DE69634563T2

DE69634563T2 - Verbesserte verfahren zur transfektion der t-zellen

Info

Publication number: DE69634563T2
Application number: DE69634563T
Authority: DE
Inventors: H. Carl JUNE; B. Craig THOMPSON; Suil Kim
Original assignee: University of Michigan; US Department of Navy
Current assignee: University of Michigan; US Department of Navy
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: CA2220226C; US20060246587A1; JPH11505419A; CA2220226A1; JP2007125041A; ATE292689T1; DE69634563D1; JP4031033B2; JP4189007B2; JP2006109844A; WO1996034970A1; EP0824594B1; EP0824594A1

Description

Unterstützung durch die Regierung
Die hier beschriebene Arbeit wurde in Teilen von der NMRDC Bewilligung 61153N AE. 4120.001.1402. unterstützt. Die US-Regierung kann deshalb bestimmte Rechte an der Erfindung haben.
Hintergrund
Die Expression exogener DNA in eukaryontischen Zellen ermöglicht die Untersuchung eines weiten Bereiches biologischer Themen, die von der Regulation der Genexpression bis zur Behandlung von Krankheiten durch auf Gen-Transfer basierende Therapien reicht. Es wurden etliche Verfahren zum Gen-Transfer in Säuger-Zellen entwickelt. Diese beinhalten die in vivo- und in vitro-Infektion mit clonierten retroviralen Vektoren (Shimotohno, K. und Temin, H. M. (1981) Cell 26: 67–77; Cone, R. D. und Mulligan, R. C. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349–6353; Dubensky, T. W., Campbell, B. A. und Villareal, L. P. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7529–7533); Seeger, C., Ganem, D. und Varmus, H. E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5849–5852), Copräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Chu, G. und Sharp, P. (1981) Gene 13: 197–202; Benvenisty, N. und Reshef, L. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9551–9555), Einkapseln von DNA in Liposomen (Felgner, P. L. und Ringold, G. M. (1989) Nature 337: 387–388; Kaneda, Y., Iwai, K. und Uchida, T. (1989) Science 243: 375–378), direkte Injektion von Plasmid-DNA (Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. und Felgner, P. L. (1990) Science 247: 1465–1468), DEAE-Dextran (McCutchan, J. H. und Pagano, J. S: (1968) J. Natl. Cancer Inst. 41: 351–357, Elektroporation (Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y. und Hofschneider, P. H. (1982) EMBO J. 1: 841–845; Cann, A. J. Koyanagi, Y. und Chen, I. S. Y. (1988) Oncogene 3: 123–128) und Beschuss von Zellen und Geweben mit DNA beschichteten Partikeln (Yang, N-S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B. und McCabe, D. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568–9572).
Obwohl die Transfektion zahlreicher Zelltypen mit einem exogenen Nucleinsäuremolekül, das ein Gen enthält, zur effizienten Expression des exogenen Gens führt, hat sich gezeigt, dass primäre T-Lymphocyten, z. B. periphere Blut-T-Lymphocyten, die von einem Individuum erhalten wurden, beständig gegen die Transfektion und Expression exogener DNA sind. Primäre T-Lymphocyten haben sich auch als beständig gegen die Expression der eingeführten Nucleinsäure erwiesen, wenn sie zunächst zum Proliferieren stimuliert wurden. Deshalb wird immer noch ein System, das die effiziente Einführung exogener DNA in primäre T-Zellen und Expression der exogenen DNA in der T-Zelle erlaubt, benötigt.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zum Transfizieren von T-Zellen mit einem ein Gen enthaltenden Nucleinsäuremolekül bereit, so dass die Expression des Gens in den T-Zellen verglichen mit klassischen Transfektions-Techniken verstärkt wird. Das Verfahren der Erfindung ist besonders zum Transfizieren primärer T-Zellen nützlich, die gegen klassische Transfektions-Techniken beständig sind. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer proliferierenden T-Zelle mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die die proliferierende T-Zelle stimulieren, vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zelle. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die T-Zelle mit einer Kombination eines ersten Wirkstoffs, der ein primäres Aktivierungssignal für die T-Zelle zur Verfügung stellt, und einem zweiten Wirkstoff, der ein co-stimulierendes Signal auslöst, stimuliert. Das Verfahren der Erfindung hat zahlreiche Anwendungen, im Besonderen für die Gentherapie.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt grafisch die relative Zellzahl und das Zellvolumen von CD28⁺-T-Zellen am Tag 1, 5, 7, 9 und 11 nach der Stimulierung (am Tag 0) mit anti-CD3 beschichteten Scheiben und anti-CD28 bei 1 μg/ml.
2 zeigt eine Wachstumskurve von frisch isolierten CD28⁺-T-Zellen, die mit einer sättigenden Menge von immobilisiertem anti-CD3-mAK G19-4 (αCD3) in der Gegenwart des anti-CD28m-AK 9.3 (αCD28) stimuliert wurden.
3 zeigt einen Northern-Blot, der die Mengen von Ets-1 (ETS-1)- und menschlicher Leukocyten-Antigen (HLA)-mRNA in den primären CD28⁺-T-Zellen zeigt, die für 0, 6, 24 und 72 Stunden nach der ersten Stimulierung (Tag 1) oder einer zweiten Stimulierung (Tag 8) mit einer sättigenden Menge von immobilisierten anti-CD3-mAK G19-4(αCD3) und anti-CD28-mAK 9.3 (αCD28) angezogen wurden.
4 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein Transfektionsprotokoll, in dem ruhende T-Zellen (Rest) zunächst mit anti-CD3 und anti-CD28 (αCD3 + αCD28) für zwei Tage inkubiert wurden, gefolgt von einer Inkubation mit anti-CD28 allein (αCD28) für 3 Tage, 10 Stunden vor der Transfektion (erste Stimulation) stimuliert wurden, bei T = 0 transfiziert werden, 30 Stunden nach der Transfektion wieder stimuliert wurden (zweite Stimulation) und 10 Stunden später geerntet wurden.
Die 5 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von exponentiell wachsenden, mit RSV-CAT transfizierten T-Zellen ausgeführt wurden, die 10 Stunden vor der Transfektion mit Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) oder konditionierten Medium allein (MED) stimuliert wurden und 40 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
6 (Graph A–D) beschreibt die Ergebnisse der cytometrischen Durchflußanalyse der mit Acridinorange gefärbten primären T-Zellen und die Proliferationstests der primären T-Zellen, die unter den folgenden Bedingungen angezogen wurden: unbehandelte ruhende primäre T-Zellen (Graph A), T-Zellen, die für 3 Tage mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden (Graph B), T-Zellen, die für 3 Tage mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden und dann in frischem Medium für 3 weitere Tage inkubiert wurden (Graph C), oder T-Zellen, die für 3 Tage mit anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden, für 10 Stunden mit Phorbol-12,13-Dibutyrat (PDBU) plus Ionomycin stimuliert und dann in frischem Medium für weitere 2 Tage und 14 Stunden inkubiert wurden (Graph D). Die grafische Darstellung der cytometrischen Durchflußanalyse der mit Acridinorange gefärbten Zellen zeigt den DNA- und RNA- Gehalt der Zellen, der ein Anhaltspunkt für die Anzahl der Zellen in der G0 (%Go), G1 (%G1) und S/G2M (%S/G2M)-Phase des Zellzyklus ist.
7 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von exponentiell wachsenden T-Zellen durchgeführt wurden, die mit RSV-CAT transfiziert wurden und die 10 Stunden vor der Transfektion (1°) mit Medium allein (MED) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) stimuliert wurden und 30 Stunden nach der Transfektion (2°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO), anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (αCD3 + αCD28) oder konditioniertem Medium (COND MED) stimuliert wurden und 10 Stunden später geerntet wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
8 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von exponentiell wachsenden T-Zellen durchgeführt wurden, die mit einem HIV-1-CAT-Expressions-Konstrukt transfiziert wurden und die 10 Stunden vor der Transfektion (1°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) oder anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (αCD3 + αCD28) stimuliert wurden und die 30 Stunden nach der Transfektion (2°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO), anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern (αCD3 + αCD28), oder konditioniertem Medium (COND MED) stimuliert wurden und 10 Stunden später geerntet wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
9 zeigt den Gesamt-RNA-Gehalt (Graph A) oder die Mengen an mRNA für IL-2 (Graph B) und HLA (Graph C), die mittels Northern-Blot-Analyse von CD28⁺-T-Zellen bestimmt wurden, die mit dem Medium allein (MED) für 12 Stunden oder mit einem anti-CD3-Antikörper (CD3) für 1, 6, 12 und 24 Stunden angezogen wurden. Graph D zeigt den Gehalt an IL-2, das von den T-Zellen hergestellt wurde, die mit dem Medium allein (MED) für 12 Stunden oder mit einem anti-CD3-Antikörper (CD3) für 1, 6, 12, 24 oder 48 Stunden angezogen wurden, und den Prozentsatz der Zellen in Phase S, G2 oder M des Zellzykluses nach 48 Stunden Anzucht mit anti-CD3.
10 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von exponentiell wachsenden T-Zellen durchgeführt wurden, die mit einem IL2-CAT-Expressions-Konstrukt transfiziert wurden und die 10 Stunden vor der Transfektion (1 °) mit dem Medium allein (MED) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) stimuliert wurden und die 30 Stunden nach der Transfektion (2°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO), anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (αCD3 + αCD28) oder konditioniertem Medium (COND MED) stimuliert wurden und 10 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
11 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von ruhenden T-Zellen durchgeführt wurden, die mit RSV-CAT transfiziert und 10 Stunden vor der Transfektion mit dem Medium allein (Tag 1: MED), anti-CD28 (Tag 1: αCD28), Enterotoxin A von Staphylococcus (Tag 1: SEA) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (Tag 1: PDBU + IONO) oder mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern für 5 Tage stimuliert wurden und die dann für 10 Stunden vor der Transfektion mit konditioniertem Medium (Tag 6: MED) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (Tag 6: PDBU + IONO) behandelt wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
12 zeigt Autoradiogramme von Southern-Blots mit Kern-DNA (Kern, Graph A) oder cytoplasmatischer DNA (Cyto, Graph B), die aus proliferierenden T-Zellen 0, 6, 24 oder 48 Stunden nach Transfektion der proliferierenden T-Zellen mit RSV-CAT oder keinem Plasmid (MOCK) extrahiert wurde, die 10 Stunden vor der Transfektion mit Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) oder konditioniertem Medium allein (MED) stimuliert wurden, und mit einem EcoRI-Fragment aus der CAT-codierenden Region des RSV-CAT hybridisiert wurde. Die Plasmid-DNA, die 1 (1c), 10 (10c), 100 (100c) und 1000 (1000c) Kopien des RSV-CAT/Zelle entsprach, wurde als Kontrolle genutzt. (lin) lineares Plasmid; (sc) überspiralisiertes Plasmid. Links in den Southern-Blots wird die Größe der Fragmente (in Kilobasen, kb) von einem Molekulargewichtsmarker gezeigt.
