JP2017060535A - シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター - Google Patents

シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター Download PDF

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Abstract

【課題】シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクターの提供。
【解決手段】シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体と、関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含むレンチウイルスベクター粒子が提供される。レンチウイルスベクター粒子は、(a)シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体を含むエンベロープ、および(b)関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含み、本E2糖タンパク質変異体は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、本E2糖タンパク質変異体は、参照配列(HR株)と比較して、ヘパラン硫酸への結合が減少している。
【選択図】図2

Description

本特許出願は、概して、標的遺伝子送達に関し、より具体的には、樹状細胞を標的とし、したがって樹状細胞ワクチン接種に使用することができるエンベロープを含む、偽型レンチウイルスの使用に関する。
樹状細胞(DC)は、免疫応答の開始および制御に必須な抗原提示細胞である。DCは、抗原を捕捉および処理し、末梢からリンパ器官に移動して、主要組織適合複合体(MHC)に制限される様式で、抗原を静止T細胞に提示することができる。これらの細胞は、骨髄(BM)に由来し、樹状形態および高い可動性を示す。特化した抗原提示細胞(APC)としてのDCの発見は、DCにインビトロで特異的抗原を負荷することを伴う、DCに基づく免疫付与/ワクチン接種の戦略における試みを加速させた(非特許文献1、非特許文献2)。しかしながら、これらの試みはすべて、自己DCにエクスビボで特異的抗原を負荷し、次いで患者に投与することを含む、患者固有の治療という労働集約的な準備を伴う。
代替戦略は、組み換えウイルス系ベクターを、指定抗原をコードする遺伝子を宿主細胞に対して直接送達する機序として利用することである。この例において、所望の適合免疫応答の誘導を通して、発現した遺伝子産生物が治療利益を提供する。しかしながら、安全かつ有効なシステムを達成するには多数の困難がある。これらの困難のうちのいくつかとしては、所望の一連の宿主細胞を標的とするベクターを設計すること、適切な送達システムを提供すること、有効な免疫応答を引き出すように所望の抗原を発現させること、および指定されたヒト被検体集団に渡って広く利用されることができるように、組み換えウイルスベクターウイルスの十分に力価の高い薬学的組成物を常に製造することが含まれる。研究室規模のシステムを、医薬産業によって産生されることができる製品に発展させることにおいて、後者は特に困難である。
研究室では多くのレンチウイルスベクターが、VSV−Gエンベロープタンパク質で偽型化される。VSVエンベロープタンパク質は、多くの細胞型を標的とすることができるため(「汎親和性」エンベロープ)、これはモデルシステムとして広く使用され、産生システムは、概して高い力価を提供する。
本明細書に開示されるシンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込まれる。通常、ウイルス膜(エンベロープ)は、単一の前駆体タンパク質の開裂から産生される、2つの糖タンパク質ヘテロ二量体E1およびE2の三量体の複数の複製を含む。前駆体タンパク質は、そのNからC末端に、E3、E2、6K、およびE1タンパク質を含む。小E3糖タンパク質は、E2タンパク質が膜に転位するためのシグナル配列として機能し、フリンまたはいくつかの他のCa2+依存セリンプロテイナーゼによって、E2から開裂する。6Kタンパク質は、E1タンパク質が膜に移動するためのシグナル配列として機能し、次に、前駆体タンパク質から開裂する。
E1およびE2糖タンパク質は、それぞれ膜貫通領域を有し、E2は、約33残基の細胞質ドメインを有するが、E1の細胞質尾部は非常に短い(約2残基)。E1およびE2はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。
本技術分野において記載されるシンドビスウイルスの単離体は、ヘパラン硫酸(HS)との相互作用を介して、細胞に感染すると考えられる。特許文献1において、レンチウイルスパッケージ化システムが記載され、E3/E2エンベロープ融合タンパク質(SVGmuと呼ばれる)は、多数の修飾を含有し、タンパク質のHSへの結合を減少させるが、DC−SIGN表面分子を介して、DCへの結合および感染を維持することが意図される。特許文献1において、野生型SVGのcDNAは、カリフォルニア工科大学のDr.J.H.Strauss研究室から得られ、PCRによってpcDNA3ベクター(Invitrogen)にクローン化され、プラスミドpSVGを生成した。10残基のタグ配列を、PCR突然変異生成によって、アミノ酸71と74の間のE2タンパク質に挿入し、HS結合部位を崩壊させた。追加の欠失をSVGのE3糖タンパク質に導入して、アミノ酸61〜64を除去した。この修飾SVGは、SVGmuとして指定された(特許文献1の配列番号11)。SVGmuのcDNAは、pcDNA3ベクター(pSVGmuと指定される、特許文献1の配列番号3)において、CMVプロモーターの下流にクローン化された。
国際公開第2008/011636号
Banchereau and Palucka,A.K.2005.Nat.Rev.Immunol.5:296−306 Figdor,et al.2004.Nat.Med.10:475−480
本発明のいくつかの実施形態
SVGmu偽型ウイルス粒子は、DC−SIGN抗原を発現する細胞を選択的に形質導入することができるが、このシステムのいくつかの点は、治療用途に適切でない。例えば、E3/E2融合タンパク質は、インフルエンザヘマグルチニンの抗原エピトープを示し、ウイルスゲノムは、宿主染色体に組み込まれ、有害な宿主遺伝子を活性化することができ、本発明者らは、ウイルスの力価が、VSV−Gエンベロープで偽型化した粒子の力価と比較して低いことを発見した。重要なことに、E2糖タンパク質からのE3の適切な処理を回避する変異(いわゆる「pE2変異体」)を有する、シンドビスウイルス株、例えば、SVGmuは、許容細胞株において成長不良であり、マウスの病原性を深刻に減衰させる。
本発明の3つの例示的なEタンパク質変異体に対して、レンチウイルスベクターを偽型化するための国際公開第WO2008/011636号において使用されるSVGmu E3−E2タンパク質のアラインメントが、図1に示される。図1に示される番号付けは、シンドビスウイルスエンベロープタンパク質のHR株を参照する。他に指定のない限り、本明細書で使用される番号付けは、シンドビスウイルスの本株を参照する。本発明者らは、SVGmuタンパク質を修飾して、向上したレンチウイルス産生システムを提供した。本発明のウイルス粒子は、SVGmuを使用するものよりも著しく高い力価で産生され、より強い免疫反応も刺激する。さらに、偽型レンチウイルス粒子は、DCに対する選択性を維持しながら、向上した力価および向上した感染性を有する。
一実施形態において、本発明は、(a)160Xが存在しないか、もしくは非酸性アミノ酸である、配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または樹状細胞に感染することができる、その配列番号1の変異体を含むエンベロープであって、このE2糖タンパク質もしくはその変異体がE3に融合されないエンベロープと、(b)関心の配列を含むレンチウイルスゲノムとを含む、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスベクター粒子を提供する。
変異体は、DC−SIGNに結合することができてもよい。好ましくは、HR株からの基準タンパク質と比較して、ヘパラン硫酸への結合も減少している。HR株のE2タンパク質は、配列番号18として示される。
好ましくは、160Xは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の1つである。一態様において、160Xは存在しないか、またはグリシン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンである。一実施形態において、Xはグリシンである。
配列番号1の変異体は、160Xが維持され、かつ上に定義したとおりである、配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも82%、85%、87%、90%、92%、95%、もしくは98%の配列同一性を有する配列を含むものとして定義される。変異体は、独立して欠失しているか、または非塩基性アミノ酸で置換される、残基50〜180に渡る領域内のリシンおよびアルギニンの1つ以上を有してもよい。一実施形態において、非塩基性アミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。
一態様において、残基Xは、欠失、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択され、残基50〜180に渡る領域内の1つ以上のリシンおよびアルギニンは、独立して欠失しているか、または非塩基性アミノ酸で置換される。
別の態様において、Xは、欠失、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択され、残基50〜180に渡る領域内の1つ以上のリシンおよびアルギニンは、好ましくは少なくとも159位を含み、独立して欠失しているか、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸で置換される。
置換または欠失されてもよい正電荷アミノ酸の候補には、残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149および159におけるリシン、ならびに残基65、92、128、137、157、170、および172におけるアルギニンが含まれる(番号付けは配列番号1を参照)。置換される場合、置換は、グルタミン酸またはアスパラギン酸から独立して選択されてもよい。
特定の実施形態において、リシン残基70、76、および159の1つ以上が欠失または置換される。置換される場合、置換は、グルタミン酸またはアスパラギン酸から独立して選択されてもよい。
シンドビスウイルスは、RNAゲノムを有するため、上述されるものに加えて、置換、挿入、または欠失を含む変異は、上に定義される配列番号1に対する相同性パーセンテージの範囲内で、配列番号1のE2配列の一部に対して行われてもよい。例えば、配列番号1の変異体は、3位がTまたはV、23位がV、209位がR、264位がG、および393位がHである場合に存在する。これらの変化の1つ以上、または配列番号1に対する他の変異が行われてもよいが、但し、変異体がDCに感染する能力を維持することとする。
一実施形態において、変異体は、配列番号1の残基70〜76の領域内に挿入を全く含有しない。本実施形態において、配列番号1の残基71〜75の配列は、非荷電であり得るか、または変異体がDCに感染する能力に影響しない、1つもしくは2つの置換を含んでもよい。
ある例において、E2タンパク質は、最初に、少なくともE3との融合において、またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。ある実施形態において、E2は、E3−E2−6K−E1ポリタンパク質の一部として発現する。シンドビスウイルスは、天然にはポリタンパク質の一部としてE2を発現し、E3/E2、E2/6K、および6K/E1の結合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および開裂される配列を有する。E3/E2ポリタンパク質配列は、配列番号20として提示される。通常、E3/E2結合は、E3/E2ポリタンパク質の残基65〜66の間で、フリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって開裂される。フリンは、2つのアミノ酸によって分離される対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるE3/E2開裂を維持するために、残基62〜66(RSKRS、配列番号26)は、2つのアミノ酸分離を有する2つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持する必要がある。
本発明の一実施形態において、ポリタンパク質は、配列番号20の残基1〜65に対応するE3配列を含むか、またはその変異体であって配列番号20の残基1〜65に対して少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも82%、85%、87%、90%、92%、95%、もしくは98%の配列同一性を有し、ここで残基62〜65はRSKRであり(配列番号27)、変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができる変異体を含む。好ましくは、ポリタンパク質のE2部分は、本明細書で上に記載される実施形態のいずれかである。
あるいは、E3/E2フリン開裂配列または他の開裂配列のいずれかの代わりに、異なる開裂配列を使用することができる。認識および開裂部位は、限定されないが、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(例えば、カテプシンD、キモシン、HIVプロテアーゼ)、システインエンドペプチダーゼ(ブロメライン、パパイン、カルパイン)、メタロエンドペプチダーゼ(例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン)、セリンエンドペプチダーゼ(例えば、キモトリプシン、IXa因子、X因子、トロンビン、トリプシン)、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼに組み込むことができる。これらの酵素に対する認識および開裂部位配列は、よく知られている。
そのような開裂部位が使用される場合、それは配列番号20の少なくとも残基1〜60、例えば、残基1〜61もしくは1〜62を含む、E3ポリタンパク質、または配列番号20の対応する数の残基に対して少なくとも80%の配列同一性、もしくは少なくとも82%、85%、87%、90%、92%、95%、もしくは98%の配列同一性を有する、その変異体に導入されてもよく、これらはC末端において本開裂配列に直接融合され、順にポリタンパク質のE2部分に融合される。好ましくは、ポリタンパク質のE2部分は、本明細書において上に記載される実施形態のいずれかである。
本発明のE2タンパク質配列は、160Xが以下の表に定義されるとおりである、配列番号1の変異体を含み、タンパク質は、以下の残基70、76ならびに159および160以外は、配列番号1において提示されるとおりであり、それは以下のとおりである。
随意に、上記配列のそれぞれは、配列番号1に対して1つ以上のさらなる変更を含んでもよいが、未変更である配列番号1の残基71〜75を有するか、または変異体がDCに感染する能力に影響しないが、本領域内のアミノ酸の数を変更しない1つもしくは2つの置換を有してもよい。
本発明のさらなるE2タンパク質配列は、配列番号3、配列番号4、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、または配列番号15であり、残基160は、Glyの代わりにAla、Ile、Leu、またはValである。そのような変異体は、未変更である配列番号1の残基71〜75も含み得るか、または変異体がDCに感染する能力に影響しないが、本領域内のアミノ酸の数を変更しない、1つもしくは2つの置換を有してもよい。
随意に、配列番号3〜15のE2配列、または上記2つの段落に記載されるさらなる変異体は、配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有するE2配列を提供するように、他の位置において異なってもよい。「少なくとも80%の配列同一性」は、少なくとも82%、85%、87%、90%、92%、95%、または98%の配列同一性のいずれをも含む。
上記実施形態において、配列番号20の66位に対応する、第1のE2残基は、Serであってもよい。
上に示されるように、配列番号3〜15のいずれかを含む、本発明のE2配列、および前記3つの段落に記載されるその変異体は、少なくともE3/E2配列、および好ましくはシンドビスE3/E2/6K/E1ポリタンパク質配列を含むポリタンパク質から発現されてもよい。実施形態のそれぞれにおけるE3ポリタンパク質配列は、配列番号20の残基1〜65、または非天然開裂部位を有する変異体を含む、上述されるその変異体のものであってもよい。
(発明の概要)
本特許出願は、関心の配列を有するゲノムとアルボウイルスの糖タンパク質を含むエンベロープとを含む、偽型レンチウイルスベクターを対象とする。アルボウイルス糖タンパク質は、シンドビスウイルス、デングウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来し得る。特に、糖タンパク質がシンドビスウイルスからのE2タンパク質である場合、E2タンパク質は、配列番号1と比較して、残基160において少なくとも1つのアミノ酸変更を有する。アミノ酸変更は、欠失であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であることができる。E2糖タンパク質は、あるいは配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する変異タンパク質であり得、欠失またはグルタミン酸以外のアミノ酸のいずれかである、残基160の変更も有することができる。糖タンパク質は、樹状細胞の感染を促進する。すべての場合において、E2糖タンパク質は、シンドビスウイルスE3との融合タンパク質の一部ではない。一部の実施形態において、E2糖タンパク質または変異体は、DC−SIGNを結合する。レンチウイルスベクターは、関心の配列を含むレンチウイルスゲノムも含む。
ある実施形態において、残基160は、存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンである。一実施形態において、残基160はグリシンである。さらに、E2糖タンパク質の他の変更は、前述の残基160の変更と組み合わせて起こり得る。そのような変更の1つは、E2の正味正電荷を減少させるためのアミノ酸の変更である。正味正電荷を減少させるための1つの方法は、リシンの1つを塩基性でないアミノ酸に変更することである。特定の実施形態において、リシン70、リシン76、またはリシン159の1つ以上が変更される。ある実施形態において、これらのリシンの1つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸に変更される。特定の実施形態において、E2糖タンパク質は、配列番号3〜16の1つである。変更の組み合わせの例には、限定されないが、160位におけるグルタミン酸の変更、および非塩基性残基へのリシン70、リシン76、またはリシン159の1つ以上の変更が挙げられる。他の変更は、残基160および随意に本明細書に開示される他の変更のいずれかの変更と組み合わせて行われてもよい。例えば、前述されるE2糖タンパク質のいずれかは、随意に、1つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を含んでもよい。1つの特定例として、E2〜E3の間のタンパク質開裂部位は、天然配列または異なるエンドペプチダーゼによって開裂される変更配列のいずれかであり得る。上記のいずれかと組み合わされ得る他の実施形態において、配列番号1の残基71〜75の配列は、未変更であるか、または変異体がDCに感染する能力に影響しない1つもしくは2つのアミノ酸置換を有する。
ある実施形態において、前述のウイルス粒子のいずれかのレンチウイルスベクターゲノムは、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来抗原、例えば、HIVまたはSIV抗原をコードする、関心の配列を含む。一部の実施形態において、記載されるベクター粒子のいずれかは、少なくとも10/mL IUの力価で産生される。
別の態様において、残基160が存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができ、残基160が存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、その変異型をコードする第1の核酸分子と、gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする第2の核酸分子と、revをコードする第3の核酸分子と、関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージ化システムが提供される。パッケージ化システムのE2糖タンパク質または変異体は、上記実施形態のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、polタンパク質は、非機能的インテグラーゼを有する。特定の実施形態において、非機能的インテグラーゼは、D64V変異を有する。一部の実施形態において、第2の核酸分子は、非組み込みレンチウイルスゲノムである。特定の実施形態において、att部位が変異もしくは欠失しているか、またはPPT部位が変異もしくは欠失しているか、あるいは両方である。非組み込みレンチウイルスゲノムは、非機能的インテグラーゼと組み合わせて、およびE2タンパク質または変異体のいずれかと組み合わせて使用することができる。レンチウイルスベクターは、少なくとも10IU/mLの力価に産生されることが好ましい。一部の例において、細胞は、上述される第1および第4の核酸分子でトランスフェクトされる。細胞は、安定な形質転換で、既に第2および第3の核酸分子を含んでいてもよい。
上述されるような糖タンパク質、または随意にシンドビスE3/E2/6K/E1ポリタンパク質の形態であるE3/E2糖タンパク質、またはE3配列が配列番号20の残基1〜65に対応する、E3/E2糖タンパク質、または配列番号20の残基1〜65に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、その変異体をコードする単離核酸分子であって、残基62〜65は、RSKRであり(配列番号27)、変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込むことができ、随意にさらに、E2ポリタンパク質の残基1はSerである、単離核酸分子が提供される。E2糖タンパク質は、上述される変異体のいずれかであり得、変更の組み合わせを含む。さらに、核酸分子を含む発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞であるように、提供される。
上記の変異体または組み合わせのいずれか1つのレンチウイルスベクター粒子を作製する方法が提供され、細胞において、残基160がグルタミン酸以外であるか、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができる、その変異体であり、および残基160が欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質をコードする第1の核酸分子と、(ii)第2の核酸分子であって、転写することができ、転写物は偽型レンチウイルスベクター粒子へと構築される、第2の核酸分子と、を発現することを含む。
レンチウイルスベクター粒子はいずれも、ヒトまたは動物被検体を治療する方法において使用することができる。治療は、免疫付与のためのワクチンであり得、ワクチンは、予防的または治療的である。ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤とともに、レンチウイルスベクター粒子を含む。あるいは、レンチウイルスベクター粒子は、インビトロで細胞に投与することができ、細胞を上記レンチウイルスベクター粒子のいずれかと混合することを含む。
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照するときに明らかとなるであろう。さらに、2009年7月24日に出願された米国特許出願第61/228,491号は、あらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または樹状細胞に感染することができ、160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有するその配列番号1の変異体を含むエンベロープであって、E2は、シンドビスウイルスE3との融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと、
(b)関心の配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムと、
を含む、レンチウイルスベクター粒子。
(項目2)
前記E2糖タンパク質または変異体は、DC−SIGNに結合する、項目1に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目3)
前記160Xは、存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンであり、例えば、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、項目1または項目2に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目4)
160Xは、グリシンである、項目1または項目2に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目5)
前記E2糖タンパク質変異体は、その正味正電荷を低減するように変更された少なくとも1つのアミノ酸を有する、項目1、2、3、または4に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目6)
前記変更されたアミノ酸は、配列番号1のリシン70、リシン76、またはリシン159から成る群から選択され、置換がグルタミン酸またはアスパラギン酸から随意に独立して選択される、項目5に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目7)
前記E2変異体配列は、配列番号2、3、または4であり(変異体1、2、および3)、1つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を随意に含む、項目1、2、3、4、5、または6に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目8)
配列番号1の残基71〜75の配列が未変化である変異体か、または前記変異体がDCに感染する能力に影響しないが、この領域内のアミノ酸の数を変更しない、1つもしくは2つの置換を有する変異体である、項目1、2、3、4、5、6、または7に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目9)
