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 전달감염하고 적합한 기법을 이용하여 발현을 측정, 예를 들어 녹색 형광 단백질 접합물로부터의 형광을 측정함으로써 특정 발현 시스템의 효능을 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 적합한 리포터 유전자는 당해분야에 널리 공지되어 있다.
3. 관심 서열의 유형
관심 서열은 어떠한 방식으로든 제한되지 않으며 당업자가 표적 세포 내에 삽입하고 전사하고 발현하고자 의도하는 임의 핵산을 포함한다. 산물은 단백질 또는 핵산일 수 있다. 관심 서열은 siRNA, 마이크로 RNA, 자가-상보적 이중쇄 RNA (여기서 상보적 영역은 약 20 개의 리보뉴클레오티드보다 길다), 또는 메시지 RNA에 상보적인 RNA (여기서 상기 상보적 (안티-센스) RNA의 메시지 RNA로의 결합은 이것이 단백질로 번역되는 능력을 차단한다)를 포함하는 단백질 또는 핵산 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 관심 서열은 면역 반응을 일으키려는 항원을 인코딩할 수 있다. 특히 제제, 예컨대 HIV, HSV, HCV, HPV, 말라리아, 또는 결핵의 감염성 질환 항원 및 종양 항원이 바람직하다.
특정 경우에 있어서, 관심 서열은 분자의 발현을 하향 조절하는 작은 저해성 RNA (siRNA) 또는 관심 마이크로 RNA (miRNA)를 인코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들어 siRNA 또는 마이크로 RNA를 인코딩하는 유전자를 이용하여 수지상 세포의 활성화 또는 성숙을 저해하는 것들을 포함하는 세포 내의 음성적 조절인자의 발현을 하향조절할 수 있다. siRNA 및 마이크로 RNA는 당해분야에 널리 공지되어 있다 (Fire 등, Nature 391:806, 1998; 또한 "The RNA Interference Resource", Applied Biosystems, Trang 등, Oncogene Suppl 2:S52, 2008; Taganov, K. 등, 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, J. E. 및 E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25; Tiemann 및 Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009 참고). 대안적으로, 관심 서열은 상보적 영역이 약 20 개 리보뉴클레오티드 길이를 초과하는 자가 상보성 이중쇄 RNA 또는 약 20 개 리보뉴클레오티드 길이를 초과하는 안티-센스 RNA를 인코딩할 수 있다. 당업자는 siRNA, miRNA, dsRNA 및 안티센스 RNA 분자가 RNA 폴리머라아제 III 프로모터로부터 발현될 수 있거나, 대안적으로 RNA 폴리머라아제 II 프로모터로부터 전사되는 비코딩 RNA 성분일 수 있다는 것을 인지할 것이다.
또한, 관심 서열은 둘 이상의 산물을 인코딩할 수 있다. 일부 구성에 있어서, 전달될 서열은 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 siRNA, 적어도 하나의 마이크로 RNA, 적어도 하나의 dsRNA 또는 적어도 하나의 안티센스 RNA 분자 또는 이들의 임의 조합을 인코딩하는 여러 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어 전달될 서열은 면역 반응을 일으키려는 하나 이상의 항원을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 항원은 단일 질환 또는 장애와 연관되거나, 또는 여러 질환 및/또는 장애와 연관될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 면역 조절 단백질을 인코딩하는 유전자는 면역 반응을 일으키려는 항원을 인코딩하는 유전자와 함께 포함할 수 있고, 그 조합으로 면역 반응을 원하는 방향 및 크기로 일으키고 조절할 수 있다. 다른 예에 있어서, siRNA, 마이크로 RNA, dsRNA 또는 안티센스 RNA 분자를 인코딩하는 서열은 면역 반응을 일으키려는 항원을 인코딩하는 유전자로 구축할 수 있고, 그 조합으로 면역 반응의 범위를 조절할 수 있다. 산물은 인코딩 서열이 하나의 프로모터와 기능적 상관관계에 있는 초기 융합 산물로 제조될 수 있다. 대안적으로 산물들이 각자 프로모터와 기능적 상관관계에 있는 서열을 별개로 인코딩할 수 있다. 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 구성에 있어서, 벡터는 수지상 세포 성숙/자극 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예시적인 자극 분자에는 GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1 BB, CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도가능 CD40 (iCD40) 등이 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 수지상 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 요소의 조절 하에 있다. 수지상 세포의 성숙은 성공적인 예방접종에 기여한다 (Banchereau, J 및 Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler, G. 등, Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor, C. G. 등, Nat. Med. 10:475-480 (2004)). 성숙에 의해 DC는 항원 포착에 능동적으로 관여하는 세포에서 T 세포 프라이밍에 대해 특화된 세포로 전환될 수 있다. 예를 들어, CD4-헬퍼 T 세포 상에서 CD40L에 의한 CD40의 참여는 CD8 T 세포의 강력한 활성화를 일으키는 DC 성숙을 위해 결정적인 신호이다. 이러한 자극 분자는 또한 성숙 인자 또는 성숙 자극 인자로 불린다. 면역 체크포인트가 암에서 기능성 세포 면역성의 활성화에 대한 상당한 장벽을 제공하며, CTLA4 및 프로그램화된 사멸-1 (PD-1)을 포함하는 T 세포 상의 저해 리간드에 특이적인 길항적 항체가 임상에서 평가되고 있는 표적화 제제의 예이다. 만성 감염 및 암에서의 상당한 관용 기전은 고수준의 PD-1을 발현하는 Ag 특이적 T 세포의 기능적 소멸에 있다. 치료적 면역화의 강도가 면역 체크포인트 조절과 함께 상당히 증강되는 것으로 나타났으므로, 비제한적 예로서 당업자는 면역 체크포인트를 저해하는 대안적 접근법이 프로그램화된 사열 (PD) 리간드 1 및 2 (PD-L1/L2)의 발현을 저해할 것을 이해할 수 있다. 저해를 달성하는 하나의 방법은 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 DC에서 PD-L1/L2의 발현을 억제하는 본원에 기재된 바와 같은 RNA 분자의 발현에 의하는 것이다. DC의 성숙 또는 특정 요소, 예컨대 면역 체크포인트, 예를 들어 PD-1 리간드의 발현은 표면 마커, 예컨대 MHC II의 상향 조절 및 발현된 케모카인과 시토카인의 프로필을 흐름 세포측정 분석에 의해 특징분석할 수 있다.
검출가능한 산물, 보통 단백질을 인코딩하는 서열을 포함시켜 원하는 산물을 발현하고 있는 세포를 동정할 수 있다. 예를 들어, 형광 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)을 관심 서열 (예로 항원을 인코딩하는 서열)과 함께 구축물 내로 도입한다. 다른 경우에 있어서, 단백질은 항체로 검출가능하거나, 단백질은 기질에 작용하여 검출가능한 산물 또는 전달감염되거나 형질도입된 표적 세포의 선별을 허용하는, 예를 들어 히그로마이신 내성과 같은 약물 내성을 부여하는 산물을 제공하는 효소일 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 진핵 세포에 사용하기 적합한 항생제 또는 다른 독소, 예로 당해분야에 공지된 것들 중에서 네오마이신, 메토트렉세이트, 블라스티시딘에 대한 내성, 또는 보체 영양결핍을 부여하거나, 또는 배지에서 빠져 있는 결정적 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 선별 마커는 선택적으로 개별 플라스미드 상에 존재하거나 공-전달감염에 의해 도입될 수 있다.
패키징 세포 내에서 원하는 바이러스의 생산에 필요한 둘 이상의 요소 (예로 관심 서열(들), 외피 분자, DC 성숙 인자)를 포함하는 하나 이상의 다중 시스트론을 가진 발현 단위를 이용할 수 있다. 다중 시스트론을 가진 벡터를 사용하면 필요한 핵산 분자의 전체 수가 감소되어 여러 벡터 게놈으로부터의 발현을 조정하는데 연관될 수 있는 어려움이 회피된다. 다중 시스트론을 가진 벡터에 있어서, 발현될 다양한 요소는 하나 이상의 프로모터 (및 필요한 경우 다른 발현 조절 요소)에 작동가능하게 연관된다. 일부 구성에 있어서, 다중 시스트론을 가진 벡터는 관심 서열, 리포터 산물을 인코딩하는 서열, 및 바이러스 요소를 포함한다. 관심 서열은 전형적으로 항원 및 선택적으로 DC 성숙 인자를 인코딩한다. 때때로 다중 시스트론을 가진 벡터는 항원을 인코딩하는 유전자, DC 성숙 인자를 인코딩하는 유전자 및 바이러스 요소를 포함한다.
다중 시스트론을 가진 발현 벡터 내에서 발현될 각 성분은, 예를 들어 내부 리보솜 도입 부위 (IRES) 요소 또는 바이러스 2A 요소에 의해 분리되어, 동일한 프로모터로부터 다양한 단백질을 개별 발현시킬 수 있다. IRES 요소 및 2A 요소는 당해분야에 공지되어 있다 (U.S. 특허 번호 4,937,190; de Felipe 등, 2004. Traffic 5: 616-626, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨). 하나의 구현예에 있어서, 족구병 바이러스 (FMDV), 말 A 형 비염 바이러스 (ERAV), 및 토시 아시그나 (thosea asigna) 바이러스 (TaV) (Szymczak 등, 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨)에서 유래하는 2A-유사 서열에 연관된 퓨린 절단 부위 서열 (RAKR)을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드 (Fang 등, 2005. Nat. Biotech 23: 584-590, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨)를 사용하여 다중 시스트론을 가진 벡터 내에서 유전 요소를 분리한다. 특정 다중 시스트론을 가진 벡터의 효능은 표준 프로토콜을 이용하여 각 유전자의 발현을 검출함으로써 쉽게 평가할 수 있다.
특이적 예에 있어서, 바이러스 벡터 게놈은 하기를 포함한다: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터 서열; HIV 5' LTR 유래의 R 및 U5 서열; 패키징 서열 (Ψ); HIV-1 플랩 신호; 내부 인핸서; 내부 프로모터; 관심 유전자; 마못 간염 바이러스 반응성 요소; tRNA 앰버 억제인자 서열; 그 인핸서 서열이 결실된 U3 요소; 닭 β-글로빈 격리인자; 및 3' HIV LTR 유래의 R 및 U5 서열. 일부 예에 있어서, 벡터 게놈은 온전한 렌티바이러스의 5' LTR 및 자가-비활성 3' LTR을 포함한다 (Iwakuma 등, Virology 15:120, 1999, 그 전문이 참조함으로써 통합됨).
벡터 게놈의 구축은 비제한적으로 제한 엔도뉴클레아제 소화, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 서열분석의 표준 기법, 예를 들어 [Sambrook 등, (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.), Coffin 등, (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1997)) 및 "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000), 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨]에 기재된 바와 같은 것들을 포함하는 당해분야에 공지된 임의의 적합한 유전자 조작 기법을 이용하여 달성할 수 있다.
4. 바이러스 입자의 생산
당해분야에 이미 공지된 임의의 다양한 방법을 이용하여 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 복사본을 포함하는 감염성 렌티바이러스 입자를 제조할 수 있다. 하나의 방법에 있어서, 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사되어 바이러스 입자로 바이러스 게놈 RNA를 패키징하는데 필요한 모든 성분을 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 패키징 세포주 내로 도입한다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 관심 서열에 부가하여 바이러스 성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나 표적 세포 내에서 게놈의 복제를 예방하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자를 보통 제거하고, 패키징 세포주 내에 별도로 제공하게 될 것이다.
일반적으로, 렌티바이러스 벡터 입자는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 포함하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 전달감염된 세포주에 의해 제조된다. 이러한 렌티바이러스 벡터 입자는 전형적으로 복제 적격이 아니다, 즉 이들은 1 회 감염만이 가능하다. 가장 종종, 여러 플라스미드 벡터를 이용하여 렌티바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리함으로써 주로 다른 복제 적격 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건 발생 확률을 감소시킨다. 그러나 원하는 경우에는 모든 렌티바이러스 성분을 갖는 하나의 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 여러 플라스미드 벡터를 채용하는 하나의 예로서, 세포주는 종종 이종성 프로모터에 작동가능하게 연관되는 LTR, 시스 작용 패키징 서열, 및 관심 서열(들)을 포함하는 바이러스 벡터 게놈 (즉 벡터 게놈 플라스미드)을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드, 바이러스 효소 및 구조 성분을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 (즉 성분, 예컨대 Gag 및 Pol을 인코딩하는 패키징 플라스미드), 및 아르보바이러스 외피 당단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 외피 플라스미드로 전달감염된다. 추가적 플라스미드, 예로 Rev-발현 플라스미드를 이용하여 본원에 기재된 바와 같고 당해분야에 공지된 레트로바이러스 입자 생산을 증강시킬 수 있다. 바이러스 입자는 세포막을 뚫고 나오며 관심 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 코어, 및 수지상 세포를 표적화하는 아르보바이러스 외피 당단백질을 포함한다. 아르보바이러스 당단백질이 신드비스 바이러스 E2 당단백질인 경우, 당단백질을 조작하여 참조 균주 HR에 비해 헤파란 설페이트에 대한 결합이 감소된다.
본 발명의 플라스미드 벡터로 패키징 세포를 전달감염하는 것은 널리 공지된 방법으로 달성할 수 있으며, 사용될 방법은 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 예를 들어 전기천공, 리포좀을 포함하는 지질-기반 전달 시스템, "네이키드" DNA의 전달 및 폴리시클로덱스트린 화합물을 이용하는 전달, 예컨대 [Schatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨)]에 기재된 것들을 포함하는 여러 비바이러스 전달 시스템이 당해분야에 공지되어 있다. 양이온성 지질 또는 염 치료 방법이 전형적으로 채용되며, 예를 들어 [Graham 등, (1973. Virol. 52:456; Wigler 등, (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76), 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨]을 참고하라. 인산칼슘 침전 방법이 가장 자주 사용된다. 그러나 핵 내 미세주입 및 박테리아 원형질체 융합을 포함하는 세포 내로 벡터를 도입하는 다른 방법을 또한 사용할 수 있다.