13 zeigt Autoradiogramme der Southern-Blots von Kern-DNA, die aus exponentiell wachsenden T-Zellen, die mit RSV-CAT transfiziert wurden und die 10 Stunden vor der Transfektion (1°) mit dem Medium allein (MED) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) stimuliert wurden und die 30 Stunden nach der Transfektion (2°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO), anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (αCD3 + αCD28) oder konditioniertem Medium (COND MED) stimuliert wurden und die mit einem EcoR1-Fragment aus der CAT-codierenden Region des RSV-CAT hybridisiert wurden. Die Plasmid-DNA, die 1 (1c), 10 (10c), 100 (100c) und 1000 (1000c) Kopien von RSV-CAT/Zelle entsprach, wurde als Kontrolle genutzt. (lin) lineares Plasmid; (sc) supergeknäueltes Plasmid. M: Molekulargewichts Marker.
14 zeigt Autoradiogramme von Southern-Blots mit Kern-DNA, die aus exponentiell wachsenden T-Zellen extrahiert wurde, die mit einem IL-2-CAT-Expressions-Konstrukt transfiziert wurden und die 10 Stunden vor der Transfektion (1°) mit Medium allein (MED) oder Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) stimuliert wurden und die 30 Stunden nach der Transfektion (2°) mit dem Medium allein (MED), Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO), anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern (αCD3 + CD28) oder konditioniertem Medium (COND MED) stimuliert wurden, und mit einem EcoRI/BamHI-Fragment aus der CAT-codierenden Region von IL-2-CAT hybridisiert wurde. Die Plasmid-DNA, die 1, 10, 100 und 1000 Kopien von IL-2-CAT/Zelle entsprach, wurde als Kontrolle genutzt. (lin) lineares Plasmid; (sc) supergeknäueltes Plasmid. M: Molekulargewichtsmarker.
Die 15 zeigt den Prozentsatz der Zählimpulse pro Minute (CpM), die aus den Kernen (Kern) oder dem Cytoplasma (cytoplasmatisch) der T-Zellen gewonnen wurden, die mit ³²P-radioaktiv markiertem linearisiertem RSV-CAT transfiziert wurden, und die 10 Stunden vor der Transfektion mit Phorbol-12,13-Dibutyrat und Ionomycin (PDBU + IONO) oder konditioniertem Medium allein (MED) stimuliert wurden und die sofort (0), 6, 24 oder 48 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden. Der Prozentsatz der Zählimpulse pro Minute wird relativ zur Gesamtzahl der Zählimpulse pro Minute, die den Zellen für die Transfektion zugefügt wurden, berechnet.
16 zeigt die Ergebnisse der CAT-Tests, die mit Zellextrakten von proliferierenden T-Zellen ausgeführt wurden, die mit einem RSV-CAT oder einem HIV-1-CAT transfiziert wurden und die mit dem Medium allein (MED), Monocyten (Mono), Enterotoxin A aus Staphylococcus (SEA) oder Monocyten und Enterotoxin A aus Staphylococcus (MONO + SEA) für 10 Stunden vor der Transfektion behandelt wurden und 40 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (% Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zum Transfizieren einer T-Zelle mit einem Nucleinsäuremolekül bereit, das ein Gen umfasst, so dass das Gen in der T-Zelle exprimiert wird. Das Verfahren der Erfindung umfasst das Inkontaktbringen einer proliferierenden T-Zelle mit wenigstens einem Wirkstoff, der die proliferierende T-Zelle stimuliert, bevor das Nucleinsäuremolekül in die T-Zelle eingebracht wird, so dass das Gen in der der T-Zelle exprimiert wird.
Das Verfahren der Erfindung basiert wenigstens in Teilen auf der Beobachtung, dass die Transfektion primärer T-Zellen mit Nucleinsäuren, die ein Gen beinhalten, zu einer geringen Expression des Gens führt, ausser die primären T-Zellen proliferieren und werden außerdem mit stimulierenden Wirkstoffen stimuliert werden, wie zum Beispiel Wirkstoffen, die ein primäres Aktivierungssignal und ein co-stimulierendes Signal in den T-Zellen induzieren. Die T-Zellen werden vorzugsweise mit den stimulierenden Wirkstoffen etwa 10 Stunden vor der Einführung der Nucleinsäure in die T-Zellen in Kontakt gebracht. So kann die signifikante Expression eines exogenen Gens in T-Zellen durch Stimulierung proliferierender T-Zellen vor der Einführung einer Nucleinsäure, die das Gen beinhaltet, in die T-Zellen erreicht werden.
Deshalb stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Transfizieren von T-Zellen mit einem Nucleinsäuremolekül, das ein Gen beinhaltet, bereit, so dass das Gen in den T-Zellen exprimiert wird. Die durch die Verfahren der Erfindung bereitgestellte Verbesserung gegenüber klassischen T-Zellen-Transfektions-Verfahren schließt das Inkontaktbringen der T-Zelle mit einem stimulierenden Wirkstoff vor (z. B. einige Stunden) der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die proliferierende T-Zelle ein.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht eine wesentlich stärkere Expression des Gens, das in die T-Zellen eingeführt wird, als herkömmliche Transfektions-Techniken. Das Verfahren der Erfindung ist besonders nützlich zum Einbringen und Exprimieren eines interessanten Gens in primäre T-Zellen. Deshalb werden in einer spezifischen Ausführungsform des Verfahrens T-Zellen von einem Individuum erhalten, in vitro mit einem Nucleinsäuremolekül in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung transfiziert und dem Wirt wieder zugeführt. Das interessante Gen kann ein Gen sein, das ein Protein codiert oder ein Gen, das ein funktionales RNA-Molekül wie zum Beispiel ein Antisense-Molekül oder ein Ribozym codiert. Das interessante Gen kann jedes interessante Protein codieren, einschließlich der Proteine, die T-Zellen schützen, Proteine, die gegenüber T-Zellen toxisch sind, oder Proteine, die von T-Zellen sekretiert werden, um Effekte auf andere Zellen auszuüben. Deshalb ist das Verfahren der Erfindung z. B. auf die Gentherapie, die Änderung der T-Zellfunktion und die Herstellung von Proteinen in T-Zellen anwendbar.
1. T-Zellen, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung transfiziert werden können
Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Transfizieren einer T-Zelle mit einem Nucleinsäuremolekül, das ein Gen umfasst, ein, so dass das Gen in der T-Zelle exprimiert wird. Der Begriff „T-Zelle" bezieht sich auf T-Lymphocyten, wie sie im Fachgebiet definiert werden, und beabsichtigt Thymocyten, unreife T-Lymphocyten, reife T-Lymphocyten, ruhende T-Lymphocyten oder aktivierte T-Lymphocyten mit einzuschließen.
Die T-Zellen können CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, CD4⁺CD8⁺-T-Zellen oder CD4^– CD8^–-T-Zellen sein. Die T-Zellen können auch T-Helferzellen wie zum Beispiel T-Helfer-1- (Th1) oder T-Helfer-2 (Th2)-Zellen sein. T-Zellen, die sich wenigstens in einem Merkmal voneinander unterscheiden, wie zum Beispiel CD4, werden hier als „Untergruppen" von T-Zellen bezeichnet.
Die T-Zellen können eine gereinigte Population von T-Zellen sein oder alternativ dazu können die T-Zellen in einer Population mit Zellen eines anderen Typs wie zum Beispiel B-Zellen und/oder anderen peripheren Blutzellen sein. Die T-Zellen können eine gereinigte Population einer Untergruppe von T-Zellen wie zum Beispiel CD4⁺-T-Zellen sein oder sie können eine T-Zell-Population sein, die verschiedene T-Zellen-Untergruppen umfasst. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die T-Zellen T-Zellclone, die in Kultur über lange Zeiträume erhalten wurden. T-Zellenclone können in verschiedenen Ausmaßen transformiert werden. In einer spezifischen Ausführungsform sind die T-Zellen T-Zellclone, die in Kultur unbegrenzt proliferieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die T-Zellen primäre T-Zellen. Der Ausdruck „primäre T-Zellen" beabsichtigt T-Zellen, die von einem Individuum erhalten werden, einzuschließen, im Gegensatz zu T-Zellen, die in Kultur über lange Zeiträume erhalten wurden. Deshalb sind primäre T-Zellen vorzugsweise periphere Blut-T-Zellen, die von einem Individuum erhalten wurden. Eine Population primärer T-Zellen kann meistens aus einer Untergruppe von T-Zellen zusammengesetzt sein. Alternativ dazu kann die Population primärer T-Zellen aus verschiedenen T-Zell-Untergruppen zusammengesetzt sein.
Die T-Zellen können von einem gesunden Individuum stammen oder alternativ dazu können die T-Zellen von einem Individuum stammen, das von einem Zustand betroffen ist. Der Zustand kann eine Infektionskrankheit sein, wie zum Beispiel ein Zustand, der von einer viralen Infektion, einer bakteriellen Infektion oder einer Infektion durch jeden anderen Mikroorganismus herrührt. In einer speziellen Ausführungsform stammen die T-Zellen von einem mit einem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) infizierten Individuum. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung stammen die T-Zellen von einem Individuum, das an einer Autoimmunkrankheit leidet oder dafür anfällig ist. Die T-Zellen können menschlicher Herkunft oder murinen Ursprungs sein oder von jeder anderen Säugerart stammen.
In Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung wird das Nucleinsäuremolekül in T-Zellen eingeführt, die aktiv proliferieren. Die T-Zellen können zum Proliferieren stimuliert werden, indem die T-Zellen mit einer Vielzahl von Wirkstoffen in Kontakt gebracht werden, wie zum Beispiel einer Kombination von Wirkstoffen, die ein primäres Aktivierungssignal und ein co-stimulierendes Signal für die T-Zellen bereitstellen. Wirkstoffe, die benutzt werden können, T-Zellen zum Proliferieren anzuregen, sind im Fachgebiet gut bekannt und weiter unten in Sektion 2 beschrieben. T-Zellen, die zum Proliferieren stimuliert werden, sind durch zelluläre Vergrößerung, Verklumpung und Ansäuerung des Anzuchtmediums gekennzeichnet. Deshalb kann T-Zell-Proliferation zum Beispiel durch Kontrollieren der Größe oder Messen des T-Zell-Volumens bewiesen werden, wie zum Beispiel mit einem Coulter-Counter. Eine ruhende T-Zelle hat einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 6,8 Mikrometer. Im Anschluss an die anfängliche Aktivierung und Stimulierung der T-Zelle steigt der durchschnittliche Durchmesser bis auf über 12 Mikrometer am Tag 4 an und beginnt etwa am Tag 6 abzunehmen. Außerdem kann die T-Zell-Proliferation mit im Fachgebiet bekannten Standardtechniken wie zum Beispiel der Tritium-Thymidin Aufnahme, abgeschätzt werden.
