JP2008502905A

JP2008502905A - ヒト前立腺疾患に対する作用物質のスクリーニング法

Info

Publication number: JP2008502905A
Application number: JP2007516559A
Authority: JP
Inventors: マーシヤル，デボラ・ジエイ; スナイダー，リンダ・エイ
Original assignee: セントカー・インコーポレーテツド
Priority date: 2004-06-15
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2008-01-31
Also published as: CA2570563A1; WO2006101503A3; EP1773406A4; EP1773406A2; US20050276758A1; AU2005329405A1; WO2006101503A2

Abstract

カニクイザルの前立腺特異的抗原をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドから得ることができるポリペプチドおよび使用が開示されている。

Description

発明の分野
本発明は、カニクイザルの前立腺特異的抗原およびその使用に関する。

発明の背景
ガンは４人に１人が罹患する重篤な疾患である。この５０年で、ガンの早期検出ならびにガンを処置するための多数の治療法の開発になかりの進歩があった。治療には１次腫瘍を除去するための手術、および転移した疾患を処置するための致死下の放射線および化学療法がある。これらの処置は多くの患者に明白な治癒をもたらしたが、処置は極めて衰弱させる恐れがあり、そしてこの疾患からの死亡を防ぐには未だに非効果的であることが多い。

前立腺ガンは男性においてガンに関連する第２の死亡原因である。毎年、およそ１８０，０００人の男性が前立腺ガンと診断され、そして毎年４０，０００人がこの疾患で死亡する。前立腺腫瘍細胞は低い増殖速度を有し、そして体内で最も迅速に分裂する細胞に対して最も毒性である標準的な化学療法には応答しない。代わりに前立腺ガンは放射線療法またはホルモン療法を用いて外科的に処置することができる。手術および放射線療法は、失禁および性的不能のような望ましくない副作用を導く恐れがある。しばしばこの疾患は、増殖因子を必要とする腫瘍細胞を餓死させるホルモン療法で成功裏に管理することができる。しかし最終的にこのように処置されたすべての腫瘍はアンドロゲン−非依存的となり、そしてこの点を越える効果的な処置はない。

能動的免疫療法を用いたガンの処置は多くの臨床前モデルで有望となることが示され、そして幾つかの臨床試験では手術、放射線または化学療法の代替または補助として有望となることが示された。能動的免疫療法の目標は、腫瘍特異的抗原に対する治療的免疫応答を生成することであり、これは次いで破壊するために腫瘍細胞を標的とする。しかしほとんどの腫瘍抗原が自己抗原であり、これに対して患者は寛容である。実際に、中枢および末梢の寛容メカニズムが、自己抗原を発現する腫瘍に対して効果的な免疫の生成を妨害すると予想される。

上記自己抗原に対する寛容をどのように破壊するかの問題を解決する１つの方法は、免疫原として異なる種に由来する緊密に関連する遺伝子またはタンパク質を使用することである。この種の免疫感作は異種免疫感作（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）としても知られており、そしてその効力はＭＨＣクラスＩ抗原に対する強化された結合能を持つ異種配列中の異常な（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）エピトープの無作為な作成、および／または異種配列中の強力なヘルパーエピトープの存在のいずれかに存在する。例えば異種分化抗原をコードするプラスミドＤＮＡの注入は、そうしなければ乏しい免疫原性自己抗原に対して、抗体およびＴ−細胞応答を誘導する強力な手段である。この異種間の取り組みは、新脈管形成（非特許文献１）、膜糖タンパク質（非特許文献２、非特許文献３）およびインテグリン（非特許文献４）を含め、幾つかの異なる型の遺伝子に対する能動免疫を誘導することにより、マウスまたはラットの配列を使用して種々のガンモデルでうまく行くことが示されてきた。

前立腺腫瘍および幾つかの胸部悪性疾患は、それらの表面にカリクレイン３（ＫＬＫ３）とも呼ばれる前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を発現する。ＰＳＡは前立腺ガンの血清マーカーとしても良く知られ、疾患の重篤度と典型的に良く相関してＰＳＡの血清レベルが上昇する。ＰＳＡが前立腺ガンの病因に役割があるのかどうかは不明であり、様々な報告でＰＳＡは腫瘍形成を強化または抑制できるいずれかであることが示された。ＰＳＡに対する幾つかの細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）エピトープが、ＨＬＡＡ２およびＡ３ハプロタイプについて記載され、これらエピトープの同定は、ワクチン接種による治療用の生体内ＣＴＬ生成の可能性を支持する。