前記関心の配列は、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来抗原、例えば、HIVもしくはSIV抗原をコードする、前記項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目10)
前記粒子は、少なくとも10/mLのIUを有する、前記項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目11)
シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体を含むエンベロープ内に偽型化されたレンチウイルスベクターゲノムであって、前記ゲノムは、関心の配列を含み、
前記E2糖タンパク質変異体は、前記レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、前記E2糖タンパク質変異体は、上記項目1〜10のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を有する、レンチウイルスベクターゲノム。
(項目12)
偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージ化システムであって、
(i)160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である配列番号1のシンドビスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第1の核酸分子と、
(ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする、第2の核酸分子と、
(iii)revをコードする、第3の核酸分子と、
(iv)関心の配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムと、
を含む、パッケージ化システム。
(項目13)
前記E2糖タンパク質は、上記項目1〜9のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を有する、項目12に記載のパッケージ化システム。
(項目14)
前記polタンパク質は、非機能的インテグラーゼを有する、項目12または13に記載のパッケージ化システム。
(項目15)
前記非機能的インテグラーゼは、D64V変異を有する、項目14に記載のパッケージ化システム。
(項目16)
前記第4の核酸分子は、非組み込みレンチウイルスゲノムである、項目12、13、14、または15に記載のパッケージ化システム。
(項目17)
前記レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも10IU/mLのタイターに産生される、項目12、13、14、15、または16に記載のパッケージ化システム。
(項目18)
項目12、13、14、15、16、または17のいずれか1項に記載の第1および第4の核酸分子でトランスフェクトされた細胞。
(項目19)
項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のいずれか1項に記載のタンパク質、または随意にシンドビスE3/E2/6K/E1ポリタンパク質の形態であるE3/E2糖タンパク質、または前記E3配列が、配列番号20の残基1〜65に対応する、E3/E2糖タンパク質、または配列番号20の残基1〜65に対して少なくとも80%の同一性を有するその変異体をコードする単離核酸分子であって、残基62〜65がRSKRであり(配列番号27)、前記変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができ、随意にさらに、E2ポリタンパク質の残基1はSerである、単離核酸分子。
(項目20)
項目19に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
(項目21)
項目20に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
(項目22)
細胞において、
(i)160Xがグルタミン酸以外である配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第1の核酸分子と、
(ii)第2の核酸分子であって、転写されることができ、前記転写物が偽型レンチウイルスベクター粒子へと構築される、第2の核酸分子と、
を発現させることを含む、項目1〜11のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター粒子を作製する方法。
(項目23)
ヒトまたは動物被検体の治療方法において使用するための、項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター粒子。
(項目24)
レンチウイルスベクター粒子をインビトロで細胞に送達する方法であって、前記細胞を、項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター粒子と混合することを含む、方法。
(項目25)
項目1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、治療または予防ワクチン。
4つのシンドビスウイルスエンベロープ、SVGmu、SIN−Var1、SIN−Var2、およびSIN−Var3のエンベロープタンパク質の配列アラインメントである。アラインメントは、SVGmu、前述されるシンドビスエンベロープに対して示される。SVGmuに対する主な差異は、E3とE2との間のフリン様プロテアーゼ開裂部位(RSKR、配列番号27)の再生、HAエピトープタグの除去、およびヘパリン結合を減少させるための一連のリシン置換を含む。 同上 パッケージ化ウイルス粒子において使用される例示的なベクターの概略図である。 レンチウイルスベクター粒子調製物の粗上澄み液の力価のグラフを示し、ベクターゲノムは、3つの異なるシンドビスウイルスエンベロープタンパク質、SVGmu、およびSIN−HRで偽型化された。ウイルス上澄み液は、標準方法を使用して、一時的なトランスフェクションによって生成し、トランスフェクションから48時間後に回収した。力価は、ヒトDC−SIGNを発現する293T細胞(293T−DC−SIGN)上で決定した。力価は、上澄み液1mL当たりのGFP発現単位の数として表され、3つの独立したトランスフェクションの平均である。エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。 偽型レンチウイルスベクター粒子の投与後のマウスにおける、T細胞の免疫学的反応を示すグラフである。(A)C57BL/6マウスは、OVAをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターの2つの用量(ng p24において示される)の1つで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるOVA257特異的CD8T細胞の数および機能は、MHC−l/ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、9日目に決定した。 (B)C57BL/6マウスは、用量範囲のOVAをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるOVA257特異的CD8T細胞のパーセンテージは、MHC−l/ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、11日目に決定した。 (C)C57BL/6マウスは、用量範囲のOVAをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるOVA257特異的CD8T細胞のパーセンテージは、細胞内サイトカイン染色によって、9日目に決定した。 例示的なレンチウイルスゲノムの図を提示する。図5Bは、3つのベクター構造のU3領域の配列を提示する。(A)すべてのレンチウイルスベクターに含まれる要素が、上部の例示的ベクターゲノムに示される。利用されるプロモーターは、ヒトユビキチン−Cプロモーター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターを含む。標準SIN U3領域に加えて、一連の拡大欠失が示される。3つのベクターのすべてからのU3領域の配列アラインメントは、(B)に示される。示される配列は、ポリプリン路(PPT)を含み、構造704において欠失し、拡大U3欠失は、703および704構造の両方に存在する。 例示的なレンチウイルスゲノムの図を提示する。図5Bは、3つのベクター構造のU3領域の配列を提示する。(A)すべてのレンチウイルスベクターに含まれる要素が、上部の例示的ベクターゲノムに示される。利用されるプロモーターは、ヒトユビキチン−Cプロモーター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターを含む。標準SIN U3領域に加えて、一連の拡大欠失が示される。3つのベクターのすべてからのU3領域の配列アラインメントは、(B)に示される。示される配列は、ポリプリン路(PPT)を含み、構造704において欠失し、拡大U3欠失は、703および704構造の両方に存在する。 図6A−6B。293T細胞の形質導入に続くレンチウイルスベクターからのGFP発現を示す。図6Aにおいて、GFPは、UbiCプロモーターに操作可能に結合され、図6Bにおいて、GFPは、CMVプロモーターに操作可能に結合された。GFP発現レベルは、DC−SIGNを発現する293T細胞の形質導入から48時間後に、インテグラーゼ不全レンチウイルスベクターから決定した。形質導入した細胞におけるGFP発現は、標準フローサイトメトリー方法によって決定し、各形質導入細胞プールから計50,000事象を回収して、平均発現レベルを決定した。 5継代中のGFP陽性細胞の数を示す。異なるベクター調製により細胞をトランスフェクトし、72時間毎に継代した。異なるNILV構成によりトランスフェクトした293T細胞培養において、相対GFP力価を決定した。野生型インテグラーゼ(IN+)またはD64V変異体インテグラーゼ(IN−)のいずれかを使用して、ベクターをパッケージ化し、それを使用して、DC−SIGNを発現する293細胞を形質導入した。次に、形質導入細胞培養を、72時間毎に15日間継代した。各継代において、培養中のGFP+細胞の数は、標準フローサイトメトリー法を使用して決定した。継代に伴うGFP発現の喪失は、経時的なベクターエピソームの喪失を示す。 組み込み(Intwt)または非組み込み(IntD64V)レンチウイルスベクターの投与に続くCD8T細胞反応を示す。C57BL/6マウスは、サル免疫不全ウイルス(SIV)からのGag抗原をコードする、組み込み(Intwt)または非組み込み(IntD64V)レンチウイルスベクターの2.5×1010個のゲノムで皮下的に免疫付与した。膵臓における抗原特異的T細胞の数およびそれらのサイトカイン分泌プロファイルは、細胞内サイトカイン染色によって、10日目に決定した。 媒体単独または腫瘍抗原をコードするウイルス粒子のいずれかを受容するマウスにおける腫瘍サイズ(左のグラフ)および生存率(右のグラフ)を示すグラフを提示する。BALB/cマウスに、2×10個のCT26結腸癌細胞を皮下的に注入した。1日後、媒体または3.2μg(p24カプシド)のAH1A5ペプチド(SPSYAYHQF、配列番号25)、修飾CT26 CD8T細胞エピトープをコードする、DC標的非組み込みレンチウイルスベクター(DC−NILV)のいずれかで皮下的に処置した。ワクチン接種したマウス対対照マウスの初期腫瘍成長および長期生存が表される。
本開示は、レンチウイルスベクター粒子(例えば、ビリオン、レンチウイルス粒子)を使用して、関心の配列をDCに送達するための、樹状細胞(DC)を標的とするための方法および組成物を提供する。レンチウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスE2に由来するエンベロープ糖タンパク質変異体と、関心の配列を含むゲノムと、随意に他の成分とを含む。糖タンパク質変異体は、HR、基準シンドビスウイルス株と比較して、ヘパラン硫酸への結合の減少を呈する。エンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。本明細書で使用する、感染を「促進する」とは、形質導入を促進することと同一であり、偽型レトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の標的細胞への受容体を介した侵入を促進または強化する際に、単独または他の分子と協調する、エンベロープ糖タンパク質の役割を指す。
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、1つ以上の、プラスミドベクター、および/または機能的ベクター粒子を生成するのに必要な成分を一緒にコードする、組み込み要素を含有する、細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、単一ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。ほとんどの場合、産生細胞クロモソームに安定して組み込まれる、複数のプラスミドベクターまたは個別の発現カセットを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝的成分を分離するが、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。一例示において、パッケージ化細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する1つ以上のプラスミドでトランスフェクトされ、LTR、cis作用性パッケージ化配列、関心の配列、ウイルス酵素的および構造的成分(例えばgagおよびpol)をコードする少なくとも1つのプラスミド、ならびにアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも1つのプラスミドを含む。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、通常、関心の配列を含有する2つのRNAゲノムと、樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む、コアを含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスE2糖タンパク質である場合、糖タンパク質は、基準株HRと比較して、ヘパラン硫酸への結合が減少するように操作される。これは、通常、HR E2糖タンパク質と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の変更を伴う。
理論に制約されることなく、細胞表面へのウイルス粒子の結合は、エンドサイトーシスを誘発し、ウイルスをエンドソームにもたらし、膜融合を引き起こして、ウイルスコアが細胞質に侵入するのを可能にすると考えられる。レンチウイルスベクター粒子を組み込むことを利用する、ある実施形態の場合、逆転写および産生物の核への移動に続いて、ウイルスのゲノムは、標的細胞ゲノムに組み込み、関心の配列を標的細胞のゲノムに組み込む。しかしながら、挿入突然変異の機会を減少させ、指定抗原の一時的発現を促進するために、他の実施形態は、標的細胞ゲノムに組み込まれないが、代わりに、関心の配列をエピソームから発現する、非組み込みレンチウイルスベクター粒子を利用する。いずれにしても、次に、感染したDCは、関心の配列、例えば、抗原、刺激分子を発現する。次に、抗原は、樹状細胞によって処理され、T細胞およびB細胞に提示され得、抗原特異的免疫反応を生じる。上述される特異的経路は、樹状細胞が抗原特異的免疫反応を刺激することができる限り、必要とされない。
予防または治療効果を提供するために、ウイルス粒子を被検体に投与することができる。関心の配列の産生物は、通常、疾患をもたらす薬剤または罹患した細胞(例えば、腫瘍細胞)の抗原である。樹状細胞の感染および産生物の発現に続いて、免疫反応が産生物に対してもたらされる。免疫反応は、体液性もしくは細胞性、または両方であってもよい。A.ウイルスベクターエンベロープ
節足動物媒介性ウイルス(アルボウイルス)は、蚊等の感染した節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、またはトリ等の宿主に伝播するウイルスである。アルボウイルスは、正極性の一本鎖RNAゲノムと、糖タンパク質含有エンベロープとを有する、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含む、ウイルスの亜科にさらに分割される。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、および西ナイルウイルスは、フラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の成員である(Wang et al.J.Virol.66,4992(1992))。シンドビスウイルスのエンベロープは、2つの膜貫通糖タンパク質を含み(Mukhopadhyay et al.Nature Rev.Microbio.3,13(2005))、E1は、融合に関与すると考えられ、E2は、細胞結合に関与すると考えられる。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。
上述されるように、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を使用して、レンチウイルス系ベクターゲノムを偽型化することができる。「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる、1つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾、変異、または操作されてもよい。
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込み、通常、2つの糖タンパク質、E1およびE2の複数の複製を含む。各糖タンパク質は、膜貫通領域を有し、E2は、約33残基細胞質ドメインを有するが、E1の細胞質尾部は、非常に短い(約2残基)。E1およびE2はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。E2は、最初に、フリンまたは他のCa2+依存セリンプロテイナーゼによって、E2および小糖タンパク質であるE3に開裂される、前駆体タンパク質として合成される。E2およびE1をコードする配列の間に、タンパク質をコードする配列である6Kが位置する。E3および6Kは、E2およびE1糖タンパク質をそれぞれ膜に移行させる働きをする、シグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域は、E3、E2、6K、およびE1をコードする配列を含む。本明細書で使用する、アルボウイルスの「エンベロープ」は、少なくともE2を含み、またE1、6K、およびE3を含んでもよい。シンドビスウイルス、HR株のエンベロープ糖タンパク質の例示的配列は、配列番号17として提示される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、GenBankにおいて認めることができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受入番号GQ252677(特にGenBankにおいて)およびNCBIにおけるウイルス変異データベース(GenBank受入番号およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列を参照することにより組み込まれる)において認めることができ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は、受入番号NP040824(エンベロープ糖タンパク質の配列を参照することによって組み込まれる)において認めることができる。
アルファウイルス、および特にシンドビスウイルスの樹状細胞上の細胞受容体は、これまで明らかに識別されていないが、1つの受容体は、DC−SIGNであると考えられる(Klimstra et al.,J Virol 77:12022,2003)。「付着」、「結合」、「標的」等の用語の使用は、同義的に用いられ、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分との間の相互作用の機序を示すことを意味しない(樹状細胞特異的ICAM−3(Intracellular Adhesion Molecules 3)−Grabbing Nonintegrin、CD209としても知られる)は、物質の急速結合およびエンドサイトーシスが可能なC型レクチン様受容体である(Geijtenbeek,T.B.,et al.Annu.Rev.Immunol.22:33−54,2004)。E2は、DC−SIGNを通して、樹状細胞に対してウイルスを標的とすると考えられる。本明細書に示されるように、DC−SIGNを発現する細胞は、DC−SIGNを発現しない同質遺伝子細胞よりも優れた(少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍優れた)シンドビスウイルスE2で偽型化されるウイルスベクター粒子によって形質導入される。E2糖タンパク質がウイルス感染を促進する機序は、場合によって、DC−SIGNに直接結合するか、または構造もしくは一部の他の機序を変更することによって、DC−SIGNに関与すると考えられる。実際の機序に関わらず、E2による標的は、DC−SIGNを発現する細胞、つまり樹状細胞に選択的である。
シンドビスウイルスは、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合すると考えられる(Klimstra et al.,J Virol 72:7357,1998、Burmes and Griffin,J Virol 72:7349,1998)。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンは、大部分の細胞型の表面に見られるため、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を減少させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させるか、またはシンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への結合を増加させる、例えば、活性を増加させるか、またはそれら両方によって達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現され得、かつエンベロープがDC−SIGNに特異的である場合でさえも起こり得る、他の分子への非特異的結合が減少し、向上した特異性が、望ましくない副作用、例えば、望ましい免疫反応を低減し得る副作用または他の細胞型の的外れな形質導入と関連付けられる副作用を回避する役割を果たし得る。DC−SIGNを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代替として、またはそれらに加えて、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質で偽型化したウイルス粒子は、VSVG等の糖タンパク質で偽型化したウイルス粒子を超える他の利点を提供し得る。そのような利点の例には、補体媒介性溶解の減少および/または神経細胞標的の減少が挙げられ、いずれもVSV−G偽型ウイルス粒子の投与と関連すると考えられる。
種々の例示において、レンチウイルスベクター粒子は、DC−SIGNを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少または抑止した。つまり、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質は、他の細胞型に対してDC−SIGNを発現する樹状細胞に選択的にウイルスを配向するように修飾されてもよい。特に構造研究および分子モデリングから得られる情報に基づいて、エンベロープタンパク質の変異体配列、特にE2およびE1糖タンパク質は、糖タンパク質がそれらのエンベロープタンパク質としての機能を維持しながら、望ましい結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように設計および生成される。各糖タンパク質に対する変異体配列の候補を作製し、下記の方法または本技術分野において知られている他の方法を使用して分析して、最も望ましい特性を有するエンベロープ糖タンパク質を識別してもよい。
シンドビスE2のある変異体配列は、配列番号1と比較して、残基160において少なくとも1つのアミノ酸の変更を有する。残基160は欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸に変更される。変更は、最も一般的に、少なくとも1つのアミノ酸の置換であるが、あるいは1つ以上のアミノ酸の追加または欠失であり得る。好ましくは、あらゆる追加アミノ酸は少数であり、安全性を低下させ得る抗原エピトープ(例えば、ヘマグルチニンタグ配列)を含まない。2つ以上の変更がある場合、それらはいずれも同一型(例えば、置換)または異なる型(例えば、置換および欠失)であり得る。複数の変更は、タンパク質配列において分散するか、または隣接して位置付けることができる。
第1の例において、変異体配列は、約残基50〜約残基180の領域に少なくとも1つのアミノ酸変更を含む。この領域内に、ヘパラン硫酸への結合に関与するアミノ酸が存在する。E2の正味正電荷を減少させることによって、ヘパラン硫酸との静電相互作用を減少させることができ、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。この領域内の正電荷アミノ酸の候補には、残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149、159におけるリシン、および残基65、92、128、137、157、170、172におけるアルギニンが挙げられる(Bear et al.,Virology 347:183−190,2006)。これらのアミノ酸の少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸へのE2結合において直接実装される。正味正電荷は、リシンもしくはアルギニンの欠失、またはリシンもしくはアルギニンを中性もしくは負電荷アミノ酸の置換によって減少させることができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンの1つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸と置換されてもよい。ある実施形態は、リシン70、76、または159の少なくとも1つの置換を有する。E2が、E3を有するポリタンパク質として発現される場合、天然E3/E2開裂部位に隣接して位置するリシンは維持される。つまり、認識配列および開裂部位は未変更である。あるいは、天然エンドペプチダーゼ開裂部位配列は、異なるエンドペプチダーゼの認識配列と置換される。
E2のある変異体はまた、樹状細胞への結合に良い影響を与える方法で修飾される。基準HR配列の残基160において認められるグルタミン酸の変更は、樹状細胞への結合を向上させることができる(その全体が組み込まれる、Gardner et al.,J
Virol 74,11849,2000を参照)。残基160の欠失または残基160の置換等の変更は、ある変異体において認められる。特定の変異体では、非荷電アミノ酸がGluに置換され、他の変異体では、非酸性アミノ酸がGluに置換される。通常、Glu160は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の1つと置換される。