2. Stimulierende Wirkstoffe
Das Verfahren der Erfindung bezieht das Inkontaktbringen proliferierender T-Zellen mit wenigstens einem stimulierenden Wirkstoff vor dem Einbringen des Nucleinsäuremoleküls in die proliferierende T-Zelle ein. Der Begriff „stimulierender Wirkstoff" beabsichtigt Wirkstoffe mit einzuschließen, die für ein Signal zu den T-Zellen sorgen, so dass die Menge der Expression des Gens, das in dem Nucleinsäuremolekül enthalten ist, das in die T-Zelle transfiziert wird, höher ist, wenn die T-Zelle mit dem stimulierenden Wirkstoff vor dem Einbringen des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zelle in Kontakt gebracht wird, als in T-Zellen, die nicht mit dem stimulierenden Wirkstoff vor Einbringen des Nucleinsäuremoleküls in Kontakt gebracht wurden.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist der stimulierende Wirkstoff ein Wirkstoff, der für ein primäres Aktivierungssignal zu einer T-Zelle sorgt. Der Begriff „primäres Aktivierungs-Signal" beabsichtigt Signale einzuschließen, die typischerweise durch den TCR/CD3-Komplex ausgelöst werden und die Aktivierung von T-Zellen induzieren. Die Aktivierung einer T-Zelle soll Modifizierungen einer T-Zelle einschließen, so dass die T-Zelle zum Proliferieren induziert wird und sich, nachdem sie ein zweites Signal wie zum Beispiel ein co-stimulierendes Signal erhalten hat, differenziert. In einer spezifischen Ausführungsform wird das primäre Aktivierungssignal durch einen Wirkstoff bereitgestellt, der mit dem T-Zellrezeptor oder dem CD3-Komplex, der mit dem T-Zellrezeptor assoziiert ist, in Kontakt tritt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff ein Antikörper, der gegen CD3 reaktiv ist, wie zum Beispiel der monoclonale Antikörper OKT3 (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, Nr. CRL 8001). In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der stimulierende Wirkstoff ein Wirkstoff, der den CD2-Komplex auf T-Zellen stimuliert, wie zum Beispiel eine Kombination von Antikörpern, z. B. T11.3 + T11.1 oder T11.3 + T11.2 (siehe z. B. Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36: 897–906).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit einer Kombination der Wirkstoffe stimuliert, die sowohl ein primäres Aktivierungssignal als auch ein co-stimulierendes Signal in der Zelle auslösen. Der Begriff "co-stimulierender Wirkstoff" beabsichtigt Wirkstoffe einzuschließen, die ein co-stimulierendes Signal in T-Zellen bereitstellen, so dass eine T-Zelle, die ein primäres Aktivierungssignal (z. B. eine aktivierte T-Zelle) erhalten hat, zum Proliferieren oder zur Sekretion von Cytokinen wie zum Beispiel IL-2, IL-4 oder Interferon-γ stimuliert wird. In einer spezifischen Ausführungsform interagiert der co-stimulierende Wirkstoff mit CD28- oder CTLA4-Molekülen an der Oberfläche der T-Zellen. In einer noch spezifischeren Ausführungsform ist das co-stimulierende Signal ein Ligand von CD28 oder CTLA4 wie zum Beispiel das B-Lymphocytenantigen B7-1 oder B7-2. Der Begriff „stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28" beabsichtigt, B7-1- und B7-2-Moleküle, Fragmente davon oder Modifizierungen davon einzuschließen, die in der Lage sind, T-Zellen co-stimulierende Signale bereit zustellen. Stimulierende Formen natürlicher Liganden von CD28 können z. B. durch Inkontaktbringen aktivierter peripherer Blutlymphocyten mit einer Form eines natürlichen Liganden von CD28 und durch Ausführen eines Standard-T-Zell-Proliferations-Tests identifiziert werden. Deshalb ist eine stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28 in der Lage, die Proliferation der T-Zellen zu stimulieren. Stimulierende Formen natürlicher Liganden von CD28/CTLA4 werden zum Beispiel in PCT-Veröffentlichung Nr. WO95/03408 beschrieben.
Andere Wirkstoffe, die zum Stimulieren von T-Zellen vor Einführung eines Nucleinsäuremoleküls in die T-Zelle benutzt werden können, beinhalten Wirkstoffe, die ein oder mehrere intrazelluläre Signaltransduktionswege stimulieren, die an der T-Zellaktivierung und/oder -Co-Stimulierung beteiligt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der stimulierende Wirkstoff ein Calcium-Ionophor wie zum Beispiel Ionomycin oder A23187. Alternativ dazu kann der stimulierende Wirkstoff ein Wirkstoff sein, der die Proteinkinase C stimuliert, wie zum Beispiel ein Phorbolester. Ein bevorzugter Phorbolester ist Phorbol-12,13-Dibutyrat. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit einer Kombination eines Calcium-Ionophors und eines Phorbolesters vor der Transfektion mit einem Nucleinsäuremolekül in Kontakt gebracht. Der stimulierende Wirkstoff kann auch ein Wirkstoff sein, der Proteintyrosinkinasen aktiviert. Ein bevorzugter Wirkstoff, der Proteintyrosinkinasen stimuliert, ist Pervanadat (O'Shea, J. J., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10306).
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der stimulierende Wirkstoff ein polyclonaler Aktivator. Polyclonale Aktivitatoren beinhalten Wirkstoffe, die an Glycoproteine binden, die an der Plasmamembran der T-Zellen exprimiert werden, und schließen Lectine wie zum Beispiel Phytohämaglutinin (PHA), Concanavalin (Con A) und Kermesbeeren-Mitogen (PWM) ein.
Es ist möglich selektiv nur einen bestimmten Clon von T-Zellen in einer Population von T-Zellen zu transfizieren, indem ein Clon ein spezifisches Aktivierungssignal erhält. Die spezifische Aktivierung eines T-Zell-Clons kann zum Beispiel erreicht werden, indem ein spezifisches Antigen benutzt wird, das von einer antigen-präsentierenden Zelle gebildet wird.
In noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist der stimulierende Wirkstoff ein Lymphokin wie zum Beispiel IL-2. Das Lymphokin wird vorzugsweise in Kombination mit einem anderen Wirkstoff wie zum Beispiel einem Wirkstoff, der für ein primäres Aktivierungssignal zu der T-Zelle sorgt, um die T-Zellen zu stimulieren, benutzt. Deshalb werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung T-Zellen mit einer Kombination eines Wirkstoffes, der für ein primäres Aktivierungssignal zu den T-Zellen sorgt (zum Beispiel einem anti-CD3 Antikörper) und einer effektiven Menge an IL-2 vor dem Transfizieren der T-Zellen mit einem Nucleinsäuremolekül in Kontakt gebracht, so dass das Nucleinsäuremolekül in den T-Zellen exprimiert wird.
Andere stimulierende Wirkstoffe, die benutzt werden können, beinhalten Super-Antigene. Der Begriff „Super-Antigen", wie er hier definiert wird, beabsichtigt, bakterielle Enterotoxine oder andere bakterielle Proteine, die in der Lage sind, die Proliferation der T-Zellen zu stimulieren, mit einzuschließen. Super-Antigene beinhalten Enterotoxine aus Staphylococcus (SE), wie SEA, SEB; SEC; SED und SEE. Super-Antigene können auch viraler Herkunft sein, wie retrovirale Super-Antigene.
Weitere Wirkstoffe, die in der Lage sind T-Zellen entweder allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zu stimulieren, und die identifiziert werden können, wobei T-Zell-Stimulationstests, die im Fachgebiet bekannt sind oder hier beschrieben werden, benutzt werden, sind auch im Geltungsbereich der Erfindung. Um T-Zellen vor der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen zu stimulieren, kann jede Kombination der oben beschriebenen Wirkstoffe benutzt werden.
Die stimulierenden Wirkstoffe können in Lösung benutzt werden oder an eine feste Oberfläche angeheftet sein. Die feste Oberfläche kann zum Beispiel die Oberfläche einer Gewebekulturschale oder eine Perle sein. Abhängig von der Natur des stimulierenden Wirkstoffs kann die Bindung an die feste Oberfläche mit im Fachgebiet wohl bekannten Verfahren ausgeführt werden. Zum Beispiel können Proteine chemisch an die Zelloberfläche querverbunden werden, wobei handelsübliche Querverbindungsreagenzien (Pierce, Rockford IL) benutzt werden, oder durch über-Nacht-Inkubation bei 4°C an Plastik immobilisiert werden. Wenn zur Stimulierung der T-Zellen mehrere Wirkstoffe benutzt werden, können einige Wirkstoffe in Lösung und einige Wirkstoffe an ein festes Hilfsmittel angelagert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die T-Zellen mit einer Kombination eines anti-CD3-Antikörpers, der an eine feste Phase gekoppelt ist, und einem löslichen anti-CD28-Antikörper stimuliert.
Die spezifische Menge des(r) stimulierenden Wirkstoffs(e), der (die) zu den T-Zellen hinzugegeben wird, verändert sich mit der Art des stimulierenden Wirkstoffs. Typischerweise werden stimulierende Wirkstoffe in der gleichen Menge eingesetzt, wie sie zur Stimulierung der T-Zellen zum Proliferieren und zum Sekretieren von Cytokinen benutzt werden, so wie es im Fachgebiet beschrieben wird.
3. Protokolle zur Stimulierung vor der Transfektion
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung werden T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht, bevor das Nucleinsäuremolekül, das das Gen umfasst, in die T-Zellen eingebracht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff für wenigstens etwa zwei Stunden vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff für wenigstens etwa vier Stunden vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff für wenigstens etwa sechs Stunden vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff für wenigstens etwa acht Stunden vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht. In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden die T-Zellen mit dem stimulierenden Wirkstoff für höchstens etwa zwei Stunden vor Transfektion, höchstens etwa 4 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 6 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 8 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 10 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 12 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 14 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 16 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 18 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 20 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 22 Stunden vor der Transfektion, höchstens etwa 24 Stunden vor der Transfektion in Kontakt gebracht.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die T-Zellen mit wenigstens einem stimulierenden Wirkstoff zwischen etwa einer Stunde und 24 Stunden vor der Einführung des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die proliferierenden T-Zellen mit wenigstens einem stimulierenden Wirkstoff zwischen etwa 5 und 15 Stunden, wie zum Beispiel etwa 10 Stunden, vor dem Transfizieren eines Nucleinsäuremoleküls, das das interessierende Gen umfasst, in Kontakt gebracht.
In einer Ausführungsform des Verfahrens werden proliferierende T-Zellen mit wenigstens einem stimulierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht und weiter mit dem Nucleinsäuremolekül transfiziert. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens werden nicht-proliferierende T-Zellen zum Proliferieren angeregt, dann mit wenigstens einem stimulierenden Wirkstoff vor dem Transfizieren in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung in Kontakt gebracht. Nicht-proliferierende T-Zellen können zum Proliferieren stimuliert werden, indem Wirkstoffe benutzt werden, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, so wie die vorstehend in dem Abschnitt „Stimulierende Wirkstoffe" beschriebenen. Bevorzugte Wirkstoffe beinhalten eine Kombination eines Wirkstoffs, der ein primäres Aktivierungssignal bereitstellt, und eines Wirkstoffs, der für ein co-stimulierendes Signal sorgt. Andere bevorzugte Kombinationen von Wirkstoffen zur Stimulierung der Proliferation von T-Zellen schließen Kombinationen eines Phorbolesters und eines Calcium-Ionophors oder PMA und IL-2 ein.