패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자 내로 패키징 위해 트랜스로 필요한 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현할 수 있고 기능적 렌티바이러스 벡터 입자를 제조할 수 있는 임의 세포주일 수 있다. 일부 적합한 패키징 세포주에는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포가 포함된다. 패키징 세포주는 필요한 바이러스 단백질을 안정적으로 발현할 수 있다. 이러한 패키징 세포주는, 예를 들어 [U.S. 특허 번호 6,218,181, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨]에 기재되어 있다. 대안적으로 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈과 함께 필요한 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 일시적으로 전달감염될 수 있다. 생성 바이러스 입자를 수집 및 이용하여 표적 세포를 감염시킨다. 외피 당단백질(들)을 인코딩하는 유전자(들)는 보통 발현 벡터, 예컨대 pcDNA3 (Invitrogen, CA USA) 내로 클로닝된다. 진핵 세포 발현 벡터는 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 여러 공급원에서 이용 가능하다. 이어서 패키징 세포, 예컨대 293T 세포를 관심 서열을 인코딩하는 (전형적으로 항원을 인코딩하는) 바이러스 벡터 게놈, 바이러스 패키징 성분을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 및 표적화 분자의 발현을 위한 벡터와 함께 전달감염시킨다. 외피는 패키징 세포의 막 상에 발현되며 바이러스 벡터 내로 도입된다.
하나의 시나리오에 있어서, 하나 이상의 벡터를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 신드비스 바이러스 외피 당단백질, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 E2로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자의 제조를 위한 패키징 세포주 내로 도입한다. 벡터는 신드비스 바이러스 외피, 관심 서열(들) (전형적으로 항원을 인코딩하는 서열) 및 패키징 세포가 제공하지 않는 바이러스의 생산에 필요한 임의 성분을 포함하는 다양한 바이러스 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 시나리오에 있어서, 패키징 세포는 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터 게놈 및 하나 이상의 추가적 벡터와 함께 전달감염된다. 예를 들어, 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터에 부가하여, 제 2 벡터는 바람직하게는 개질 (또한 변종으로도 불림) 신드비스 바이러스 외피를 인코딩하는 유전자를 수반한다. 일부 경우에 있어서, 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터 게놈에는 또한 케모카인, 시토카인, DC 성숙 인자, 또는 면역 체크포인트 기전을 조절하는 인자의 비제한적 예를 포함하는 선택된 면역 조절 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된다. 다른 경우에 있어서, 선택된 면역 조절 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터 및 하나 이상의 추가적 벡터로 패키징 세포 내에 전달 감염되는 제 3 벡터 내에 포함된다.
바이러스의 생산은 본원에 기재된 바와 같이 측정되며, 부피 당 IU로 표현된다. IU는 감염 단위, 또는 대안적으로 형질도입 단위 (TU)이다; IU 및 TU는 바이러스 벡터 입자 제조물의 역가에 대한 정량적 측정치로 상호변경적으로 사용할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 게놈이 쉽게 측정가능한 산물을 발현할 수 있는 바이러스가 생산된다. 형광 단백질인 녹색 형광 단백질이 바람직하다. 렌티바이러스 벡터는 전형적으로 비삽입성이다. 이어서 바이러스를 표적 세포에 투여하고, GFP를 발현하는 표적 세포를, 예컨대 흐름 세포측정에 의해 결정한다 (실시예 3 참고). 이어서 역가를 계산한다. 역가는 가능한 한 높은 것이 바람직하지만, 세포 상청액은 적어도 1 x 105 IU/mL, 적어도 3 x 105 IU/mL, 적어도 1 x 106 IU/mL, 적어도 3 x 106 IU/mL, 또는 적어도 1 x 107 IU/mL이다 (임의 농도 대비). 대안적으로 역가는 VSV-G 외피를 갖는 동일한 세포 내에서 가성형태화된 동일한 렌티바이러스 벡터 역가의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%이다.
C. 바이러스 전달
바이러스는 바이러스가 관심 폴리뉴클레오티드의 전달을 원하는 표적 수지상 세포 (DC)에 접촉할 수 있게 하는 방식으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 때때로 적합한 양의 바이러스를 직접 (생체 내), 예로 신체 내로의 주사를 통해 인간 또는 다른 동물 내에 도입하게 된다. 적합한 동물에는 비제한적으로 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 토끼, 닭 또는 다른 새가 포함된다. 바이러스 입자는 여러 경로로, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 절내, 복강내 또는 점막으로 주사할 수 있다. 바이러스는 피하 주사 장치, 예컨대 [U.S. 특허 번호 7,241,275, 7,115,108, 7,108,679, 7,083,599, 7,083,592, 7,047,070, 6,971,999, 6,808,506, 6,780,171, 6,776,776, 6,689,118, 6,670,349, 6,569,143, 6,494,865, 5,997,501, 5,848,991, 5,328,483, 5,279,552, 4,886,499, 이들 전부의 전문이 참조함으로써 통합됨]에 개시된 장치를 이용하여 전달할 수 있다. 다른 주사 위치, 예컨대 표적 세포를 포함하는 기관 내로 직접 주사하는 것도 적합하다. 예를 들어 림프절 내 주사, 비장 내 주사 또는 골수내 주사를 이용하여 바이러스를 림프절, 비장 및 골수로 각각 전달할 수 있다. 특정 상황 및 표적 세포의 성질에 따라, 도입은 다른 수단을 통해, 예를 들어 흡입 또는 상피 조직과의 직접적 접촉, 예를 들어 눈, 입 또는 피부 내의 접촉을 포함하여 수행될 수 있다.
대안적으로 표적 세포를 제공하고 시험관 내, 예컨대 배양 플레이트에서 바이러스와 접촉시킨다. 표적 세포는 전형적으로 건강한 피험체 또는 치료를 필요로 하는 피험체, 또는 항원에 대한 면역 반응을 제공하기 원하는 피험체에서 수득한 수지상 세포를 포함하는 세포군이다. 피험체로부터 세포를 수득하는 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 정맥절개, 수술적 절개 및 생검이 포함된다. 인간 DC는 또한 CD34α+ 인간 조혈 전구세포를 수득하고 다른 곳에 기재된 시험관 내 배양 방법을 이용하여 (예로 Banchereau 등, Cell 106, 271-274 (2001), 그 전문이 참조함으로써 통합됨) 생성시킬 수 있다.
바이러스를 배지 중에 현탁하고 배양 플레이트의 웰, 관 또는 다른 용기에 첨가할 수 있다. 바이러스를 포함하는 배지를 세포 접종 전에 또는 세포를 접종한 후에 첨가할 수 있다. 세포는 전형적으로 생활성 및 숙주 세포의 형질도입이 일어나도록 하는 적합한 농도의 바이러스를 제공하는 적절한 양의 배지 중에 인큐베이션한다. 세포는 바람직하게는 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있는 충분한 양의 시간 동안 바이러스와 인큐베이션된다. 바람직하게는 세포는 적어도 1 시간, 적어도 5 시간 또는 적어도 10 시간 동안 바이러스와 인큐베이션된다.
생체 내 및 시험관 내 전달 둘 다에 있어서, 원하는 표적 세포를 감염시키기 충분한 수를 포함하는 바이러스 입자 분취량을 사용할 수 있다. 표적 세포를 배양하게 되는 경우, 바이러스 입자의 농도는 일반적으로 적어도 1 IU/㎕, 보다 바람직하게는 적어도 10 IU/㎕, 더욱 바람직하게는 적어도 300 IU/㎕, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1X104 IU/㎕, 더 바람직하게는 적어도 1X105 IU/㎕, 더더욱 바람직하게는 적어도 1X106 IU/㎕ 또는 심지어 바람직하게는 적어도 1X107 IU/㎕이다.
시험관 내 바이러스 감염 이후, 표적 세포를 인간 또는 다른 동물 내로 도입 (또는 재도입) 할 수 있다. 세포를 표피, 표피 아래 내로, 또는 말초 혈류 내로 도입할 수 있다. 동물 내로 도입된 세포는 바람직하게는 해당 동물에서 유래되어 면역 역반응이 회피된다. 유사한 면역 배경을 갖는 공여체 유래의 세포를 또한 사용할 수 있다. 또한 사용할 수 있는 다른 세포에는 면역 역반응을 회피하도록 설계된 것들이 포함될 수 있다.
표적 세포는 예를 들어 관심 서열 또는 유전자(들)의 도입, 전사 및/또는 발현, 도입된 유전자의 복사본 수 및 도입 위치에 대해 분석할 수 있다. 이러한 분석은 언제든지 수행할 수 있으며, 당해분야에 공지된 임의 방법으로 수행할 수 있다.
바이러스 또는 바이러스-감염 수지상 세포가 투여되는 피험체를 감염 세포의 위치, 바이러스 유래 폴리뉴클레오티드 또는 관심 유전자의 발현, 면역 반응의 자극에 대해 분석하고, 당해분야에 공지된 임의 방법으로 질환 또는 장애에 연관된 증상을 모니터링할 수 있다.
상기 개시된 세포를 감염시키는 방법은 세포의 개인 특이적 특징에 의존하지 않는다. 그 결과, 다양한 동물종으로 쉽게 확장된다. 일부 경우에 있어서, 바이러스 입자는 인간 또는 인간 수지상 세포로 전달되며, 다른 예에 있어서 이들은 동물, 예컨대 마우스, 말, 개, 고양이 또는 새에게 전달된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 바이러스 벡터 게놈은 가성형태화되어 광범위한 숙주 범위 뿐만 아니라 표적 세포 특이성이 부여된다. 당해분야의 숙련자는 또한 특정 동물종에서 관심 서열의 원하는 발현을 달성하기 위한 적절한 내부 프로모터 및 다른 요소를 인지할 것이다. 따라서 당해분야의 숙련자는 임의 종으로부터 수지상 세포를 감염시키는 방법을 개질시킬 수 있을 것이다.
D. 치료적 및 예방적 면역화
수지상 세포는 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위해, 구체적으로는 환자에서 면역 반응의 활성화가 유익할 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위해 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자로 감염될 수 있다. 이러한 여러 질환이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 치료 또는 예방하기 쉬운 질환 또는 장애에는 비제한적으로 암, 자가면역 질환, 및 바이러스성, 박테리아성, 진균성 및 기생충 감염을 포함하는 감염이 포함된다. 하나의 방법에 있어서, 관심 서열을 수지상 세포로 전달하기 위해 질환을 본원에 기재된 바이러스 입자로 치료하며, 여기서 관심 서열의 발현은 질환 특이적 항원을 생성하며 항원 특이적 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응의 자극을 일으킨다. 일반적으로 관심 서열은 면역 반응을 일으키려는 항원을 인코딩하지만, 보통 수지상 세포에서는 발현되지 않는다. 항원은 수지상 세포에 의해 발현 및 제시된다. 바이러스 벡터 게놈은 또한 DC 성숙 인자를 인코딩할 수 있다.
전형적인 사용에 있어서, 바이러스 입자는 면역 반응을 일으키려는 항원을 인코딩하는 서열을 수지상 세포로 전달한다. 전달은 수지상 세포를 바이러스와 시험관 내에서 접촉시켜 성취되며, 이때 감염된 수지상 세포가 환자에게 제공된다. 다른 경우, 전달은 바이러스가 수지상 세포를 생체 내에서 감염시키도록 피험체에 전달함으로써 성취될 수 있다. 이어서 수지상 세포는 환자 내에서 항원 특이적 T 세포 또는 B 세포를 자극하여 발현된 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도한다. 이러한 방식으로 질환 또는 장애를 앓는 환자를 원하는 특이성을 갖는 면역 세포를 생성시켜 치료한다.
질환 또는 장애에 연관된 임의 항원을 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 입자를 이용하여 수지상 세포를 전달할 수 있다. 질환 또는 장애에 연관된 항원은 수지상 세포를 표적으로 삼는 바이러스 입자의 제조에 대해 동정된다. 여러 질환 및 장애에 연관된 항원은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 항원은 질환 또는 장애에 연관된 것으로 이미 공지되어 있을 수 있고, 또는 당해분야에 공지된 임의 방법으로 동정할 수 있다. 예를 들어, 환자가 앓는 암의 유형에 대한 항원, 예컨대 종양 연관 항원은 공지되어 있을 수 있고, 또는 당해분야에 공지된 임의의 다양한 방법으로 스스로 종양에서 동정할 수 있다.
종양-연관 항원이, 예를 들어, 신장 세포 암종, 전립선암, 흑색종, 및 유방암을 포함하는 다양한 암에 대해 공지되어 있다. 일부 유방암에 있어서, 예를 들어 Her-2 수용체는 암성 세포의 표면 상에서 과발현된다. 예시적 종양 항원에는 비제한적으로 정소의 면역 특별격리 부위 및 다양한 종양 세포에서 발현되는 돌연변이되지 않은 항원인 MAGE, BAGE, RAGE, 및 NY-ESO-1; 계통 특이적 종양 항원, 예컨대 멜라닌 세포-흑색종 계통 항원, MART-1/Melan-A, gpl OO, gp75, mda-7, 티로시나아제 및 티로시나아제-관련 단백질, 신장 세포 암종-5T4, SM22-알파, 카르보닉 안하이드라아제 I 및 IX (G250 으로도 알려져 있음), 저산소증-유도가능 인자 (예로 HIF-1 알파 및 HIF-2 알파), VEGF 또는 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 특이적 항원 (PSA), 전립선산 포스파타아제, 및 전립선의 6 개 막통과 상피 항원 (STEAP), 동일한 조직에서 유래되는 정상 및 신생물 세포에서 발현되는 항원인 NKX3.1; 종양 세포에서 돌연변이된 유전자 또는 정상 세포에 비해 종양에서 상이한 수준으로 전사되는 유전자 유래 에피토프 단백질/펩티드, 예컨대 텔로머라아제 효소, 서비빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이되거나 야생형인 p53, 시토크롬 P450 1 B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예컨대 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라아제-V; 골수종 및 B-세포 임파종에서 독특한 유전형을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론성 재배열; 종양 바이러스 절차에서 유래하는 에피토프 단백질/펩티드, 예컨대 인간 유두종 바이러스 단백질 E6 및 E7; 종양 선택적 발현을 나타내는 비돌연변이된 종양태아성 단백질, 예컨대 암배아 항원 및 알파-태아성단백질. 여러 종양 연관 항원이 검토되었다 (예를 들어, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합된 "Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigen recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001를 참고).