他の変異体は、2つ以上のアミノ酸変更を含む。通常、これらの変異体において、変更の1つはGlu160であり、残りの変更は、残基約50〜約180に渡る領域内のリシンおよびアルギニンの1つ以上の変更である。ある変異体は、非酸性残基へのGlu160の変更または欠失、および非塩基性アミノ酸へのリシン70、リシン76、またはリシン159の1つ以上の変更を含む。いくつかの特定の変異体は、Glyに対してGlu160、Gluに対してLys70、およびGluに対してLys159;Glyに対してGlu160、Gluに対してLys70、76、および159;Glu160およびLys70の欠失およびGluに対する159;ならびにGlu160およびLys70、76の欠失、およびGluに対して159の変更を含む。
ある例において、E2タンパク質は、最初に、少なくともE3との融合またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。リーダー配列がE3であるか、または別の配列であるかに関わらず、ウイルスエンベロープのE2は、E3または他のリーダー配列を含んではならない。言い換えれば、E2は、好ましくは、E3/E2融合タンパク質ではない(例えば、SVGmuと呼ばれるE3/E2融合タンパク質)。ある実施形態において、E2は、E3−E2−6K−E1ポリタンパク質の一部として発現される。シンドビスウイルスは、自然に、E2をポリタンパク質の一部として発現し、E3/E2、E2/6K、および6K/E1の接合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および開裂される配列を有する。通常、E3/E2接合は、残基65〜66の間でフリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって開裂される。フリンは、2つのアミノ酸によって分離される、対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるE3/E2開裂を維持するために、残基62〜66(RSKRS、配列番号26)は、2つのアミノ酸分離を有する2つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持しなければならない。あるいは、E3/E2フリン開裂配列または他の開裂配列のいずれかの代わりに、異なる開裂配列を使用することができる。認識部位および開裂部位は、限定されないが、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(例えば、カテプシンD、キモシン、HIVプロテアーゼ)、システインエンドペプチダーゼ(ブロメライン、パパイン、カルパイン)、メタロエンドペプチダーゼ(例えば、コラーゲナーゼ、サーモリシン)、セリンエンドペプチダーゼ(例えば、キモトリプシン、IXa因子、X因子、トロンビン、トリプシン)、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼのために組み込むことができる。これらの酵素の認識および開裂部位配列は、よく知られている。
既述されるもの以外に、E2内のアミノ酸が変更されてもよい。一般に、変異体E2配列は、基準E2配列に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%の配列同一性を有してもよい。変異体糖タンパク質は、E2を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力等の生物学的機能を呈しなければならない。実験によって、ウイルス会合、細胞表面への付着、および感染の種々の態様において、重要な役割を有すると考えられる、エンベロープ糖タンパク質の領域が識別された。変異体を作製する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。E2の細胞質尾部−約残基408〜415は、ウイルス会合に重要である(その全体が組み込まれる、West et al.J Virol 80:4458−4468,2006)。他の領域は、二次構造の形成に関与し(約残基33〜53)、ならびに輸送およびタンパク質安定性に関与する(約残基86〜119)(その全体が組み込まれる、Navaratmarajah et al.,J Virol 363:124−147,2007)。変異体は、膜に広がる領域、約残基370〜380の疎水特性を維持してもよい。変異体は、N結合した糖鎖付加部位残基NIT(残基196〜198)およびNFT(残基318〜320)の1つまたは両方を維持してもよく、パルミトイル化される部位の1つ以上を維持してもよい(C−396、C416、およびC417)(組み込まれる、Strauss and Strauss Microbiol Rev 58,491〜562、1994;pp.499〜509)。一方、E2の多くの領域は、欠失事象なしに変更されてもよい。例えば、E2の多くの異なる位置におけるトランスポゾンの挿入は、依然として生存ウイルスをもたらす(Navaratmarajah、前記の個所)。
ある実施形態において、タグペプチドが、E3、6K、またはE1タンパク質に組み込まれてもよい。いくつかの目的で、タグは、E2に組み込まれてもよいが、タグは、ヒト患者に投与するための産生物での使用には望ましくない。短い配列である(例えば、5〜30アミノ酸)タグペプチドを使用して、ウイルス粒子内のエンベロープ発現およびその存在の検出を促進することができる。検出目的で、タグ配列は、通常、抗体または化学物質によって検出可能となる。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を促進することである。タグの結合パートナーを含有する物質を使用して、ウイルスを吸収することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを移動させる部分による処理によって達成することができ、またはタグ配列が開裂可能な配列と結合している場合には適切なエンドペプチダーゼによる処理は、便宜的にウイルスの放出を可能にする(例えば、Qiagenカタログ、Factor Xa Protease Systemを参照)。タグペプチドの除去は、一般に、動物被検体におけるウイルス粒子使用の安全目的で望ましい。タグが除去されない場合、タグに対する免疫反応が起こり得る。
適切なタグには、限定されないが、特に、その抗体が商業的に入手可能であるFLAG(DYKDDDDK)(その全体が組み込まれる、米国特許第4,703,004号)、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ポリ(His)(その全体が組み込まれる、米国特許第4,569,794号)、チオレドキシン、HA(ヘマグルチニン)−タグが挙げられる。ポリ(His)は、ニッケルまたはコバルト等の結合性金属イオンを含有する親和性媒体上に吸着し、低pH媒体で溶出することができる。
ウイルス粒子は、樹状細胞を標的とするウイルスに組み込まれる、エンベロープ糖タンパク質の特異性を決定するように評価されてもよい。例えば、骨髄細胞の混合群を被検体から取得し、インビトロで培養することができる。あるいは、DC−SIGNを発現するか、または発現しない同質遺伝子細胞株を取得して使用することができる。組み換えウイルスを、骨髄細胞の混合群または同質遺伝子細胞株に投与することができ、ウイルスに組み込まれるレポーター遺伝子の発現は、培養細胞において分析することができる。ある実施形態は、限界希釈分析を用いてもよく、細胞の混合群は、別々の部分に分けられ、次に、漸減量のウイルスで別々に培養される(例えば、各部分のウイルスは2倍、5倍、10倍少ない)。一部の実施形態において、混合細胞群中の感染細胞の少なくとも約50%、より好ましくは、少なくとも約60%、70%、80%、または90%、さらにより好ましくは、少なくとも約95%が、DC−SIGNを発現する樹状細胞である。ある実施形態において、感染した樹状細胞対感染した非樹状細胞(または非DC−SIGN発現細胞)の比は、少なくとも約2:1、少なくとも約3:1、少なくとも約4:1、少なくとも約5:1、少なくとも約6:1、少なくとも約7:1、少なくとも約8:1、少なくとも約9:1、少なくとも約10:1、少なくとも約20:1、少なくとも約30:1、少なくとも約40:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約200:1、少なくとも約500:1、少なくとも約1000:1、少なくとも約5000:1、少なくとも約10,000:1、またはそれ以上である。限界希釈の場合、通常、優れた選択性は、より高い希釈(すなわち、より少量の)ウイルス投入で見られる。
偽型ウイルス粒子の活性は、多様な手技のいずれかによって決定することができる。例えば、感染効率(IU、感染単位)を測定するための好適な方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノム内でコードされる産生物の発現を測定することによってである。分析することができるあらゆる産生物を使用してもよい。便宜的な種類の産生物の1つは、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光タンパク質である。GFPおよび分析は、実施例3等の実施例において例示される。使用することができる他の産生物には、細胞表面上で発現されるタンパク質(例えば、抗体結合による検出)、酵素等が挙げられる。産生物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性/活性は、免疫反応を決定することによって評価することができる。さらに、哺乳類における副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的とする能力は、例えば、以下に記載されるような細胞培養において直接試験することもできる。
ウイルス粒子を調製して、それらの選択性および/またはそれらが標的細胞膜の貫通を促進する能力に関して試験することもできる。未修飾糖タンパク質を有するエンベロープを有するウイルス粒子は、比較のための対照として使用することができる。つまり、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を、標準感染分析を使用して、ウイルスに感染させる。既定の時間が経過した後、例えば、感染から48時間後に細胞を採取することができ、例えば、フローサイトメトリーによって、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを決定することができる。選択性は、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを計算することによって、スコア化することができる。同様に、変異体エンベロープ糖タンパク質がウイルス力価に及ぼす影響は、変異体エンベロープを含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージを、対応する野生型(未修飾)エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージで割ることによって定量化することができる。特に適切な変異体は、選択性と感染力価との最良の組み合わせを有する。変異体が選択されると、ウイルス濃度分析を行って、これらのウイルスが、活性を低下させることなく濃縮され得ることを確認してもよい。ウイルスの上澄みを採取し、超遠心分離法によって濃縮する。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限界希釈およびエンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって決定することができ、上述されるように、ウイルスによって発現される産生物の発現を測定する。
レンチウイルスベクター粒子の標的細胞への侵入は、別の種類の活性評価である。BlaM−Vpr(βラクタマーゼVpr)融合タンパク質を利用して、HIV−1ウイルスの貫通、BlaMおよびシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、E1の融合が評価されており、E2/E1融合タンパク質を使用して、標的細胞への融合および貫通を促進することにおけるエンベロープタンパク質の有効性を評価することができる。ウイルス粒子は、例えば、パッケージ化細胞を、ウイルス要素BlaM−Vpr、および関心の変異体エンベロープ(ならびに必要に応じて親和性分子)で一時的にトランスフェクトすることによって調製されてもよい。得られるウイルスを使用して、結合の遊離阻害剤(例えば、抗体)の不在または存在下で、標的分子(または親和性分子)が特異的に結合する、分子を発現する細胞に感染することができる。次に、細胞をCO非依存培地で洗浄し、CCF2染料(Aurora Bioscience)を負荷する。室温で培養して、開裂反応を完了させた後、パラホルムアルデヒドによって細胞を固定し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡で分析することができる。青色細胞の存在は、ウイルスが細胞質中に貫通したことを示し、遮断抗体が添加される場合は、青色細胞が少なくなることが予想される(その全体が組み込まれる、Cavrois et al.Nat Biotechnol 20:1151−1154,2002)。
貫通が低pHに依存するか否かを調査するため、および所望のpH依存を有するエンベロープ糖タンパク質を識別するために、NHClまたはpHを変更する他の化合物を、感染ステップにおいて添加することができる(NHClは、エンドソームの酸性コンパートメントを中和する)。NHClの例において、青色細胞の消失は、ウイルスの貫通が低pH依存であることを示す。さらに、活性がpH依存であることを確認するために、リソソーム作用剤、例えば、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシン Al、モネンシン、ニゲリシン等を、培養緩衝液に添加してもよい。これらの薬剤は、エンドソームコンパートメント内のpHを上昇させる(例えば、Drose and Altendorf,J.Exp.Biol.200,1−8,1997)。これらの薬剤の阻害作用は、ウイルス融合および侵入に対するpHの役割を明らかにする。異なる融合分子を示すウイルス間の異なる侵入動態を比較し、特定の施用に対して最も適切なものが選択されてもよい。
PCR系侵入分析を利用して、逆転写を監視し、ウイルス侵入の動態を示すようなウイルスDNA合成の動態を測定することができる。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子は、293T細胞等の標的細胞、DC、またはエンベロープタンパク質分子の適切な結合パートナー(受容体)を発現するように操作されたか、または自然に発現する、あらゆる他の細胞と共に培養される。即時または(感染を起こすための)時間増分後のいずれかで、未結合ウイルスを除去し、細胞のアリコートをウイルス核酸に関して分析する。これらのアリコートからDNAを抽出して、一般に、半定量分析において、LTR特異的プライマーでプライムする増幅分析にかける。LTR特異的DNA産生物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
B.レンチウイルスベクターゲノム
ウイルスベクター粒子は、関心の配列を含むゲノムを含む。他の配列は、ゲノムがウイルス粒子にパッケージ化されるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入に続いて関心の配列の発現を促進する配列等を含んでもよい。ゲノムは、多量の適切な入手できるレンチウイルスゲノム系ベクターのいずれかに由来し得、ヒト遺伝子治療施用に対して識別されるもの、例えば、PfeiferおよびVermaによって説明されるものを含む(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Annu.Rev.Genomics
Hum.Genet.2:177−211,2001)。簡潔性の目的で、ゲノムは、「ウイルスベクターゲノム」または「ベクターゲノム」とも呼ばれる。
1.骨格
適切なレンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)、HIV−2、フェリン免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス(SIV)、およびマエディ/ビスナウイルスに基づくものを含む。レンチウイルスの望ましい特性は、それらが分裂および非分裂細胞の両方に感染することができることであり、標的細胞が分裂している(または標的細胞を刺激して分裂させる)必要はない。一般に、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、得られるウイルスベクター粒子が偽型化されるように、異なるウイルスに基づく。望ましくは、ベクターゲノムの安全機能が組み込まれる。安全性機能は、自己不活性化LTRおよび非組み込みゲノムを含む。例示的ベクターは、実施例5および図5においてさらに論じられ、そのようなベクターは、関心の抗原の発現のために、本発明の実施形態において使用されてもよい。
一部の例示的な実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、HIV−1ゲノムまたはSIVゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構成は、レンチウイルスの5’および3’LTRからの配列を含み、特に、レンチウイルスの5’LTRからのRおよびU5配列を含んでもよい。LTR配列は、あらゆる種からのあらゆるレンチウイルスからのLTR配列であってもよい。例えば、それらは、HIV、SIV、FIV、またはBIVからのLTR配列であってもよい。通常、LTR配列は、HIV LTR配列である。
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化3’LTRを含んでもよい(いずれもそれら全体が組み込まれる、Zufferey et al.J Virol 72:9873,1998、Miyoshi et al.,J Virol 72:8150,1998)。自己不活性化ベクターは、一般に、3’末端反復配列(LTR)からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、ベクター組み込み中に5’LTRに複製される。一例において、3’LTRのU3要素は、そのエンハンサー配列、TATAボックス、Sp1、およびNF−κB部位の欠失を含有する。自己不活性化3’LTRの結果として、侵入および逆転写に続いて生成されるプロウイルスは、不活性化5’LTRを含む。その論理的根拠は、ベクターゲノムの移動のリスク、およびLTRが付近の細胞プロモーターに及ぼす影響を減少させることによって、安全性を向上させることである。自己不活性化3’LTRは、本技術分野においてしられているあらゆる方法によって構成されてもよい。
随意に、レンチウイルス5’LTRからのU3配列は、ウイルス構成のプロモーター配列、例えば、異種プロモーター配列と置換されてもよい。これは、パッケージ化細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。エンハンサー配列が含まれてもよい。パッケージ化細胞株においてウイルスゲノムの発現を増加させる、あらゆるエンハンサー/プロモーターの組み合わせが使用されてもよい。一実施例において、CMVエンハンサー/プロモーター配列が使用される(それぞれその全体が組み込まれる、米国特許第5385839号および米国特許第5168062号)。
ある実施形態において、挿入突然変異のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムを組み込み不全となるように構成することによって最小化される。多様なアプローチを遂行して、非組み込みベクターゲノムを再生することができる。これらのアプローチは、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分への突然変異を操作することを含む。ベクターゲノム自体を修飾して、例えば、付着部位の一方または両方を変異もしくは欠失すること、または欠失もしくは修飾を通して3’LTR−近位ポリプリン区画(PPT)を非機能的にすることによって、組み込みを回避することができる。さらに、非遺伝的アプローチが使用可能であり、これらは、インテグラーゼの1つ以上の機能を阻害する薬剤を含む。アプローチは、相互排他的ではなく、つまり、それらの1つより多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的であり得るか、またはインテグラーゼおよびPPT部位が非機能的であり得るか、または付着部位およびPPT部位が非機能的であり得るか、またはそれらのすべてが非機能的であり得る。
上記のように、1つのアプローチは、非機能的インテグラーゼを作製および使用することである。インテグラーゼは、ウイルス二重鎖平滑末端DNAの開裂と、染色体標的部位の2つの鎖において、末端を5’リン酸塩に結合することに関与する。インテグラーゼは、亜鉛結合モチーフ(HHCC)を含有するN末端ドメイン、触媒コアおよび保存DD35Eモチーフ(HIV−1におけるD64、D116、E152)を含有する中央ドメインコア、およびDNA結合特性を有するC末端ドメインの3つの機能ドメインを有する。インテグラーゼに導入される点突然変異は、正常機能を崩壊させるのに十分である。多くのインテグラーゼ突然変異が構成および特性化された(すべてそれら全体が組み込まれる、Philpott and Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007、Apolonia,Thesis submitted to University College London,April 2009,pp,82−97、Engelman et al.J Virol 69:2729,1995、Nightingale et al.Mol Therapy,13:1121,2006を参照)。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を欠失または突然変異させて、好ましくは、逆転写酵素活性または核標的を著しく損なうことなく、タンパク質を不活性化することができ、それによって、プロウイルスの標的細胞ゲノムへの組み込みのみを回避する。許容される突然変異は、インテグラーゼ触媒、鎖移転、att部位への結合、宿主染色体DNAへの結合、および他の機能を低下させることができる。例えば、HIVまたはSIVインテグラーゼの残基35における、単一アスパラギン酸からアスパラギンへの置換は、ウイルスDNAの組み込みを完全に抑止する。インテグラーゼの欠失は、一般に、C末端ドメインに限定される。残基235〜288のコード配列の欠失は、有用な非機能的インテグラーゼをもたらす(Engelman et al.J Virol 69:2729,1995)。さらなる実施例として、突然変異、例えば、Asp64(残基数は、HIV−1に対して指定され、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼの対応する残基数は、当業者によって容易に決定され得る)(例えば、D64E、D64V)、Asp116(例えば、D116N)、Asn120(例えば、N120K)、Glu152、Gln148(例えば、Q148A)、Lys156、Lys159、Trp235(例えば、W235E)、Lys264(例えば、K264R)、Lys266(例えば、K266R)、Lys273(例えば、K273R)を生成することができる。他の突然変異を構成し、組み込み、導入遺伝子の発現、および他の望ましいパラメータに関して試験することができる。これらの機能に関する分析は、よく知られている。突然変異は、部位特異的突然変異誘発および核酸配列の化学合成を含む、多種の手技のいずれかによって生成することができる。1つの突然変異を作製してもよいか、またはこれらの突然変異の複数がインテグラーゼ内に存在することができる。例えば、インテグラーゼは、2つのアミノ酸、3つのアミノ酸、4つのアミノ酸等において、突然変異を有してもよい。
あるいは、またはインテグラーゼ変異体の使用と組み合わせて、U3およびU5内の付着部位(att)を突然変異させることもできる。インテグラーゼは、これらの部位に結合し、3’末端ジヌクレオチドは、ベクターゲノムの両端で開裂する。CAジヌクレオチドは、陥没した3’末端に位置付けられ、CAは、宿主染色体へのヌクレオチドブロック組み込みの突然変異を処理するために必要とされる。CAジヌクレオチドのAは、組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両端における突然変異は、最良の結果をもたらす(Brown et al J Virol 73:9011(1999)。一例示において、各末端のCAは、TGに変更される。他の例示において、各末端のCAは、一端においてTGに変更され、他端においてGTに変更される。他の例示において、各端のCAは欠失し、他の例示において、CAのAは各末端で欠失する。
組み込みは、ポリプリン区画(PPT)の変異または欠失によって阻害することもできる(その全体が組み込まれる、第WO2009/076524号)、3’LTRに近位に位置付けられる。PPTは、プラス鎖DNA合成のプライマー結合部位として機能することができる、約15ヌクレオチドのポリプリン配列である。この例において、PPTの突然変異または欠失は、逆転写プロセスを標的とする。機序にとらわれることなく、PPTを変異または欠失させることによって、線状DNAの産生は、根本的に減少し、本質的に1−LTR DNA環のみが産生される。組み込みは、線状二本鎖DNAベクターゲノムを必要とし、組み込みは、本質的にそれなしで排除される。上記のように、PPTは、変異または欠失によって非機能的にすることができる。通常、約15nt PPT全体が欠失されるが、一部の実施形態において、より短い14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、および2ntの欠失が作製されてもよい。変異が作製される場合、通常、複数の変異が、特にPPTの5’半分で作製されるが(McWilliams et al.,J Virol 77:11150,2003)、最初の4つの塩基における単一および二重変異は、依然として転写を減少させる。PPTの3’末端で作製される変異は、一般に、より劇的な効果を有する(Powell and Levin J Virol 70:5288,1996)。
ベクターゲノム非組み込みを作製するためのこれらの異なるアプローチは、個別または組み合わせて使用することができる。複数のアプローチを使用して、重複機構によって二重安全ベクターを構築してもよい。したがって、PPT変異または欠失は、att部位もしくは欠失、またはインテグラーゼ変異と組み合わせることができるか、またはPPT変異もしくは欠失は、att部位変異もしくは欠失およびインテグラーゼ変異の両方と組み合わせることができる。同様に、att部位変異または欠失およびインテグラーゼ変異は、相互に組み合わされるか、またはPPT変異もしくは欠失と組み合わされてもよい。
2.調節要素
本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムは、標的細胞において発現することが望ましい、関心の配列を含む。通常、関心の配列は、5’LTRと3’LTR配列との間に位置付けられる。さらに、関心の配列は、好ましくは、他の遺伝要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む、転写調節配列と機能的な関係にあり、特定の方法で関心の配列の発現を調節する。ある例において、有用な転写調節配列は、活性に関して、一時的かつ空間的に高度に調節されるものである。成分の発現を調節するために使用され得る発現制御要素は、本技術分野において知られており、これらに限定されないが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節要素を含む。