In Übereinstimmung mit der am stärksten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Transfizieren primärer T-Zellen werden ruhende primäre T-Zellen zunächst mit wenigstens einem Wirkstoff, der die Proliferation der T-Zellen stimuliert, in Kontakt gebracht, wie zum Beispiel einer Kombination eines Calcium-Ionophors und eines Phorbolesters. Nach einer Zeit zwischen circa 3 und 8 Stunden, vorzugsweise circa 5 Stunden, im Anschluss an die Induktion der T-Zell-Proliferation werden die proliferierenden T-Zellen mit wenigstens einem Wirkstoff in Kontakt gebracht, der die T-Zellen stimuliert. Schließlich, zwischen 2 und 15 Stunden, vorzugsweise etwa 10 Stunden, nach dem Kontakt mit dem stimulierenden Wirkstoff werden die T-Zellen mit einem Nucleinsäuremolekül, das ein interessantes Gen umfasst, transfiziert, so dass das Gen in den T-Zellen exprimiert wird. In einer anderen Ausführungsform werden die T-Zellen weiterhin mit Wirkstoffen, die die T-Zellen stimulieren nach der Transfektion der T-Zellen in Kontakt gebracht.
Um primäre T-Zellen von einem Individuum zu erhalten, können periphere einkernige Blutzellen aus einem Individuum isoliert und durch Dichtegradientenzentrifugation, z. B. Ficoll/Hypaque, gereinigt werden. In einer spezifischen Ausführungsform werden die gereinigten peripheren Blutzellen dann mit einem Nucleinsäuremolekül in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung transfiziert. In anderen Ausführungsformen des Verfahrens werden periphere einkernige Blutzellen weiter auf spezifische Zelltypen angereichert, bevor sie transfiziert werden. Monocyten können zum Beispiel durch Anheften an Plastik abgereichert werden. Wenn es gewünscht wird, kann die CD4⁺-T-Zell-Population weiter durch Abtrennung von restlichen Monocyten, B-Zellen, NK-Zellen und CD8⁺-T-Zellen angereichert werden, indem magnetische Kügelchen, die mit monoclonalen Antikörpern (mAK) und anti-Maus-Ig beschichtet wurden, verwendent werden, wobei handelsübliche mAKs (wie zum Beispiel anti-CD14 (Mo2), anti-CD11b (mo1), anti-CD20 (B1), anti-CD16 (3G8) und anti-CD8 (7PT3F9)-mAKs benutzt werden. Das Verfahren der Erfindung kann auch auf Untergruppen von CD4⁺-T-Zellen wie zum Beispiel CD4⁺CD45RA⁺- (natürliche CD4⁺-T-Zellen) und CD4⁺CD45RO⁺- (Gedächtnis-T-Zellen) T-Zell Untergruppen angewendet werden. Diese können, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden mit dem zusätzlichen Gebrauch des anti-CD45RO-Antikörpers (UCHLI) zur Herstellung der CD4⁺CD45RA⁺-Zellen und der Beigabe des anti-CD45RA-Antikörpers (2H4) zur Herstellung der CD4⁺CD45RO⁺-T-Zellen.
Die Effizienz der Reinigung kann mittels Durchfluß-Cytometrie (Coulter, EPICS Elite) überprüft werden, wobei anti-CD3-, anti-CD4-, anti-CD8-, antiCD14-mAKs oder weitere Antikörper benutzt werden, die die spezifischen Untergruppen der T-Zellen erkennen, gefolgt von FluoresceinisothiocyanatkonjugiertenZiegen-anti-Maus Immunglobulin (Fisher, Pittsburgh, PA) oder anderen sekundären Antikörpern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin das Stimulieren der T-Zellen, um nach der Transfektion der T-Zellen in vitro eine Expansion zu bewirken. T-Zellen können zum Expandieren in vitro stimuliert werden, wie es in dem Abschnitt Beispiele beschrieben wird. In einer spezifischen Ausführungsform werden T-Zellen mit einem Wirkstoff inkubiert, der für ein primäres Aktivierungssignal sorgt, wie zum Beispiel anti-CD3, und einem Wirkstoff, der für ein co-stimulierendes Signal sorgt, so wie zum Beispiel ein anti-CD28-Antikörper. Zwei Tage später werden die Zellen mit frischem Medium verdünnt und der co-stimulierende Wirkstoff wird zur Kultur hinzugegeben. Die T-Zellen werden dann gezählt, gemessen und mit frischem Medium jeden zweiten Tag verdünnt, solange bis sich die Größenverteilung beinahe wieder zurück zu dem Profil der ruhenden Zellen verändert (nach etwa 10 Tagen) hat. Die T-Zellen können dann wieder mit dem Wirkstoff, der für ein primäres Aktivierungssignal sorgt, und einem Wirkstoff, der für ein co-stimulierendes Signal sorgt, stimuliert werden. Die Größenbestimmung und das Zählen der T-Zellen können mittels eines Coulter-Counter, wie hier beschrieben, durchgeführt werden.
In noch einer stärker bevorzugten Ausführungsform sind die T-Zellen primäre T-Zellen. Deshalb können die T-Zellen von einem Individuum erhalten werden, in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung transfiziert werden und in vitro expandiert werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die transfizierten und expandierten T-Zellen dem Individuum wieder verabreicht. Es kann wünschenswert sein, die T-Zellen weiter zum Beispiel mit Gradientenzentrifugation zu reinigen, bevor sie dem Individuum verabreicht werden.
4. Transfektion der T-Zellen
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Transfizieren von T-Zellen mit einer Nucleinsäure, die ein Gen umfasst, so dass das Gen in den T-Zellen exprimiert wird. Der Begriff „T-Zellen transfizieren" beabsichtigt, alle Mittel einzuschließen, mit denen ein Nucleinsäuremolekül in eine T-Zelle eingeführt werden kann. Der Begriff „Transfektion" umfasst eine Vielzahl gebräuchlicher Techniken zur Einführung von Nucleinsäuren in Säugerzellen einschließlich Elektroporation, Calciumphosphat- Präzipitation, DEAE-Dextran-Behandlung, Lipofektion, Microinjektion und virale Injektion. Geeignete Verfahren zum Transfizieren von Säugerzellen können bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und anderen Laborlehrbüchern gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Nucleinsäuremolekül, das ein interessantes Gen codiert, in eine T-Zelle eingeführt, wobei ein viraler Vektor benutzt wird. Solche viralen Vektoren beinhalten zum Beispiel recombinante Retroviren, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Herpes simplex-Virus-1. Retrovirale Vektoren und Adeno-assoziierte Virus-Vektoren werden allgemein so verstanden, dass sie das recombinante Gen-Liefersystem der Wahl für den Transfer exogener Gene in vivo besonders in Menschen sind. Sie können alternativ dazu zur Einführung exogener Gene ex vivo in T-Zellen benutzt werden. Diese Vektoren stellen die effiziente Zuführung der Gene in T-Zellen bereit und die transferierten Nucleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert. Eine wichtige Vorraussetzung zum Gebrauch von Retroviren ist es, besonders im Hinblick auf die Möglichkeit der Ausbreitung des Wildtyp-Virus in der Zellpopulation die Sicherheit ihres Gebrauchs zu gewährleisten. Die Entwicklung spezialisierter Zelllinien („Verpackungszellen" genannt), die nur replikationsdefekte Retroviren produzieren, hat den Gebrauch von Retroviren in der Gentherapie erhöht und defekte Retroviren sind zum Gebrauch beim Gentransfer zu Zwecken der Gentherapie gut charakterisiert (für einen Überblick vgl. Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271). Deshalb können rekombinante Retroviren konstruiert werden, in denen der Teil der retroviralen Codierungssequenz (gag, pol, env durch ein interessantes Gen ersetzt wird, was zur defekten retroviralen Replikation führt. Das replikationsdefekte Retrovirus wird dann in Virionen verpackt, die zum Infizieren einer Zielzelle unter Verwendung eines Helfervirus mittels Standardtechniken benutzt werden können. Anleitungen zur Herstellung recombinanter Retroviren und zur Infizierung von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren können in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) Greene Publishing Associates, (1989), Kapitel 9.10–9.14 und anderen Standard-Laborhandbüchern gefunden werden. Beispiele geeigneter Retroviren beinhalten pLJ, pZIP, pWE und pEM, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Beispiele geeigneter Verpackungs-Viruslinien, um sowohl ecotropische als auch amphotropische retrovirale Systeme herzustellen, beinhalten ψCrip, ψCre, ψ2 und ψAm.
Weiterhin wurde gezeigt, dass es möglich ist, das Infektionsspektrum von Retroviren und folglich auf Retroviren basierenden Vektoren zu begrenzen, indem virale Verpackungsproteine auf der Oberfläche der viralen Partikel modifiziert werden (vgl. zum Beispiel PCT-Veröffentlichungen WO93/25234 und WO94/06920). Strategien zur Modifikation des Infektionsspektrums retroviraler Vektoren beinhalten zum Beispiel: die Kopplung von Antikörpern, die spezifisch für die Zelloberflächen-Antigene sind, mit dem viralen env-Protein (Roux et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 9079–9083, Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73: 3251–3255; und Goud et al. (1983) Virology 163: 251–254); oder die Kopplung von Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden mit dem viralen env-Protein (Neda et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143–14146). Die Kopplung kann in Form von chemischem Quervernetzen mit einem Protein oder einem anderen Molekül (z. B. Lactose, um das env-Protein in ein Asialoglycoprotein umzuwandeln) wie auch durch Bilden von Fusionsproteinen (z. B. Einzelketten-Antikörper/env-Fusionsproteinen) erfolgen. Deshalb werden in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung virale Partikel, die ein Nucleinsäuremolekül enthalten, das ein interessantes Gen, funktionell mit geeigneten regulatorischen Elementen verbunden, enthält, zum Beispiel in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Verfahren modifiziert, so dass sie spezifisch Untergruppen von T-Zellen ansteuern. Zum Beispiel können die viralen Partikel mit Antikörpern gegen Oberflächenmoleküle, die für bestimmte T-Zelltypen spezifisch sind, beschichtet werden. Im Besonderen ist es möglich, selektiv CD4⁺T-Zellen anzusteuern, indem der virale Partikel mit Antikörpern verbunden wird, die das CD4-Molekül auf den T-Zellen erkennen. Deshalb wird die Infektion der CD4⁺-T-Zellen vorzugsweise über eine Infektion von CD8⁺-T-Zellen erfolgen. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn nur spezifische Untergruppen von T-Zellen zum Transfizieren erwünscht sind. Weiterhin werden retrovirale Systeme zur Einführung und Expression eines Nucleinsäuremoleküls, das ein interessantes Gen enthält, in T-Zellen einschließlich der primären T-Zellen in Kasid, A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 473; Morecki, S. et al. (1991) Cancer Immunol. Immunother. 32: 342; Culver, K. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3155; und Finer, M. H. et al. (1994) Blood, 83: 43 beschrieben.