実際に、ヒトおよびマウス前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）をコードするＤＮＡの使用が、再発する前立腺ガンの患者を対象としたフェイズＩの臨床試験で試された。非特許文献５を参照にされたい。またこれらの著者は臨床前実験で、異種ＤＮＡ（例えばヒトＰＳＭＡＤＮＡのマウスへの注入）の使用が、免疫学的寛容を克服するための絶対要件であることも示した。

免疫療法の有力な標的抗原としてＰＳＡの研究、ならびにその生理学的役割を調査する他の研究は、適切な動物モデルが無いために妨げられてきた。マウスに関する前立腺特異的カリクレイン遺伝子（そのＰＳＡ遺伝子は、霊長類のファミリーメンバーである）が無かったので、現在、前立腺ガンの免疫学的観点をモデル化するためのマウス系を利用することはできない。実際に、今日までに同定されたマウスのカリクレイン遺伝子のいずれもヒトＰＳＡ遺伝子と同じ発現パターンをもたない（非特許文献６）。これに関する１つの例外は、ヒトＰＳＡ遺伝子を発現するためのトランスジェニックマウスを工作することであった（非特許文献７）。このようにヒトの疾患を処置するためのより一層関連性のある動物モデルが未だに必要である。

参考文献

Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０２：１８１５−２３，２００３Ｗｏｌｃｈｏｋｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎ．１，９−１８，２００１ＳｉｏｕｄａｎｄＳｏｒｅｎｓｅｎＤ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，３８−４５，２００３Ｌｏｕｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．３１，５１−６９，２００２Ｗｏｌｃｈｏｋｅｔａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０，６５９−６６，２００３Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ＪＡ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１０，３９３−４１９、１９８９Ｗｅｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９４，６３６９−６３７４，１９９７

発明の要約
本発明の１つの観点は、配列番号１に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補的配列、フラグメントまたはバリアントを含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号２に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補的配列、フラグメントまたはバリアントを含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号４に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補的配列、フラグメントまたはバリアントを含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補的配列、フラグメントまたはバリアントを含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補的配列、フラグメントまたはバリアントを含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の観点は、配列番号３に示される配列を有するポリペプチドを含んでなる単離されたポリペプチドである。

本発明の別の観点は、配列番号５に示される配列を有するポリペプチドを含んでなる単離されたポリペプチドである。

本発明の別の観点は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる単離された完全長のヒト前立腺特異的抗原である。

本発明の別の観点は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる単離された成熟ヒトＰＳＡである。

本発明の別の観点は、作用物質をカニクイザルに投与することを含んでなる、ヒト前立腺の疾患を処置するために使用する作用物質の効力を評価する方法である。

発明の詳細な説明
本明細書で引用するすべての公報は、限定するわけではないが特許および特許出願を含め、完全な説明を通して引用により本明細書に編入する。

本明細書で使用する用語「ＤＮＡワクチン」または「核酸ワクチン」は、組織細胞による抗原の発現のために、抗原をコードするＤＮＡの生体内導入を個体の組織へ向けるために有用な組成物を表す。ＤＮＡワクチンは例えば国際公開第９５／２０６６０号および同第９３／１９１８３明細書パンフレットに記載されている。

本明細書で使用する用語「核酸補助物（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、抗原に対する免疫応答を強化するタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列を意味する。

本発明は単離されたカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＳＡポリペプチドおよびポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、配列番号３に説明するアミノ酸配列を有する完全長のカニクイザルＰＳＡ、およびそれをコードするポリヌクレオチドを提供し、それらには限定するわけではないが配列番号１または２を有するポリヌクレオチド、またはそれらの相補的配列を含む。完全長のカニクイザルＰＳＡは、２４残基のＮ−末端リーダー配列（配列番号６）を有すると予想される。また本発明はリーダー配列を欠き、そして配列番号５に説明するアミノ酸配列を有する成熟カニクイザルＰＳＡ、およびそれをコードするポリヌクレオチドを提供し、それらには限定するわけではないが配列番号４に説明する配列を有するポリヌクレオチド、またはそれらの相補的配列を含む。さらに本発明はカニクイザルＰＳＡの均等なフラグメントおよびバリアント、ならびにコードまたは相補的核酸、カニクイザルＰＳＡまたはフラグメントまたはバリアントを含んでなるベクター、そのようなベクターを含有する宿主細胞、およびそのようなカニクイザルＰＳＡ、ベクターまたは宿主細胞の作成法および使用法を提供する。