関心の配列およびあらゆる他の発現可能な配列は、通常、内部プロモーター/エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター/エンハンサーは、ウイルスベクター構成において、5’LTR配列と3’LTR配列との間に位置付けられるものであり、関心の配列に操作可能に結合される。内部プロモーター/エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている、あらゆるプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーの組み合わせであってもよい。「機能的関係」および「操作可能に結合される」は、制限なく、プロモーターおよび/またはエンハンサーが適切な分子と接触すると関心の配列が発現される、プロモーターおよび/またはエンハンサーに関して、配列が正しい位置および配向にあることを意味する。
内部プロモーター/エンハンサーの選択は、関心の配列の望ましい発現パターンおよび知られているプロモーター/エンハンサーの特定の特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性であってもよい。使用されてもよい構成的プロモーターの非限定例は、ユビキチンのプロモーター(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5510474号、第WO98/32869号)、CMV(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Thomsen et al.,PNAS 81:659,1984、米国特許第5168062号)、β−アクチン(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gunning et al.1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831−4835)、およびpgk(例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Adra et al.1987 Gene 60:65−74、Singer−Sam et al.1984 Gene 32:409−417、およびDobson et al.1982 Nucleic Acids Res.10:2635−2637を参照)を含む。
あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。一部の好適な実施形態において、プロモーターは、標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、CD11c、CD103、TLR、DC−SIGN、BDCA−3、DEC−205、DCIR2、マンノース受容体、Dectin−1、Clec9A、MHCクラスIIを含む、樹状細胞によって発現される、あらゆる産生物に由来し得る。さらに、プロモーターは、関心の配列の誘導性発現を可能にするように選択されてもよい。誘導性発現のための多数のシステムが本技術分野において知られており、テトラサイクリン応答システム、lacオペレーター−リプレッサーシステム、ならびに熱ショック、金属イオンを含む多様な環境変化または生理学的変化に応答するプロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素症、ステロイド、例えば、プロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えば、VEGFプロモーターが含まれる。プロモーターの組み合わせを使用して、関心の遺伝子の望ましい発現を得てもよい。当業者は、関心の有機体または標的細胞における遺伝子の望ましい発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。
ウイルスゲノムは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIまたはIII応答性プロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、関心の配列に操作可能に結合することができ、終結配列に結合することもできる。さらに、複数のRNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターを組み込んでもよい。RNAポリメラーゼIIおよびIIIプロモーターは、当業者によく知られている。RNAポリメラーゼIIIプロモーターの適切な範囲は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Paule and White,Nucleic Acids Research.,Vol.28,pp 1283−1298(2000)において見つけることができる。RNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターは、下流RNAコード配列を転写するようにRNAポリメラーゼIIまたはIIIを指示することができる、あらゆる合成または操作DNAフラグメントも含む。さらに、RNAポリメラーゼIIまたはIII(Pol IIまたはIII)プロモーター、またはウイルスベクターゲノムの一部として使用されるプロモーターは、誘導可能であり得る。あらゆる適切な誘導性Pol IIまたはIIIプロモーターは、本発明の方法とともに使用することができる。特に適したPol IIまたはIIIプロモーターは、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ohkawa and Taira,Human Gene Therapy,Vol.11,pp 577−585(2000)およびMeissner et al.Nucleic Acids Research,Vol.29,pp 1672−1682(2001)において提供される、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。
内部エンハンサーは、関心の遺伝子の発現を増加させるように、ウイルス構成に存在してもよい。例えば、CMVエンハンサー(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Boshart et al.Cell,41:521,1985)を使用してもよい。HIV、CMV等のウイルスゲノム、および哺乳類ゲノム中の多くのエンハンサーが識別および特性化された(GenBankを参照)。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者であれば、望ましい発現パターンに基づいて、適切なエンハンサーを選択することができる。
ウイルスベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、関心の配列に操作可能に結合されるプロモーター、ウイルス成分、および本明細書に論じられる他の配列を含有する。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写が起こるのを許可する、核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性、構成的、一時的に活性、または組織特異的であってもよい。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的要素の存在または不在によって誘導される。それらが操作可能に結合される遺伝子の発現を、生物体の発生、その製造のある段階において、または特定の組織において、オンオフすることができるため、誘導性プロモーターは、遺伝子操作において有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとしてグループ分けすることができる。通常、化学的に調節されるプロモーターは、これらに限定されないが、アルコール調節されるプロモーター(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI(alcA)遺伝子プロモーター)、テトラサイクリン調節されるプロモーター(例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター)、ステロイド調節されるプロモーター(例えば、ratグルココルチコイド受容体(GR)系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体(ER)系プロモーター、モスエクジソン受容体系プロモーター、およびステロイド/レチノイド/チロイド受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター)、金属調節されるプロモーター(例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター)、および原因関連プロモーター(例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病因関連(PR)タンパク質系プロモーター)を含む。通常、物理的に調節されるプロモーターには、これらに限定されないが、温度調節されるプロモーター(例えば、熱ショックプロモーター)、および光調節されるプロモーター(例えば、大豆SSUプロモーター)が含まれる。他の例示的プロモーターは、他の部分、例えば、2009年5月18日にアクセスされたPatent Lensウェブサイト上の″Promoters used to regulate gene expression″(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される。
当業者は、特定の状況に基づいて、適切なプロモーターを選択することができる。多くの異なるプロモーターは、プロモーターを発現される遺伝子に操作可能に結合するための方法であるとして、本技術分野においてよく知られている。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、パッケージ化細胞および標的細胞において発現させてもよい。しかしながら、異種プロモーターは、一般に、天然プロモーターと比較して、優れた転写および望ましいタンパク質の高い収率を許可するため、好適である。
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサルウイルス40(SV40)等のウイルスのゲノムから得てもよい。プロモーターは、例えば、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または通常、天然配列と関連付けられるプロモーターであってもよいが、但し、そのようなプロモーターは、標的細胞と適合する。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において自然発生するウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、CD11cプロモーターであり得る。
転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーは、通常、その転写を増加させるように、プロモーターに作用する、通常、約10〜300bp長のDNAのシス作用エレメントである。現在、哺乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン)および真核細胞ウイルスに由来する多くのエンハンサー配列が知られている。例には、複製起点の外側のSV40エンハンサー(bp 100〜270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の外側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対して5’または3’位でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから5’位に位置付けられる。
発現ベクターは、転写の終了およびmRNAの安定化に必要な配列を含有してもよい。これらの配列は、真核細胞またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合によっては3’の未翻訳領域において見つけられる場合が多く、本技術分野においてよく知られている。
ウイルスベクターゲノムは、追加の遺伝因子を含有してもよい。構成物に含まれてもよい因子の種類は、いかなる方法においても限定されず、特定の結果を達成するために選択されてもよい。例えば、標的細胞へのウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれてもよい。そのようなシグナルの例は、HIV−1フラップシグナルである。さらに、標的細胞内のプロウイルス組み込み部位の特性化を促進する因子が含まれてもよい。例えば、tRNAアンバーサプレッサーは、構成物に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロブリンからのインスレーター配列は、ウイルスゲノム構成物に含まれてもよい。この因子は、メチル化および異質染色質化の効果に起因して、標的細胞内で組み込みプロウイルスをサイレンシングする機会を減少させる。さらに、インスレーターは、染色体上の組み込み部位において、周囲のDNAからの正または負の位置効果から、内部エンハンサー、プロモーター、および外来遺伝子を遮断し得る。さらに、ベクターゲノムは、関心の遺伝子の発現を強化するように設計された1つ以上の遺伝因子を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答配列(WRE)が構成物に配置されてもよい(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Zufferey et al.1999.J.Virol.74:3668−3681、Deglon et al.2000.Hum.Gene Ther.11:179−190)。
ウイルスベクターゲノムは、通常、パッケージ化または産生細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構成される。プラスミドは、一般に、細菌中のプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、本技術分野においてよく知られている。さらに、複製の原核生物起源を含むベクターは、その発現が薬物耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬物耐性産生物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
本明細書に記載される成分の1つ以上を含有するプラスミドは、本技術分野においてよく知られる標準手技を使用して容易に構成される。構成されるプラスミドにおいて適切な配列を確認するための分析の場合、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって精製および分析される大腸菌、または従来方法によって決定されるそのDNA配列において複製されてもよい。
哺乳類細胞において一時的発現のために構成されるベクターを使用してもよい。一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製を蓄積するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴い、順に、発現ベクターにおいて、抗原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる、高レベルのポリペプチドを合成する。Sambrook et al.,上記、pp.16.17−16.22を参照されたい。ポリペプチドの発現に対する適合に適した他のベクターおよび方法は、本技術分野においてよく知られており、特定の状況に対して容易に適合される。
本明細書に提供される手技を使用して、当業者は、パッケージ化細胞を、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトし、適切な手技を使用して発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体を使用して発現を測定することによって、特定の発現系の有効性を試験することができることを認識するであろう。適切なレポーター遺伝子は、本技術分野においてよく知られている。
3.関心の配列の種類
関心の配列は、いかなる方法においても限定されず、当業者が標的細胞に組み込み、転写、および発現させることを望む、あらゆる核酸を含む。産生物は、タンパク質または核酸であり得る。関心の配列は、タンパク質またはsiRNA、ミクロRNA、相補領域が約20リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖RNA、またはメッセージRNAに相補的なRNAを含む、核酸分子をコードすることができ、メッセージRNAに対するこの相補(アンチセンス)RNAの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。一部の例において、関心の配列は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードすることができる。特に、腫瘍抗原およびHIV、HSV、HCV、HPV、マラリア、または結核等の病原体からの感染疾患抗原が望ましい。
ある例において、関心の配列は、分子の発現を下方調節する関心の低分子阻害RNA(siRNA)またはミクロRNA(miRNA)をコードする遺伝子であり得る。例えば、siRNAまたはミクロRNAをコードする遺伝子を使用して、樹状細胞の活性または変異を阻害するものを含む、細胞内の負の調節因子の発現を下方調節することができる。siRNAおよびミクロRNAは、本技術分野においてよく知られている(Fire et al.,Nature 391:806,1998、″The RNA Interference Resource″of Applied Biosystems,Trang et al.,Oncogene Suppl 2:S52,2008、Taganov,K.,et al.2007.Immunity 26:133−137、Dahlberg,J.E.and E.Lund.2007.Sci.STKE 387:pe25、Tiemann and Rossi,EMBO Mol Med 1:142,2009も参照されたい)。あるいは、関心の配列は、相補領域が約20リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖RNA、または約20リボヌクレオチド長よりも大きいアンチセンスRNAをコードすることができる。当業者であれば、siRNA、miRNA、dsRNA、およびアンチセンスRNA分子が、RNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現し得ること、あるいは、RNAポリメラーゼIIプロモーターから転写される、非コードRNAの成分であり得ることを理解するであろう。
さらに、関心の配列は、複数の産生物をコードしてもよい。一部の構成において、送達される配列は、少なくとも1つのタンパク質、少なくとも1つのsiRNA、少なくとも1つのミクロRNA、少なくとも1つのdsRNA、もしくは少なくとも1つのアンチセンスRNA分子をコードする複数の遺伝子、あるいはそれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。例えば、送達される配列は、それに対する免疫反応が所望される1つ以上の抗原をコードする、1つ以上の遺伝子を含むことができる。1つ以上の抗原は、単一の疾患または障害と関連付けることができるか、またはそれらは、複数の疾患および/または障害と関連付けることができる。一部の例において、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする遺伝子とともに含まれることができ、その組み合わせは、免疫反応を誘発し、所望の配向および規模に調節することができる。他の例において、siRNA、ミクロRNA、dsRNA,またはアンチセンスRNA分子をコードする配列は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする遺伝子とともに構成されることができ、その組み合わせは、免疫反応の範囲を調節することができる。産生物は、コード配列が1つのプロモーターと機能的関係にある、初期融合産生物として産生されてもよい。あるいは、産生物は、別々にコードされてもよく、各コード配列は、プロモーターと機能的関係にある。プロモーターは、同一であるか、または異なってもよい。
ある構成において、ベクターは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。例示的刺激分子には、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド(CD40L)、薬物誘導CD40(iCD40)等が挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、通常、樹状細胞内でコード配列を発現させる、1つ以上の調節因子の制御下にある。樹状細胞の成熟は、良好なワクチン接種に寄与する(Banchereau,J and Palucka,A.K.Nat.Rev.Immunol.5:296−306(2005)、Schuler,G.et al.Curr.Opin.Immunol.15:138−147(2003)、Figdor,C.G.et al.Nat.Med.10:475−480(2004))。成熟は、抗原捕捉に活発に関与する細胞からのDCを、T細胞プライミングに特化される細胞に変換することができる。例えば、CD40LによってCD40をCD4−ヘルパーT細胞に係合することは、DC成熟に重要なシグナルであり、CD8T細胞の強力な活性をもたらす。そのような刺激分子は、成熟因子または成熟刺激因子とも称される。免疫チェックポイントは、癌における機能的細胞性免疫の活性に対する重要な障壁を表し、CTLA4およびプログラム死−1(PD−1)を含む、T細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、クリニックにおいて評価されている標的薬剤の例である。慢性感染症および癌において重要な耐性機序は、高レベルのPD−1を発現するAg特異的T細胞の機能的消耗である。治療的免疫付与の有効性は、免疫チェックポイントの制御と組み合わせることによって著しく強化されることが示されたため、非限定例として、当業者であれば、免疫チェックポイントを阻害する代替アプローチが、プログラム死(PD)リガンド1および2(PD−L1/L2)の発現を阻害することであると理解することができる。阻害を達成するための一方法は、本明細書に記載されるもの等のRNA分子の発現によってであり、RNA分子の1つ以上をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたDCにおいて、PD−L1/L2の発現を抑制する。DCの成熟または免疫チェックポイント、例えば、PD−1リガンド等の特定因子の発現は、MHC II等の表面マーカーの上方調節のフローサイトメトリー分析、および発現したケモカインおよびサイトカインのプロファイルによって特性化することができる。
検出可能な産生物、通常、タンパク質をコードする配列を含まれることにより、所望の産生物を発現している細胞の識別を可能にすることができる。例えば、蛍光マーカータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)は、(例えば、抗原をコードする)関心の配列とともに構成物に組み込まれる。他の例において、タンパク質は、抗体によって検出可能であってもよいか、またはタンパク質は、検出可能な産生物を産出するように基質に作用する酵素であってもよく、トランスフェクトまたは形質導入した標的細胞の選択を可能にする、例えば、ヒグロマイシン耐性等の薬物耐性を付与する産生物であってもよい。典型的な選択遺伝子は、真核細胞での使用に適切な抗生物質または他の毒素、例えば、本技術分野において知られている中で、ネオマイシン、メトトレキセート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠陥を相補するか、または培地から抑制される重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択的マーカーは、別個のプラスミド上に随意に存在し、共トランスフェクションによって導入することができる。
パッケージ化細胞において所望のウイルスを産生するために必要な要素(例えば、関心の配列、エンベロープ分子、DC成熟因子)の2つ以上を含む、1つ以上の多シストロン発現単位を利用してもよい。多シストロンベクターは、必要とされる核酸分子の総数を減少させ、したがって、複数のベクターゲノムからの調和した発現と関連付けられる可能な困難を回避する。多シストロンベクターにおいて、発現される種々の要素は、1つ以上のプロモーター(および必要に応じて他の発現制御要素)に操作可能に結合される。一部の構成において、多シストロンベクターは、関心の配列、レポーター産生物をコードする配列、およびウイルス要素を含む。関心の配列は、通常、抗原および随意にDC成熟因子をコードする。時には、多シストロンベクターは、抗原をコードする遺伝子、DC成熟因子をコードする遺伝子、およびウイルス要素を含む。
多シストロン発現ベクターにおいて発現される各成分は、同一プロモーターから種々のタンパク質の別個の発現を可能にするように、例えば、内部リボソーム侵入部位(IRES)要素またはウイルス2A要素によって分離されてもよい。IRES要素および2A要素は、本技術分野において知られている(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,937,190号、de Felipe et al.2004.Traffic 5:616−626)。一実施形態において、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)、およびゾーシーアシグナウイルス(TaV)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Szymczak et al.2004.Nat.Biotechnol.22:589−594)からの2A様配列と結合される、フリン開裂部位配列(RAKR)をコードするオリゴヌクレオチド(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Fang et al.2005.Nat.Biotech 23:584−590)を使用して、多シストロンベクター内の遺伝要素を分離する。特定の多シストロンベクターの有効性は、標準プロトコルを使用して、各遺伝子の発現を検出することによって容易に試験することができる。
特定の例示において、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー/プロモーター配列、HIV 5’LTRからのRおよびU5配列、パッケージ化配列(Ψ)、HIV−1フラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、関心の遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス応答配列、tRNAアンバーサプレッサー配列、そのエンハンサー配列の欠失を有するU3要素、ニワトリβ−グロブリンインスレーター、ならびに3’HIV LTRのRおよびU5配列を含む。一部の例示において、ベクターゲノムは、正常なレンチウイルス5’LTRおよび自己不活性化3’LTRを含む(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Iwakuma et al.Virology 15:120,1999)。