항원은 또한 감염성 질환, 예를 들어, HIV/AIDS에 연관된 항원일 수 있다. 항원은, 예를 들어 gp120 (Klimstra, W. B. 등, 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K. A. 등, 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A. P. 등, 1998. J Virol 72: 7349-7356, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨)일 수 있다. 다른 예시적 항원에는 비제한적으로 하기가 포함된다: gag, pol, env, tat, nef 및 rev (Lieberman, J. 등, 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. 등, 1998. Viral Immunol 11 (4): 167-181, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨).
바이러스 항원의 예에는 비제한적으로 아데노바이러스 폴리펩티드, 알파바이러스 폴리펩티드, 칼리시바이러스 폴리펩티드, 예로 칼리시바이러스 캡시드 항원, 코로나바이러스 폴리펩티드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩티드, 에볼라 바이러스 폴리펩티드, 엔테로바이러스 폴리펩티드, 플라비바이러스 폴리펩티드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩티드, 예로 B 형 간염 코어 또는 표면 항원, 또는 C 형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어, 또는 비구조 단백질, 허피스바이러스 폴리펩티드, 예로 허피스 심플렉스 바이러스 또는 바리셀라 조스터 바이러스 당단백질, 면역결핍 바이러스 폴리펩티드, 예로 인간 면역결핍 바이러스 외피 또는 프로테아제, 감염성 복막염 바이러스 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예로 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 뉴라미니다아제, 또는 핵 단백질, 백혈병 바이러스 폴리펩티드, 마버그 바이러스 폴리펩티드, 오르소믹소바이러스 폴리펩티드, 유두종 바이러스 폴리펩티드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예로 헤마글루티닌/뉴라미니다아제, 파라믹소바이러스 폴리펩티드, 파보바이러스 폴리펩티드, 페스티바이러스 폴리펩티드, 피코나 바이러스 폴리펩티드, 예로 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, 폭스 바이러스 폴리펩티드, 예로 박시니아 바이러스 폴리펩티드, 광견병 바이러스 폴리펩티드, 예로 광견병 바이러스 당단백질 G, 레오바이러스 폴리펩티드, 레트로바이러스 폴리펩티드, 및 로타바이러스 폴리펩티드가 포함된다.
박테리아성 항원의 예에는 비제한적으로 액티노마이세스 폴리펩티드, 바실러스 폴리펩티드, 박테로이드 폴리펩티드, 보르데텔라 폴리펩티드, 바르토넬라 폴리펩티드, 보렐리아 폴리펩티드, 예로 B. 부르그도페리 OspA, 브루셀라 폴리펩티드, 캄필로박터 폴리펩티드, 캅노사이토파가 폴리펩티드, 클라미디아 폴리펩티드, 클로스트리듐 폴리펩티드, 코리네박테리움 폴리펩티드, 콕시엘라 폴리펩티드, 더마토필러스 폴리펩티드, 엔테로코커스 폴리펩티드, 에를리키아 폴리펩티드, 에스체리키아 폴리펩티드, 프란시셀라 폴리펩티드, 푸소박테리움 폴리펩티드, 해모바르토넬라 폴리펩티드, 해모필러스 폴리펩티드, 예로 H. 인플루엔자 b 형 외막 단백질, 헬리코박터 폴리펩티드, 클레비시엘라 폴리펩티드, L-형 박테리아 폴리펩티드, 렙토스피라 폴리펩티드, 리스테리아 폴리펩티드, 미코박테리아 폴리펩티드, 미코플라스마 폴리펩티드, 나이세리아 폴리펩티드, 네오리케챠 폴리펩티드, 노카르디아 폴리펩티드, 파스퇴렐리아 폴리펩티드, 펩토코커스 폴리펩티드, 펩토스트렙토코커스 폴리펩티드, 뉴모코커스 폴리펩티드, 프로테우스 폴리펩티드, 슈도모나스 폴리펩티드, 리케챠 폴리펩티드, 로칼리마에아 폴리펩티드, 살모넬라 폴리펩티드, 시겔라 폴리펩티드, 스타필로코커스 폴리펩티드, 스트렙토코커스 폴리펩티드, 예로 S. 피오진 M 단백질, 트레포네마 폴리펩티드, 및 예르시니아 폴리펩티드, 예로 Y. 페스티스 F1 및 V 항원이 포함된다.
진균성 항원의 예에는 비제한적으로 앱시디아 폴리펩티드, 아크레모늄 폴리펩티드, 알테르나리아 폴리펩티드, 아스페르길러스 폴리펩티드, 바시디오볼루스 폴리펩티드, 비폴라리스 폴리펩티드, 블라스토마이세스 폴리펩티드, 칸디다 폴리펩티드, 코치디오이데스 폴리펩티드, 코니디오볼루스 폴리펩티드, 크립토코커스 폴리펩티드, 쿠르발라리아 폴리펩티드, 에피더모피톤 폴리펩티드, 엑소피알라 폴리펩티드, 게오트리쿰 폴리펩티드, 히스토플라스마 폴리펩티드, 마두렐라 폴리펩티드, 말라세지아 폴리펩티드, 마이크로스포럼 폴리펩티드, 모닐리엘라 폴리펩티드, 모르티에렐라 폴리펩티드, 무코 폴리펩티드, 패실로마이세스 폴리펩티드, 페니실륨 폴리펩티드, 피알레모늄 폴리펩티드, 피알로포라 폴리펩티드, 프로토테카 폴리펩티드, 슈달레스케리아 폴리펩티드, 슈도마이크로도치움 폴리펩티드, 피티움 폴리펩티드, 리노스포리듐 폴리펩티드, 리조푸스 폴리펩티드, 스콜레코바시듐 폴리펩티드, 스포로트릭스 폴리펩티드, 스템필리움 폴리펩티드, 트리코피톤 폴리펩티드, 트리코스포론 폴리펩티드, 및 자일로히파 폴리펩티드가 포함된다.
원생동물 기생충 항원의 예에는 비제한적으로 바베시아 폴리펩티드, 발란티듐 폴리펩티드, 베스노이샤 폴리펩티드, 크립토스포리듐 폴리펩티드, 아이메리아 폴리펩티드, 엔세팔리토준 폴리펩티드, 엔타모에바 폴리펩티드, 기아디아 폴리펩티드, 해몬디아 폴리펩티드, 헤파토준 폴리펩티드, 이소스포라 폴리펩티드, 라이슈마니아 폴리펩티드, 마이크로스포리디아 폴리펩티드, 네오스포라 폴리펩티드, 노세마 폴리펩티드, 펜타트리코모나스 폴리펩티드, 플라스모듐 폴리펩티드, 예로 P. 팔시파룸 서컴스포로조이트 (PfCSP), 스포로조이트 표면 단백질 2 (PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카르복시 말단 (PfLSAI c-term), 및 수송 단백질 1 (PfExp-1), 뉴모시스티스 폴리펩티드, 사코시스티스 폴리펩티드, 스키스토소마 폴리펩티드, 테일레리아 폴리펩티드, 톡소플라스마 폴리펩티드, 및 트립파노소마 폴리펩티드가 포함된다.
연충동물 기생충 항원의 예에는 비제한적으로 아칸토케일로네마 폴리펩티드, 앨루로스트롱길러스 폴리펩티드, 안사일로스토마 폴리펩티드, 안지오스트롱길러스 폴리펩티드, 아스카리스 폴리펩티드, 브루기아 폴리펩티드, 부노스토뭄 폴리펩티드, 카필라리아 폴리펩티드, 차베르티아 폴리펩티드, 쿠페리아 폴리펩티드, 크레노소마 폴리펩티드, 딕티오카울러스 폴리펩티드, 디오토파임 폴리펩티드, 디페탈로네마 폴리펩티드, 디필로보트리움 폴리펩티드, 디플리듐 폴리펩티드, 디로필라리아 폴리펩티드, 드라쿤쿨러스 폴리펩티드, 엔테로비우스 폴리펩티드, 필라로이데스 폴리펩티드, 해몬쿠스 폴리펩티드, 라고킬라스카리스 폴리펩티드, 로아 폴리펩티드, 만소넬라 폴리펩티드, 무엘레리우스 폴리펩티드, 나노피에투스 폴리펩티드, 네카토르 폴리펩티드, 네마토디루스 폴리펩티드, 오에소파고스토뭄 폴리펩티드, 온코세르카 폴리펩티드, 오피스토르키스 폴리펩티드, 오스테르타기아 폴리펩티드, 파라필라리아 폴리펩티드, 파라고니무스 폴리펩티드, 파라스카리스 폴리펩티드, 피살롭테라 폴리펩티드, 프로토스트롱길러스 폴리펩티드, 세타리아 폴리펩티드, 스피로세르카 폴리펩티드, 스피로메트라 폴리펩티드, 스테파노필라리아 폴리펩티드, 스트롱길로이데스 폴리펩티드, 스트롱길러스 폴리펩티드, 텔라지아 폴리펩티드, 톡사스카리스 폴리펩티드, 톡소카라 폴리펩티드, 트리키넬라 폴리펩티드, 트리코스트롱길러스 폴리펩티드, 트리쿠리스 폴리펩티드, 운시나리아 폴리펩티드, 및 우체레리아 폴리펩티드가 포함된다.
외부기생충 항원의 예에는 비제한적으로 벼룩; 참진드기 및 물렁진드기를 포함하는 진드기; 파리류, 예컨대 깔따구, 모기, 모래 파리, 먹파리, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 체체파리, 침파리, 구더기증 유발 파리 및 각다귀; 개미; 거미, 이; 등에; 및 참 벌레, 예컨대 빈대 및 키스 벌레 유래 폴리펩티드 (보호성 항원 뿐만 아니라 알레르기원 포함)가 포함된다.
일단 항원을 동정 및 선별하면, 원하는 항원을 인코딩하는 서열이 동정된다. 바람직하게는 서열은 cDNA를 포함한다. 바이러스 감염 후, 관심 서열 (예로 항원을 인코딩하는 서열)이 표적 수지상 세포에 의해 발현된다. 생체 외에서 접촉되는 경우, 표적 수지상 세포를 이어서 환자에게 다시, 예를 들어 주사에 의해 원하는 항원에 대해 면역 반응을 생성시킬 수 있는 면역 세포와 상호반응하는 곳으로 돌려보낸다. 바람직한 구현예에 있어서, 재조합 바이러스는 제 자리에서 표적화된 수지상 세포를 형질도입하는 곳으로 환자에게 주사된다. 이어서 수지상 세포는 치료할 질환 또는 장애에 연관된 특이적 항원을 발현하며, 환자는 질환 또는 장애에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있다.
바이러스 벡터 게놈은 둘 이상의 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 표적 수지상 세포의 형질도입 시, 세포에 전달된 여러 항원에 대해 면역 반응을 일으킨다. 일부 구현예에 있어서, 항원은 단일 질환 또는 장애에 관련된다. 다른 구현예에 있어서, 항원은 다중 질환 또는 장애에 관련된다.
일부 바이러스에 있어서, DC의 성숙을 활성화하고/하거나 자극하는 DC 성숙 인자가 관심 서열과 함께 전달된다. 대안적으로 DC는 바이러스의 전달 이전, 이와 동시, 또는 이후에 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. DC 성숙 인자는 바이러스 투여와 별도로 제공할 수 있다.
본원에서 기재되는 하나 이상의 면역 조정 또는 DC 성숙 인자는 바이러스 게놈 내에 포함되며 바이러스가 수지상 세포를 감염시킨 후 발현되는 하나 이상의 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 면역 조정 인자를 인코딩하는 서열은 또한 패키징 세포주에서 하나 이상의 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터와 함께 전달감염되는 별도의 벡터에서 제공될 수 있다.
본원에 기재되는 방법을 환자에서 선택적 면역치료를 위해 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이 면역 반응을 일으키려는 항원이 동정된다. 원하는 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하고 재조합 바이러스 내로 패키징한다. 표적 수지상 세포는 종종 환자에서 수득되며 원하는 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스로 형질도입된다. 이어서 수지상 세포를 다시 환자에게 전달한다.
바이러스 입자는 생체 내 주사될 수 있으며, 여기서 DC를 감염시키고 전형적으로 항원을 인코딩하는 관심 서열을 전달한다. 바이러스 입자의 양은 적어도 3X106 IU 이며, 적어도 1X107 IU, 적어도 3X107 IU, 적어도 1X108 IU, 적어도 3X108 IU, 적어도 1X109 IU, 또는 적어도 3X109 IU일 수 있다. 선택된 간격으로, 수여체의 림프 기관으로부터의 DC를 이용하여, 예를 들어 마커 발현, 예컨대 GFP 또는 루시퍼라아제를 관찰함으로써 발현을 측정할 수 있다. 핵산 모니터링 기법 및 역전사효소 (RT) 활성 측정을 또한 이용하여 바이러스 입자의 생체 분포를 분석할 수 있다. 렌티바이러스 벡터 입자 치료 수여체의 말초 혈액 단핵구, 림프절, 비장 또는 전이성 또는 표적 병원체 감염 조직에서 유래되는 T 세포를 항원 자극에 대한 반응의 크기 및 기간에 대해 측정할 수 있다. DC 이외의 조직 세포, 예컨대 상피 세포 및 림프 세포를 생체 내 유전자 전달의 특이성에 대해 분석할 수 있다.
AIDS의 만연 (및 다른 바이러스 질환)을 종료시키는 가장 효과적이고 강력한 방법은 효과적인 예방 백신임이 널리 동의되고 있다. 현재까지 HIV에 대해 어떠한 예방접종 방법도 III 상 시험을 성공적으로 통과하지 못하고 있다. 따라서 새롭고 효과적인 예방접종 전략이 시급히 요구된다. 하나의 전략은 DC의 예방접종이다. 이 시행에 있어서, 바이러스 단백질을 인코딩하는 서열, 예컨대 상술한 서열을 바이러스 벡터 내로 클로닝한다. 환자는 본원에 기재된 바와 같이 구축된 바이러스로 감염된다. 동물 모델에 있어서, 분자적으로 클로닝한 HIV 리포터 바이러스 (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) 및 임상 단리물을 이용하여 동물에 꼬리 정맥 주사로 투여한다. 감염 증거는 경시적으로 비장 세포, 림프절 및 말초 혈액에서 모니터링할 수 있다. HIV-gag 단백질에 대한 PCR 증폭 및 리포터 바이러스 내 HAS에 대한 흐름 세포측정을 이용하여 바이러스 도입 및 복제에 대해 평가할 수 있다. 생산적인 제 자리 DC 예방접종으로 HIV 투여에 대한 내성을 증가시킬 수 있다.