「フラグメント」は、本発明の任意のポリペプチドのすべてではなく一部のアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここでフラグメントは完全長形の残基７０および／または７９を含む（成熟形の残基２１および／または４６に均等である）。フラグメントは例えば配列番号３または５に示すアミノ酸配列に示すようなアミノ酸配列の一部を有する短縮ポリペプチド、またはヘテロロガスなアミノ−および／またはカルボキシ末端アミノ酸配列を含む連続する一連の残基のようなそのバリアントを含むことができる。宿主細胞により、または宿主細胞中で生成される本発明のポリペプチドの分解形も含まれる。他の例示的フラグメントは、アルファ−ヘリックスまたはアルファ−ヘリックス形成領域、ベータシートまたはベータシート形成領域、回転または回転形成領域（ｔｕｒｎ−ｆｏｒｍｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）、コイルまたはコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ−両親媒性領域、ベータ−両親媒性領域、柔軟領域、表面−形成領域、基質結合領域、細胞外領域および高抗原性指数領域（ｈｉｇｈａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｎｄｅｘｒｅｇｉｏｎ）を含んでなるフラグメントのような、構造または機能的特質を特徴とする。

具体的例のフラグメントは、ヒトクラスＩ分子に結合することができるペプチドをコードする成熟形の残基１４１〜１６３を含む。Ｃｏｒｒｅａｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８９，２９３−３００（１９９７）およびＸｕｅｅｔａｌ．，ＴｈｅＰｒｏｓｔａｔｅ３０，７３−７８（１９９７）を参照にされたい。別の例のフラグメントは、残基１６〜２５、４２〜５０、４８〜５６および７５〜８３を含む。さらに例示するフラグメントは、配列番号３に説明するアミノ酸配列に由来する少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを含み、ここでフラグメントは完全長形の残基４５および／または７０を含み、あるいは配列番号５に説明するアミノ酸配列に由来する少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを含み、ここでフラグメントは成熟形の残基２１および／または４６を含む。

「バリアント」ポリペプチドは、アミノ酸置換、挿入、欠失またはその組み合わせが作成されたカニクイザルＰＳＡポリペプチドまたはフラグメントである。自然に存在する修飾された、または異常なアミノ酸は、置換または挿入に使用することができる。バリアントポリヌクレオチドは、バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のバリアントポリペプチドは、宿主中のＰＳＡに免疫応答を誘発する。

本発明のポリヌクレオチドは、カニクイザルＰＳＡの抗原決定基をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターを有する組成物を調製するために有用である。組成物はさらに、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）のような核酸補助物をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびＩＬ−１８の発現を制御するプロモーターポリヌクレオチドを含むことができる。これらの組成物は、哺乳動物のガンに関連する腫瘍タンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用することができ、そして特定のガンまたは他の腫瘍関連病状の処置および／または予防に核酸ワクチンとして有用である。

本発明に有用な抗原決定基は、カニクイザルＰＳＡから得られるか、またはそれから誘導される。腫瘍抗原はそれらの免疫原性を強化するために変異させることもできる。抗原タンパク質に対する、より確固とした免疫応答を発揮させるために、抗原遺伝子をどのように修飾することができるかの例には、イントロン配列の付加、分泌に必要なシグナル配列の改変もしくは除去、または改善される翻訳のためのコドンの至適化のような抗原遺伝子の発現に影響を及ぼす変化を含む。さらに抗原遺伝子は、分解のためのユビキチン化シグナルの付加、細胞区画標的配列の付加、分子シャペロン配列の付加、およびＣＴＬエピトープ配列の至適化のような遺伝子の翻訳産物に変化を導入するために修飾されることができる。抗原遺伝子は一緒に融合して、免疫原性を上げることができる。ＣＴＬ／ヘルパーエピトープは一緒に連結されるか、または免疫グロブリン分子のような別の分子の一部として挿入されることができる。上に開示する分子の少なくとも１つの抗原決定基をコードするヌクレオチドは、本発明において有用である。さらに上に開示した任意のポリヌクレオチドに相補的な配列も、本発明の組成物に有用である。

これらの抗原決定基を含む本発明の組成物は、ＰＳＡが独自に発現される、過剰に発現される、またはガンにより引き起こされる腫瘍の存在に付随する任意のガンの処置に有用である。これらのガンには限定するわけではないが、ホルモン抗療性前立腺ガン（ＨＲＰＣ）を含む前立腺および乳ガンを含む。