ベクターゲノムの構成は、本技術分野において知られる、あらゆる適切な遺伝子操作技術を使用して達成することができ、制限なしに、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.(1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.)、Coffin et al.(Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1997))、および″RNA Viruses:A Practical Approach″(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000)に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、およびDNA配列決定の標準技術を含む。
4.ウイルス粒子の産生
本技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのRNA複製を含む、感染性レンチウイルス粒子を産生してもよい。1つの方法において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージ化するために必要な成分のすべてを含有するパッケージ化細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、1つ以上の関心の配列に加えて、ウイルス成分をコードする1つ以上の遺伝子含んでもよい。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージ化細胞株において別々に提供される。
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含有する、1つ以上のプラスミドベクターでトランスフェクトされる細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、それらは、単に一ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。多くの場合、複数のプラスミドベクターを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子成分を分離し、主に、そうでなければ複製可能なウイルスを生成し得る組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、必要に応じて、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。複数のプラスミドベクターを用いるシステムの一例として、細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する少なくとも1つのプラスミド(すなわち、ベクターゲノムプラスミド)でトランスフェクトされ、LTR、シス作用パッケージ化配列、および多くの場合、異種プロモーターに操作可能に結合される、関心の配列、ウイルス酵素的および構造的成分をコードする少なくとも1つのプラスミド(すなわち、GagおよびPol等の成分をコードする、パッケージ化プラスミド)、およびアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも1つのエンベローププラスミドを含む。追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載され、本技術分野において知られるようなRev発現プラスミドを使用して、レトロウイルス粒子産生を強化することができる。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、関心の配列を含むゲノムを含むコア、および樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスE2糖タンパク質である場合、糖タンパク質を操作して、基準HR株と比較して、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。
本発明のプラスミドベクターによるパッケージ化細胞のトランスフェクションは、よく知られている方法によって達成することができ、使用される方法は、いかなる方法においても限定されない。多数の非ウイルス送達システムは、本技術分野において知られており、例えば、エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質系送達システム、「裸の」DNAの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を使用する送達、例えば、Schatzlein AGに記載されるものが含まれる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2001.Non−Viral Vectors in Cancer Gene Therapy:Principles and Progresses.Anticancer Drugs)。通常、陽イオン性脂質または塩処理方法が用いられる。例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Grahamら(1973.Virol.52:456、Wiglerら(1979.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373−76)を参照されたい。リン酸カルシウム沈殿方法が最も頻繁に使用される。しかしながら、ベクターを細胞に導入するための他の方法を使用してもよく、核微量注入および細菌原形質融合を含む。
パッケージ化細胞株は、ウイルスゲノムRNAをレンチウイルスベクター粒子にパッケージ化するためのトランスにおいて必要な、ウイルス調節および構造的タンパク質を含む成分を提供する。パッケージ化細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することができる、あらゆる細胞株であってもよい。一部の適切なパッケージ化細胞株には、293(ATCC CCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL−10)、およびCf2Th(ATCC CRL 1430)細胞が挙げられる。パッケージ化細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。そのようなパッケージ化細胞株は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,218,181号に記載される。あるいは、パッケージ化細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、1つ以上の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸によって、一時的にトランスフェクトされてもよい。得られるウイルス粒子を回収し、標的細胞の感染に使用する。エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、通常、pcDNA3等の発現ベクター(Invitrogen、米国カリフォルニア州)にクローン化される。真核細胞発現ベクターは、本技術分野においてよく知られており、多数の商業的供給源から入手できる。次に293T細胞等のパッケージ化細胞を、関心の配列をコードする(通常、抗原をコードする)ウイルスベクターゲノム、ウイルスパッキング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、および標的分子の発現のためのベクターで共トランスフェクトする。エンベロープは、パッケージ化細胞の膜上に発現され、ウイルスベクターに組み込まれる。
1つのシナリオにおいて、本明細書に記載されるように、E2等のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を調製するために、1つ以上のベクターを使用して、ポリヌクレオチド配列をパッケージ化細胞株に導入する。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含む、ウイルスの種々の成分をコードするポリヌクレオチド配列、関心の配列(通常、抗原をコードする)、およびパッケージ化細胞によって提供されないウイルスを産生するために必要なあらゆる成分を含有することができる。
さらに他のシナリオにおいて、パッケージ化細胞は、抗原をコードするウイルスベクターゲノム、および1つ以上の追加のベクターで共トランスフェクトされる。例えば、抗原をコードするウイルスベクターに加えて、第2のベクターは、好ましくは、修飾した(変異体とも呼ばれる)シンドビスウイルスエンベロープをコードする遺伝子を担持する。一部の状況において、抗原をコードするウイルスベクターゲノムは、選択した免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列も含み、非限定例として、ケモカイン、サイトカイン、DC成熟因子、または免疫チェックポイント機序を調節する因子を含む。他の状況において、選択した免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列は、抗原をコードするウイルスベクターおよび1つ以上の追加ベクターによって、パッケージ化細胞に共トランスフェクトされる、第3のベクターに含有される。
ウイルスの産生は、本明細書に記載のとおり測定され、容量当たりのIUとして表現される。IUは、感染単位、あるいは形質導入単位(TU)であり、IUおよびTUは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的測定値として同義的に使用することができる。本明細書に記載されるように、ゲノムが容易に測定可能な産生物を発現することができる、ウイルスが産生される。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好適である。レンチウイルスベクターは、通常、非組み込みである。次に、ウイルスを標的細胞に投与し、例えば、フローサイトメトリーによって、GFPを発現する標的細胞の数を決定する(実施例3を参照)。次に、力価を計算する。力価は、可能な限り高いことが好ましいが、細胞上澄みの少なくとも1×10IU/mL、少なくとも3×10IU/mL、少なくとも1×10IU/mL、少なくとも3×10IU/mL、または少なくとも1×10IU/mLである(あらゆる濃縮前)。あるいは、力価は、VSV−Gエンベロープを有する同一細胞において偽型化された同一のレンチウイルスベクターの力価の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%である。
C.ウイルスの送達
ウイルスは、ウイルスが、関心のポリヌクレオチドの送達が所望される、標的樹状細胞(DC)と接触するのを可能にする、あらゆる方法で、標的細胞に送達されてもよい。時によって、適切な量のウイルスが、例えば、身体への注入を通して、ヒトまたは他の動物に直接(インビボ)導入される。適切な動物には、限定されないが、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、または他のトリが挙げられる。ウイルス粒子は、静脈内、皮内、皮下、結節内、腹腔内、または粘膜等の多数の経路によって注入されてもよい。ウイルスは、すべて参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,241,275号、第7,115,108号、第7,108,679号、第7,083,599号、第7,083,592号、第7,047,070号、第6,971,999号、第6,808,506号、第6,780,171号、第6,776,776号、第6,689,118号、第6,670,349号、第6,569,143号、第6,494,865号、第5,997,501号、第5,848,991号、第5,328,483号、第5,279,552号、第4,886,499号に開示されるデバイス等の皮下注入デバイスを使用して送達されてもよい。他の注入位置も適切であり、例えば、標的細胞を含む器官に直接注入される。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入、または骨髄内注入を使用して、ウイルスをリンパ節、脾臓、および骨髄にそれぞれ送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば、眼、口、または皮膚の上皮組織との直接接触を含む、他の手段を通して導入を行うことができる。
あるいは、標的細胞は、例えば、培養プレートにおいて、インビトロで提供され、ウイルスと接触される。標的細胞は、通常、健康な被検体または治療を必要とするか、もしくは抗原に対する免疫反応を刺激することが望ましい被検体から得られた樹状細胞を含む細胞群である。被検体から細胞を得る方法は、本技術分野においてよく知られており、静脈切開術、外科的切開、および生検が挙げられる。ヒトDCは、CD34α+ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の個所に記載されるようなインビトロ培養方法を使用することによって生成されてもよい(例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Banchereau et al.Cell 106,271−274(2001))。
ウイルスを培地中に懸濁し、培養プレート、管、または他の容器のウェルに添加してもよい。ウイルスを含有する培地は、細胞のプレーティング前、または細胞がプレーティングされた後に添加されてもよい。細胞は、通常、適量の培地中で培養して、生存能力を提供し、宿主細胞の形質導入が起こるように、培地中のウイルスの適切な濃度を可能する。細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染するのに十分な時間に、ウイルスで培養される。好ましくは、細胞は、少なくとも1時間、少なくとも5時間、または少なくとも10時間、ウイルスで培養される。
インビボおよびインビトロ送達の両方において、所望の標的細胞に感染するのに十分な数を含有するウイルス粒子のアリコートを使用してもよい。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、一般に、少なくとも1IU/μL、より好ましくは、少なくとも10IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも300IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、またはさらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μLである。
インビトロでのウイルス感染に続いて、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入(または再導入)することができる。細胞は、皮内、皮下、または末梢血流に導入することができる。動物に導入された細胞は、好ましくは、有害な免疫反応を回避するために、その動物に由来する細胞である。類似する免疫背景を有するドナーに由来する細胞を使用してもよい。使用することもできる他の細胞は、有害な免疫反応を回避するように設計されるものを含む。
標的細胞は、例えば、関心の配列または遺伝子の組み込み、転写、および/または発現、組み込まれる遺伝子の複製数、および組み込みの位置に関して分析されてもよい。そのような分析は、あらゆる時間に行われてもよく、かつ本技術分野において知られているあらゆる方法によって行われてもよい。
ウイルスまたはウイルス感染した樹状細胞が投与される被検体は、感染細胞の位置、ウイルス送達されたポリヌクレオチドまたは関心の遺伝子の発現、免疫反応の刺激に関して分析し、本技術分野において知られているあらゆる方法によって、疾患または障害と関連付けられる症状を監視することができる。
上に開示される細胞に感染する方法は、細胞の個別の特異的特性に依存しない。結果として、それらは、多様な動物種に容易に拡大される。一部の例において、ウイルス粒子は、ヒトまたはヒト樹状細胞に送達され、他の例において、それらは、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはマウス、またはトリ等の動物に送達される。本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムを偽型化して、広範な宿主範囲ならびに標的細胞の特異性を付与する。当業者であれば、特定の動物種において関心の配列の望ましい発現を達成するために適切な内部プロモーターおよび他の要素にも気付くであろう。したがって、当業者であれば、あらゆる種からの樹状細胞に感染する方法を修飾することができる。
D.治療的および予防的免疫付与
樹状細胞は、疾患または障害の予防または治療のための、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクター粒子、特に、患者における免疫反応の活性化が有益となるものに感染させてもよい。多くのそのような疾患は、よく知られている。例えば、本発明の方法による治療または予防の影響を受けやすい疾患または障害には、限定されないが、癌、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、および寄生感染を含む感染が挙げられる。他の方法において、疾患は、関心の配列を樹状細胞に送達するために、本明細書に記載されるウイルス粒子によって治療され、関心の配列の発現は、疾患特異的抗原を産生し、抗原特異的細胞免疫反応および体液性免疫反応の刺激をもたらす。一般に、関心の配列は、それに対して免疫反応が所望される抗原をコードするが、通常は、樹状細胞において発現されない。抗原は、樹状細胞によって発現および提示される。ウイルスベクターゲノムは、DC成熟因子をさらにコードしてもよい。
典型的な用途において、ウイルス粒子は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする配列を樹状細胞に送達する。樹状細胞をウイルスとインビトロで接触させることによって、送達が達成され得、感染した樹状細胞が患者に提供される。またある時には、樹状細胞にインビボで感染させるために、ウイルスを被検体に送達することによって、送達が達成され得る。次に、樹状細胞は、患者において抗原特異的T細胞またはB細胞を刺激し、発現した抗原に対する細胞性および体液性免疫反応を誘導する。そのような方法において、疾患または障害を患う患者は、所望の特異性を有する免疫細胞を生成することによって治療される。
疾患または障害と関連付けられるあらゆる抗原は、本明細書に記載されるように、ウイルス粒子を使用して樹状細胞に送達することができる。疾患または障害と関連付けられる抗原は、樹状細胞を標的とするウイルス粒子の調製のために識別される。多くの疾患および障害と関連付けられる抗原は、本技術分野においてよく知られている。抗原は、疾患または障害と関連付けられることが前もって知られ得るか、または本技術分野において知られているあらゆる方法によって識別されてもよい。例えば、患者が罹患している癌種に対する抗原、例えば、腫瘍関連抗原が知られ得るか、または本技術分野において知られている多様な方法のいずれかによって、腫瘍自体から識別されてもよい。
腫瘍関連抗原は、例えば、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、および乳癌を含む、多様な癌に関して知られている。一部の乳癌において、例えば、Her−2受容体は、癌細胞の表面上で過剰発現される。例示的な腫瘍抗原には、これらに限定されないが、MAGE、BAGE、RAGE、およびNY−ESO−1が挙げられ、睾丸の免疫特権領域において、および未変異抗原である、系統特異的腫瘍抗原、例えば、メラニン細胞−黒色腫系統抗原MART−1/Melan−A、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌−5T4、SM22−α、炭酸脱水酵素IおよびIX(G250としても知られる)、低酸素誘導因子(例えば、HIF−1αおよびHIF−2α)、VEGFまたは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、および前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1(これらは同一組織に由来する正常および新生細胞において発現される抗原である);正常細胞と比較して、腫瘍細胞において変異される遺伝子、または腫瘍において異なるレベルで転写される遺伝子に由来するエピトープ/ペプチド、例えばテロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型または野生型p53、サイトクロームP450 1B1、および異常発現したイントロン配列、例えば、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V;骨髄腫およびB−細胞リンパ腫において固有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再構成;腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープタンパク質/ペプチド、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6およびE7、腫瘍選択的発現を有する非変異腫瘍胎児タンパク質、例えば、癌胎児性抗原およびα−フェトタンパク質等の多様な腫瘍細胞において発現される。多数の腫瘍関連抗原が検討された(例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、″Tumor−Antigens Recognized By T−Lymphocytes,″Boon T,Cerottini J C,Vandeneynde B,Vanderbruggen P,Vanpel A,Annual Review Of Immunology 12:337−365,1994、″A listing of human tumor antigens recognized by T cells,″Renkvist N,Castelli C,Robbins P F,Parmiani G.Cancer Immunology Immunotherapy 50:(1)3−15 MAR 2001を参照)。
抗原は、感染疾患、例えば、HIV/AIDS等と関連付けられる抗原でもあり得る。抗原は、例えば、gp120であり得る(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Klimstra,W.B.,et al.2003.J Virol 77:12022−12032、Bernard,K.A.,et al.2000.Virology 276:93−103、Byrnes,A.P.,et al.1998.J Virol 72:7349−7356)。他の例示的抗原には、これらに限定されないが、gag、pol、env、tat、nef、およびrevが挙げられる(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lieberman,J.et al.1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13(5):383−392、Menendez−Arias,L.et al.1998.Viral Immunol 11(4):167−181)。
ウイルス抗原の例には、これらに限定されないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド(例えば、カリシウイルスカプシド抗原)、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス(AE)ポリペプチド(例えば、B型肝炎コアまたは表面抗原、またはC型肝炎ウイルスE1もしくはE2糖タンパク質、コア、または非構造的タンパク質)、ヘルペスウイルスポリペプチド(例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質)、免疫不全ウイルスポリペプチド(例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ)、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド(例えば、A型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはヌクレオタンパク質)、白血病ウイルスポリペプチド、マルバーグウイルスポリペプチド、またはオルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド(例えば、ヘマグルチニン/ノイラミニダーゼ)、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド(例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド)、ポックスウイルスポリペプチド(例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド)、狂犬病ウイルスポリペプチド(例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質G)、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。
細菌抗原の例には、これらに限定されないが、アクチノミセスポリペプチド、バシルスポリペプチド、バクテロイドポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド(例えば、B.ライム病OspA)、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コキシエラポリペプチド、ダーマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド(例えば、H.インフルエンザ型b外膜タンパク質)、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、L型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、スタフィロコッカスポリペプチド、ストレプトコッカスポリペプチド(例えば、S.ピロゲンMタンパク質)トレポネマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド(例えば、Y.ペスティスF1)およびV抗原が挙げられる。
真菌抗原の例には、これらに限定されないが、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、パシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コッキジオイドポリペプチド、コニジオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィラロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドが挙げられる。
プロトゾア寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エンタモエバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチド(例えば、P.熱帯性サーカムスポロゾイト(PfCSP)、種虫表面タンパク質2(PfSSP2)、肝臓状態抗原1のカルボキシル末端(PfLSA1 c−term)、および輸出タンパク質1(PfExp−1)、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられる。