백신에는 종종 보강제가 포함된다. 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자를 또한 보강제와 함께 투여할 수 있다. 보강제는 재조합 바이러스 입자와 함께, 재조합 바이러스 입자 이전 또는 재조합 바이러스 입자 이후에 투여할 수 있다. 바이러스 입자와 함께 투여하는 경우, 바람직한 보강제는 바이러스 입자의 완전성을 크게 손상시키지 않는다, 예컨대 외피 당단백질을 포함하는 바이러스 막을 손상시키지 않는다.
다양한 보강제를 바이러스와 함께 사용하여 바이러스 벡터 게놈에서 인코딩되는 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 바람직한 보강제는 반응의 정성적 형태에 영향을 주는 항원의 입체형태를 변경시키지 않으면서 항원에 대한 내재적 반응을 증강시킨다. 바람직한 보강제에는 알룸, 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (MPL) (GB 2220211 참고)가 포함된다. QS21은 남아메리카에서 발견되는 퀼라자 사포나하 몰리나 (Quillaja Saponaha Molina) 나무의 줄기에서 단리되는 트리테르펜 글리코시드 또는 사포닌이다 (Kensil 등, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell 및 Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. 특허 번호 5,057,540 참고). 다른 보강제에는 선택적으로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (Stoute 등, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997) 참고)와 조합된 수중유 에멀젼 (예컨대 스쿠알렌 및 땅콩유)이 있다. 또 다른 보강제는 CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998)이다. 대안적으로, Aβ를 보강제에 커플링할 수 있다. 예를 들어, Aβ의 지질펩티드 형태를 B 형 간염 항원 예방접종에 대해 기재된 바와 같은 Aβ (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997))의 N-말단에 직접 팔미트산 또는 다른 지질을 커플링하여 제조할 수 있다. 그러나 이러한 커플링이 이에 대한 면역 반응의 성질에 영향을 미치기 위해서는 Aβ의 입체형태를 실질적으로 변경시키지 말아야 한다. 보강제는 활성제와 함께 치료적 조성물의 성분으로 투여될 수 있고, 또는 치료제의 투여와 별도로, 그 이전에, 동시에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다.
하나의 보강제 클래스로는 알루미늄염 (알룸), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄이 있다. 이러한 보강제를 다른 특이적 면역자극제, 예컨대 MPL 또는 3-DMP, QS21, 다량체성 또는 단량체성 아미노산, 예컨대 폴리글루탐산 또는 폴리라이신과 함께 또는 이것들 없이 사용할 수 있다. 또 다른 보강제 클래스로는 수중유 에멀션 제형이 있다. 이러한 보강제는 다른 특이적 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드 (예로 N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (노르-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-AI-D-이소glu-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 (DTP-DPP), theramide.TM.) 또는 다른 박테리아 세포벽 성분과 함께 또는 이것들 없이 사용할 수 있다. 수중유 에멀션에는 (a) 마이크로분무기, 예컨대 모델 110Y 마이크로분무기 (Microfluidics, Newton Mass.)를 이용하여 서브마이크론 입자로 제형화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80, 및 0.5% Span 85 (선택적으로 다양한 향의 MTP-PE 포함)를 포함하는 MF59 (WO 90/14837), (b) 서브마이크론 에멀션으로 마이크로분무되거나 볼텍스되어 더 큰 입자 크기의 에멀션을 생성하는 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP 함유 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 모노포스포릴지질 A (MPL), 트레할로오스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (Detox™)을 포함하는 리비 보강제 시스템 (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)이 포함된다. 또 다른 바람직한 보강제 클래스로는 사포닌 보강제, 예컨대 Stimulon.TM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) 또는 이로부터 생성되는 입자, 예컨대 ISCOM (면역자극 복합체) 및 ISCOMATRIX가 있다. 다른 보강제에는 프로인트 완전 보강제 (CFA) 및 프로인트 불완전 보강제 (IFA)가 포함된다. 다른 보강제에는 시토카인, 예컨대 인터류킨 (IL-1, IL-2, 및 IL-12), 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
본원의 조성물과 사용할 수 있는 또 다른 보강제는 하기 화학식 1로 확인된다:
Figure pct00002
식 중, A1 및 A2 부분은 수소, 포스페이트 및 포스페이트 염의 군으로부터 독립적으로 선택된다. 나트륨 및 칼륨은 포스페이트 염에 대한 예시적 짝이온이다. R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6 부분은 C3-C23으로 나타내는 3 내지 23 탄소수의 히드로카르빌 군으로부터 독립적으로 선택된다. 추가 명확성을 위해, 부분이 다중 멤버를 갖는 지정된 군으로부터 "독립적으로 선택되는" 경우, 제 1 부분에 대해 선택된 멤버가 제 2 부분에 대해 선택된 멤버의 선택에 어떠한 방식으로든 영향을 주거나 이를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 함이 설명될 것이다. R1, R3, R5 및 R6 이 결합되는 탄소 원자는 비대칭이며, 따라서 R 또는 S 입체화학 중 어느 하나로 존재할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 모든 탄소 원자는 R 입체화학인 반면, 또 다른 구현예에 있어서 모든 탄소 원자는 S 입체화학이다.
"히드로카르빌"은 수소 및 탄소로부터 전체적으로 형성되는 화학적 부분을 나타내며, 여기서 탄소 원자의 배열은 직쇄 또는 분기쇄, 비환형 또는 환형일 수 있고, 인접 탄소 원자 간의 결합은 전체적으로 단일 결합인, 즉 포화 히드로카르빌을 제공할 수 있거나, 또는 임의의 두 인접 탄소 원자 가운데 이중 또는 삼중 결합이 존재할, 즉 불포화 히드로카르빌을 제공할 수 있고, 히드로카르빌기 중 탄소 원자의 수는 3 내지 24이다. 히드로카르빌은 대표적인 직쇄 알킬에 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하고 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실 등이 포함되고; 분기쇄 알킬에 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등이 포함되는 알킬일 수 있다. 대표적인 포화 환형 히드로카르빌에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되는 반면; 불포화 환형 히드로카르빌에는 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐 등이 포함된다. 불포화 히드로카르빌에는 인접 탄소 원자 가운데 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합이 포함된다 (히드로카르빌이 비환형인 경우에는 각각 "알케닐" 또는 "알키닐" 로, 히드로카르빌이 적어도 부분적으로 환형인 경우에는 각각 시클로알테닐 및 시클로알키닐로 불림). 대표적인 직쇄 및 분기쇄 알케닐에는 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등이 포함되는 반면; 대표적인 직쇄 및 분기쇄 알키닐에는 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐 등이 포함된다.
화학식 1의 보강제는 당해분야에 공지된 합성 방법, 예를 들어 그 각 공보가 본원에 참조로 도입되는 [PCT 국제 공보 번호 WO 2009/035528 뿐만 아니라 WO 2009/035528로 나타낸 공보]에 개시된 합성 방법으로 수득할 수 있다. 특정 보강제를 또한 상업적으로 얻을 수 있다. 바람직한 보강제는 Avanti Polar Lipids, Alabaster AL의 카탈로그에서 제품 번호 699800로 나타내는 것이다 (하기 E10과 함께 E1을 참고하라).
본 발명의 다양한 구현예에 있어서, 보강제는 화학식 1의 구조를 갖지만, A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6 부분은 이들 부분에 대해 앞서 제공된 옵션의 하위세트에서 선택되며, 여기서 이들 하위세트를 아래에 E1, E2 등으로 나타낸다.
E1: A1은 포스페이트 또는 포스페이트 염이고 A2는 수소이다.
E2: R1, R3, R5 및 R6은 C3-C21 알킬이고; R2 및 R4는 C5-C23 히드로카르빌이다.
E3: R1 , R3, R5 및 R6은 C5-C17 알킬이고; R2 및 R4는 C7-C19 히드로카르빌이다.
E4: R1 , R3, R5 및 R6은 C7-C15 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C17 히드로카르빌이다.
E5: R1, R3, R5 및 R6은 C9-C13 알킬이고; R2 및 R4는 Cn-C15 히드로카르빌이다.
E6: R1, R3, R5 및 R6은 C9-C15 알킬이고; R2 및 R4는 Cn-C17 히드로카르빌이다.
E7: R1 , R3, R5 및 R6은 C7-C13 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C15 히드로카르빌이다.
E8: R1, R3, R5 및 R6은 Cn-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 히드로카르빌이다.
E9: R1, R3, R5 및 R6은 Cn 알킬이고; R2 및 R4는 C13 히드로카르빌이다.
E10: R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고 R2 및 R4는 트리데실이다.
특정 옵션에 있어서, E2 내지 E10은 각각 구현예 E1과 조합되고/되거나 E2 내지 E9의 히드로카르빌기는 알킬기, 바람직하게는 직쇄 알킬기이다.
화학식 1의 보강제는 선택적으로 각각 아래에 논의된 바와 같은 공동 보강제와 함께 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 이와 관련하여, 제형, 예로 GLA 보강제에 대한 수성 제형 (AF) 및 안정한 에멀션 제형 (SE)을 제공하는 US 특허 공개 번호 2008/0131466을 참조하라 (여기서 이들 제형은 화학식 1의 임의 보강제에 대해 이용할 수 있다).
보강제는 단일 조성물로서 본 발명의 바이러스와 함께 투여할 수 있고, 또는 본 발명의 재조합 바이러스의 투여 이전, 이와 동시 또는 이후에 투여할 수 있으며, 면역원 및 보강제는 동일한 바이알에 포장 및 공급될 수 있고 또는 개별 바이알 내에 포장되어 사용 전에 혼합될 수 있다. 면역원 및 보강제는 전형적으로 의도하는 치료 용도를 나타내는 라벨과 함께 포장된다. 면역원 및 보강제가 별도 포장되는 경우, 패키징에는 전형적으로 사용 전 혼합에 대한 설명서가 포함된다. 보강제 및/또는 담체의 선택은 보강제를 함유하는 백신의 안정성, 투여 경로, 투여 일정, 예방접종하는 종에 대한 보강제의 효능에 근거하며, 인간에 있어서 약제학적으로 허용가능한 보강제는 관련 조절체에 의해 인간 투여에 대해 허용되었거나 허용가능한 것이다. 예를 들어, 프로인트 완전 보강제는 인간에 대해 적합하지 않다. 알룸, MPL 및 QS21은 바람직하다. 선택적으로 둘 이상의 상이한 보강제, 예컨대 알루미늄과 MPL, 알룸과 QS21, MPL과 QS21, 및 알룸, QS21 및 MPL을 함께 동시에 사용할 수 있다. 또한 프로인트 불완전 보강제를 선택적으로 임의의 알룸, QS21, 및 MPL, 그리고 이들의 모든 조합과 함께 사용할 수 있다 (Chang 등, Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)).
E. 약제학적 조성물 및 키트
또한 본원에서는 본원에 제공되는 바이러스 및 하나 이상의 성분을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 포함된다. 약제학적 조성물에는 본원에 제공되는 바와 같은 바이러스 벡터 입자 및 약제학적 담체가 포함될 수 있다. 키트에는 본원에 제공되는 약제학적 조성물 및/또는 조합물, 및 하나 이상의 성분, 예컨대 사용 설명서, 피험체로의 화합물 투여용 장치, 및 피험체로의 화합물 투여 장치가 포함될 수 있다.
본원에서는 본원에 제공되는 바와 같은 바이러스 입자 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예로 고형, 액형, 분말형, 수성형 또는 동결건조형일 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당해분야에 공지되어 있다. 이러한 담체 및/또는 첨가제는 종래 방법으로 제형화할 수 있고, 적합한 용량으로 피험체에 투여할 수 있다. 안정화제, 예컨대 지질, 뉴클레아제 저해제, 중합체, 및 킬레이트화제는 조성물이 체내에서 분해되는 것을 방지할 수 있다.
본원에 제공되는 바이러스 벡터 입자는 키트로 포장될 수 있다. 키트에는 선택적으로 하나 이상의 성분, 예컨대 사용 설명서, 장치, 및 추가 시약, 및 방법의 실시를 위한 성분, 예컨대 관, 용기 및 시린지가 포함될 수 있다. 예시적 키트에는 본원에 제공되는 바이러스가 포함될 수 있고, 선택적으로 사용 설명서, 피험체 내에서 바이러스 검출을 위한 장치, 피험체로의 바이러스 투여를 위한 장치, 및 피험체로의 화합물 투여를 위한 장치가 포함될 수 있다.
관심 유전자 (전형적으로 항원)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 또한 본원에 포함된다. 키트에는 바이러스 패키징 성분을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 및 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 인코딩하는 벡터가 포함될 수 있다. 일부 키트에는 바이러스 패키징 성분을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 인코딩하는 벡터, 및 적어도 하나의 DC 성숙 인자를 인코딩하는 벡터가 포함될 것이다.
관심 서열 (전형적으로 항원)을 인코딩하는 바이러스 벡터 및 선택적으로 DC 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트가 또한 본원에 포함된다. 일부 키트에 있어서, 키트에는 바이러스 패키징 성분을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 및 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 인코딩하는 벡터가 포함된다.
키트에는 또한 설명서가 포함될 수 있다. 설명서에는 전형적으로 바이러스 및 선택적으로 키트에 포함된 다른 성분 및 바이러스 투여를 위한 피험체의 적절한 상태 결정 방법, 적절한 투여량, 및 적절한 투여 방법을 포함하는 투여 방법을 설명하는 명확한 표시가 포함된다. 설명서에는 또한 치료 기간에 걸쳐 피험체를 모니터링하기 위한 지침이 포함될 수 있다.
본원에 제공되는 키트에는 피험체로의 바이러스 투여를 위한 장치가 포함될 수 있다. 의약 또는 백신 투여를 위해 당해분야에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치에는 비제한적으로 피하 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 무바늘 주사 장치, 흡입기 및 액체 분배기, 예컨대 스포이드가 포함된다. 전형적으로 키트의 바이러스 투여용 장치는 키트의 바이러스와 상용성일 것이다; 예를 들어 무바늘 주사 장치, 예컨대 고압 주사 장치가 고압 주사로 손상되지 않는 바이러스를 포함하는 키트에 포함될 수 있지만, 전형적으로 고압 주사로 손상되는 바이러스를 포함하는 키트에는 포함되지 않는다.