また本発明は、リーダーまたは分泌配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列をコードする配列のような別の種から合成的に生産されるか、または誘導される別のコード配列を含むリーディングフレイム中に、成熟ポリペプチドコード配列またはそのフラグメントを提供する。また本発明のポリヌクレオチドは、転写されるが翻訳されない配列、終止コドン、リボゾーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロンおよびポリアデニル化シグナルのような少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、さらなるアミノ酸をコードするさらなる配列を含むことができる。これらのさらなるポリヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎｔｚｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６，８２１−８２４（１９８９）に記載されているようなヘキサ−ヒスチジンペプチドのようなマーカー配列、またはＷｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３７，７６７（１９８４）に記載されている、融合ポリペプチドの精製を容易にするＨＡペプチドタグをコードすることができる。

また本発明は本発明のポリヌクレオチド（１もしくは複数）を含んでなるベクター、本発明のベクターで遺伝的に工作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生産に関する。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を生産するために採用することができる。

本発明のポリペプチドの組換え生産のために、宿主細胞は遺伝的に工作されて発現系またはその一部および本発明のポリヌクレオチドを包含することができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．、分子生物学における基本的方法（ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、第２版、アペレトン＆ランゲ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ）、ノルウォーク、コネクチカット州（１９９４）、およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、第３版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、（２００１）のような研究用マニュアルから当業者には周知の方法により行うことができる。これらの方法にはリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介型トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染を含む。

宿主の代表例には、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）細胞；連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｉ）、腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のようなバクテリア細胞；クルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のような真菌：ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマおよびミエローマのような動物細胞；および裸子植物または被子植物細胞のような植物細胞を含む。

本発明のポリペプチドを生産するために多くの様々な発現系を使用することができる。そのような系には、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入配列、酵母染色体配列、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコルナウイルス（ｐｉｃｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）およびレトロウイルスのような染色体−、エピソーム−およびウイルスから誘導化されるベクター、およびコスミドおよびファジェミドのようなそれらの組み合わせから誘導化されるベクターを含む。発現系構築物は、発現を調節または引き起こす制御領域を含むことができる。一般に宿主中でポリヌクレオチドを維持または増やし、かつ／またはポリペプチドを発現するために適する任意の系またはベクターを発現に使用することができる。適切なＤＮＡ配列は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，同上に説明されているような当業者に周知な種々の技術により、発現系に挿入することができる。

真核細胞発現系では、本発明のポリペプチドはシグナルペプチドまたはリーダー配列のような適切な分泌シグナルを包含させることにより、小胞体の管腔または細胞外環境へ分泌され得る。これらのシグナルは、配列番号６（予想）に示すアミノ酸配列を有するシグナル配列のようなカニクイザルＰＳＡには異種または内因性となり得る。

本発明のポリペプチドは、既知のアミノ酸配列または本発明のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列から導かれるアミノ酸配列を使用して、自動化ペプチド合成器での固相ペプチド合成のような化学合成により生成してもよい。そのような技術は当業者には周知である。

本発明のポリペプチドは、組換え細胞カルチャーから、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、高性能液体クロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知方法により回収し、そして精製することができる。タンパク質が単離および／または精製中に変性される場合、タンパク質をリフォールディングするための周知技術を使用して、活性な立体配置を再生することができる。

カニクイザルＰＳＡの少なくとも１つのエピトープを含んでなる本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産するために使用することができる。タンパク質または核酸の免疫感作を使用して、マウス、キメラ、ヒト化および完全にヒトのモノクローナル抗体を作成するための技術は、当業者には知られている。

また本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、カニクイザルＰＳＡタンパク質の血清タンパク質への結合に影響を与えることにより、ＰＳＡタンパク質機能をモジュレートする物質の存在について、媒質をアッセイするために有用である。モジュレーターの例にはポリペプチドまたは低有機分子がある。

ＤＮＡワクチンとして使用するために、本発明のポリペプチドは、当業者に周知のような適切な調節配列および制御要素を有するプラスミド、哺乳動物ウイルス、バクテリアまたは哺乳動物細胞のような１もしくは複数の細胞送達ベクター内に含まれることができる。例えば腫瘍抗原および核酸補助ポリヌクレオチド配列の発現は、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＨＣＭＶＩＥ）プロモーターまたはジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびＳＶ４０後期、ＳＶ４０初期ｐｏｌｙＡシグナルまたは合成ｐｏｌｙＡ配列のようなポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルのような適切なプロモーターの制御下であることができる。ＨＣＭＶＩＥイントロンＡまたは抗原もしくは補助遺伝子に由来する天然のイントロンのようなイントロンは、発現を強化するために含めることができる。