蠕虫寄生抗原の例には、これらに限定されないが、アカントケイロネマポリペプチド、ネコ円虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、大口腸線虫ポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィムポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボツリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイドポリペプチド、ヘモンカスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、血色食道虫ポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイドポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリクリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびバンクロフト糸状虫ポリペプチドが挙げられる。
外部寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、ノミからのポリペプチド(保護抗原ならびにアレルゲンを含む);カタダニおよび軟ダニを含むダニ;ハエ(例えば、小昆虫、蚊、サシチョウバエ、クロバエ、ウシアブ、ノサシバエ、シカバエ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ症をもたらすハエ、およびヌカカ);アリ;クモ;シラミ;ダニ;および半翅類の昆虫(例えば、トコジラミおよびサシガメ)が挙げられる。
抗原が識別および選択されると、所望の抗原をコードする配列が識別される。好ましくは、配列は、cDNAを含む。ウイルス感染に続いて、関心の配列(例えば、抗原をコードするもの)は、標的樹状細胞によって発現される。エクスビボで接触されると、次に、標的樹状細胞は、例えば、注入によって患者に戻され、それらは、所望の抗原に対して免疫反応を生成することができる、免疫細胞と相互作用する。好適な実施形態において、組み換えウイルスは、患者に注入されて、標的樹状細胞を原位置で形質導入する。次に、樹状細胞は、治療される疾患または障害と関連付けられる特定の抗原を発現し、患者は、疾患または障害に対して有効な免疫反応を開始することができる。
ウイルスベクターゲノムは、複数の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有してもよく、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対して免疫反応を生成する。一部の実施形態において、抗原は、単一疾患または障害に関連する。他の実施形態において、抗原は、複数の疾患または障害に関連する。
ウイルスの一部において、DCの成熟を活性化および/または刺激するDC成熟因子は、関心の配列と併せて送達される。代替例において、DCは、ウイルスの送達前、ウイルスの送達と同時、またはウイルスの送達後に、DC成熟因子の送達によって活性化される。DC成熟因子は、ウイルスの投与とは別に提供されてもよい。
本明細書に記載されるように、1つ以上の免疫調節またはDC成熟因子は、ウイルスゲノムに含有され、ウイルスが樹状細胞に感染した後に発現される、1つ以上の配列によってコードすることができる。免疫調節因子をコードする配列は、パッケージ化細胞株において1つ以上の抗原をコードするウイルスベクターで共トランスフェクトされる、個別のベクターにおいて提供することもできる。
本明細書に記載される方法は、患者における養子免疫療法に使用することができる。上述されるように、免疫反応が所望される抗原が識別される。所望の抗原をコードするポリヌクレオチドが得られ、組み換えウイルスにパッケージ化される。標的樹状細胞は、患者から採取し、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えウイルスで形質導入される。次に、樹状細胞を患者に戻す。
ウイルス粒子は、インビボで注入されてもよく、それらは、DCに感染し、通常、抗原をコードする、関心の配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも3×10IUであり、少なくとも1×10IU、少なくとも3×10IU、少なくとも1×10IU、少なくとも3×10IU、少なくとも1×10IU、または少なくとも3×10IUであり得る。選択した間隔で、受容体のリンパ器官からDCを使用して、マーカー発現、例えば、GFPまたはルシフェラーゼを観察することによって、発現を測定してもよい。核酸モニタリング技術および逆転写(RT)活性の測定値を使用して、ウイルス粒子の生体内分布を分析することもできる。末梢血単核細胞からのT細胞、リンパ節、またはレンチウイルスベクター粒子で治療した受容体の悪性もしくは標的病因に感染した組織は、抗原刺激に対する反応の規模および期間から測定されてもよい。上皮細胞およびリンパ細胞等のDC以外の組織細胞は、インビボ遺伝子送達の特異性に関して分析されてもよい。
AIDSの流行(および他のウイルス疾患)を終結させるための最も有効な潜在的方法は、有効な予防ワクチンであることが広く同意される。これまで、HIVに対するワクチン接種方法は、第3相試験を良好に通過していない。したがって、新規の有効なワクチン接種戦略が緊急に必要とされる。1つの戦略は、DCのワクチン接種である。この実装において、上述されるもの等のウイルスタンパク質をコードする配列は、ウイルスベクターにクローン化される。患者を、本明細書に記載されるように構成されたウイルスに感染させる。動物モデルにおいて、分子クローン化したHIVレポーターウイルス(NFNSZ−r−HSAS、NL−r−HSAS)および臨床単離体を使用し、尾静脈注射によって動物に曝露してもよい。感染の証拠は、脾細胞、リンパ節、および末梢血において経時的に監視されてもよい。レポーターウイルスにおけるHIV−gagタンパク質のPCR増幅およびHASのフローサイトメトリーを使用して、ウイルスの組み込みおよび複製を試験してもよい。生産的原位置DCワクチン接種は、HIV曝露に対する耐性を増加させ得る。
ワクチンは、アジュバントを含む場合が多い。本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントは、組み換えウイルス粒子とともに、組み換えウイルス粒子の前、または組み換えウイルス粒子の後に投与されてもよい。ウイルス粒子とともに投与される場合、望ましいアジュバントは、ウイルス粒子の完全性を著しく崩壊させない(例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を崩壊させない)。
多様なアジュバントをウイルスと組み合わせて使用して、ウイルスベクターゲノムにおいてコードされる抗原に対する免疫反応を引き起こすことができる。好適なアジュバントは、反応の定量形態に影響する抗原において構造変化をもたらすことなく、抗原に対する固有反応を増補する。好適なアジュバントは、alum、3De−O−アシル化モノリン酸化脂質A(MPL)を含む(英国特許第GB2220211号を参照)。QS21は、南アフリカで見られるQuillaja Saponaria Molinaという木の枝から単離されたトリテルペン配糖体またはサポニンである(Kensil et al.,in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell and Newman,Plenum Press,NY,1995、米国特許第5,057,540号を参照)。他のアジュバントは、モノリン酸化脂質A等の免疫刺激剤と随意に組み合わせて、水中油エマルション(例えば、スクアランまたはピーナッツ油)である(Stoute et al.,N.Engl.J.Med.336,86−91(1997))。別のアジュバントはCpGである(Bioworld Today,Nov.15,1998を参照)。あるいは、Aβをアジュバントに結合することができる。例えば、Aβのリポペプチド版は、B型肝炎抗原ワクチン接種に関して記載されるように、パルミチン酸または他の脂質をAβのN末端に直接結合することによって調製することができる(Livingston,J.Immunol.159,1383−1392(1997))。しかしながら、そのような結合は、それに対する免疫反応の性質に影響するように、Aβの構造を実質的に変更してはならない。アジュバントは、活性成分を有する治療組成物の成分として投与することができるか、または治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に個別に投与することができる。
一群のアジュバントは、アルミニウム塩(alum)、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等である。そのようなアジュバントは、MPLまたは3−DMP、QS21、ポリマーまたは単量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシン等の他の特定の免疫刺激剤の有無に関わらず使用することができる。別の群のアジュバントは、水中油エマルション製剤である。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド(例えば、N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)、N−アセチルグルクサミニル−N−アセチルムラミル−L−AI−D−イソグル−L−アラ――ジパルミトキシプロピルアミド(DTP−DPP)テラミド(商標)、または他の細菌細胞壁成分の有無に関わらず使用することができる。水中油エマルションは、(a)Model 110Y ミクロ流動化剤(Microfluidics(マサチューセッツ州ニュートン))等のミクロ流動化剤を使用してサブミクロン粒子に製剤された、5% スクアレン、0.5% Tween80、および0.5% Span85を含有する(随意に様々な量のMTP−PEを含有する)、MF59(国際公開第WO90/14837号)、(b)いずれもサブミクロンエマルションにミクロ流動化されるか、または粒径の大きいエマルションを生成するようにボルテックスされる、10% スクアラン、0.4% Tween80、5% プルロン遮断したポリマー L121、およびthr−MDPを含有する、SAF、および(c)2% スクアレン、0.2% Tween80、ならびにモノリン脂質A(MPL)、トレハロースジミコール酸(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくは、MPL+CWS(Detox(商標))からなる基からの1つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ribiアジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem(モンタナ州ハミルトン)。別の群の好適なアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Stimulon(商標)(QS21、Aquila(マサチューセッツ州ウースター)、またはISCOM(免疫刺激複合体)およびISCOMATRIX等からそこで生成される粒子である。他のアジュバントは、完全フロインドアジュバント(CFA)および不完全フロインドアジュバント(IFA)を含む。他のアジュバントは、サイトカイン、例えば、インターロイキン(IL−1、IL−2、およびIL−12)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)を含む。
本明細書の組成物と併用することができる別のアジュバントは、化学式(I)によって識別され、
式中、A1およびA2部分は、水素、リン酸、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分R、R、R、R、R、およびRは、3〜23個の炭素を有する、C−C23と表されるヒドロカルビルの群から独立して選択される。さらなる明確さのために、ある部分が複数の成員を有する特定の群「から独立して選択される」場合、第1の部分に選択された成員は、第2の部分に選択された成員の選択を、いかなる方法においても影響または制限しないことを理解すべきであると説明される。R、R、R、およびRが結合する炭素原子は、非対称であり、したがって、RまたはS立体化学のいずれかで存在してもよい。一実施形態において、それらの炭素原子のすべては、R立体化学であるが、別の実施形態において、それらの炭素原子のすべては、S立体化学である。
「ヒドロカルビル」は、水素および炭素から全体的に形成される化学部分を指し、炭素原子の配置は、直鎖または分岐、非環状または環状であってもよく、隣接する炭素原子間の結合は、全体的に単一結合であってもよく、すなわち、飽和ヒドロカルビルを提供するか、またはあらゆる2つの隣接する炭素原子間に、二重結合または三重結合が存在してもよく、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し、ヒドロカルビル基内の炭素原子の数は、3〜24個の炭素原子の間である。ヒドロカルビルは、アルキルであってもよく、代表的な直鎖アルキルは、メチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル等を含み、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、分岐アルキルは、イソプロピル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソペンチル等を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含むが、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも1つの二重または三重結合を含有する(ヒドロカルビルが非環状である場合は、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と称され、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合は、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと称される)。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、1−ブテニル、2−ブテニル、イソブチレニル、1−ペンテニル、2−ペンテニル、3−メチル−1−ブテニル、2−メチル−2−ブテニル、2,3−ジメチル−2−ブテニル等が挙げられるが、代表的な直鎖および分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、1−ブチニル、2−ブチニル、1−ペンチニル、2−ペンチニル、3−メチル−1−ブチニル等が挙げられる。
式(I)のアジュバントは、本技術分野において知られている合成方法によって得られてもよく、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、PCT国際公開第WO2009/035528号、ならびにそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる、WO2009/035528号において識別される出版物を参照されたい。あるアジュバントは、商業的に得られてもよい。好適なアジュバントは、Avanti Polar Lipids(アラバマ州アラバスター)のカタログで識別されるような製品番号699800であり、以下のE1をE10と組み合わせて参照されたい。
本発明の種々の実施形態において、アジュバントは、式(I)の化学構造を有するが、部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、これらの部分に対して以前に提供された選択肢のサブセットから選択され、これらのサブセットは、以下でE1、E2等と識別される。
E1:Aはリン酸またはリン酸塩であり、Aは水素である。
E2:R、R、R、およびRは、C−C21アルキルであり、RおよびRは、C−C23ヒドロカルビルである。
E3:R、R、R、およびRは、C−C17アルキルであり、RおよびRは、C−C19ヒドロカルビルである。
E4:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C−C17ヒドロカルビルである。
E5:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C11−C15ヒドロカルビルである。
E6:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C11−C17ヒドロカルビルである。
E7:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C−C15ヒドロカルビルである。
E8:R、R、R、およびRは、C11−C20アルキルであり、RおよびRは、C12−C20ヒドロカルビルである。
E9:R、R、R、およびRは、C11アルキルであり、RおよびRは、C13ヒドロカルビルである。
E10:R、R、R、およびRは、ウンデシルであり、RおよびRは、トリデシルである。
ある選択肢において、E2〜E10のそれぞれは、実施形態E1と組み合わされ、および/またはE2〜E9のヒドロカルビル基は、アルキル基であり、好ましくは、直鎖アルキル基である。
式(I)のアジュバントは、随意に共アジュバントとともに、薬学的組成物に製剤されてもよく、それぞれ以下に論じられるとおりである。この点において、例えば、GLAアジュバントの水性製剤(AF)および安定したエマルション製剤(SE)製剤を提供する、米国特許公開第2008/0131466号が参照され、これらの製剤は、式(I)のアジュバントのいずれかに利用されてもよい。
アジュバントは、単一組成物として本発明のウイルスとともに投与することができるか、または本発明の組み換えウイルスの投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、同一バイアルにパッケージ化して供給することができるか、または個別のバイアルにパッケージ化して使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、通常、意図される治療施用を示すラベルとともにパッケージ化される。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージ化される場合、パッケージ化は、通常、使用前に混合するための説明書を含む。アジュバントおよび/または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種のアジュバントの有用性に依存し、ヒトにおいて、薬学的に許容されるアジュバントは、認可されたものであるか、または関連規制機関によってヒトへの投与が承認される。例えば、完全フロインドアジュバントは、ヒト投与に適切ではない。Alum、MPL、およびQS21は好適である。随意に、2つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができ、例えば、alumとMPL、alumとQS21、MPLとQS21、およびalum、QS21とMPLを一緒に使用することができる。不完全フロインドのアジュバントは、随意にalum、QS21、およびMPL、ならびにそれらのすべての組み合わせと併せて、使用することができる(Chang et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 32,173−186(1998))。
E.薬学的組成物およびキット
本明細書に提供されるウイルス、および1つ以上の成分を含有する、薬学的組成物およびキットもまた本明細書において考慮される。薬学的組成物は、本明細書に提供されるようなウイルスベクター粒子、および薬学的担体を含むことができる。キットには、本明細書に提供される薬学的組成物および/または組み合わせ、ならびに1つ以上の成分、例えば、使用に関する説明書、化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むことができる。
本明細書に提供されるようなウイルス粒子を含有する薬学的組成物、および適切な薬学的担体が本明細書において提供される。本明細書に提供される薬学的組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、含水、または凍結乾燥形態であり得る。適切な薬学的担体の例は、本技術分野において知られている。そのような担体および/または添加剤は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被検体に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート化剤等の安定化剤は、体内の分解から組成物を保存することができる。
本明細書に提供されるウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、使用に関する説明書、デバイス、および追加の試薬等の1つ以上の成分、ならびに方法を実践するための管、容器、およびシリンジ等の成分随意に含むことができる。例示的なキットには、本明細書に提供されるウイルスを含むことができ、使用に関する説明書、被検体内のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを随意に含むことができる。
関心の遺伝子(通常、抗原)をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本明細書において考慮される。キットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、およびシンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクターを含んでもよい。一部のキットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも1つのDC成熟因子をコードするベクターを含有する。
関心の配列(通常、抗原)をコードするウイルスベクター、および随意にDC成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において考慮される。一部のキットにおいて、キットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも1つのプラスミドおよびシンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。
キットは、説明書を含んでもよい。説明書は、通常、ウイルスを説明する具体的な表現、および随意に、キットに含まれる他の成分、およびウイルスを投与するための被検体の適切な状態、適切な投与量、および適切な投与方法を含む、投与の方法を含む。説明書は、治療期間に渡って被検体をモニタリングするためのガイダンスを含むこともできる。
本明細書に提供されるキットは、ウイルスを被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤またはワクチンを投与するための本技術分野において知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的デバイスには、これらに限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられる。通常、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに適合し、例えば、高圧注入デバイス等の無針注入デバイスを、高圧注入によって損傷されないウイルスとともに、キットに含めることができるが、通常、高圧注入によって損傷されるウイルスとともに、キットに含まれない。
本明細書に提供されるキットは、DC活性剤または刺激剤等の化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤を被検体に投与するための本技術分野において知られる多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的なデバイスには、これらに限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイスが挙げられ、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられる。通常、化合物をキットに投与するためのデバイスは、化合物の投与に関する望ましい方法に適合する。
以下の実施例は、例証の目的で提供され、限定を目的としない。
実施例1
シンドビスウイルスエンベロープ変異体の操作
シンドビスウイルス(SV)−アルファウイルス属およびトガウイルス科の成員−は、恐らくDC−SIGNを通して、DCに感染することができる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Klimstra,W.B.,et al.2003.J.Virol.77:12022−12032)。しかしながら、SVの研究室株の正準ウイルス受容体は、細胞表面ヘパラン硫酸(HS)であり、多くの細胞型で認められる(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Strauss,J.H.,et al.1994.Arch.Virol.9:473−484、Byrnes,A.P.,and D.E.Griffin.1998.J.Virol.72:7349−7356)。ヘパラン硫酸結合を減少させるために、変異体E2エンベロープ(SVGmuと呼ばれる)がWangらによって構築された(その全体が組み込まれる、米国特許第2008/0019998号)。それらの戦略の一部は、E3/E2前駆タンパク質結合において4つのアミノ酸を欠失すること、および2つのアミノ酸の欠失、ならびにヘマグルチニンからの10アミノ酸配列の後次の添加を伴う(図1Aおよび1Bを参照)。天然開裂配列が崩壊したため、得られるE2タンパク質は、E3およびE2(pE2としても知られる)の融合として発現され、外来エピトープ(ヘマグルチニン)も示す。以下に示されるように、SVGmuは、特に発現レベルが低いことが問題である。
異なる戦略を使用して、発明者らは、ヘパラン硫酸への結合を減少させ、樹状細胞との特異性を増加し、発現を向上させるように、シンドビスウイルスのE2糖タンパク質を操作した。これらの特性を得るための一般的なアプローチは、E2の残基160(図1の残基233)を非酸性アミノ酸、特にアラニン以外のアミノ酸に変更するか、またはそれを欠失することによって、樹状細胞の感染性を高めること、タンパク質の正味正負荷を減少させることによってヘパリン結合を減少させること、HA(ヘマグルチン)エピトープを除去すること、およびE2のN末端における開裂部位、この例ではフリン開裂部位を復元することである。ウイルスエンベロープの一部として、これらのE2糖タンパク質は、DCの感染を媒介することができるとともに、他の細胞型の感染を減少または抑止した。
これらの原理に従って、E2のいくつかの変異体配列を設計し、以下の表に示す。太字体は、HR株シンドビスウイルスエンベロープ配列からの変更を示す(GenBank NC001547.1)。
ヒトに対してコドン最適化される核酸配列を含む、変異体の一部をコードする核酸配列を合成した(図1も参照)。変異体のDNAは、pcDNA3等の発現ベクターにクローン化した。
実施例2
シンドビスウイルスE2エンベロープ糖タンパク質変異体を含むウイルスベクター粒子の調製