Ein anderes virales Genliefersystem, das in der vorliegenden Erfindung gebräuchlich ist, benutzt von Adenoviren stammende Vektoren. Das Genom eines Adenovirus kann so verändert werden, dass es ein interessantes Genprodukt codiert und exprimiert, aber im Hinblick auf seine Fähigkeit, in einem normalen lytischen viralen Lebenszyklus zu replizieren, inaktiviert ist. Vergleiche zum Beispiel Berkner et al. (1988) Biotechniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431–434; und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143–155. Geeignete adenovirale Vektoren, die von dem Adenovirus-Stamm Ad Typ 5 dl324 oder anderen Adenovirusstämmen (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) stammen, sind dem Fachmann wohl bekannt. Rekombinante Adenoviren können unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein, weil sie nicht in der Lage sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren. Weiterhin ist das Viruspartikel relativ stabil und der Reinigung und Konzentration zugänglich und wie vorher kann es modifiziert werden, um das Infektionsspektrum zu beeinflussen. Weiterhin wird eingeführte adenovirale DNA (und fremde DNA, die darin enthalten ist) nicht in das Genom der Wirtszelle integriert, sondern bleibt episomal; dabei werden mögliche Probleme, die als ein Ergebnis einer Insertionsmutagenese in Situationen auftreten können, in denen die eingeführte DNA in das Wirtsgenom integriert wird, verhindert (z. B. retrovirale DNA). Zudem ist die Tragekapazität des adenoviralen Genoms für fremde DNA verglichen mit anderen Genabgabe-Vektoren groß (bis zu 8 Kilobasen) (Berkner et al., zitiert supra; Haj-Ahmand und Graham (1986) J. Virol. 57: 267). Bei den meisten replikationsdefekten adenoviralen Vektoren, die gegenwärtig im Einsatz sind und deshalb von der vorliegenden Erfindung befürwortet werden, sind die viralen E1 und E3-Gene ganz oder teilweise deletiert, aber behalten so viel wie 80 des adenoviralen genetischen Materials bei (vergleiche z. B. Jones et al. (1979) Cell 16: 683; Berkner et al., supra; und Graham et al. in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Hrsg. (Humana, Clifton, NJ, 1991) Bd. 7, S. 109–127). Die Expression des interessanten Gens, das in dem Nucleinsäuremolekül enthalten ist, kann unter Kontrolle von zum Beispiel dem E1A-Promotor, dem späten Hauptpromotor (MLP) und assoziierten Leadersequenzen, dem E3-Promotor oder exogen hinzugefügten Fromotorsequenzen stattfinden.
Noch ein weiteres virales Vektorsystem, das zur Abgabe eines Nucleinsäuremoleküls, das ein interessantes Gen enthält, nützlich ist, ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). Das Adeno-assoziierte Virus ist ein natürlich vorkommendes defektes Virus, das ein anderes Virus wie zum Beispiel ein Adenovirus oder ein Herpesvirus als Helfer-Virus zur effizienten Replikation und einem produktiven Lebenszyklus benötigt. (Für einen Überblick vergleiche Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158: 97–129). Adeno-assoziierte Viren zeigen eine hohe Frequenz stabiler Integration (vergleiche zum Beispiel Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349–356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822–3828 und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 1963–1973). Vektoren, die so wenig wie 300 Basenpaare des AAV beinhalten, können verpackt und integriert werden. Der Raum für exogene DNA ist auf etwa 4,5 kb begrenzt. Ein AAV-Vektor, wie er bei Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260 beschrieben wird, kann zur Einführung von DNA in T-Zellen benutzt werden. Eine Vielzahl von Nucleinsäuren wurden in verschiedene Zelltypen eingeführt, wobei AAV-Vektoren benutzt wurden (vergleiche zum Beispiel Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466–6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32–39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611–619 und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781–3790). Andere virale Vektor-Systeme, die Anwendung in der Gentherapie haben, stammen vom Herpes-Virus, Vaccinia-Virus und einigen RNA-Viren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Nucleinsäuremolekül, das ein interessantes Gen enthält, in eine T-Zelle mittels nicht-Virus-vermittelter Verfahren zur Transfektion eingeführt, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Verfahren beinhalten Elektroporation, Calciumphosphat-Präzipitation und DEAE-Dextran-Transfektion.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Nucleinsäuremolekül, das ein interessantes Gen enthält, von einem Zellabgabe-Vehikel getragen und in die T-Zelle abgegeben. Solche Vehikel beinhalten zum Beispiel kationische Liposomen (Lipofection^TM) oder derivatisierte (z. B. mit Antikörpern konjugierte) Polylysin-Konjugate, Gramicidin S und künstliche virale Hüllen. Diese Vehikel können eine Nucleinsäure abgeben, die in einem Plasmid, Vektor oder viraler DNA eingebaut ist. In einer spezifischen Ausführungsform wird die effiziente Einführung des Nucleinsäuremoleküls in primäre T-Lymphocyten durch Transfizieren der primären T-Lymphocyten mit Adenovirus-assoziierter Plasmid-DNA, die mit kationischen Liposomen komplexiert ist, erreicht, wie es bei Philip, R. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 2411 beschrieben ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Nucleinsäuremolekül, das ein interessantes Gen enthält, in eine spezifische Zelle in Form eines löslichen molekularen Komplexes abgegeben. Der Komplex beinhaltet die Nucleinsäure, die wieder freisetzbar an einen Träger gebunden ist, der einen Nucleinsäure bindenden Wirkstoff und einen zellspezifischen, bindenden Wirkstoff umfasst, der an das Oberflächenmolekül der T-Zelle bindet und der eine solche Größe hat, dass er anschließend in die Zelle aufgenommen werden kann. Solche Komplexe sind im US-Patent Serien Nr. 5.166. 320 beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Nucleinsäure in die T-Zellen mittels Partikel-Beschuss eingeführt, wie es bei Yang, N.-S. und Sun, W. H. (1995) Nature Medicine 1: 481 beschrieben ist.
5. Nucleinsäuremoleküle, die ein interessantes Gen umfassen
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Gen enthält, in eine T-Zelle. Der Begriff „ein Nucleinsäuremolekül" beabsichtigt DNA und RNA einzuschließen und kann sowohl einzel- als auch doppelsträngige beinhalten. Der Begriff „Gen" beabsichtigt eine DNA-Nucleotid-Sequenz einzuschließen, die in RNA transkribiert werden kann, oder alternativ dazu ein RNA-Molekül, das in wenigstens ein Protein translatiert werden kann.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Gen eine Nucleotidsequenz, die eine oder mehrere offene Leserahmen enthält, d.h. Sequenzen, die Peptide codieren, so dass bei Transfektion in T-Zellen in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung, wenigstens ein Protein in der T-Zelle synthetisiert wird. Das Gen, das wenigstens ein Protein codiert, kann jedes Gen wie zum Beispiel ein Cytokin codierendes Gen sein. Das Gen kann ein Peptid codieren oder das Gen kann mehrere codieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Gen eine Nucleotidsequenz, die durch Einführung in die T-Zellen in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung in ein oder mehrere funktionelle RNA-Moleküle exprimiert wird (z. B. ein Antisense-RNA-Molekül). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hemmt das funktionelle RNA-Molekül oder vermindert wenigstens die Expression eines oder mehrerer endogener Gene in der T-Zelle. Deshalb ist das Verfahren der Erfindung zur Verminderung der Expression eines selektierten Gens in T-Zellen nützlich. T-Zellen werden zum Beispiel mit einem Nucleinsäuremolekül transfiziert, das ein Antisense-RNA codierendes Gen enthält, so dass die Translation einer endogenen RNA reduziert wird. Eine „Antisense"-Nucleinsäure umfasst eine Nucleotid-Sequenz, die zu einer „Sense"-Nucleinsäure komplementär ist, z. B. komplementär zu einer mRNA-Sequenz, die ein Protein codiert, und in Übereinstimmung mit den Regeln von Watson und Crick zur Basenpaarung konstruiert wurde. Dementsprechend kann eine Antisense-Nucleinsäure über Wasserstoffbrücken an eine Sense-Nucleinsäure gebunden werden. Die Antisense-Sequenz, die zu einer mRNA-Sequenz komplementär ist, kann zu einer Sequenz komplementär sein, die in der Codierungs-Region der mRNA gefunden wurde oder sie kann zu einer nichttranslatierten 5'- oder 3'-Region der mRNA komplementär sein. Eine Antisense-Nucleinsäure ist vorzugsweise zu einer Region komplementär, die dem Initiationscodon vorangeht oder dieses überspannt oder die sich in der nichttranslatierten 3'-Region der mRNA befindet. Zur Diskussion der Regulation der Genexpression, wobei Antisense-Gene benutzt werden, vergl. Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Expression eines endogenen Gens in einer T-Zelle durch Einführung einer Nucleinsäure, die ein Ribozym codiert, in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung codiert, reduziert. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuclease-Aktivität, die in der Lage sind, Einzelstrang-Nucleinsäuren zu spalten, wie zum Beispiel eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region haben. Ein Ribozym, das eine Spezifität für eine interessante Nucleinsäure hat, kann basierend auf der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure entwickelt werden. Ein Derivat einer Tetrahymena-L-19 IVS-RNA kann zum Beispiel so konstruiert werden, dass die Basen-Sequenz der aktiven Stelle komplementär zur Basen-Sequenz ist, die in einer interessanten mRNA gespalten werden soll. Vergleiche zum Beispiel Cech et al. US-Patent Nr. 4.987.071 und Cech et al. US-Patent Nr. 5,116,742.
Das "Nucleinsäuremolekül", das das Gen umfasst, kann ein DNA-Molekül oder ein RNA-Molekül sein. Das Nucleinsäuremolekül kann ein Teil eines natürlichen Nucleinsäuremoleküls sein oder kann alternativ dazu synthetisch hergestellt werden. Das Nucleinsäuremolekül beinhaltet typischerweise regulatorische Elemente, an die das Gen funktionell gebunden ist. „Funktionell gebunden" soll bedeuten, dass die Nucleotidsequenz des Gens mit wenigstens einer regulatorischen Sequenz in einer Weise verbunden ist, die die Expression des Gens in T-Zellen erlaubt (d.h. Transkription). Regulatorische Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt und selektiert, um die Expression des Gens in einer geeigneten T-Zelle zu lenken. Folglich beinhaltet der Begriff regulatorische Sequenz Promotoren, Enhancer und andere Expressions-Kontroll-Elemente. Solche regulatorischen Sequenzen sind dem Fachmann wohl bekannt und sind weiter bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. Diese regulatorischen Elemente beinhalten solche, die zur Transkription und Translation des Gens nötig sind und können Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale und Sequenzen, die zum Transport des Moleküls zu dem geeigneten zellulären Kompartiment benötigt werden, einschließen. Wenn die Nucleinsäure eine cDNA in einem recombinanten Expressionsvektor ist, werden die regulatorischen Funktionen, die für die Transskription und/oder Translation der cDNA verantwortlich sind, oft von viralen Sequenzen bereitgestellt. Beispiele für üblicherweise benutzte virale Promotoren beinhalten solche, die von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Affen-Virus 40 sowie retroviralen LTRs stammen.