本発明のポリペプチドに有用な例示的プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点、ａｐｈ（３’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、イントロンＡを含むＨＣＭＶ前初期プロモーター、合成ｐｏｌｙＡ配列およびウシ成長ホルモンターミネーターを含む。別の例示的プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点、ａｎｔ（４’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、ラウス肉腫ウイルス長末端（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌ）反復配列、ＨＣＭＶ前初期プロモーターおよびＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡ配列を含む。

本発明のポリペプチドに組換えウイルス宿主として作用することができる適切なウイルスの例には、当該技術分野で知られているようなワクシニア、カナリア痘およびアデノウイルスを含む。種々の遺伝的に工作されたウイルス宿主（組換えウイルス）も使用することができる。本発明の組成物を含有するウイルス細胞送達ベクターは、Ｂリンパ球、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化を標的とする適切な免疫応答を促進することができる。

本発明の組成物との使用に好適な組換えウイルスは、ワクシニアウイルス（国際公開第８７／０６２６２号パンフレット；Ｃｏｏｎｅｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１８８２−１８８６（１９９３）；Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６，２４４−２５２（１９９２）；ＭｃＥｌｒａｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６９，４１−４７（１９９４））である。別の態様では、組換えカナリア痘を使用することができる（Ｐｉａｌｏｕｘｅｔａｌ．，ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１１，３７３−３８１（１９９５），ｅｒｒａｔｕｍｉｎＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１１，８７５（１９９５）；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４，９７７−９８５（１９９６）；Ｆｒｉｅｓｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１４，４２８−４３４（１９９６）；Ｇｏｎｃｚｏｌｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１３，１０８０−１０８５（１９９５））。別の選択は欠損アデンノウルスまたはアデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスである（Ｇｉｌａｒｄｉ−Ｈｅｂｅｎｓｔｒｅｉｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１，２４２５−２４３１（１９９０）；Ｐｒｅｖｅｃｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１，２７−３０（１９９０）；Ｌｕｂｅｃｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６７６３−６７６７（１９８９）；Ｘｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１９，２２０−２２７（１９９６）。他の適切なウイルスベクターには、限定する訳ではないが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えばＫａｐｌｉｔｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ，Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２，３２０−３３０（１９９１）を参照にされたい）、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のような弱毒化または欠失ＤＮＡウイルスを含み、例えば米国特許第５，９９０，０９１号；同第５，７６６，５９９号；同第５，７５６，１０３号；同第６，０８６，８９０号；同第６，２７４，１４７号；同第５，５８５，２５４号；同第６，１４０，１１４号；同第５，６１６，３２６号；同第６，０９９，８４７号；同第６，２２１，１３６号；同第６、０８６，８９１号；同第５，９５８，４２５号；同第５，７４４，１４３号；同第５，５５８，８６０号；同第５，２６６，４８９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，７９５，８７２号；同第５，６９３，５３０号；同第６，０２０，１７２号明細書を参照にされたい。

本発明のポリペプチドを、製薬学的に許容され得る担体または希釈剤中に配合することができる。種々の水性担体、例えば０．４％食塩水、０．３％グリシン等を使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、そして一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は通例の周知な滅菌法（例えば濾過）により滅菌することができる。組成物は生理学的条件に近づけるために、ｐＨ調整および緩衝剤のような製薬学的に許容され得る補助物質を必要に応じて含むことがてきる。そのような製剤中の本発明のポリペプチドの濃度は、広く変動することができ、すなわち約０．５％未満から、通常は、または少なくとも約１％から多くても１５もしくは２０重量％であることができ、そして主に流体容量、粘度および選択した特定の投与様式に従い他の因子に基づき選択される。さらに本発明のポリペプチドを含有するプラスミドは、微粒子中に、または脂質、バッファーもしくは他の賦形剤と配合され得る。