シンドビスエンベロープ偽型ウイルスは、FUGWまたはその誘導体等のレンチウイルスベクター、gag、pol、およびrevをコードするパッケージ化プラスミド、および変異体シンドビスウイルスエンベロープ配列を用いる、293T細胞の標準リン酸カルシウム媒介の一時的トランスフェクションによって調製される。FUGWは、GFPレポーター遺伝子の発現を駆動するように、ヒトユビキチン−Cプロモーターを担持する自己不活性化レンチウイルスベクターである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lois,C,et al.2002.Science 295:868−872)。レンチウイルス移動ベクター(FUGWおよびその誘導体)は、第3代HIV系レンチウイルスベクターであり(一般に、Cockrell and Kafri Mol.Biotechnol.36:184,2007を参照)、3’LTRのU3領域の大部分が欠失し、自己不活性化3’−LTRをもたらす。
組み換えレンチウイルスベクターの産生は、293T細胞(293LTV細胞株、CELL BIOLABS INC,LTV−100)のリン酸カルシウム(CaPO)媒介一時的トランスフェクションによって達成された。293T細胞は、CaPOと一緒に沈殿した4つのプラスミドでトランスフェクトされた。レンチウイルスベクター調製物を産生するために使用される以下の4つのプラスミドは、図3に概略的に示され、以下i)レンチウイルスベクター、ii)プラスミドをコードするHIV Rev、iii)プラスミドをコードするHIV Gag/Pol、およびiv)プラスミドをコードするエンベロープに対応する。レンチウイルスベクターは、望ましい抗原または免疫調節因子をコードしてもよく、特定の標的欠失を含有して、感染した細胞の宿主染色体への組み込みを回避してもよい。一時的トランスフェクションに利用することができる代替プラスミドのさらなる実施例には、本明細書に記載されるD64V変異等のそれを不全にするそのインテグラーゼにおける変異を含む、ポリメラーゼホロ酵素をコードするものが挙げられる。ある目的で、プラスミドをコードするエンベロープは、VSV−G等の非DC標的汎親和性エンベロープをコードしてもよい。
本明細書に記載される実験の場合、それぞれ120μgベクターおよび60μgのGag/PolおよびRevプラスミド、ならびに240μgのエンベローププラスミドを含有する、CaPO沈殿物を、0.45μm孔径のフィルターを通してろ過し、ローラーボトル中で成長させ、10%ウシ胎仔血清を補充した75mLのDMEM培地を含有する、約6×10個の293T細胞に添加した。トランスフェクションから6時間後、培地を100mLの新鮮な培地と交換し、トランスフェクションから36時間後に回収した。培養上澄みを低速(1200rpm)で遠心分離して細胞残屑をペレット化した後、0.45μmフィルターを通してろ過した。レンチウイルスベクター調製物を含有するろ液は、17,700×gで5時間、20℃で遠心分離することによって随意に濃縮した。次に、ペレット化したレンチウイルスベクターをPBSに望ましい容量で懸濁させた。このプロセスは、通常、本明細書に記載されるシンドビスウイルス糖タンパク質エンベロープを使用して、5×10IU/mL以上、または各ローラーボトル培養の場合、計5×10IUを産出した。より典型的に、このプロセスは、各ローラーボトル培養の場合、少なくとも計1×10IUを産出した。
さらなる詳細において、−4日目に、150mLの細胞培養培地をローラーボトル(RB)に添加し、37℃のローラーラック培養器(0.2rpm)に最長1時間配置した。各RBに、合流型15cmの皿を通過させる。−2日目に、培地をRBから吸引し、100mLの予熱した培地と置き換えた。−1日目に、トランスフェクションのために、細胞を調製物に播種する。RBを100mLの細胞培養培地で最長1時間予熱する。培地を吸引し、10〜12mLのPBSを添加する。RBを側面におき、2度回転させて細胞をコーティングする。PBSを吸引して、10〜12mLのトリプシン溶液を添加する。RBを再度側面に置き、2度回転させて細胞をコーティングする。トリプシン溶液を吸引し、RBを培養器に5分間置いた。RBに、10mLの温かい培地を添加し、RBを一度激しく回転させて、細胞を分離する。10mLピペットを使用して、細胞をピペットで、例えば、10回上下させて、単一の細胞懸濁液を保証する。細胞を新しい容器に除去し、培地で希釈する(RB当たり40mLの培地)。細胞をカウントし、新鮮なRBに7×10/mLで播種して、培養器中で一晩保持する。
0日目に、播種から約22時間後、プラスミド溶液を以下のように調製した。各RBに対して、プラスミド溶液(120μgベクター、60μg Gag/Pol、60μg Rev、60μgエンベロープ)、2.5mL 1.25M CaCl、およびろ過した滅菌水を一緒に混合して、最終容量を12.5mLにした。2.7mL 2×HBS(50mM HEPES、10mM KCl、12mM デキストロース、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4・7H2O、pH7.0、滅菌ろ過)緩衝液を50mL管(1管/RB)に添加する。中程度の設定で渦流しながら、12.7mL 水−CaCl2−DNA混合液を、12.7mL 2xHBSに滴下添加する。管に蓋をし、渦流を(最大速度)5〜10秒継続する。25mL 培地をRBから除去し、沈殿物(25mL)をRBに添加する。6時間培養した後、培地を吸引して、100mLの新鮮な予熱細胞培養培地を添加する。37℃の培養器に戻す。
トランスフェクションから36〜48時間後、RBからの上澄み液を250mL 円錐管に回収し、以下のように処理した。上澄み液を10分間、2000rpmで遠心分離する。0.45μmフィルターを通して上澄み液をろ過する。上澄み液を500mL管内で5時間、10,000rpm、20℃で遠心分離する。ベクターをPBSまたはHBSS中で望ましい濃度に懸濁し、−80℃で保管する。
得られる偽型ウイルスベクターは、以降、FUGW/V1、FUGW/V2等と称される。VSV−G糖タンパク質でエンベロープされたウイルスベクターゲノムは、以降、FUGW/VSV−Gと称される。
実施例3
シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子の産生
この例において、異なるシンドビスウイルスエンベロープにより偽型化したレンチウイルスベクターの力価が決定される。使用したE2糖タンパク質は、SIN−Var1(配列番号3)、SIN−Var2(配列番号4)、SIN−Var3(配列番号5)、SVGmu(配列番号2)、HR(配列番号18)であった。
シンドビスウイルス糖タンパク質偽型化レンチウイルスベクター粒子は、実施例2に記載されるように、293T細胞のトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションから48時間後に粗上澄み液を採取し、それを使用して、前日に6ウェル皿に2E5細胞/ウェルで置かれていた、ヒトDC−SIGN(293−DCSIGN)を発現する293T細胞に形質導入した。72時間、37℃で培養した後、形質導入した細胞をGuava Easy−Cyte血球計算器(Millipore)上で分析することによって力価を決定した。計25,000事象をカウントして、GFP+形質導入した細胞のパーセンテージを決定し、順にこれを使用して、各ウイルスのGFP力価(IU、感染単位)を計算した。
標的形質導入の研究を促進するために、ヒトDC−SIGNを発現する細胞株を構築する。細胞株は、ヒトDC−SIGNのコード配列を含有する、VSVG偽型化レンチベクターによる親293T細胞の安定形質導入によって生成される。ヒトDC−SIGNのcDNAは、プラスミドpUNO−hDCSIGN1Aa(InvivoGene)から増幅され、レンチウイルスプラスミドFUW内のヒトユビキチン−Cプロモーターの下流でクローン化され、FUW−hDCSIGNを生成する。あるいは、細胞株は、DC−SIGNのコード配列を含有する、VSVG偽型化広宿主性(非レンチウイルス)ベクターによる親293T細胞の安定した形質導入によって生成され、レンチウイルスベクター粒子による形質導入の下流核酸系分析をさらに促進する。レンチベクターまたは広宿主性ベクターを、次に、VSVGで偽型化し、それを使用して293T細胞に形質導入する。あるいは、細胞株は、ヒトDC−SIGNをコードするプラスミドによる親293T細胞の安定した形質導入によって生成される。得られる細胞を、抗体染色(抗ヒトDC−SIGN抗体(BD Biosciences)および細胞分類に供し、DC−SIGN+細胞株の均一群を産出する。
3つの独立実験において、SIN−Var1エンベロープで偽型化されるレンチウイルスベクターは、SVGmuまたはシンドビスウイルスのHR株で偽型化されるものよりも約10倍高い力価を有した(図3、上のグラフ)。続く研究において、3つのシンドビスエンベロープ変異体の生産性を比較した。代表的な結果が示される。Sin−Var1、Sin−Var2、およびSIN−Var3エンベロープは、同様の全体力価を有するレンチウイルスベクター粒子を生成する。
シンドビスウイルス変異体E2糖タンパク質を含むウイルスベクター粒子の特異性は、293T.hDC−SIGNまたは親293T細胞の形質導入、および細胞株内の可視マーカー(例えば、GFP)の発現の測定値によって評価される。
標的細胞(293T.hDC−SIGNまたは293T細胞)を、24ウェル培養皿に播種し(0.2×10細胞/ウェル)、皿を2,500rpm、30℃で90分間、遠心分離することによって、ウイルス上澄み液(1mL/ウェル)により形質導入する。その後、上澄み液を新鮮な培養培地と置き換え、3日間37℃で培養する。マーカーを発現する細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって測定される。
以下の表に示されるように、E2変異体1およびE2変異体3はいずれも、hDC−SIGNを発現する、優先的に標的される細胞である(細胞に特異的である)。
実施例4
シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子の免疫原性
この実施例において、免疫原性は、異なるシンドビスウイルスエンベロープで偽型化したレンチウイルスベクターに関して評価される。より特異的に、抗原特異的CD8T細胞の量およびそれらのサイトカイン分泌プロファイルを決定した。使用したE2糖タンパク質は、SIN−Var1(配列番号3)、SIN−Var2(配列番号4)、SIN−Var3(配列番号5)、SVGmu(配列番号2)であった。
ウイルスゲノムは、オボアルブミン(OVA)をコードする配列を含む。レンチウイルスベクター粒子は、実施例2に記載されるように、293T細胞をトランスフェクトすることによって生成した。上澄み液を回収し、ELISAキット(Advanced Bioscience Labs、メリーランド州ケンジントン)を使用してp24の量を決定した。タンパク質p24は、偽型ビリオンおよびgag遺伝子の産生物において見られる、HIVコアタンパク質である。C57BL/6マウス(5マウス/群)を、オボアルブミンOVAをコードする組み込み不全レンチベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるOVA257(SIINFEKL)(配列番号24)ペプチド特異的CD8T細胞の数および機能、ならびにサイトカイン分泌プロファイルは、MHC−l/ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、9日目に決定した。
つまり、脾臓を抽出し、70μMナイロンフィルターを通して押し付けることによって均質化した。赤血球を低張性ショックによって、蒸留水に短時間曝露することにより溶解して、10xPBSの添加によって、速やかに等張性環境に戻した。試料当たり約5×10個の脾細胞を、PE標識化H−2Kb/OVA257五量体(Prolmmune)を用いて、25℃で、2% FCSおよび2mM EDTA(FACS緩衝液)を有するPBS中で染色した。次に、細胞を2回洗浄し、生存性染料LIVE/DEAD近赤外線(L/D NIR、Invitrogen)および以下の蛍光染色標識化抗体:CD44
FITC、CD19 PerCP−Cy5.5、およびCD8 Pacific Blue(eBioscience)を用いて、4℃で染色した。BD LSR IIフローサイトメーター上でデータを収集し(50,000 CD8+事象)、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて分析した。CD8T細胞を識別するためのゲート戦略は、以下のとおり、リンパ球(前方散乱lo−med、側方散乱lo)、単一細胞(側方散乱領域=側方散乱高)、肝臓細胞(L/D NIR−)、CD8T細胞(CD8+
CD19−)であった。CD8+ゲート内でIFN−γを発現する細胞のパーセンテージを決定し、図4Aおよび4Bに表した。水平線は、平均値を示す。非特異的IFN−γ染色は、媒体(HBSS)を注入したマウスの脾臓細胞において決定し、ここで細胞は、ペプチドによりインビトロで刺激した。IFN−γ染色は、ペプチドなしで培養されたすべての試料について、0.2%未満であった(図示せず)。IFN−γを産生するCD8T細胞の比率に加えて、TNFαおよび/またはIL−2も産生するIFN−γ+細胞の比率も、キーで示されるように表される。
一式の実験において、使用されるウイルスの量は、2500ngまたは125ngのいずれかのp24を含有した。図4Aは、シンドビス変異体エンベロープで偽型化したレンチベクターが、インビボで同様の活性を有することを示す。左端のパネルに示されるように、抗原特異的CD8T細胞の平均は、本質的に、2つの異なる投与量において同一である。さらに、IFN−γ細胞の平均パーセンテージも類似している。サイトカイン分泌のパターン、具体的に、IL−2またはTNF−αも発現するIFN−γ陽性細胞の比率も類似し、IL−2およびTNF−αについて陰性であるI IFN−γは最高パーセンテージを有する。
別の実験において、5匹のマウス群に、連続希釈用量のウイルスまたは媒体を投与した。SinVar1またはSVGmuのいずれかで、ウイルスを偽型化した。CD44hi
H−2Kb/OVA257五量体+発現型を有する細胞のパーセンテージは、図4Bに表される。接続する線は平均値を表す。図4Bに示されるように、SinVar1偽型LVは、実質的に、SVGmuよりも優れた抗原特異的CD8T細胞の拡大を誘発した。さらに、SinVar1偽型レンチベクターは、SVGmuよりも優れた機能的CD8T細胞反応を誘発した(図4C)。非特異的IFN−γ染色は、ペプチドで再刺激されたHBSS注入(媒体)マウスにおいて決定した。IFN−γ染色は、ペプチドなしに培養されたすべての試料に対して、0.2%未満であった(図示せず)。
実施例5
非組み込みレンチウイルスベクター(NILV)の構築
多様な非組み込みレンチウイルスベクターを構築した。例示的レンチウイルスベクターの概略は、図5Aに示される。上の図は、プロウイルス形態のベクターを示す。すべてのベクターは、スプライスドナー、パッケージ化シグナル(psi)、Rev応答配列(RRE)、スプライスドナー、スプライスアクセプター、中央ポリプリン路(cPPT)およびWPRE要素を含有する。さらに、すべてのベクター構造は、哺乳類細胞における発現のためのプロモーター、および例示的構造において「抗原」と標識される関心の配列を含有する。実施例において利用されるプロモーターは、ヒトユビキチンCプロモーター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、およびラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)を含む。
U3領域の拡大図は、すぐ上流のPPT(ポリプリン路)配列とともに、オープンボックスとして以下に示される。下には、3つの異なるU3領域が概略形態で示され、それらの配列は、図5Bおよび配列番号21〜23に示される。これらの構造は、U3領域に欠失を含有する。SIN構造は、U3に約130個のヌクレオチドの欠失を有し(Miyoshi,et al.J Virol 72:8150,1998、Yu et al.PNAS 83:3194,1986)、TATAボックスが除去され、LTRプロモーター活性が抑止される。構造703および704における欠失は、レンチウイルスベクターからの発現を増加させる(その全体が組み込まれる、Bayer et al.Mol
Therapy 16:1968,2008)。さらに、構造704は、3’PPTの欠失を含有し、ベクターの組み込みが減少する(その全体が組み込まれる、国際公開第WO2009/076524号)。すべての構造のU3領域の配列は、図5Bに示される。3’PPTは、3位において開始し、SIN欠失したベクターに対する拡大欠失が示される。
実施例6
レンチウイルスベクター粒子による形質導入に続く樹状細胞における発現
この実施例は、拡大U3欠失を有するベクターから生成された樹状細胞におけるGFP(緑色蛍光タンパク質)発現レベルを示す。
一連のウイルスは、上述されるように、293T細胞のトランスフェクションによって産生された。すべてのウイルスは、SIN−Var1エンベロープ、GFPトランス遺伝子との操作的結合において、UbiCまたはCMVプロモーターを含有するベクターゲノム、およびD64V変異を含有することによる不全インテグラーゼを含む。形質導入から48時間後に、粗上澄み液を採取し、相当量の各上澄み液を使用して、293T−DCSIGN細胞を形質導入した。GFP発現は、形質導入から72時間後、GUAVA Easy−Cyteフローサイトメーターを使用して決定した。形質導入した細胞群のそれぞれに対して、合計50,000事象をカウントした。FlowJoサイトメトリック分析ソフトウェアを使用して、データを分析した。
UbiC(図6、パネルA)およびCMV(図6、パネルB)プロモーターの両方に対して、同様の結果が得られた。拡大U3欠失(703および704)を含有するレンチウイルスベクターは、SIN欠失したベクターに対して、高い全体導入遺伝子発現を示した。構造704におけるPPTの欠失は、構造703に対してわずかに発現を減少させた。
実施例7
U3において大規模な欠失を有するベクターは非組み込みである
この実施例は、293−DC−SIGN細胞の形質導入に続いて、異なるベクター欠失と不全型または野生型インテグラーゼとの組み合わせを含有する、SIN−Var1偽型ベクターの相対組み込み効率を証明する。
インテグラーゼ遺伝子およびU3欠失の多数の異なる組み合わせにより、ベクターストックを生成した。U3欠失(図5Aおよび5Bを参照)、SIN、703、および704を有するベクターは、野生型インテグラーゼ遺伝子または変異型インテグラーゼ遺伝子のいずれかで、上記のようにトランスフェクトした。これらの実験におけるベクターは、GFPおよびG418抵抗の両方をコードする、GFP−2A−新生導入遺伝子を含有する。リーディングフレームを、2A自己開裂ペプチドを介して結合し、個別のタンパク質を生成する。すべてのベクターのGFP力価は、標準フローサイトメトリー法を使用して決定した。次に、ベクターストックを使用して、前日に6ウェル皿に5×10細胞/ウェルで置いた、293−DC−SIGN細胞を感染させた。形質導入に続いて、細胞をトリプシンで72時間毎に処理した。各継代において、2×10細胞を、2mL DMEM+10% FBS中の6ウェル皿に再度配置した。残りの細胞を使用して、フローサイトメトリーによりGFP+細胞の数を決定した。
図7において、相対GFP力価は、継代1において認められる力価の比率として提示される。GFP発現の喪失は、GFP導入遺伝子の喪失を反映し、これは、初期形質導入ステップにおける組み込みの喪失の結果である。予想されるように、D64V変異インテグラーゼ(IN−)を含有するすべてのウイルスは、非組み込みであることが分かった。さらに、PPT欠失(704)を含有するウイルスは、野生型IN遺伝子の存在下においても組み込み不全であることが分かった。これは、3’PPTの欠失が、インテグラーゼ変異と組み合わせて、重複性の安全機序を提供することを示す。
実施例8
組み込みおよび非組み込みレンチウイルスベクターは、同等に免疫原性である
この実施例において、CD8T細胞反応は、組み込みまたは非組み込みウイルスによる免疫付与に続いて評価する。
C57BL/6マウスは、サル免疫不全ウイルス(SIV)からのGag抗原をコードする、組み込み(Intwt)または非組み込み(IntD64V)レンチベクターの2.5×1010個のゲノムで皮下的に免疫付与した。膵臓中のSIV Gag特異的CD8T細胞の数および機能は、SIV Gag由来のペプチドAAVKNWMTQTLを再刺激に使用したことを除いて、10日目に、上述されるように、細胞内サイトカイン染色によって決定した。図8は、非組み込みレンチベクターが、組み込みレンチベクターに相当するCD8T細胞反応を引き出すことができることを示す。さらに、サイトカイン発現のパターンが類似する。
実施例9
DC−NILVによる免疫付与は、治療効果を提供する
この実施例において、腫瘍細胞を受容したマウスは、腫瘍抗原を発現するDC−NILVで免疫付与することによって治療される。
BALB/cマウスに、2×10 CT26結腸癌細胞を皮下注射した。1日後、マウスを、媒体、または3.2μgのp24カプシドタンパク質を含有するSINvar1偽型レンチウイルスベクター粒子調製物のいずれかで皮下的に治療した。ウイルスベクターエンベロープは、上述されるようなシンドビスウイルスE2の変異体を含み、ベクターは、非組み込みであり、AH1A5ペプチド(SPSYAYHQF、配列番号25)、CT26腫瘍細胞に対する拒絶抗原である、修飾MMTV gp70 CD8T細胞エピトープをコードする。免疫付与マウス対対照マウスの初期腫瘍成長ならびに長期生存が表される。図9は、腫瘍がDC−NILVを受容するマウスにおいて、よりゆっくり成長し、さらに生存率(75日目に測定)は、実質的により優れていた(20%に比較して60%の生存率)ことを示す。したがって、DC−標的非組み込みレンチベクター(DC−NILV)は、腫瘍の治療的処置において有効である。
本発明の実施形態には、これらに限定されないが、以下が含まれる。
1. レトロウイルス、例えば、レンチウイルスベクター粒子であって、
(a) 160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその配列番号1の変異体を含む、エンベロープであって、前記E2糖タンパク質またはその変異体は、E3に融合されない、エンベロープと、
(b) 関心の配列を含む、レンチウイルスゲノムと、
を含む、レトロウイルスベクター粒子。
2. 前記E2糖タンパク質または変異体は、DC−SIGNに結合する、実施形態1に記載のレトロウイルスベクター粒子。
3. 前記160Xが存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンであり、例えば、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、実施形態1または実施形態2に記載のレトロウイルスベクター粒子。
4. 160Xがグリシンである、実施形態1または実施形態2に記載のレトロウイルスベクター粒子。
5. 前記E2糖タンパク質変異体は、その正味正電荷を低減するように変更された少なくとも1つのアミノ酸を有する、実施形態1、2、3または4に記載のレトロウイルスベクター粒子。
6. 前記変更アミノ酸は、配列番号1のリシン70、76、または159から成る群から選択され、置換がグルタミン酸またはアスパラギン酸から随意に独立して選択される、実施形態5に記載のレトロウイルスベクター粒子。
7. E2変異体配列は、配列番号2、3、または4であり(変異体1、2、および3)、1つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を随意に含む、実施形態1、2、3、4、5、または6に記載のレトロウイルスベクター粒子。
8. 配列番号1の残基71〜75の配列が未変化である変異体か、または前記変異体がDCに感染する能力に影響しないが、この領域内のアミノ酸の数を変更しない、1つもしくは2つの置換を有する変異体である、実施形態1、2、3、4、5、6、または7に記載のレトロウイルスベクター粒子。
上記実施形態のあらゆる組み合わせが、本発明により、以下の非限定的な組み合わせで示されるように考慮され、「>」は、より早い番号の実施形態に対する言及を示す:4>2>1、5>4>1、5>4>2>1、5>3>1、5>3>2>1、6>5>4>1、6>5>4>2>1、6>5>3>2>1、6>4>2>1、6>3>2>1、6>5>3>1、7>6>5>4>1、7>6>5>4>2>1、7>6>5>3>1、7>6>5>3>2>1、7>6>4>2>1、7>5>4>1、7>5>4>2>1、7>5>3>1、7>5>3>2>1、7>4>2>1、7>3>2>1、7>6>4>1、7>6>4>2>1、7>6>3>1、7>6>3>2>1、7>6>2>1、8>4>2>1、8>5>4>1、8>5>4>2>1、8>5>3>1、8>5>3>2>1、8>6>5>4>1、8>6>5>4>2>1、8>6>5>3>2>1、8>6>4>2>1、8>6>3>2>1、8>6>5>3>1、8>7>6>5>4>1、8>7>6>5>4>2>1、8>7>6>5>3>1、8>7>6>5>3>2>1、8>7>6>4>2>1、8>7>5>4>1、8>7>5>4>2>1、8>7>5>3>1、8>7>5>3>2>1、8>7>4>2>1、8>7>3>2>1、8>7>6>4>1、8>7>6>3>1、8>7>6>3>2>1、8>7>6>2>1。
本発明のさらなる実施形態には、以下が含まれる。
9. 前記関心の配列は、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来の抗原、例えば、HIVもしくはSIV抗原をコードする、上記実施形態のいずれかに記載のレトロウイルスベクター粒子。
10. シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体を含むエンベロープ内に偽型化されたレトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ベクターゲノムであって、前記ゲノムは関心の配列を含み、
前記E2糖タンパク質変異体は、前記レトロウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、前記E2糖タンパク質変異体は、上記実施形態1〜9のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する、レトロウイルスベクターゲノム。
11. 偽型レトロウイルスベクター粒子を産生するためのレトロウイルスベクターパッケージ化システムであって、
(i)160Xが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第1の核酸分子と、
(ii)転写されることができ、前記転写物は、偽型レトロウイルスベクター粒子へと構築される、第2の核酸分子と、
を含む、パッケージ化システム。
12. 前記E2糖タンパク質は、上記実施形態1〜9のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する、実施形態11に記載のパッケージ化システム。
13. 前記第1の核酸分子は、随意にシンドビスウイルスE3/E2/6K/E1ポリタンパク質の形態である、E3/E2糖タンパク質をコードする、実施形態11または12に記載のパッケージ化システム。
14. 前記E3配列は、配列番号20の残基1〜65、または配列番号20の残基1〜65に対して少なくとも80%の配列同一性を有するその変異体に対応し、残基62〜65はRSKRであり(配列番号27)、前記変異体は偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができ、随意にさらに前記E2ポリタンパク質の残基1が随意にSerである、実施形態13に記載のパッケージ化システム。
15. gagおよびpolタンパク質をコードする第3の核酸分子をさらに含む、実施形態11、12、13、または14に記載のパッケージ化システム。