Mit der cDNA verbundene regulatorische Sequenzen können selektiert werden, um eine konstitutive oder induzierbare Transkription zum Beispiel den Gebrauch eines induzierbaren Enhancers zu ermöglichen. Deshalb sind in einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die ein interessantes Gen umfassenden Nucleinsäuremoleküle unter der Kontrolle eines induzierbaren Kontrollelements, so dass die Expression des Gens angeschaltet oder ausgeschaltet werden kann, indem die T-Zellen, die die Nucleinsäure enthalten, mit einem Wirkstoff, der das induzierbare Kontrollelement beeinflusst, in Kontakt treten bzw. nicht in Kontakt treten.
In einer spezifischen Ausführungsform ist das Nucleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines induzierbaren Kontrollelements. Induzierbare regulatorische Systeme zum Gebrauch in Säugerzellen sind im Fachgebiet bekannt, zum Beispiel Systeme, in denen die Genexpression von Schwermetallionen (Mayo et al. (1982) Cell 29: 99–108; Brinster et al. (1982) Nature 296: 39–42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1480–1489; Hitzeschock (Nouer et al. (1991) in Heat Shock Response, Hrsg. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, S. 167–220); Hormonen (Lee et al. (1981) Nature 294: 228–232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2038–2042; Klock et al. (1987) Nature 329: 734–736; Israel & Kaufmann (1989) Nucl. Acids Res. 17: 2589–2604 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/23431), Tetracyclin (Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/29442) oder mit FK506 ähnlichen Molekülen (PCT-Veröffentlichung Nr. WO94/18317) reguliert werden.
Induzierbare Kontrollelemente können in allen T-Zellen induzierbar sein oder alternativ nur in einer spezifischen Untergruppe der T-Zellen wie zum Beispiel in CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, T-Helfer 1 (Th1)-, T-Helfer 2 (Th2)-Zellen. Induzierbare Kontrollelemente können auch Elemente sein, die durch einen Wirkstoff in einem T-Zellen-Typ (wie zum Beispiel CD4⁺-T-Zellen) induzierbar sind und die durch einen anderen Wirkstoff in einem anderen T-Zellen-Typ (wie zum Beispiel CD8⁺-T-Zellen) induzierbar sind.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das ein interessantes Gen enthaltende Nucleinsäuremolekül unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen, die konstitutiv die Expression des Nucleinsäuremoleküls steuern. Regulatorische Elemente, die die Expression von Nucleinsäuremolekülen, mit denen sie funktionell verbunden sind, konstitutiv steuern, können virale Elemente sein (z. B. von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus, Affen-Virus 40 oder Retrovirus stammend). Alternativ dazu können konstitutive T.Zell-Enhancer wie zum Beispiel ein T-Zell-Rezeptor-Enhancer benutzt werden (siehe z. B. Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729–733).
Das ein interessantes Gen umfassende Nucleinsäuremolekül, das mit dem regulatorischen Element funktionell verbunden wird, wird typischerweise in einem Vektor getragen (z. B. einem Plasmid oder viraler DNA), der Sequenzen, die zur in vitro-Selektion und -Amplifikation des Vektors in Bakterien nötig sind, beinhaltet. Ein Vektor, der die Expression des Gens, das von einem Vektor getragen wird, erlaubt, wird weiterhin als ein „Expressions-Vektor" bezeichnet.
6. Anwendung für das Verfahren der Erfindung
Die Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Einführung und Expression eines in einem Nucleinsäuremolekül enthaltenden Gens in eine T-Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die T-Zellen primäre T-Zellen. Deshalb erlaubt das Verfahren der Erfindung die Expression eines Gens auf hoher Ebene, wenn es in primäre T-Zellen eingeführt wird, im Vergleich zu früheren Verfahren zum Transfizieren primärer T-Zellen. Die Fähigkeit primäre T-Zellen mit einem Nucleinsäuremolekül, das ein Gen umfasst, zu transfizieren, so dass das Gen in den T-Zellen exprimiert wird, hat zahlreiche Anwendungen im Besonderen für die Gentherapie.
In einer spezifischen Ausführungsform werden periphere Blut-T-Zellen von einem Individuum erhalten und ex vivo mit einem Nucleinsäuremolekül, das eine Gen enthält, das ein interessantes Protein codiert, transfiziert, so dass das Protein in den T-Zellen synthetisiert wird. Die T-Zellen können dann dem Individuum wieder verabreicht werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird das exogene Protein, das in den T-Zellen synthetisiert wird, von den T-Zellen sekretiert. Die Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Herstellung eines sekretierbaren Proteins in einem Individuum bereit. Proteine innerhalb der Erfindung beinhalten zum Beispiel Cytokine, Lymphokine und Wachstumsfaktoren. Deshalb können die von den transfizierten T-Zellen hergestellten Proteine vorwiegend gegen andere Zellen gerichtet werden als gegen T-Lymphocyte.
Alternativ dazu kann das von den transfizierten T-Zellen hergestellte Protein ein intrazelluläres oder ein Membran Protein sein. In einer spezifischen Ausführungsform ist das exogene Protein ein Protein, das die T-Zellen vor einer Infektion zum Beispiel einem Virus schützt. So ein Verfahren ist zur Vermehrung einer T-Zellpopulation nützlich, von denen einige T-Zellen mit einem Virus zum Beispiel dem menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV) infiziert sind. Deshalb kann die Population der T-Zellen ohne begleitende Ausbreitung der Infektion auf alle Zellen ausgeweitet werden.
In einer anderen Ausführungsform ist das exogene Protein ein Protein, das eine spezifische Untergruppe der T-Zellen abtötet, wie zum Beispiel ein Toxin. Das Protein kann selektiv auf spezifische Untergruppen der T-Zellen abzielen, dadurch dass es das Gen unter der Kontrolle eines regulatorischen Kontrollelementes hat, das für die T-Zell-Untergruppe spezifisch ist. Es ist auch möglich, ein exogenes Gen spezifisch zu einen bestimmten Typ von T-Zellen lenken, indem ein Transfektionsverfahren benutzt wird, das die selektive Transfektion bestimmter T-Zellen-Untergruppen ermöglicht. T-Zellen können zum Beispiel mit Liposomen, die auf ihrer Membran Liganden für ein spezifisches Molekül einer T-Zell-Untergruppe beinhalten, transfiziert werden.
Das Gen, das in die T-Zellen mit dem Verfahren der Erfindung eingeführt wird, kann auch ein Gen sein, das zur Behandlung einer genetischen Krankheit entwickelt wurde, wie zum Beispiel der schwer kombinierte Immundefekt aufgrund von Adenin-Desaminase Mangel. Ein Gen, das die Adenosin-Desaminase codiert, kann zum Beispiel in primäre T-Lymphocyten eingeführt und darin exprimiert werden, wobei das Verfahren der Erfindung benutzt wird. Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Behandlung des Hyper-IgM-Syndroms, einer genetischen Funktionsstörung, die durch eine Mutation in dem CD40-Liganden (gp39) auf den T-Zellen charakterisiert und durch Defekte in der T-Helfer-Zellen abhängigen Antikörper-Antwort charakterisiert ist. Deshalb können T-Zellen von einem Individuum, das das Hyper-IGM-Syndrom hat, ex vivo mit einer gp39 codierenden Nucleinsäure transfiziert werden, vorzugsweise unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, gefolgt von der Verabreichung der T-Zellen an den Patienten. Andere genetische Krankheiten, die von einem dysfunktionalen Gen in den T-Zellen herrühren, wie zum Beispiel einem Gen, das ein Protein codiert, das in Signal-Transduktions-Wege der T-Zellen involviert ist, können mit dem Verfahren der Erfindung behandelt werden.
Die folgende Erfindung wird dazu von den folgenden Beispielen verdeutlicht, was nicht als weitere Begrenzung aufgefasst werden soll. Die Inhalte aller Referenzen, anhängiger Patentanmeldungen und veröffentlichter Patente, die hier in dieser Anmdeldung zitiert werden, werden hier ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen.
Beispiele
Beispiel 1 In vitro-Langzeit-Kultur von peripheren CD28⁺-Blut-T-Lymphocyten
Direkte Transfektionsexperimente werden oft benötigt, um die funktionelle Wichtigkeit der putativen regulatorischen Elemente in vivo zu zeigen. Solche Studien benutzen typischerweise transformierte oder unsterbliche Zelllinien. Dennoch wird es bevorzugt, regulatorische DNA-Sequenzen in interessanten primären Zellen zu studieren. Für die in Aussicht stehende Studie der Zellzyklus regulierten besonders Go-spezifischen Genexpression ist die Erhaltung eines physiologischen Hintergrundes nötig. Diese Beispiele werden konstruiert, um Bedingungen zu entwickeln, die die Expression exogener DNA, die in primäre T-Zellen transfiziert wird, zu ermöglichen.
Es wurden periphere Blut-T-Zellen wie folgt hergestellt. Leucozytenmanschetten wurden durch Leukophorese gesunder 21 bis 31 Jahre alter Spender oder vom Roten Kreuz erhalten. Periphere einkernige Blutzellen (PBMCs) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation durch ein Ficoll-Hypaque (Pharmacia)-Kissen oder mit Lymphocyte Separation Medium (Litton Bionetics) erhalten. Die CD28⁺-Untergruppe der T-Zellen wurde dann aus den PBMCs mittels negativer Selektion isoliert, wobei Immunadsorption mit Ziegen-anti-Maus-Ig beschichteten magnetischen Partikeln (Dynal Inc.), wie vorher beschrieben wurde, benutzt wurden (June, C. H., Ledbetter, J. A., Gillespie, M. M., Lindsten, T. und Thompson, C. B. (1987) Mol. Cell. Biol. 11: 5435–5445). Die Zellreinigung wurde routinemäßig mit Durchflußcytometrie und Histochemie überwacht. Die daraus resultierende Zell-Population enthielt > 99% CD2⁺ und > 98% CD28⁺, wie mittels Fluorescenz-aktivierter Zellsortiertungs(FACS)-Analyse, wobei Fluoresceinisothiocyanat (FITC-) konjugierte mAKs benutzt wurden, gemessen. Monocyten, B-Zellen und große granuläre Lymphocyten konnten nicht mit der Immunfluorescenz-Analyse detektiert werden. Ruhende T-Zellen wurden dennoch aus der mononukleären Zellfraktion durch Zentrifugal-Auswaschung, wie kürzlich beschrieben, hergestellt (Thompson, C. B., Ryan, J. J., Sieckmann, D. G., Finkelmann, F. D., Mond, J. J. und Scher, I. (1983) J. Immunol. Methods 63: 299–307). Diese Zellen enthielten zu > 95% CD2⁺, was mit der Duechfluß-Cytometrie bestimmt wurde. Mit beiden Verfahren betrug die Lebensfähigkeit der Zellen > 99%, was mittels Trypan-Blau-Ausschluss" gemessen wurde.
Menschliche periphere Blut-T-Zellen, die, wie oben beschrieben, erhalten wurden, waren > 99% CD2⁺, > 98% CD28⁺ und in einem ruhenden Zustand. Die in dieser Studie verwendeten, gereinigten T-Zellen wurden von akzessorischen Zellen abgereichert und proliferierten nicht in vitro nach Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA), Phorbolmyristatacetat (PMA) oder Ionomycin allein. Dennoch konnten diese T-Zellen zur Teilung mittels Quervernetzen des TCR-CD3-Komplexes mit immobilisierten monoclonalen Antikörpern (mAK) stimuliert werden oder indem geeignete PMA-Mengen und Ionomycin benutzt wurden (Lindsten, T., June, C. H. und Thompson, C. B. (1988) EMBO J. 7: 2787–2794). Unter diesen Bedingungen wurden > 90% der ruhenden T-Zellen aktiviert und die Mehrheit der Zellen durchlief synchron einen Zyklus Zellteilung.