본원에 제공되는 키트에는 또한 피험체로의 화합물 투여용 장치, 예컨대 DC 활성화기 또는 자극기가 포함될 수 있다. 피험체로의 의약 투여를 위해 당해분야에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치에는 비제한적으로 피하 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 무바늘 주사 장치가 포함되지만, 비제한적으로 피하 바늘, 정맥내 주사, 카테터, 무바늘 주사 장치, 흡입기 및 액체 분배기, 예컨대 스포이드가 있다. 전형적으로 키트의 화합물 투여용 장치는 화합물의 투여에 대해 원하는 방법과 상용성일 것이다
하기 실시예를 예시로서 제공하지만, 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
신드비스 바이러스 외피 변종의 조작
신드비스 바이러스 (SV)-알파바이러스속 토가바이러스과 멤버-는 아마도 DC-SIGN을 통해 DC를 감염시킬 수 있다 (Klimstra, W. B. 등, 2003. J. Virol. 77: 12022-12032, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨). 그러나 실험실 SV 균주의 정준 바이러스 수용체는 여러 세포 유형에서 발견되는 세포-표면의 헤파란 설페이트 (HS)이다 (Strauss, J. H. 등, 1994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A. P., 및 D. E. Griffin. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356, 그 각각의 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨). 헤파란 설페이트 결합을 감소시키기 위해, 돌연변이 E2 외피 (SVGmu로 부름)를 Wang 등의 방법으로 구축했다 (US 2008/0019998, 그 전문이 도입됨). 이들의 일부 전략에는 E3/E2 프로-단백질 접합에서의 4 개 아미노산 결실 및 헤마글루티닌 유래의 10 개 아미노산 서열의 후속 첨가를 갖는 2 개 아미노산 결실이 관여된다 (도 1A 및 1B 참고). 생성 E2 단백질은 천연 절단 서열이 손상되었기 때문에 E3 및 E2의 융합 (pE2 로도 알려져 있음)으로 발현되며, 또한 외래 에피토프 (헤마글루티닌)를 발현한다. 아래에 나타내는 바와 같이, SVGmu는 다른 문제점 가운데 낮은 발현 수준의 문제점을 갖는다.
상이한 전략을 이용하여, 본 발명자들은 신드비스 바이러스의 E2 당단백질을 조작함으로써 헤파란 설페이트에 대한 결합을 감소시키고, 수지상 세포에 대한 특이성을 증가시키고, 발현을 개선시켰다. 이러한 특징을 보유하기 위한 일반적 접근법은 E2의 잔기 160 (도 1 에서의 잔기 233)을 비산성 아미노산, 특히 알라닌 이외의 아미노산으로 변경하거나 이를 결실시켜 수지상 세포의 감염성을 증가시키고, 단백질의 전체적 양의 전하를 감소시켜 헤파린 결합을 감소시키고, HA (헤마글루티닌) 에피토프를 제거하고, E2의 N-말단에서 절단 부위, 이 경우에는 퓨린 절단 부위를 복구하는 것이다. 바이러스 외피의 일부로서, 이들 E2 당단백질은 DC의 감염을 매개할 뿐만 아니라 다른 세포 유형의 감염을 감소시키거나 없앨 수 있다.
이런 원칙에 따라, E2의 몇몇 변종 서열을 설계하여 하기 표에 나타낸다. 굵은 서체는 HR 균주 신드비스 바이러스 외피 서열 (GenBank NC 001547.1)로부터의 변경을 나타낸다.
Figure pct00003
인간에 대해 코돈이 최적화된 핵산 서열을 포함하여 일부 변종을 인코딩하는 핵산 서열을 합성하였다 (도 1을 또한 참고). 변종에 대한 DNA를 발현 벡터, 예컨대 pcDNA3 내로 클로닝하였다.
실시예 2
신드비스 바이러스 E2 외피 당단백질 변종을 포함하는 바이러스 벡터 입자의 제조
293T 세포를 렌티바이러스 벡터, 예컨대 FUGW 또는 그 유도체, gag, pol 및 rev, 및 변종 신드비스 바이러스 외피 서열을 인코딩하는 패키징 플라스미드로 표준 인산칼슘 매개 일시적 전달감염에 의해 신드비스 외피-가성형태화된 바이러스를 제조하였다. FUGW는 GFP 리포터 유전자의 발현을 유도하는 인간 유비퀴틴-C 프로모터를 수반하는 자가-비활성 렌티바이러스 벡터이다 (Lois, C 등, 2002. Science 295: 868-872, 그 전문이 본원에 참조함으로써 통합됨). 렌티바이러스 전달 벡터 (FUGW 및 그 유도체)는 제 3 세대 HIV-기반 렌티바이러스 벡터이며 (일반적으로 Cockrell 및 Kafri Mol. Biotechnol. 36: 184, 2007 참고), 여기서는 3' LTR의 U3 영역 대부분이 결실되어 자가-비활성 3'-LTR 이 생성된다.
재조합 렌티바이러스 벡터의 생산은 293T 세포 (293LTV 세포주; CELL BIOLABS INC, LTV-100)의 인산칼슘 (CaPO4)-매개 일시적 전달감염에 의해 달성하였다. 293T 세포는 CaPO4와 함께 침전된 4 개의 플라스미드로 전달감염되었다. 하기 4 가지 플라스미드를 사용하여 도 3에 도식적으로 나타내고 하기에 대응하는 렌티바이러스 벡터 제조물을 제조하였다: i) 렌티바이러스 벡터; ii) HIV Rev 인코딩 플라스미드; iii) HIV Gag/Pol 인코딩 플라스미드; 및, iv) 외피 인코딩 플라스미드. 렌티바이러스 벡터는 원하는 항원 또는 면역조정 요소를 인코딩할 수 있으며, 감염된 세포의 숙주 염색체 내로의 도입을 방지하기 위해 특히 표적화된 결실을 포함한다. 일시적 전달감염에 이용할 수 있는 대안적인 플라스미드의 추가 예에는 그 인테그라아제가 돌연변이, 예컨대 본원에 기재되는 D64V 돌연변이를 보유하여 결함을 갖게 되는 폴리머라아제 완전효소를 인코딩하는 것들이 포함된다. 특정 목적을 위해, 외피 인코딩 플라스미드는 비-DC 표적화 범친화적 외피, 예컨대 VSV-G를 인코딩할 수 있다.
본원에 기재된 실험을 위해, 0.45 ㎛ 포어 크기의 필터를 통해 여과한 각각 Gag/Pol 및 Rev 플라스미드인 120 ㎍ 및 60 ㎍의 벡터, 240 ㎍의 외피 플라스미드의 CaPO4 침전물을 회전 병에서 배양하고 10% 소 태아 혈청으로 보강된 DMEM 배지 75 mL을 포함하는 대략 6 x 107 개 293T 세포에 추가하였다. 전달감염 6 시간 후, 배지를 100 mL의 새 배지로 교체하고 전달감염 36 시간 후에 수집하였다. 배양 상청액을 저속 (1200 rpm)으로 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화한 후 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 렌티바이러스 벡터 제조물을 포함하는 여과액을 선택적으로 20℃에서 5 시간 동안 17,700 x g에서 원심분리하였다. 이어서 펠렛화한 렌티바이러스 벡터를 원하는 부피의 PBS 중에 재현탁하였다. 이 절차로 전형적으로 본원에 기재된 신드비스 바이러스 당단백질 외피를 이용하여 > 5 x 105 IU/mL, 또는 각각의 회전 병 배양물에 대해 5 x 107 IU를 얻었다. 보다 전형적으로 본 절차로 각각의 회전 병 배양물에 대해 적어도 총 1 x 108 IU를 얻었다.
보다 상세하게는 -4 일째에, 150 mL의 세포 배양 배지를 37℃ 롤러 랙 인큐베이터 (0.2 rpm)에 1 시간 동안 놓인 회전병 (RB)에 첨가하였다. 각각의 RB 내로 융합성으로 15 cm 디쉬에서 계대하였다. -2 일째에, 배지를 RB에서 흡인하고 100 mL의 예비 가온한 배지로 교체하였다. -1 일째에, 세포를 전달감염용 제조물에 접종하였다. RB를 100 mL의 세포 배양 배지로 ~1 hr 동안 예비 가온하였다. 배지를 흡인하고 10~12 mL의 PBS를 첨가하였다. RB를 측면으로 놓고 2 회 회전시켜 세포를 코팅하였다. PBS를 흡인하고 10-12 mL의 트립신 용액을 첨가하였다. RB를 다시 측면으로 놓고 2 회 회전시켜 세포를 코팅하였다. 트립신 용액을 흡인하고 RB를 인큐베이터에 5 분 동안 놓아 두었다. RB에 10 mL의 가온 배지를 첨가하고 RB를 한번 강력히 회전시켜 세포를 탈착시켰다. 10 mL 피펫을 이용하여, 세포를 예로 10 회간 위 아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁물을 얻었다. 세포를 새 용기로 옮기고 배지로 희석하였다 (RB 당 배지 40 mL). 세포를 계수하고 새 RB 내로 7x107 VmI로 접종하여 하룻밤 동안 인큐베이터 내에 유지하였다.
0 일째에, 접종 후 대략 22 hr에 플라스미드 용액을 다음과 같이 제조하였다. 각각의 RB에 있어서, 플라스미드 용액 (120 ㎍ 벡터, 60 ㎍ Gag/Pol, 60 ㎍ Rev, 60 ㎍ 외피), 2.5 mL의 1.25M CaCl2, 및 여과 살균수를 최종 부피 12.5 mL로 함께 혼합하였다. 2.7 mL의 2 x HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCl, 12 mM 덱스트로오스, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4-7H2O, pH 7.0, 살균 여과) 완충액을 50 mL 튜브 (1 개 튜브/RB)에 첨가하였다. 12.7 mL의 물-CaCl2-DNA 혼합물을 배지 침적 시 볼텍싱하면서 12.7 mL의 2 x HBS에 적가하였다. 튜브 마개를 닫고 5~10 초 동안 계속 볼텍싱하였다 (최대 속도로). RB로부터 25 mL 배지를 제거하고 침전물 (25 mL)을 RB에 첨가하였다. 6 hr 동안 인큐베이션한 후 배지를 흡인 제거하고 100 mL의 새로운 예비 가온 세포 배양 배지를 첨가하였다. 다시 37℃ 인큐베이터에 넣었다.
전달감염 36 내지 48 hr 후, RB 상청액을 250 mL의 코니칼 튜브 내로 수집하여 다음과 같이 처리하였다. 상청액을 10 분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 0.45 um 필터를 통해 여과하였다. 500 mL 튜브 내의 상청액을 5 hr 동안 10,000 rpm 및 20℃에서 원심분리하였다. 벡터를 PBS 또는 HBSS 중에 원하는 농도로 재현탁하여 -80℃에 보관하였다.
생성된 가성형태화 바이러스 벡터를 이후 FUGWA/1, FUGWA/2 등으로 부른다. VSV-G 당단백질 외피를 갖는 바이러스 벡터 게놈을 이후 FUGvWVSV-G로 부른다.
실시예 3
신드비스 바이러스 외피 당단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자의 제조
이 실시예에 있어서, 역가는 상이한 신드비스 바이러스 외피로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터에 대해 결정하였다. 사용한 E2 당단백질은 SIN-VaM (서열 번호 3), SIN-Var2 (서열 번호 4), SIN-Var3 (서열 번호 5), SVGmu (서열 번호 2), HR (서열 번호 18) 이었다.
신드비스 바이러스 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자는 실시예 2에 기재된 바와 같이 293T 세포의 전달감염에 의해 생성하였다. 조생성 상청액을 전달감염 48 시간 후에 수집하여 전날 2E5 세포/웰로 6-웰 디쉬에 접종한 인간 DC-SIGN (293-DCSIGN)을 발현하는 293T 세포를 형질도입하는데 사용하였다. 역가는 37℃에서 72 hr 인큐베이션 후, Guava Easy-Cyte 세포흐름 측정기 (Millipore) 상에서 형질도입된 세포를 분석하여 결정하였다. 총 25,000 회를 계수하여 GFP+ 형질도입된 세포 백분율을 결정하고, 이를 다시 각 바이러스에 대한 GFP 역가 (IU, 감염 단위)를 계산하는데 사용하였다.
표적화된 형질도입 연구를 촉진시키기 위해, 인간 DC-SIGN을 발현하는 세포주를 구축하였다. 세포주는 인간 DC-SIGN에 대한 코딩 서열을 포함하는 VSVG-가성형태화 렌티벡터로 부모 293T 세포를 안정적으로 형질도입함으로써 생성하였다. 인간 DC-SIGN에 대한 cDNA를 플라스미드 pUNO-hDCSIGN1Aa (InvivoGene)로부터 증폭하고 렌티바이러스 플라스미드 FUW에서 인간 유비퀴틴-C 프로모터의 하류에 클로닝하여 FUW-hDCSIGN을 생성하였다. 대안적으로, 세포주는 DC-SIGN에 대한 코딩 서열을 포함하는 VSVG-가성형태화된 양생 (비렌티바이러스) 벡터로 부모 293T 세포를 안정적으로 형질도입함으로써 생성하여 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 형질도입의 하류 핵산-기반 분석을 더 촉진시켰다. 이어서 렌티벡터 또는 양생 벡터를 VSVG로 가성형태화하고 293T 세포의 형질도입에 사용하였다. 대안적으로, 세포주는 인간 DC-SIGN를 인코딩하는 플라스미드로 부모 293T 세포를 안정적으로 형질도입함으로써 생성하였다. 생성 세포를 항체로 염색하고 (항인간 DC-SIGN 항체 (BD Biosciences)) 세포를 정렬시켜 균일한 집단의 DC-SIGN+ 세포주를 얻었다.
3 개의 독립적 실험에 있어서, SIN-VaM 외피로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터는 SVGmu로 가성형태화된 것 또는 신드비스 바이러스의 HR 균주의 역가에 비해 대략 10 배 더 높은 역가를 가졌다 (도 3, 상부 그래프). 후속 연구에서는 이들 3 가지 신드비스 외피 변종의 생산성을 비교하였다. 대표적 결과를 나타낸다. Sin-Var1, Sin-Var2 및 SIN-Var3 외피는 유사한 전체 역가를 갖는 렌티바이러스 벡터 입자를 생성하였다.
신드비스 바이러스 변종 E2 당단백질을 포함하는 바이러스 벡터 입자의 특이성을 293T.hDC-SIGN 또는 부모 293T 세포의 형질도입 및 세포주 내 가시적인 마커 (예로 GFP)의 발현 측정으로 평가하였다.