16. 第2の核酸分子は、関心の配列を含む、実施形態11〜15のいずれか1つに記載のパッケージ化システム。
17. 実施形態11〜16のいずれか1つに記載の前記第1および第2の核酸分子でトランスフェクトされた細胞。
18. 実施形態1〜9のいずれか1つに記載のタンパク質、または実施形態13もしくは14に定義されるE3/E2糖タンパク質をコードする、単離核酸分子。
19. 実施形態18の核酸分子を含む、発現ベクター。
20. 実施形態19の発現ベクターを含む、宿主細胞。
21. 実施形態1〜10のいずれか1つに記載のレトロウイルスベクター粒子を作製する方法であって、細胞において、
(i)160Xがグルタミン酸以外である配列番号1のシンドビスウイルスE2糖タンパク質、または配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第1の核酸分子と、
(ii)転写されることができ、前記転写物は偽型レトロウイルスベクター粒子へと構築される、第2の核酸分子と、
を発現させることを含む、方法。
22. ヒトまたは動物被検体の治療方法において使用するための、実施形態1〜10のいずれか1つに従うレトロウイルスベクター粒子。
23. レトロウイルスベクター粒子をインビトロで細胞に送達する方法であって、前記細胞を、実施形態1〜10のいずれか1つに従うレトロウイルスベクター粒子と混合することを含む、方法。
24. 実施形態1〜10のいずれか1つに記載のレトロウイルスベクター粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、治療ワクチン。

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  1. シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクターなど。
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Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2657737T3 (es) * 2009-07-15 2018-03-06 Calimmune Inc. Vector dual para la inhibición del virus de la inmunodeficiencia humana
BR112013020875A2 (pt) * 2011-02-15 2019-09-24 Immune Design Corp método para indução de uma resposta imune específica para um imunógeno em um indivíduo.
JP6054942B2 (ja) * 2011-04-08 2016-12-27 イミューン デザイン コーポレイション 免疫原性組成物、ならびに体液性および細胞性免疫応答を誘発するための該組成物の使用方法
WO2013116656A1 (en) * 2012-02-03 2013-08-08 Emory University Immunostimulatory compositions, particles, and uses related thereto
US9486539B2 (en) 2012-03-26 2016-11-08 The Regents Of The University Of California Nipah virus envelope pseudotyped lentiviruses and methods of their use
US8323662B1 (en) * 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
US9713635B2 (en) 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
AU2013237900B2 (en) * 2012-03-30 2017-07-27 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing DC- SIGN
CN107540730B (zh) 2012-05-16 2021-07-16 免疫设计公司 用于hsv-2的疫苗
EP2943203A4 (en) * 2013-01-11 2016-08-24 Scripps Research Inst METHOD AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE TRANSDUCTION EFFICIENCY OF RETROVIRAL VECTORS
GB201308772D0 (en) * 2013-05-15 2013-06-26 Imp Innovations Ltd Vectors
PL3116900T3 (pl) 2014-03-09 2021-03-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje użyteczne w leczeniu niedoboru transkarbamylazy ornitynowej (otc)
JP2017522312A (ja) 2014-07-15 2017-08-10 イミューン デザイン コーポレイション Tlr4アゴニストアジュバント及びレンチウイルスベクターを用いたプライム・ブーストレジメン
EP3838296A1 (en) * 2015-01-21 2021-06-23 Cornell University Viral vectors for prophylaxis and therapy of hemoglobinopathies
CN112481211B (zh) * 2015-01-26 2024-07-05 儿童医院公司 免疫调节性提高的细胞及其使用和生产方法
BR112017019776B1 (pt) * 2015-03-18 2020-07-28 Omnicyte proteínas de fusão que compreendem glicoproteínas de superfície de alfavírus modificadas e antígeno associado a tumor e métodos dos mesmos
DK3283658T3 (da) 2015-05-18 2020-05-18 Calimmune Inc Fremgangsmåder til at diskriminere mellem HIV-1 og lentivirus-vektorer
EP3347374A1 (en) 2015-09-09 2018-07-18 Immune Design Corp. Ny-eso-1 specific tcrs and methods of use thereof
BR112018008911A2 (pt) * 2015-11-09 2018-11-27 Immune Design Corp composições compreendendo vetores lentivirais que expressam il-12 e métodos de uso das mesmas
WO2017083356A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Immune Design Corp. A retroviral vector for the administration and expression of replicon rna expressing heterologous nucleic acids
WO2017147119A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 Immune Design Corp. Multigenome retroviral vector preparations and methods and systems for producing and using same
BR112018067565A2 (pt) * 2016-03-04 2019-02-05 Univ New York vetores de vírus que expressam múltiplos epítopos de antígenos associados a tumor para induzir imunidade antitumor
US11078282B2 (en) 2016-04-15 2021-08-03 Alpine Immune Sciences, Inc. CD80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2017250358B2 (en) 2016-04-15 2023-06-01 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3235828A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-25 Genethon Stable pseudotyped lentiviral particles and uses thereof
EP3235908A1 (en) 2016-04-21 2017-10-25 Ecole Normale Superieure De Lyon Methods for selectively modulating the activity of distinct subtypes of cells
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3872180A1 (en) 2016-10-20 2021-09-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
EP3596116B1 (en) 2017-03-16 2023-09-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3054068A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2020511144A (ja) 2017-03-16 2020-04-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Pd−l2バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
CN110869507A (zh) 2017-05-08 2020-03-06 旗舰先锋创新V股份有限公司 促进膜融合的组合物和其用途
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
US11116833B2 (en) * 2018-02-08 2021-09-14 George Mason University Method and system for inactivating virus infectivity for producing live-attenuated vaccines
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN113348244A (zh) * 2018-11-23 2021-09-03 维拉治疗有限公司 Vsv嵌合载体
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP7495435B2 (ja) 2019-06-14 2024-06-04 ザ ジェイ. デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ. デビッド グラッドストーン 治療用干渉粒子による免疫不全ウイルス感染を処置するための組成物及び方法
US20220307050A1 (en) * 2019-08-01 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Non-viral transgenesis
CN110982842B (zh) * 2019-12-31 2023-04-18 山西大学 一种慢病毒表达载体的设计及应用
KR20240028975A (ko) 2021-04-08 2024-03-05 사나 바이오테크놀로지, 인크. Cd8-특이적 항체 구조체들 및 이의 조성물
US20230340627A1 (en) * 2022-04-05 2023-10-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of viral particles by digital assay
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023240124A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pseudotyped viral particles for targeting tcr-expressing cells

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5298420A (en) 1990-08-03 1994-03-29 Tanox Biosystems, Inc. Antibodies specific for isotype specific domains of human IgM and human IgG expressed or the B cell surface
TW279133B (ja) 1990-12-13 1996-06-21 Elan Med Tech
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JPH08504091A (ja) 1992-09-22 1996-05-07 メディカル・リサーチ・カウンシル 外部表面に非ウィルス性ポリペプチドを提示する組換えウィルス
US6534051B1 (en) 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
US5279552A (en) 1993-01-11 1994-01-18 Anton Magnet Intradermal injection device
US5997501A (en) 1993-11-18 1999-12-07 Elan Corporation, Plc Intradermal drug delivery device
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5660835A (en) 1995-02-24 1997-08-26 East Carolina University Method of treating adenosine depletion
WO1997005266A1 (en) 1995-07-25 1997-02-13 Introgene B.V. Methods and means for targeted gene delivery
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
FR2747046B1 (fr) 1996-04-05 1998-06-19 Univ Paris Curie Nouveaux vaccins issus de plasmovirus
EP0961830A1 (en) 1997-01-29 1999-12-08 Neurosearch A/S EXPRESSION VECTORS AND METHODS FOR $i(IN VIVO) EXPRESSION OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES
US6432699B1 (en) * 1997-03-28 2002-08-13 New York University Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A
US6531123B1 (en) 1997-05-01 2003-03-11 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
ZA988446B (en) 1997-09-18 2000-03-22 Res Dev Foundation Production of vaccines using arthropod vectored viruses.
WO1999013905A1 (en) 1997-09-18 1999-03-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Receptor-binding pocket mutants of influenza a virus hemagglutinin for use in targeted gene delivery
US6218181B1 (en) 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US7078483B2 (en) 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
AU763007B2 (en) * 1998-05-22 2003-07-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral delivery system
EP1165842A4 (en) * 1999-03-16 2004-07-07 Dana Farber Cancer Inst Inc LENTIVIRAL VECTOR SYSTEMS FOR SCREENING LARGE QUANTITIES
DK1175497T3 (da) 1999-04-14 2010-05-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Præparater og fremgangsmåder til generering af et immunrespons ved udnyttelse af alfavirusbaserede vektorsystemer
EP1046651A1 (en) 1999-04-19 2000-10-25 Koninklijke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-T interaction
CA2392010A1 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Regents Of The University Of California Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
CA2388676A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Chiron Corporation Method of obtaining cellular immune responses from proteins
US7241275B2 (en) 1999-10-14 2007-07-10 Becton, Dickinson And Company Intradermal needle
US6776776B2 (en) 1999-10-14 2004-08-17 Becton, Dickinson And Company Prefillable intradermal delivery device
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20020193740A1 (en) 1999-10-14 2002-12-19 Alchas Paul G. Method of intradermally injecting substances
US6569143B2 (en) 1999-10-14 2003-05-27 Becton, Dickinson And Company Method of intradermally injecting substances
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
US20040091853A1 (en) * 2001-03-02 2004-05-13 Hazuda Daria J. Viral reporter particles
WO2002101057A1 (fr) * 2001-06-08 2002-12-19 Dnavec Research Inc. Transfert genique dans des cellules souches embryonnaires de primate a l'aide d'un virus de l'immunodeficience simienne de pseudo type vsv-g utilise comme vecteur
US7737124B2 (en) 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
AU2002336517B2 (en) 2001-09-13 2008-09-11 California Institute Of Technology Method for producing transgenic animals
US7195916B2 (en) 2001-09-13 2007-03-27 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell
ATE439041T1 (de) 2001-09-13 2009-08-15 California Inst Of Techn Verfahren zur expression von kleinen antiviralen rna-molekülen innerhalb einer zelle
US6971999B2 (en) 2001-11-14 2005-12-06 Medical Instill Technologies, Inc. Intradermal delivery device and method
ES2374042T3 (es) 2002-02-04 2012-02-13 Becton, Dickinson And Company Dispositivo y método para suministrar o extraer una sustancia a través de la piel.
US7115108B2 (en) 2002-04-02 2006-10-03 Becton, Dickinson And Company Method and device for intradermally delivering a substance
US7047070B2 (en) 2002-04-02 2006-05-16 Becton, Dickinson And Company Valved intradermal delivery device and method of intradermally delivering a substance to a patient
US6780171B2 (en) 2002-04-02 2004-08-24 Becton, Dickinson And Company Intradermal delivery device
KR101002955B1 (ko) * 2002-04-26 2010-12-21 인스티튜트 클레이톤 드 라 리쎄르셰 개선된 키메라 당단백질 및 슈도타입 렌티바이러스 벡터
US7455833B2 (en) 2002-07-15 2008-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
JP5145492B2 (ja) 2002-08-16 2013-02-20 独立行政法人科学技術振興機構 組換えbcgワクチン
AU2003297474A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
US7090837B2 (en) 2003-01-21 2006-08-15 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors
US7556814B2 (en) 2003-10-23 2009-07-07 Karp Nelson M Immunogenic compositions comprising UV-irradiated, psoralen-inactivated, desialated human immunodeficiency virus (HIV) devoid of CD55 and CD59 in the viral membrane
US7108679B2 (en) 2004-03-11 2006-09-19 Becton, Dickinson And Company Intradermal syringe and needle assembly
US20070275873A1 (en) * 2004-04-29 2007-11-29 Heidner Hans W Methods and Compositions Comprising Protein L Immunoglobulin Binding Domains for Cell-Specific Targeting
US20080227736A1 (en) * 2004-06-03 2008-09-18 Regents Of The University Of California, Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006031996A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
RU2007134371A (ru) * 2005-02-16 2009-03-27 Лентиджен Корпорейшн (Us) Лентивирусные векторы и их применение
US20070020238A1 (en) 2005-06-01 2007-01-25 David Baltimore Method of targeted gene delivery using viral vectors
EP2520168B1 (en) * 2006-07-21 2014-03-19 California Institute of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
DK2068918T4 (da) 2006-09-26 2024-09-02 Access To Advanced Health Inst Vaccinesammensætning omfattende syntetisk adjuvant
CA2698668A1 (en) 2007-09-07 2009-03-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthetic lipid a derivative
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALI A. NASIR ET AL.: "Performance of coarse and fine timing synchronization in OFDM receivers", FUTURE COMPUTER AND COMMUNICATION (ICFCC), 2010 2ND INTERNATIONAL CONFERENCE ON, vol. Vol.2, JPN6015002039, 24 May 2010 (2010-05-24), pages 412 - 416 *

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