本発明のポリペプチドは、ＤＮＡの送達を補助し、生体内におけるその完全性を維持し、またはワクチンの免疫原性を強化できるアジュバントと配合することもできる。化学アジュバントは、抗原に対する免疫応答を強化する化合物または混合物を含むことができる。化学アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポとして、およびまた免疫応答を非特異的に強化するリンパ系アクチベーターとしても役立つことができる（Ｈｏｏｄｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄｅｄ．，（１９８４），Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ，ｐ３８４）。アジュバントには限定するわけではないが完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリマー、ポリアニオン、ペプチド、油もしくは炭化水素エマルジョン、カサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ）のような有用なヒト用アジュバントを含む。アジュバントの選択は、ワクチン接種する個体に依存する。好ましくは製薬学的に許容され得るアジュバントが使用される。例えばヒト用のワクチンには完全および不完全フロインドアジュバントを含め、油または炭化水素エマルジョンアジュバントを回避すべきである。ヒトに使用するために適するアジュバントの１例は、ａｌｕｍ（アルミナゲル）である。具体的な態様では、本発明の組成物をａｌｕｍ中で筋肉内に投与する。あるいは本発明の組成物は皮下に、皮内に、腹腔内に、筋肉内に投与され得るか、または他の許容され得るワクチン投与経路を介して投与することができる。

本発明のポリペプチドは、異なる順序で一時的に投与することができ、あるいは同時に身体の異なる部位に投与することができる。本発明のポリペプチドは、筋肉、皮膚、リンパ節への直接注入により、あるいは粘膜表面への適用により送達することもできる。具体的な態様では、本発明のポリペプチドは筋肉内に提供される。他の有力な送達様式には、ＤＮＡの注入、続いて電気穿孔によるＤＮＡの細胞の取り込みおよび発現の強化、あるいは遺伝子銃または類似デバイスによる投与を含む。本発明のポリペプチドで免疫感作した個体に由来する血清または細胞の抗−腫瘍活性をスクリーニングするために、当該技術分野で知られている任意の適切なスクリーニングアッセイを使用することができる。

本発明のポリペプチドは、製薬学的調製物中にある場合、単位剤形で存在することができる。適切な治療に有効な用量は、当業者により容易に決定され得る。決定した用量は必要ならば、処置期間中に医師により適切に選択された適切な時間間隔で反復することができる。

本発明のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥し、そして使用前に適切な担体中に再構成することができる。この技術は従来のタンパク質調製を用いて効果的となることが示され、そして当該技術分野で知られている凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。

本発明の別の観点は、作用物質をカニクイザルに投与することを含んでなる、ヒト前立腺の疾患を処置するために使用する作用物質の効力を評価する方法である。ヒトとカニクイザルＰＳＡとの間の高い相同性は、カニクイザルが前立腺ガン用のＰＳＡ特異的ワクチンを試験するための適切なモデルであり、ならびに前立腺炎のような前立腺疾患の処置のための薬剤であることを示唆している。ワクチンとして本発明の方法に有用な作用物質には、核酸、ポリペプチドおよび細胞性ワクチンを含む。カニクイザルの前立腺は解剖学的および組織学的手段により評価する時、他の霊長類種よりもヒトの前立腺により類似しているようである（Ｈａｂｅｎｉｃｈｔｅｔａｌ．；Ｐｒｏｓｔａｔｅ１１，３１３−３２６（１９８７）。

成功裏の治療用のガンワクチンは、免疫系の、腫瘍が誘導する免疫抑制または免疫応答の逸脱を克服する能力に依存する。カニクイザルＰＳＡ遺伝子の同定およびシークエンシングは、どのように治療用ワクチンが完全に自己抗原に設定された寛容を打ち破ることができるかの可能性を理解するモデルとしてのカニクイザルの用途を提供する。例えば動物をカニクイザルＰＳＡ配列をコードするワクチンで免疫感作し、そして補助物、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは強力なヘルパーエピトープの包含のようなワクチン修飾を用いて寛容を破壊する最良の方法を評価することができる。この動物モデルは、ＰＳＡに対する非応答性のメカニズムに関する洞察を得、そして自己免疫、ヒト前立腺ガンの免疫療法に関する標的抗原としてＰＳＡを使用する細胞性応答を生じる方法の開発を可能とする系を提供する。

本発明の別の観点では、カニクイザルはＰＳＡ遺伝子に対する効果的な免疫応答を追加免疫するための異種免疫感作法を試験するために有用である。能動的ヒト免疫療法において、カニクイザルＰＳＡ遺伝子を使用することは、ＭＨＣクラスＩ抗原への強化された結合能力、または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する強化されたヘルパー活性を持つエピトープを潜在的に作成することによる現在の治療モダリティーよりも高レベルの効果を潜在的に提供することができる。これを大きな動物モデルで試験するために、ヒトＰＳＡワクチンをカニクイザルで試験して、この異種応答に関して重要なエピトープを分析することができる。