Um die ruhenden Zellen zu aktivieren und ihre langfristige Expansion in Kultur zu fördern, wurden frisch isolierte ruhende T-Zellen erhalten, wie oben beschrieben, in einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in Komplettmedium angezogen: RPMI 1640 (GIBCO), ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (GIBCO), 2 mM L-Glutamin, Penicillin G (100 U/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und 15 mM Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, pH 7,4; GIBCO) und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ stehen gelassen. Nach der Übernacht-Inkubation wurden am Tag 1 des Expansions-Protokolls die ruhenden T-Zellen mit einer gesättigten Menge von immobilisiertem anti-CD3-Antikörper (αCD3)-mAK G19-4 gegen die CD3ε-Kette in Gegenwart eines löslichen anti-CD28-Antikörpers (αCD28)-mAK 9,3 (1 μg/ml) stimuliert, wie bei June et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 11: 5435–5445 beschrieben wird. CD3-mAK G19-4 (IgG1) wurde, wie kürzlich beschrieben, hergestellt und gereinigt (Ledbetter, J. A., Martin, P. J., Spooner, C. E., Wofsy, D., Tsu, T. T., Beatty, P. G. und Gladstone, P. (1985) J. Immunol. 135: 2331–2336). mAK G19-4 wurde an die Oberfläche eines Plastik-Gewebekulturkolbens/Platte in Mengen, die zur Proliferation geeignet waren, absorbiert, wie vorher beschrieben wurde (Geppert, T. D. und Lipsky, P. E. (1987) J. Immunol. 138: 1660–1666). Dies wurde wegen des Bedarfs an Quervernetzung durchgeführt (Williams, J. M., Ransil, B. J., Shapiro, H. M. und Strom, T. B. (1984) J. Immunol. 133: 2986–2995) und um die Internalisation des CD3-Komplexes zu verhindern (Ledbetter, J. A., June, C. H., Martin, P. J., Spooner, C. E., Hansen, J. A. und Meier, K. E. (1986) J. Immunol. 136: 3945–3952). CD28-mAK 9.3 (IgG2a) wurde auf Protein-A-Sepharose gereinigt, gegen PBS dialysiert, durch einen 0,22 μm-Sterilfilter gefiltert, durch Zentrifugation (100.000 × g für 45 min) von Aggregaten gereinigt und mit 1 μg/ml benutzt (Ledbetter, J. A., Martin, P. J., Spooner, C. E., Wofsy, D., Tsu, T. T., Beatty, P. G. und Gladstone, P. (1985) J. Immunol. 135: 2331–2336).
Zwei Tage später am Tag 3 wurden die aktivierten T-Zellen gezählt, gemessen und auf eine Konzentration von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml mit frischem Komplettmedium verdünnt. MAK 9.3 wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml hinzugefügt. Zählen, Messen und Verdünnung der Zellen wurde jeden zweiten Tag wiederholt, solange bis die Größenverteilung sich annähernd zurück zu der eines ruhenden Zellprofils änderte; an diesem Punkt wurden die T-Zellen in Komplettmedium auf 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und wieder wie vorher stimuliert (erste erneute Stimulation gewöhnlich um Tag 10 herum).
Die Zellen wurden gezählt, wobei ein Counter ZM Counter (Counter Electronics) benutzt wurde. Die Zellen wurden auf einer linearen Skala mit einem Coulter Counter-Model ZM gemessen, der mit einer zylindrischen 70-μm-Öffnung und einem Channelyzer Modell C-256 (Coulter Electronics) ausgestattet und an einen IBM-PC-Computer angeschlossen war. Die Zellen wurden in Isoton suspendiert und die Eichung wurde mittels Gebrauch von Latex-Kugeln mit einheitlichem Durchmesser durchgeführt.
Die Behandlung von Mitogen oder anti-T-Zellrezeptor (anti-TCR) stimulierten T-Zellen mit αCD28 induzierte einen synergistischen Anstieg der T-Zell-Proliferation. Co-Stimulierung der ruhenden T-Zellen mit αCD3 und αCD28 sorgte für ein anfängliches lebhaftes exponetielles Wachstum und zellulären Stoffwechsel, der durch zelluläre Vergrößerung, Verklumpung und Ansäuerung des Kulturmediums gekennzeichnet war. Die Zellen durchliefen mehrere Runden der Zellteilung und die Anzahl stieg auf das 6 bis 8-fache im Verlauf der ersten 7 bis 8 Tage in Kultur an. An diesem Punkt nahm ihre Wachstumsrate ab. Am Tag 10–11 der Kultur hörte die Zellteilung auf und die Zellen glichen ruhenden Zellen in ihrer Größe (1). An diesem Punkt des Expansionsprotokolls wurden die Zellen mit immobilisierten αCD3 in der Gegenwart von αCD28 wieder stimuliert und durchlebten eine weitere Periode exponentiellen Wachstums, die durch zelluläre Aggregation und Vergrößerung charakterisiert war.
2 zeigt Wachstumscharakteristika von Zellen, die auf diese Weise angezogen wurden. Wie gezeigt wurde, konnten die Zellen erhalten und in exponentieller Weise für viele Wochen (mehr als 3 Monate) gezüchtet werden, indem die wiederholte αCD3/αCD28-Co-Stimulierung benutzt wurde. Die durchflußcytometrische Analyse wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, um die phänotypische Entwicklung dieser Zellen zu verfolgen. Mit der Zeit wurden die in dieser Weise expandierten T-Zellen fortschreiten eher CD4⁺45RO⁺, was einen Wechsel im Phänotyp von naiven T-Helferzellen (Th) zu Gedächtniszellen widerspiegelt. Dies ist in direktem Gegensatz zu Zellen, die in der Gegenwart von exogenem IL-2 nach αCD3/αCD28-Co-Stimulierung gezüchtet wurden. Diese Zellen wurden fortschreitend mit der Zeit eher CD8⁺ und waren schließlich unfähig zur weiteren Proliferation in der Anzucht. Diese Beobachtungen zeigen, dass irgendein von CD4⁺-Zellen hergestellter Faktor zur kontinuierlichen T-Zell-Proliferation nötig ist.
Beispiel 2 – Zelluläre Proliferation ist nicht ausreichend zur Expression exogener DNA
Nachdem die wiederholte αCD3/αCD28-Co-Stimulierung zur langfristigen clonalen Expansion von primären T-Zellen etabliert war, wurden Zellen, die nach Gebrauch dieser Anleitung gewachsen waren, auf endogene ets-1-mRNA-Expression mittels Northern-Blot-Verfahren analysiert.
Zur RNA-Extraktion wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und die gesamte zelluläre RNA wurde mittels Guanidiniumisothiocyanat extrahiert (Chirgwin et al., 1979). Die Proben wurden auf gleiche rRNA-Gehalte eingestellt und der Ausgleich mittels Ethidiumbromidfärbung gleicher Mengen RNA-Proben bestätigt, die in einem nicht denaturierendem 1% Agarosegel, wie kürzlich beschrieben wurde, aufgetrennt wurden (June, C. H., Ledbetter, J. A. Gillespie, M. M., Lindsten, T. und Thompson, C. B. (1987) Mol. Cell. Biol. 11: 5435–5445). Diese angeglichenen RNA-Proben (5 bis 10 μg) wurden in 1% Agarose/Formaldehyd-Gelen aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert. DNA-Sonden wurden mittels Nick-Translation auf eine spezifische Aktivtät von 3 bis 9 × 10⁸ CpM/μg eingestellt. Die IL-2-spezifische Sonde war eine 1,0 kb-PstI-cDNA-Insertion, die aus dem pTCGF5-Plasmid stammte (Clark, S. C., Arya, S. K., Wong-Staal, F., Matsumoto-Kobayashi, M., Kay, R. M., Kaufmann, R. J., Brown, E. L., Shoemaker, C., Copeland, T. und Oroszian, S. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2543–2547). Die HLA-B7-Sonde war ein 1,4kb-PstI- Fragment, das aus pHLA-B7 isoliert wurde (Sood, A. K., Pereira, D. und Weissman, S. M. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 616–620). Die ets-1-DNA-Sonde bestand aus einem 442 Basenpaar-EcoR1/XbaI-Fragment des 5'-Endes einer 1,9 kb-ets-1-cDNA (Ho, I-C., Bhat, N. K., Gottschalk, L. R., Lindsten, T., Thompson, C. B., Papas, T. S. und Leiden, J. M. (1990) Science 250: 814–817). Die Membranen wurden gewaschen und einem Röntgenfilm (Kodak XAR-2 oder XAR-5) für 4 Stunden bis zu 7 Tagen bei –70°C ausgesetzt, wobei Verstärkerfolie benutzt wurde.
Zur Herstellung von Northern-Blots wurde RNA aus peripheren Blut-T-Zellen extrahiert, die in Übereinstimmung mit dem Protokoll zur clonalen Langzeit-Expansion primärer T-Zellen, wie vorher beschrieben, zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aktivierung mit αCD3/αCD28 am Tag 1 oder nach Restimulierung am Tag 8 angezogen wurden. Die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse sind in 3 dargestellt. Ruhende menschliche T-Zellen exprimieren große Mengen an ets-1-mRNA und -Protein. Ruhende T-Zellen und „aktivierte" Zellen exprimierten am Tag 8 große Mengen an ets-1-mRNA. Nach Antigen-Rezeptor-Quervernetzung in der Gegenwart von αCD28 nahm ets-1-mRNA bis zu nicht nachweisbaren Mengen nach 6 Stunden ab. In beiden Zellen von Tag 1 und Tag 8 wurde ets-1-mRNA wieder exprimiert und zwischen 24 und 72 Stunden nach Stimulierung erhalten.
Um zu bestimmen, welche cis-agierenden regulatorischen Elemente die ets-1 Gen-Expression modulieren, wurden primäre Zellen in der log-Phase des Wachstums am Tag 6 des Langzeitig-Anzuchtprotokolls mit einem den ets-1-Promoter beinhaltenden Plasmid, das mit dem CAT-Gen (ETS-1-CAT-2) verbunden war, transfiziert. Dieses Konstrukt zeigte stabile Reporter-Aktivität in Jurkat T-Zellen. Im Anschluss an die Transfektion der primären T-Zellen mit 1 μg DNA mit DEAE-Dextran (Ho, I-C., Bhat, N. K., Gottschalk, L. R., Lindsten, T., Thompson, C. B., Papas, T. S. und Leiden, J. M. (1990) Science 250: 814–817) wurden die Zellen wiederholt gewaschen und dann in Komplettmedium resuspendiert. 40 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität getestet.