표적 세포 (293T.hDC-SIGN 또는 293T 세포)를 24-웰 배양 디쉬 (웰 당 0.2X106 세포)에 접종하고 디쉬를 2,500 rpm 및 30℃에서 90 분 동안 원심분리한 바이러스 상청액 (웰 당 1 mL)으로 형질도입하였다. 이어서 상청액을 새 배양 배지로 교체하고 37℃에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 마커를 발현하는 세포의 백분율을 흐름 세포측정으로 측정하였다.
하기 표에 나타내는 바와 같이, E2 변종 1 및 E2 변종 3은 hDC-SIGN을 발현하는 세포를 우선적으로 표적화하였다 (세포에 대해 특이적이었다).
Figure pct00004
실시예 4
신드비스 바이러스 외피 당단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자의 면역원성
이 실시예에 있어서, 면역원성을 상이한 신드비스 바이러스 외피로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터로 평가하였다. 보다 구체적으로는, 항원 특이적 CD8 T 세포의 양 및 이들의 시토카인 분비 프로필을 결정하였다. 사용된 E2 당단백질은 SIN-VaM (서열 번호 3), SIN-Var2 (서열 번호 4), SIN-Var3 (서열 번호 5), SVGmu (서열 번호 2) 였다.
바이러스 게놈에는 오발부민 (OVA)을 인코딩하는 서열이 포함되었다. 렌티바이러스 벡터 입자는 실시예 2에 기재된 바와 같이 293T 세포를 전달감염시켜 생성하였다. 상청액을 수집하고, p24의 양을 ELISA 키트 (Advanced Bioscience Labs, Kensington MD)를 이용하여 결정하였다. 단백질 p24는 가성형태화된 비리온 내에서 발견되며 gag 유전자의 산물인 HIV 코어 단백질이다. C57BL/6 마우스 (군 당 5 마리 마우스)를 오발부민 OVA을 인코딩하는 도입-결핍 렌티벡터로 피하 면역시켰다. OVA257 (SIINFEKL) (서열 번호 24) 펩티드 특이적 CD8 T 세포의 수와 기능 및 비장 내 시토카인 분비 프로필을 9 일째에 MHC-1/펩티드 다합체 및 세포 내 시토카인 염색에 의해 결정하였다.
간단하게는 비장을 추출하고 70 μM의 나일론 필터를 통해 가압하여 호모게나이즈하였다. 적혈구를 잠시 증류수에 노출시켜 저장성 쇼크에 의해 용해시키고 즉시 10 x PBS를 첨가하여 등장성 환경으로 복구시켰다. 표본 별로 대략 5x106 개의 비장세포를 2% FCS 및 2 mM EDTA를 포함하는 25℃ PBS (FACS 완충액) 중의 PE-표지 H-2Kb/OVA257 펜타머 (ProImmune)로 염색하였다. 이어서 세포를 2 회 세척하고 생활성 염료 LIVE/DEAD 근적외선 (L/D NIR; Invitrogen) 및 하기 형광색소 표지 항체: CD44 FITC, CD19 PerCP-Cy5.5, 및 CD8 Pacific 청색 (eBioscience)으로 4℃에서 염색하였다. BD LSR I1 흐름 세포측정기 (50,000 회 CD8+) 상에서 데이터를 수집하고 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar)로 분석하였다. CD8 T 세포를 동정하기 위한 동기화 전략은 다음과 같았다: 임파구 (전방 산란 저-중, 측방 산란 저), 단일 세포 (측방 산란 면적 = 측방 산란 높이), 살아있는 세포 (L/D NIR-), CD8 T 세포 (CD8+ CD19-). CD8+ 게이트 내에서 IFN-γ를 발현하는 세포의 백분율을 결정하여 도 4a 및 4b에 나타내었다. 수평선은 평균값을 나타낸다. 비특이적 IFN-Y 염색은 담체 (H BSS)-주사 마우스의 비장 세포에서 결정하였으며, 여기서 세포를 펩티드로 시험관 내에서 자극하였다. IFN-γ 염색은 펩티드 없이 배향한 모든 표본에서 0.2% 미만이었다 (나타내지 않음). IFN-γ를 생산하는 CD8 T 세포 분획에 부가하여, TNFα 및/또는 IL-2를 또한 생산하는 IFN-γ+세포 분획을 나타내며, 중요하게 제시한다.
하나의 실험 세트에 있어서, 사용한 바이러스양에는 p24 2500 ng 또는 125 ng 이 포함되었다. 도 4a는 신드비스 변종 외피로 가성형태화된 렌티벡터가 생체 내에서 유사 활성을 가짐을 예시한다. 가장 왼쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 항원 특이적 CD8 T 세포의 평균은 상이한 두 투여량에서 본질적으로 동일하다. 또한, IFN-γ 세포의 평균 백분율도 유사하다. 시토카인 분비 패턴, 구체적으로 IL-2 또는 TNF-알파를 또한 발현하는 IFN-감마 양성 세포의 분획도 유사하며, I IFN-γ 세포의 가장 높은 백분율은 IL-2 및 TNF-α에 대해 음성이다.
또 다른 실험 세트에 있어서, 5 마리 마우스군에 바이러스의 일련의 희석 용량 또는 담체를 투여하였다. 바이러스는 SinVari 또는 SVGmu로 가성형태화되었다. CD44hi H-2Kb/OVA257 펜타머+ 표현형을 갖는 세포의 백분율을 도 4b에 나타낸다. 연결선은 평균값을 의미한다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, SinVari-가성형태화된 LV는 SVGmu에 비해 항원 특이적 CD8 T 세포의 실질적으로 더 큰 확장을 유도하였다. 또한 SinVari-가성형태화된 렌티벡터는 SVGmu에 비해 더 큰 기능적 CD8 T 세포 반응을 유도하였다 (도 4c). 비특이적 IFN-γ 염색을 펩티드로 재자극한 HBSS-주사 (담체) 하우스에서 결정하였다. IFN-γ 염색은 펩티드를 포함하지 않은 모든 배양 표본에 대해 0.2% 미만이었다 (나타내지 않음).
실시예 5
비삽입성 렌티바이러스 벡터 (NILV)의 구축
다양한 비삽입성 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 렌티바이러스 벡터의 예시도를 도 5a에 나타낸다. 상부도는 프로바이러스 형태의 벡터를 나타낸다. 모든 벡터는 스플라이스 공여체, 패키징 신호 (psi), Rev-반응성 요소 (RRE), 스플라이스 공여체, 스플라이스 수여체, 중심 폴리-퓨린 트랙 (cPPT) 및 WPRE 요소를 포함한다. 또한 모든 벡터 구축물은 포유류 세포에서의 발현을 위한 프로모터 및 예시적 구축물에서 표지된 "항원" 인 관심 서열을 포함한다. 본 실시예에서 이용하는 프로모터에는 인간 유비퀴틴 C 프로모터 (UbiC), 사이토메갈로바이러스 조기 발현 프로모터 (CMV), 및 라우스 육종 바이러스 프로모터 (RSV)가 포함된다.
U3 영역을 확대한 도면을 PPT (폴리퓨린 트랙) 서열 바로 상류의 열린 상자로 아래에 나타낸다. 아래에는 도식 형태로 3 가지 상이한 U3 영역을 나타낸다; 이들의 서열은 도 5b에 서열 번호 21~23으로 나타낸다. 구축물은 U3 영역에 결실을 포함한다. SIN 구축물은 U3 내에 약 130 개 뉴클레오티드의 결실을 가지며 (Miyoshi 등, J Virol 72: 8150, 1998; Yu 등, PNAS 83: 3194, 1986), 이는 TATA 박스를 제거하여 LTR 프로모터 활성을 없앤다. 구축물 703 및 704 에서의 결실은 렌티바이러스 벡터로부터의 발현을 증가시킨다 (Bayer 등, Mol Therapy 16: 1968, 2008, 그 전문이 도입됨). 또한, 구축물 704는 3' PPT의 결실을 포함하며, 이는 벡터 도입을 감소시킨다 (WO 2009/076524, 그 전문이 도입됨). 모든 구축물의 U3 영역 서열을 도 5b에 나타낸다. 3' PPT는 위치 3에서 시작하며, SIN-결실 벡터에 비해 연장된 결실을 나타낸다.
실시예 6
렌티바이러스 벡터 입자의 형질도입에 따른 수지상 세포 내의 발현
이 실시예는 U3 결실이 연장된 벡터로 생성된 수지상 세포 내의 GFP (녹색 형광 단백질) 발현 수준을 나타낸다.
일련의 바이러스를 상술한 바와 같이 293T 세포의 전달감염에 의해 생산하였다. 모든 바이러스는 SIN-VaM 외피, GFP 형질도입 유전자와 작동가능하게 연관된 UbiC 또는 CMV 프로모터, 및 D64V 돌연변이를 포함함으로써 결핍된 인테그라아제를 갖는 벡터 게놈을 포함한다. 조생성 상청액을 형질도입 48 시간 후에 수집하고, 각 상청액의 동등 부피를 이용하여 293T-DCSIGN 세포를 형질도입하였다. GFP 발현을 GUAVA Easy-Cyte 흐름 세포측정기를 이용하여 형질도입 72 시간 후에 결정하였다. 총 50,000 회 각각의 형질도입된 세포군을 계수하였다. FlowJo 세포측정 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
UbiC (도 6, 패널 A) 및 CMV (도 6, 패널 B) 프로모터 모두로부터 유사한 결과를 수득하였다. 연장된 U3 결실을 포함하는 렌티바이러스 벡터 (703 및 704)는 SIN 결실 벡터에 비해 전체적으로 더 높은 형질도입 유전자 발현을 나타내었다. 구축물 704에서 PPT의 결실은 구축물 703에 비해 발현을 약간 감소시켰다.
실시예 7
U3 내의 큰 결실을 갖는 벡터는 비삽입성임.
이 실시예는 293-DC-SIGN 세포의 형질도입 후 결핍 또는 야생형 인테그라아제를 갖는 상이한 벡터 결실의 조합을 포함하는 SIN-VaM 가성형태화된 벡터의 상대적 도입 효율을 나타낸다.
여러 상이한 조합의 인테그라아제 유전자 및 U3 결실을 갖는 벡터 스톡을 생성하였다. U3 결실을 갖는 벡터 (도 5a 및 5B 참고), SIN, 703, 및 704를 야생형 인테그라아제 유전자 또는 돌연변이 인테그라아제 유전자로 상기와 같이 전달감염시켰다. 이들 실험에서의 벡터는 GFP 및 G418 내성을 모두 인코딩하는 GFP-2A-Neo 형질도입 유전자를 포함하였다. 해독틀은 2A 자가-절단 펩티드를 통해 연관되어 개별 단백질을 생성하였다. 모든 벡터 스톡에 대한 GFP 역가는 표준 흐름 세포측정 방법을 이용하여 결정하였다. 이어서 벡터 스톡을 이용하여 전날 6 웰 디쉬에 5 X 105 세포/웰로 접종된 293-DC-SIGN 세포를 감염시켰다. 형질도입 후, 세포를 트립신으로 매 72 시간 마다 처리하였다. 각각의 계대 시, 2 X 105 세포를 2 mL의 DMEM + 10% FBS 중 6 웰 디쉬 내로 재접종하였다. 잔여 세포를 이용하여 GFP+ 세포의 수를 흐름 세포측정으로 결정하였다.
도 7 에서, 상대 GFP 역가를 계대 1에서 관찰되는 역가의 분율로 나타낸다. GFP 발현의 소실은 GFP 형질도입 유전자의 소실을 반영하며, 이는 초기 형질도입 단계의 부재 결과이다. 예측되는 바와 같이, D64V 돌연변이 인테그라아제 (IN-)를 포함하는 모든 바이러스는 비삽입성으로 나타났다. 또한, PPT 결실 (704)을 포함하는 바이러스는 야생형 IN 유전자의 존재 하에서도 도입 결핍인 것으로 나타났다. 이는 3' PPT의 결실이 인테그라아제 돌연변이와 함께 중복되는 안전성 기전을 제공함을 나타낸다.
실시예 8
삽입성 및 비삽입성 렌티바이러스 벡터는 동등하게 면역원성임.
이 실시예에 있어서, CD8 T 세포 반응을 삽입성 또는 비삽입성 바이러스로의 면역화 후에 평가하였다.
C57BL/6 마우스를 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV) 유래 Gag 항원을 인코딩하는 삽입성 (Intwt) 또는 비삽입성 (IntD64V) 렌티벡터의 2.5x1010 게놈으로 피하 면역시켰다. 비장 내 SIV Gag 특이적 CD8 T 세포의 수 및 기능을 10 일째에 상술한 바와 같이 세포 내 시토카인 염색으로 결정하였으나, 예외적으로 재자극을 위해서는 SIV Gag 유래 펩티드 AAVKNWMTQTL을 사용하였다. 도 8은 비삽입성 렌티벡터가 삽입성 렌티벡터에 상응하는 CD8 T 세포 반응을 일으킬 수 있음을 보여준다. 또한 시토카인 발현 패턴이 유사하다.
실시예 9
DC-NILV로의 면역화는 치료적 효과를 제공함.
이 실시예에 있어서, 종양 세포를 투여받은 마우스를 종양 항원을 발현하는 DC-NILV로 면역화하여 치료한다.
BALB/c 마우스에 2x104 개 CT26 결장 암종 세포를 피하 주사하였다. 1 일 후, 마우스에 담체 또는 3.2 ㎍의 p24 캡시드 단백질을 포함하는 SINvari 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자 제조물을 피하 처리하였다. 바이러스 벡터 외피는 상술한 바와 같이 신드비스 바이러스 E2의 변종을 포함하며, 벡터는 비삽입성이고, CT26 종양 세포에 대한 거부 항원인 개질 MMTV gp70 CD8 T 세포 에피토프, AH1A5 펩티드 (SPSYAYHQF;서열 번호 25)를 인코딩한다. 면역화 대 대조군 마우스의 초기 종양 성장 뿐만 아니라 장기 생존을 나타낸다. 도 9는 종양이 DC-NILV를 투여받은 마우스에서 더 느리게 자라며, 생존율 (75 일째에 측정함)이 실질적으로 더 낫다 (20% 대비 60% 생존)는 것을 보여준다. 따라서 DC-표적화 비삽입성 렌티벡터 (DC-NILV)는 종양의 치료적 처리에 효과적이다.