本発明をこれから以下の具体的な非限定的実施例を参照にして説明する。

実施例１
カニクイザルＰＳＡ遺伝子の単離、クローニングおよびシークエンシング
ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して、製造元の使用説明に従いカニクイザルの前立腺組織（カムブレックスバイオサイエンスウォーカーズビレ社（ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅＩｎｃ．）、ウォーカーズビレ、メリーランド州）から精製した。逆転写反応は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キットを使用して行い、そしてオリゴｄＴプライマーを使用して釣り上げた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、転写開始部位にアニールする遺伝子特異的フォワードプライマーを、ヒトおよびアカゲザルＰＳＡｍＲＮＡの３’非翻訳領域中の保存領域とアニールするリバースプライマーと対合させた（配列番号１１および１２、表１、５’ＰＳＡおよび３’ＰＳＡ）。最初のＡＴＧは表１に示す５’ＰＳＡプライマーの残基１９−２１に位置する。５’ＰＳＡプライマーは、５’末端に工作したＢａｍＨＩ部位（表１の下線部）をもつ翻訳開始部位にアニールし、そして３’ＰＳＡプライマーは、３’末端に工作したＢａｍＨＩ部位をもつ３’非翻訳領域内の保存領域にアニールする。１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型を用いて１００ｎｇの各プライマーを使用するＰＣＲを以下の条件で行った：９４℃で３０秒、６０℃で１分、６８℃で１分の３０サイクル、続いて６８℃で５分の１サイクル。１０パーセントのＰＣＲ反応がアガロースゲルで分析され、そして約１０００ｂｐのバンドが明らかになった（データは示さず）。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製を使用して精製した（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）。約６０ｎｇの各産物は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して直接配列決定し、続いてＰｒｉｓｍＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡシークエンシング装置で分析した。ＰＣＲフラグメントは、ヌクレオチド３８３−４０６および６５３−６７６にそれぞれ対応する２０ｎｇの５’ＰＳＡ配列および３’ＰＳＡ配列プライマーを使用して配列決定した（表１の配列番号１３および１４）。加えて、特異的ＰＣＲ産物もサブクローン化し、そして配列決定した。生じたすべてのＰＳＡ遺伝子は、少なくとも２匹のカニクイザルに由来する前立腺組織から確認した。

フラグメントの配列は、ＶｅｃｔｏｒＮＴｉソフトウェア（インビトロジェン、フレデリック、メリーランド州）を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースと比較し、そしてヒトおよびアカゲザルのＰＳＡ配列（それぞれＧｅｎｂａｎｋ寄託番号＃Ｍ２１８９６および＃Ｘ７３５６０）と整列させた。カニクイザルＰＳＡ配列も、利用可能なｅｍｂｌおよび他の配列データベースに対してＢＬＡＳＴで調査した。ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＮ調査を行い、そして同一の記録は見つからなかった。

カニクイザルＰＳＡ遺伝子の５’および３’非翻訳領域の完全配列を得るために、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）を使用した。全ＲＮＡは少なくとも２匹のオス成体のカニクイザルの前立腺から抽出し、そしてｍＲＮＡ転写物の５’および３’非翻訳領域を、それぞれヌクレオチド４９−７２および７８２−８０５（配列番号１５および１６）に対応する表１に示す５’および３’ＲＡＣＥプライマーを使用して、リガーゼ−媒介ＲＡＣＥ反応により増幅した。

３匹の異なるサルに由来する４つのクローンを配列決定し、そして整列した。完全長のカニクイザルＰＳＡｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を図１および配列番号１および２に示す。図１では、コード領域の翻訳されたアミノ酸配列を番号付けし、そしてヌクレオチド配列の上に示す。ヌクレオチド残基は左に番号を付す。推定されるポリアデニル化シグナルは太字で示す。

ｃＤＮＡフラグメントのシークエンシング分析では、カニクイザルＰＳＡｍＲＮＡが約３３塩基（配列番号１の残基１〜３３）の短い５’非コーディング領域、２６１アミノ酸（配列番号３）に対応する７８３塩基（配列番号１の残基３４〜８１６）のオープンリーディングフレーム、および６６０塩基（配列番号１の残基８１７〜１４７６）の３’非翻訳領域からなることが示された。カニクイザルＰＳＡの最初の２４アミノ酸は、シグナル配列を含むと予想される（配列番号６）。成熟ＰＳＡのアミノ末端は、図１の残基１に示すようにイソロイシンになると予想される。カニクイザルＰＳＡに由来する成熟２３７アミノ酸形のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および５に示す。