본 발명의 구현예에는 비제한적으로 하기가 포함된다.
1. 하기를 포함하는 레트로바이러스의, 예로 렌티바이러스의 벡터 입자:
(a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열 번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 포함하는 외피, 여기서, 상기 E2 당단백질 또는 이들의 변종은 E3에 융합되지 않음; 및
(b) 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 게놈.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 E2 당단백질 또는 변종이 DC-SIGN에 결합하는 레트로바이러스 벡터 입자.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 160X가 없거나, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신인, 예컨대 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되는 레트로바이러스 벡터 입자.
4. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 160X가 글리신인 레트로바이러스 벡터 입자.
5. 구현예 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 상기 E2 당단백질 변종이 그 전체 양의 전하를 감소시키기 위해 변형된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 레트로바이러스 벡터 입자.
6. 구현예 5에 있어서, 상기 변형된 아미노산이 서열 번호 1의 라이신 70, 라이신 76, 또는 라이신 159로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 치환이 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택적으로 독립적으로 선택되는 레트로바이러스 벡터 입자.
7. 구현예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, 상기 E2 변종 서열이 선택적으로 하나 이상의 추가 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열 번호 2, 3, 또는 4 인 (변종 1, 2, 및 3 인) 레트로바이러스 벡터 입자.
8. 구현예 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 71~75 서열이 변경되지 않았거나, DC를 감염시키는 변종의 능력에 영향을 미치지 않지만 이 영역 내 아미노산의 수를 변경시키지 않는 하나 또는 두 개의 치환을 갖는 변종인 레트로바이러스 벡터 입자.
하기 비제한적 조합에 설정된 바와 같은 상기 구현예의 임의 조합이 본 발명에 포함되며, 여기서 ">"는 앞서 번호를 지정한 구현예를 나타낸다: 4>2>1 ; 5>4>1 ; 5>4>2>1; 5>3>1; 5>3>2>1; 6>5>4>1; 6>5>4>2>1; 6>5>3>2>1; 6>4>2>1; 6>3>2>1; 6>5>3>1; 7>6>5>4>1; 7>6>5>4>2>1; 7>6>5>3>1; 7>6>5>3>2>1; 7>6>4>2>1; 7>5>4>1; 7>5>4>2>1; 7>5>3>1; 7>5>3>2>1; 7>4>2>1; 7>3>2>1; 7>6>4>1; 7>6>4>2>1; 7>6>3>1; 7>6>3>2>1; 7>6>2>1; 8>4>2>1; 8>5>4>1; 8>5>4>2>1; 8>5>3>1; 8>5>3>2>1; 8>6>5>4>1; 8>6>5>4>2>1; 8>6>5>3>2>1; 8>6>4>2>1; 8>6>3>2>1; 8>6>5>3>1; 8>7>6>5>4>1; 8>7>6>5>4>2>1; 8>7>6>5>3>1; 8>7>6>5>3>2>1; 8>7>6>4>2>1; 8>7>5>4>1; 8>7>5>4>2>1; 8>7>5>3>1 ; 8>7>5>3>2>1 ; 8>7>4>2>1 ; 8>7>3>2>1 ; 8>7>6>4>1 ; 8>7>6>3>1 ; 8>7>6>3>2>1 ; 8>7>6>2>1.
본 발명의 추가 구현예에는 하기가 포함된다:
9. 임의의 상기 구현예에 있어서, 상기 관심 서열이 종양 특이적 항원 또는 바이러스 유래 항원, 예컨대 HIV 또는 SIV 항원을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터 입자.
10. 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 포함하는 외피 내에 가성형태화된 레트로바이러스의, 예로 렌티바이러스의 벡터 게놈으로서,
상기 게놈이 관심 서열을 포함하며, E2 당단백질 변종이 레트로바이러스 벡터 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진하고; E2 당단백질 변종이 상기 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는 게놈.
11. 하기를 포함하는, 가성형태화된 레트로바이러스 벡터 입자 제조용 레트로바이러스 벡터 패키징 시스템:
(i) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 이들의 변종의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자, 및;
(ii) 전사되고 전사물이 가성형태화된 레트로바이러스 벡터 입자로 조립될 수 있는 제 2 핵산 분자.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 E2 당단백질이 상기 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는 패키징 시스템.
13. 구현예 11 또는 12에 있어서, 상기 제 1 핵산 분자가 선택적으로 신드비스 바이러스 E3/E2/6K/E1 폴리단백질의 형태인 E3/E2 당단백질을 인코딩하는 패키징 시스템.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 E3 서열이 서열 번호 20의 잔기 1~65 또는 서열 번호 20의 잔기 1~65에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이들의 변종에 해당하며, 여기서 잔기 62~65는 RSKR (서열 번호 27)이고, 상기 변종은 선택적으로 E2 폴리단백질의 잔기 1이 Ser 인, 가성형태화된 바이러스 외피 내로 도입될 수 있는 패키징 시스템.
15. 구현예 11, 12, 13 또는 14에 있어서, gag 및 pol 단백질을 인코딩하는 제 3 핵산 분자를 추가로 포함하는 패키징 시스템.
16. 구현예 11 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 제 2 핵산 분자가 관심 서열을 포함하는 패키징 시스템.
17. 구현예 11 내지 16 중 어느 하나의 제 1 및 제 2 핵산 분자로 전달감염된 세포.
18. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 단백질 또는 구현예 13 또는 14에 정의된 E3/E2 당단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
19. 구현예 18의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
20. 구현예 19의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
21. 세포 내에서 하기를 발현시키는 것을 포함하는, 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 레트로바이러스 벡터 입자의 제조 방법:
(i) 160X가 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 이들의 변종의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자, 및;
(ii) 전사되고 전사물이 가성형태화된 레트로바이러스 벡터 입자로 조립될 수 있는 제 2 핵산 분자.
22. 인간 또는 동물 피험체의 치료 방법에 사용하기 위한 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 레트로바이러스 벡터 입자.
23. 세포를 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 레트로바이러스 벡터 입자와 혼합하는 것을 포함하는, 레트로바이러스 벡터 입자를 세포로 시험관 내에서 전달하는 방법.
24. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 레트로바이러스 벡터 입자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 치료 백신.
SEQUENCE LISTING <110> Immune Design Corporation <120> Lentiviral Vectors Pseudotyped with a Sindbis Virus Envelope Glycoprotein <130> IDC 203PC <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 423 <212> PRT <213> Sindbis virus <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Ser Val Ile Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys 1 5 10 15 Ser Tyr Cys His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu 20 25 30 Gln Val Trp Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser 35 40 45 Ala Gln Phe Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr 50 55 60 Arg Tyr Met Ser Leu Lys Gln Asp His Thr Val Lys Glu Gly Thr Met 65 70 75 80 Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys Arg Arg Leu Ser Tyr 85 90 95 Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro Gly Asp Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser Cys Thr Leu Ala Arg 115 120 125 Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu Lys Tyr Asp Leu Pro Pro 130 135 140 Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr Asp Arg Leu Lys Xaa 145 150 155 160 Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro Arg Pro His Ala Tyr 165 170 175 Thr Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Ser Gly Lys Val Tyr Ala Lys Pro Pro 180 185 190 Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys Gly Asp Tyr Lys Thr 195 200 205 Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly Cys Thr Ala Ile Lys 210 215 220 Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys Trp Val Phe Asn Ser 225 230 235 240 Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala Gln Gly Lys Leu His 245 250 255 Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro Ser Thr Cys Met Val Pro Val Ala His 260 265 270 Ala Pro Asn Val Ile His Gly Phe Lys His Ile Ser Leu Gln Leu Asp 275 280 285 Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg Leu Gly Ala Asn Pro 290 295 300 Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr Val Arg Asn Phe Thr 305 310 315 320 Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly Asn His Glu Pro Val 325 330 335 Arg Val Tyr Ala Gln Glu Ser Ala Pro Gly Asp Pro His Gly Trp Pro 340 345 350 His Glu Ile Val Gln His Tyr Tyr His Arg His Pro Val Tyr Thr Ile 355 360 365 Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met Ile Gly Val Thr Val 370 375 380 Ala Val Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu Cys Leu Thr Pro Tyr 385 390 395 400 Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr Ser Leu Ala Leu Leu Cys 405 410 415 Cys Val Arg Ser Ala Asn Ala 420 <210> 2 <211> 986 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 2 Met Ser Ala Ala Pro Leu Val Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val 1 5 10 15 Ser Phe Pro Cys Asp Arg Pro Pro Thr Cys Tyr Thr Arg Glu Pro Ser 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Ile Leu Glu Glu Asn Val Asn His Glu Ala Tyr Asp 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Ala Ile Leu Arg Cys Gly Ser Ser Gly Ser Val Ile 50 55 60 Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys Ser Tyr Cys 65 70 75 80 His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu Gln Val Trp 85 90 95 Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser Ala Gln Phe 100 105 110 Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr Arg Tyr Met 115 120 125 Ser Leu Lys Gln Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Val 130 135 140 Lys Glu Gly Thr Met Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro 165 170 175 Gly Asp Ser Val Thr Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser 180 185 190 Cys Thr Leu Ala Arg Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu Lys 195 200 205 Tyr Asp Leu Pro Pro Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr 210 215 220 Asp Arg Leu Ala Ala Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro 225 230 235 240 Arg Pro His Ala Tyr Thr Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Ser Gly Lys Val 245 250 255 Tyr Ala Lys Pro Pro Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys 260 265 270 Gly Asp Tyr Lys Thr Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly 275 280 285 Cys Thr Ala Ile Lys Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys 290 295 300 Trp Val Phe Asn Ser Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala 305 310 315 320 Gln Gly Lys Leu His Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro Ser Thr Cys Met 325 330 335 Val Pro Val Ala His Ala Pro Asn Val Ile His Gly Phe Lys His Ile 340 345 350 Ser Leu Gln Leu Asp Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg 355 360 365 Leu Gly Ala Asn Pro Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr 370 375 380 Val Arg Asn Phe Thr Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly 385 390 395 400 Asn His Glu Pro Val Arg Val Tyr Ala Gln Glu Ser Ala Pro Gly Asp 405 410 415 Pro His Gly Trp Pro His Glu Ile Val Gln His Tyr Tyr His Arg His 420 425 430 Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met 435 440 445 Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu 450 455 460 Cys Leu Thr Pro Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr Ser 465 470 475 480 Leu Ala Leu Leu Cys Cys Val Arg Ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Thr 485 490 495 Glu Thr Met Ser Tyr Leu Trp Ser Asn Ser Gln Pro Phe Phe Trp Val 500 505 510 Gln Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ala Phe Ile Val Leu Met Arg Cys Cys 515 520 525 Ser Cys Cys Leu Pro Phe Leu Val Val Ala Gly Ala Tyr Leu Ala Lys 530 535 540 Val Asp Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr Val Pro Asn Val Pro Gln Ile 545 550 555 560 Pro Tyr Lys Ala Leu Val Glu Arg Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Asn Leu 565 570 575 Glu Ile Thr Val Met Ser Ser Glu Val Leu Pro Ser Thr Asn Gln Glu 580 585 590 Tyr Ile Thr Cys Lys Phe Thr Thr Val Val Pro Ser Pro Lys Ile Lys 595 600 605 Cys Cys Gly Ser Leu Glu Cys Gln Pro Ala Ala His Ala Gly Tyr Thr 610 615 620 Cys Lys Val Phe Gly Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Gln 625 630 635 640 Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn Ser Gln Met Ser Glu Ala Tyr Val Glu 645 650 655 Leu Ser Ala Asp Cys Ala Ser Asp His Ala Gln Ala Ile Lys Val His 660 665 670 Thr Ala Ala Met Lys Val Gly Leu Arg Ile Val Tyr Gly Asn Thr Thr 675 680 685 Ser Phe Leu Asp Val Tyr Val Asn Gly Val Thr Pro Gly Thr Ser Lys 690 695 700 Asp Leu Lys Val Ile Ala Gly Pro Ile Ser Ala Ser Phe Thr Pro Phe 705 710 715 720 Asp His Lys Val Val Ile His Arg Gly Leu Val Tyr Asn Tyr Asp Phe 725 730 735 Pro Glu Tyr Gly Ala Met Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ala 740 745 750 Thr Ser Leu Thr Ser Lys Asp Leu Ile Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu 755 760 765 Leu Lys Pro Ser Ala Lys Asn Val His Val Pro Tyr Thr Gln Ala Ser 770 775 780 Ser Gly Phe Glu Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu Gln Glu 785 790 795 800 Thr Ala Pro Phe Gly Cys Lys Ile Ala Val Asn Pro Leu Arg Ala Val 805 810 815 Asp Cys Ser Tyr Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asn Ala 820 825 830 Ala Phe Ile Arg Thr Ser Asp Ala Pro Leu Val Ser Thr Val Lys Cys 835 840 845 Glu Val Ser Glu Cys Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr 850 855 860 Leu Gln Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Gln Cys Pro Val His Ser His 865 870 875 880 Ser Ser Thr Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Val His Val Leu Glu Lys 885 890 895 Gly Ala Val Thr Val His Phe Ser Thr Ala Ser Pro Gln Ala Asn Phe 900 905 910 Ile Val Ser Leu Cys Gly Lys Lys Thr Thr Cys Asn Ala Glu Cys Lys 915 920 925 Pro Pro Ala Asp His Ile Val Ser Thr Pro His Lys Asn Asp Gln Glu 930 935 940 Phe Gln Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ser Trp Ser Trp Leu Phe Ala Leu 945 950 955 960 Phe Gly 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Lys Ala Arg Arg Glu Cys Leu Thr Pro 450 455 460 Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr Ser Leu Ala Leu Leu 465 470 475 480 Cys Cys Val Arg Ser Ala Asn Ala 485 <210> 21 <211> 683 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 21 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 180 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca 240 cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc 300 actgaccttt ggatggtgct acaagctagt accagttgag caagagaagg tagaagaagc 360 caatgaagga gagaacaccc gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc 420 ggagagagaa gtattagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acatggcccg 480 agagctgcat ccggactgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct 540 ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca 600 agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 660 gtcagtgtgg aaaatctcta gca 683 <210> 22 <211> 416 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 22 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 180 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 240 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360 ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagca 416 <210> 23 <211> 401 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 23 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttactgg aagggctaat 180 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca 240 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 300 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 360 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc a 401 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 24 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 26 Arg Ser Lys Arg Ser 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 27 Arg Ser Lys Arg 1

Claims (25)

  1. 하기를 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자:
    (a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며, 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산이고 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열 번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 포함하는 외피, 여기서, 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아님; 및
    (b) 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 E2 당단백질 또는 변종이 DC-SIGN에 결합하는 렌티바이러스 벡터 입자.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 160X가 없거나, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신인, 예컨대 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택되는 렌티바이러스 벡터 입자.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 160X가 글리신인 렌티바이러스 벡터 입자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 당단백질 변종이 그 전체 양의 전하를 감소시키기 위해 변형된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 변형된 아미노산이 서열 번호 1의 라이신 70, 라이신 76, 또는 라이신 159로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 치환이 글루탐산 또는 아스파르트산으로부터 선택적으로 독립적으로 선택되는 렌티바가러스 벡터 입자.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E2 변종 서열이 선택적으로 하나 이상의 추가 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열 번호 2, 3, 또는 4 인 (변종 1, 2, 및 3 인) 렌티바이러스 벡터 입자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 잔기 71~75 서열이 변경되지 않았거나, DC를 감염시키는 변종의 능력에 영향을 미치지 않지만 이 영역 내 아미노산의 수를 변경시키지 않는 하나 또는 두 개의 치환을 갖는 변종인 렌티바이러스 벡터 입자.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열이 종양 특이적 항원 또는 바이러스 유래 항원, 예컨대 HIV 또는 SIV 항원을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터 입자.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 105/mL 이상의 IU를 갖는 렌티바이러스 벡터 입자.
  11. 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변종을 포함하는 외피 내에 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 게놈으로서,
    상기 게놈이 관심 서열을 포함하며, 상기 E2 당단백질 변종이 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진하고; 상기 E2 당단백질 변종이 상기 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 갖는 렌티바이러스 벡터 게놈.
  12. 하기를 포함하는, 가성형태화된 렌티바이러스 벡터 입자 제조용 렌티바이러스 벡터 패키징 시스템:
    (i) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 수지상 세포를 감염시킬 수 있고, 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 이들의 변종의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자;
    (ii) gag 및 pol 단백질을 인코딩하는 제 2 핵산 분자;
    (iii) rev를 인코딩하는 제 3 핵산 분자; 및
    (iv) 관심 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 E2 당단백질이 상기 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 갖는 패키징 시스템.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 pol 단백질이 비기능적 인테그라아제를 갖는 패키징 시스템.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 비기능적 인테그라아제가 D64V 돌연변이를 갖는 패키징 시스템.
  16. 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 4 핵산 분자가 비삽입성 렌티바이러스 게놈인 패키징 시스템.
  17. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자가 적어도 105 IU/mL의 역가로 제조되는 패키징 시스템.
  18. 청구항 12 내지 17 중 어느 한 항의 제 1 및 제 2 핵산 분자로 전달감염된 세포.
  19. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 단백질, 또는 선택적으로 신드비스 E3/E2/6K/E1 폴리단백질의 형태인 E3/E2 당단백질, 또는
    E3 서열이 서열 번호 20의 잔기 1~65에 해당하는 E3/E2 당단백질, 또는
    잔기 62~65가 RSKR (서열 번호 27)이고, 변종이 가성형태화된 바이러스 외피 내로 도입될 수 있고, 선택적으로 추가로 E2 폴리단백질의 잔기 1이 Ser인, 서열 번호 20의 잔기 1~65에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 변종
    을 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
  20. 청구항 19의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  21. 청구항 20의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 세포 내에서 하기를 발현시키는 것을 포함하는, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 입자의 제조 방법:
    (i) 160X가 글루탐산 이외의 아미노산인 서열 번호 1, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 서열이 80% 동일성을 가지며 수지상 세포를 감염시킬 수 있고, 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 이들의 변종의 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 인코딩하는 제 1 핵산 분자, 및;
    (ii) 전사되고 전사물이 가성형태화된 레트로바이러스 벡터 입자로 조립될 수 있는 제 2 핵산 분자.
  23. 인간 또는 동물 피험체의 치료 방법에 사용하기 위한 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 입자.
  24. 세포를 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 입자와 혼합하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터 입자를 세포로 시험관 내에서 전달하는 방법.
  25. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 입자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 치료 또는 예방 백신.
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2015133046A (ru) * 2009-07-15 2018-12-24 Кэлиммьюн Инк. Двойной вектор для подавления вируса иммунодефицита человека
AU2012217723A1 (en) * 2011-02-15 2013-08-29 Immune Design Corp. Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
CA2863658C (en) * 2012-02-03 2023-03-14 Emory University Immunostimulatory compositions, particles, and uses related thereto
EP2844746A4 (en) 2012-03-26 2016-07-20 Univ California LENTIVIRUS PSEUDOTYPED WITH NIPAH VIRUS ENVELOPE AND METHODS OF USE
US9713635B2 (en) * 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
US8323662B1 (en) * 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
EP2831095B1 (en) * 2012-03-30 2018-11-28 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc-sign
EA034351B1 (ru) 2012-05-16 2020-01-30 Иммьюн Дизайн Корп. Трехкомпонентная вакцина против впг-2 и способы ее применения
WO2014109728A1 (en) * 2013-01-11 2014-07-17 The Scripps Research Institute Methods and compositions for enchancing transduction efficiency of retroviral vectors
GB201308772D0 (en) * 2013-05-15 2013-06-26 Imp Innovations Ltd Vectors
HUE051311T2 (hu) 2014-03-09 2021-03-01 Univ Pennsylvania Ornitin transzkarbamiláz (TC) deficiencia kezelésében alkalmas készítmények
JP2017522312A (ja) 2014-07-15 2017-08-10 イミューン デザイン コーポレイション Ｔｌｒ４アゴニストアジュバント及びレンチウイルスベクターを用いたプライム・ブーストレジメン
EP3247409B1 (en) * 2015-01-21 2020-11-04 Cornell University Viral vectors for prophylaxis and therapy of hemoglobinopathies
CN112481211B (zh) * 2015-01-26 2024-07-05 儿童医院公司 免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法
RU2017132190A (ru) * 2015-03-18 2019-04-18 Омнисайт Гибридные белки, содержащие модифицированные поверхностные гликопротеины альфавируса и опухолеассоциированный антиген, и способы, связанные с ними
CN108026593A (zh) 2015-05-18 2018-05-11 卡琳缪恩股份有限公司 区分hiv-1与慢病毒载体的方法
KR20180043800A (ko) 2015-09-09 2018-04-30 이뮨 디자인 코포레이션 Ny-eso-1 특이적 tcrs 및 그의 사용 방법
MX2018005467A (es) * 2015-11-09 2018-12-11 Immune Design Corp Composiciones que comprenden vectores lentivirales que expresan interleucina-12, y metodos de uso de las mismas.
US11135283B2 (en) 2015-11-09 2021-10-05 Immune Design Corp. Retroviral vector for the administration and expression of replicon RNA expressing heterologous nucleic acids
AU2017223460A1 (en) 2016-02-23 2018-09-13 Immune Design Corp. Multigenome retroviral vector preparations and methods and systems for producing and using same
CA3015530A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 New York University Virus vectors expressing multiple epitopes of tumor associated antigens for inducing antitumor immunity
EP3443000A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3442999A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3235908A1 (en) 2016-04-21 2017-10-25 Ecole Normale Superieure De Lyon Methods for selectively modulating the activity of distinct subtypes of cells
EP3235828A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-25 Genethon Stable pseudotyped lentiviral particles and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3491013A1 (en) 2016-07-28 2019-06-05 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20190099194A (ko) 2016-10-20 2019-08-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 분비가능한 변이체 면역조절 단백질 및 조작된 세포 치료
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2018235838B2 (en) 2017-03-16 2023-12-14 Alpine Immune Sciences, Inc. CD80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3596116B1 (en) 2017-03-16 2023-09-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20200034668A (ko) 2017-05-08 2020-03-31 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 막 융합을 촉진시키기 위한 조성물 및 그의 용도
CA3078517A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
US11116833B2 (en) * 2018-02-08 2021-09-14 George Mason University Method and system for inactivating virus infectivity for producing live-attenuated vaccines
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2022510276A (ja) 2018-11-30 2022-01-26 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
JP7495435B2 (ja) 2019-06-14 2024-06-04 ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン 治療用干渉粒子による免疫不全ウイルス感染を処置するための組成物及び方法
US20220307050A1 (en) * 2019-08-01 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Non-viral transgenesis
CN110982842B (zh) * 2019-12-31 2023-04-18 山西大学 一种慢病毒表达载体的设计及应用
EP4320242A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Sana Biotechnology, Inc. Cd8-specific antibody constructs and compositions thereof
US20230340627A1 (en) * 2022-04-05 2023-10-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of viral particles by digital assay
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023240124A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pseudotyped viral particles for targeting tcr-expressing cells

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5298420A (en) 1990-08-03 1994-03-29 Tanox Biosystems, Inc. Antibodies specific for isotype specific domains of human IgM and human IgG expressed or the B cell surface
TW279133B (ko) 1990-12-13 1996-06-21 Elan Med Tech
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JPH08504091A (ja) 1992-09-22 1996-05-07 メディカル・リサーチ・カウンシル 外部表面に非ウィルス性ポリペプチドを提示する組換えウィルス
US6534051B1 (en) 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
US5279552A (en) 1993-01-11 1994-01-18 Anton Magnet Intradermal injection device
US5997501A (en) 1993-11-18 1999-12-07 Elan Corporation, Plc Intradermal drug delivery device
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5660835A (en) 1995-02-24 1997-08-26 East Carolina University Method of treating adenosine depletion
AU727531B2 (en) 1995-07-25 2000-12-14 Crucell Holland B.V. Methods and means for targeted gene delivery
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
FR2747046B1 (fr) 1996-04-05 1998-06-19 Univ Paris Curie Nouveaux vaccins issus de plasmovirus
WO1998032869A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
US6432699B1 (en) * 1997-03-28 2002-08-13 New York University Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A
US6531123B1 (en) 1997-05-01 2003-03-11 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
WO1999013905A1 (en) 1997-09-18 1999-03-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Receptor-binding pocket mutants of influenza a virus hemagglutinin for use in targeted gene delivery
ZA988446B (en) 1997-09-18 2000-03-22 Res Dev Foundation Production of vaccines using arthropod vectored viruses.
US6218181B1 (en) 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US7078483B2 (en) 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
AU763007B2 (en) * 1998-05-22 2003-07-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral delivery system
WO2000055335A1 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
CA2373300C (en) 1999-04-14 2012-02-21 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
EP1046651A1 (en) 1999-04-19 2000-10-25 Koninklijke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-T interaction
EP1214437A1 (en) 1999-08-27 2002-06-19 The Regents of the University of California Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
ES2337017T3 (es) 1999-10-13 2010-04-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Procedimiento para obtener respuestas inmunitarias celulares de proteinas.
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US6569143B2 (en) 1999-10-14 2003-05-27 Becton, Dickinson And Company Method of intradermally injecting substances
US6776776B2 (en) 1999-10-14 2004-08-17 Becton, Dickinson And Company Prefillable intradermal delivery device
US20020193740A1 (en) 1999-10-14 2002-12-19 Alchas Paul G. Method of intradermally injecting substances
US7241275B2 (en) 1999-10-14 2007-07-10 Becton, Dickinson And Company Intradermal needle
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
CA2439620A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 Merck & Co., Inc. Viral reporter particles
CA2449589A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Dnavec Research Inc. Gene transfer into primate embryonic stem cells using vsv-g pseudotyped simian immunodeficiency virus vector
EP1425400B1 (en) 2001-09-13 2016-11-02 California Institute Of Technology Method for producing transgenic animals
US7732193B2 (en) 2001-09-13 2010-06-08 California Institute Of Technology Method for expression of small RNA molecules within a cell
US7195916B2 (en) 2001-09-13 2007-03-27 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell
US7737124B2 (en) 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
WO2003041763A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Medical Instill Technologies, Inc. Intradermal delivery device and method
CA2474742C (en) 2002-02-04 2012-01-17 Becton, Dickinson And Company Dermal access member
US7115108B2 (en) 2002-04-02 2006-10-03 Becton, Dickinson And Company Method and device for intradermally delivering a substance
US6780171B2 (en) 2002-04-02 2004-08-24 Becton, Dickinson And Company Intradermal delivery device
US7047070B2 (en) 2002-04-02 2006-05-16 Becton, Dickinson And Company Valved intradermal delivery device and method of intradermally delivering a substance to a patient
ATE424464T1 (de) * 2002-04-26 2009-03-15 Inst Nat Sante Rech Med Verbesserte chimäre glykoproteine und pseudotypisierte lentivirale vektoren
US7455833B2 (en) 2002-07-15 2008-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
EP1535627B1 (en) 2002-08-16 2008-07-09 Japan Science and Technology Agency Recombinant bcg vaccine
AU2003297474A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
US7090837B2 (en) 2003-01-21 2006-08-15 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors
US7786288B2 (en) 2003-10-23 2010-08-31 Karp Nelson M Immunizing compositions encoding an epitope obtained from the HIV-1 capsid protein cyclophilin A binding site
US7108679B2 (en) 2004-03-11 2006-09-19 Becton, Dickinson And Company Intradermal syringe and needle assembly
US20070275873A1 (en) * 2004-04-29 2007-11-29 Heidner Hans W Methods and Compositions Comprising Protein L Immunoglobulin Binding Domains for Cell-Specific Targeting
WO2005118802A2 (en) 2004-06-03 2005-12-15 The Regents Of The University Of California Targeting pseudotyped retroviral vectors
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006031996A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
RU2007134371A (ru) * 2005-02-16 2009-03-27 Лентиджен Корпорейшн (Us) Лентивирусные векторы и их применение
WO2006130855A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
PL2048955T3 (pl) 2006-07-21 2013-11-29 California Inst Of Techn Nakierowane dostarczanie genu dla szczepienia komórek dendrytycznych
PT2486938T (pt) 2006-09-26 2018-06-12 Infectious Disease Res Inst Composição para vacina contendo adjuvante sintético
CA2698668A1 (en) 2007-09-07 2009-03-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthetic lipid a derivative
DK2222861T3 (en) 2007-12-11 2018-02-05 Univ North Carolina Chapel Hill POLYPURIN-TRACT MODIFIED RETROVIRAL VECTORS

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