実施例２
霊長類ＰＳＡ遺伝子の配列比較
ＧｅｎｂａｎｋデーターベースのヒトおよびアカゲザルＰＳＡｃＤＮＡに対するカニクイザルＰＳＡ配列のタンパク質配列の比較を図２に示す。種間で異なる残基を太字で示して強調する。各種は２３７アミノ酸長となることが予想される成熟タンパク質をコードする。この比較は、カニクイザルＰＳＡのアミノ酸配列がヒトＰＳＡと８９．７％同一であることを明らかにした（２７／２６１残基の差異）（図２）。アカゲザルのアミノ酸配列はヒト遺伝子と９０％同一であった（２６／２６１残基の差異）。カニクイザルおよびアカゲザルのアミノ酸配列はわずか２個のアミノ酸、すなわち成熟形の残基２１および４６で異なり、９９．２％の同一性であった。

３種の遺伝子のヌクレオチド配列も、コード領域について比較した。およそ９３．５％の同一性がヒトとカニクイザルとアカゲザルの配列の間に存在する（データは示さず）。２種の霊長類ｃＤＮＡの間ではこの領域にわずか３個のヌクレオチド残基が異なり、９９．６％の同一性を与える。ヒトおよびアカゲザルのタンパク質と同様に、カニクイザルＰＳＡも１８３位にセリンを有し、これは疎水性アミノ酸でセリンプロテアーゼの切断特異性の原因となることが示されている（Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．ａｎｄＬｉｌｊａ，Ｈ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２１４，３１７−３２２（１９８７））。

５’非翻訳領域（ＵＴＲ）はアカゲザルとカニクイザルの間で同一であった。カニクイザルの５’ＵＴＲの配列はヒトの配列よりも８塩基長かった（データは示さず）。

種間に３’ＵＴＲ中で幾つかの差異があった。第１にカニクイザルの３’ＵＴＲはアカゲザルの３’ＵＴＲよりも７５塩基短く、７２塩基対の欠失がカニクイザルの配列のＴＧＡ終止コドンから塩基４０５／４０６に位置している。これらの欠失の外に、種間には３’ＵＴＲにおけるわずか３個のヌクレオチド差異が存在する。予想通り、ヒトとカニクイザルの３’ＵＴＲにはさらなる差異が存在した。第１に、ヒトの配列にはカニクイザル配列のｂｐ３４〜８７に対応する５４塩基対の欠失が存在する。さらにカニクイザルの配列にはヒトの配列に比べて４塩基対の付加があり、そして７２塩基対の欠失に加えて１塩基対の欠失がある。また種間には３１塩基対の差異が存在する（データは示さず）。

実施例３
カニクイザル組織でのＰＳＡ発現の分析
カニクイザル組織におけるカニクイザルＰＳＡのＲＮＡ発現パターンを調査するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析は種々の組織から精製したＲＮＡを使用して行った。腎臓、肺、精巣、胸腺および前立腺からの全ＲＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡを実施例１に記載したように合成した。非特異的増幅用に、陰性対照としてＤＮＡ鋳型は使用しなかった。単離した全ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを使用した第１鎖合成用の鋳型として使用した。１００ｎｇのｃＤＮＡを上記のようにＰＣＲ増幅に供した。ＰＳＡ遺伝子は５’ＰＳＡ（配列番号１１）および３’ＰＳＡ（配列番号１２）プライマーを使用して増幅し、１０００ｂｐのＰＳＡ特異的産物を得た。β−アクチンはカニクイザル特異的フォワード（配列番号１７）およびリバース（配列番号１８）プライマーを使用して添加対照として増幅した；２１６ｂｐの産物が増幅された。この結果は、ＰＳＡｍＲＮＡが前立腺組織でのみ検出され、そして腎臓、肺、精巣または胸腺では検出されないことを示した（データは示さず）。

本発明を完全に記載したが、添付する特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、当業者には多くの変更および修飾がなされ得ることは明らかであろう。

完全長のカニクイザルＰＳＡのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。カニクイザル、ヒトおよびアカゲザルＰＳＡのアミノ酸配列比較を示す。

Claims

作用物質をカニクイザルに投与することを含んでなる、ヒト前立腺の疾患を処置するために使用する作用物質の効力の評価方法。
ヒト前立腺疾患が前立腺ガンである請求項１に記載の方法。
ヒト前立腺疾患が前立腺炎である請求項１に記載の方法。
作用物質がワクチンを含んでなる請求項２に記載の方法。
ワクチンがＤＮＡワクチンである請求項４に記載の方法。
ＤＮＡワクチンが配列番号３または５に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなる請求項５に記載の方法。