Anhand des DEAE-Dextran-Transfektionsprotokolls wurden die Zellen einmal mit PBS und dann einmal mit TS-Puffer pH 7,4 gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurden die Zellen auf 10⁷/ml in TS-Puffer, der 500 μg DEAE-Dextran (Molekulargewicht 500.000) und 1 bis 10 μg supergeknäueltes Plasmid-DNA enthielt, resuspendiert. Dieses Gemisch wurde 12 bis 15 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen. 10 ml mit 20% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin und 15 mM Hepes (RPMI 1640/20% FCS/G/H) ergänztes RPMI 1640 wurden zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden in Gewebekulturkolben überführt und für 30 min bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann pelletiert, einmal mit RPMI 1640/20% FCS/G/H gewaschen und in 10 ml RPMI 1640/20% FCS/G/H bei 37°C, 5% CO₂ resuspendiert.
In anderen hier beschriebenen Beispielen wurden die primären T-Zellen mittels Elektroporation transfiziert. Anhand des Elektroporationsprotokolls wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und auf 20 × 10⁶ Zellen/ml in eiskaltem RPMI 1640/20% FCS/G/H resuspendiert. 6 × 10⁶ Zellen in 300 μl wurden in eine sterile 0,4 cm-Elektroporationsküvette (BioRad) überführt. 1 bis 10 μg Reporterplasmid wurden hinzugefügt und die Zellen mittels Gene Pulser (BioRad) bei 250 V und 960 μFarad der Elektroportation unterzogen. Die Zellen wurden für 10 min auf Eis inkubiert, auf 10 ml mit RPMI 1640/20% FCS/G/H verdünnt und bei 37°C, 5% CO₂ gestellt.
Gleiche Zellextrakt-Volumina wurden auf CAT-Aktivität in einer 16-Stunden-Reaktion getestet. EDTA wurde zur Endkonzentration von 5 mM hinzugefügt und die Extrakte wurden bei 65°C für 10 min erhitzt, um die Hydrolyse von Acetyl-CoA und die Deacetylierung von Chloramphenicol zu verhindern (Crabb, D. W. und Dixon, J. E. (1987) Anal. Biochem. 163: 88–92). Vor der Autoradiografie der CAT-Test-Dünnschichtchromatografie(DC)-Platte wurden Flecke, die [¹⁴C]-Chloramphenicol und seinen acetylierten Derivaten entsprachen, mittels eines Betascope (Betagen) oder Phosphorabbildungsgeräts (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die prozentuale Acetylierung wurde berechnet, nachdem die Hintergrundwerte von den experimentellen Werten mit und ohne Acetylierung subtrahiert wurden. Wenn die prozentuale Acetylierung außerhalb der linearen Streubreite des Tests für einen gegebenen Teil der Transfektion lag, wurden gleiche Volumina der Zellextrakte verdünnt und der CAT-Test erneut ausgeführt. Die CAT-Aktivität wurde dann auf den Gehalt an Protein in der Reaktion normalisiert. Die normalisierte CAT-Aktivität wird als (Prozent Acetylierung/mg Protein) × 50 ausgedrückt. Alle Vergleiche der Reporteraktivtät stammen von zur selben Zeit mit den gleichen Reagenzien stimulierten, transfizierten, geernteten und getesteten Zellen.
Keine ETS-1-CAT-2-Reporteraktivität wurde in auf diese Art transfizierten Zellen bestimmt. Da endogene ets-1-mRNA bevorzugt in ruhenden Zellen exprimiert wird und etwa 2–3 Tage nach der T-Zellen-Stimulierung wieder induziert wird, wurde ETS-1-CAT-2-Reporter-Expression erwartet, unabhängig davon, ob die T-Zellen wieder in einen ruhenden Zustand eintraten oder nicht. Überraschenderweise zeigte auch die Transfektion von Zellen mit positiven Kontrollen wie RSV-CAT, HIV-CAT und HTLV-1-CAT keine messbare Reporteraktivität. Basierend auf dem Anstieg der Zellzahl befanden sich die Zellen am Tag 6 des Langzeit-Anzucht-Protokolls im log-Phasen-Wachstum (2). Dennoch ergab die Transfektion dieser Zellen mit konstitutiven Reporter-Konstrukten keine messbare Reporteraktivität, was darauf hindeutet, dass Proliferation alleine zur effizienten transgenen Expression nicht ausreichend ist.
Um zu bestimmen, ob „aktive" Signaltransduktion zur Reportergen-Expression nötig ist, wurden primäre T-Zellen in der log-Wachstumsphase am Tag 5 des Anzuchtprotokolls mit Phorbolester (PDBU) plus Calciumionophor (Ionomycin) 10 Stunden vor der Transfektion stimuliert.
4 beschreibt den für diese und folgende Transfektionen benutzten Zeitplan. Ruhende T-Zellen wurden durch Inkubation mit einer sättigenden Menge an immobilisiertem anti-CD3-Antikörper und anti-CD28 mit 1 μg/ml zum Proliferieren angeregt. Zwei Tage später am Tag 3 wurden die aktivierten Zellen gezählt, gemessen und auf eine Konzentration von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml mit frischem Komplettmedium eingestellt. MAK 9.3 wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml hinzugefügt. Am Tag 5 wurden die Zellen mit 10 ng/ml Phorbol-12,13-dibutyrat (PDBU, von LC Services Corp.) und 0,4 μg/ml Ionomycin (Calbiochem) stimuliert. An Tag 6 zehn Stunden nach der Stimulierung wurden die Zellen mit 10 μg konstitutiv exprimiertem Reporter-Konstrukt RSV-CAT transfiziert, wobei hauptsächlich DEAE-Dextran, wie zuvor beschrieben, benutzt wurde (Ho, I-C., Bhat, N. K., Gottschalk, L. R., Lindsten, T., Thompson, C. B., Papas, T. S. und Leiden, J. M. (1990) Science 250: 814–817). PRSV-CAT (RSV-CAT) besteht aus RSV-LTR-Sequenzen, die mit dem 5'-Ende der Codierungssequenzen für CAT verbunden sind (Gorman, C. M., Merlino, G. T., Willingham, M. C., Pastan, I. und Howard, B. H. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6777–6781). Die Zellen wurden 40 Stunden später geerntet und auf CAT-Aktivität geprüft.
Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt. Die Vorstimulierung mit PDBU + Ionomycin der proliferierenden primären Zellen ergab einen 67-fachen Anstieg der RSV-CAT-Reporter-Expression verglichen mit Zellen, die allein mit konditioniertem Medium behandelt wurden. Um zu bestimmen, ob dieser starke Unterschied in der RSV-CAT-Reporter-Aktivität aufgrund eines Unterschieds in der proliferierenden Kapazität der stimulierten gegen die nicht stimulierten Zellen erfolgte, wurde der proliferierende Zustand dieser Zellen gemessen, indem das Folgende gebraucht wurde 1) Acridinorange-Färbung zur Zellzyklus-Analyse, 2) Tritum-Thymidin [³H]TdR-Einbau als ein Maß für DNA-Synthese und 3) Zellgröße als eine allgemeine Messung zellulärer Aktivität. Autologe ruhende primäre Zellen und αCD3/αCD28 stimulierte Zellen von Tag 3 des Langzeit-Anzuchtprotokolls wurden gleichzeitig als Kontrollen für den ruhenden Zustand (G₀/G₁-Verbindung) und stabile Proliferation gemessen.
Gereinigte ruhende T-Zellen (Tag 1) wurden mit einer sättigenden Menge an immobilisiertem αCD3-mAK G19-4 in der Gegenwart des αCD28-mAK 9.3 (1 μg/ml) stimuliert. Am Tag 3 wurden aktivierte T-Zellen auf eine Konzentration von 0,5 × 10⁶/ml mit frischem Komplettmedium verdünnt und mAK 9.3 wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml hinzugefügt. Am Tag 6 wurden T-Zellen im exponentiellen Wachstum mit Phorbol-12,13-Dibutyrat (PDBU) (10 ng/ml) plus Ionomycin (0,4 μg/ml) oder konditioniertem Medium allein für 10 Stunden behandelt. Zellen von Tag 3 und Tag 6 wurden mit Acridinorange zur Zellzyklusanalyse, wie nachstehend beschrieben wurde, gefärbt. Nichtstimulierte Zellen (Tag 1) wurden gleichzeitig analysiert, um den G₀/G₁-Übergang zu bestimmen.
Die Zellen wurden auf den DNA- und RNA-Gehalt mit einen FACScan-Durchfluß-Cytometer (Becton-Dickinson) nach Färbung mit Acridinorange (Polysciences) analysiert, wobei ein Verfahren, das von Darzynkiewicz (1990) Methods Cell Biol. 33: 285–298) beschrieben wurde, benutzt wurde. 1 bis 5 × 10⁶ Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in kaltem 70% Ethanol in einer Konzentration von 2 × 10⁶/ml fixiert. Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und in Komplettmedium auf eine Konzentration von unter 2 × 10⁶/ml resuspendiert. 0,2 ml dieser Zellsuspension wurden mit Acridinorange gefärbt und im FACScan analysiert. Zellen mit einem erhöhten RNA-Gehalt und unveränderten DNA-Gehalt wurden für G₁-Phase-Zellen gehalten. Zellen mit erhöhtem RNA- und DNA-Gehalt wurden für S- oder G₂M-Phasen gehalten.
Zur Bestimmung des [³H]TdR-Einbaus der Z-Zellen von Tag 1, 3 und 6 wurden die Zellen in vierfachen Proben in Flachboden-Microtiter Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung angezogen. Das Endvolumen der Anzucht betrug 200 μl in Komplettmedium. 1 μCi Tritium-Thymidin [³H]TdR (ICN) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Kulturen wurden für 6 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Nach 6 Stunden Anzucht wurden die Zellen auf Glas-Microfaser-Streifen (Whatman) geerntet, wobei ein PHD-Zellenerntergerät (Cambridge Technologies) benutzt wurde, und in einem Flüssigkeitsscintillationszähler (LKB) gezählt. Alle Werte wurden als mittlere CpM ± Standardabweichung der vierfachen Züchtungen angegeben.
Wie in 6 gezeigt wird, führte die Stimulierung der ruhenden T-Zellen mit αCD3/αCD28 zu einem Fortschreiten von mehr als 92% der Zellen von der G₀- zu der G₁- oder S/G₂M-Phasen des Zellzyklus am dritten Tag der zellulären Expansion. Dies stimmte mit einem 207-fachen Anstieg der Tritium-Thymidin-Aufnahme und einem Anstieg des mittleren Zellvolumens überein. Am Tag 6 der Anzucht befanden sich mehr als 91% der Zellen, die in konditioniertem Medium allein wuchsen, entweder in der G₁- oder S/G₂M-Phasen des Zellzyklus. Mehr als 92% der mit PDBU und Ionomycin behandelten Zellen, die auf DNA- und RNA-Gehalte 10 Stunden nach Stimulierung getestet wurden, befanden sich in der G₁ oder S/G₂M-Phase des Zellzyklus. Diese Daten zeigen die aktive Veranlagung der Zellen zum Durchlaufen des Zellzyklus zum Zeitpunkt der Transfektion und die gleichen Fähigkeiten zur Proliferation der PDBU/IONO stimulierten gegenüber den nicht stimulierten Zellen. In der Tat zeigten mit PDBU/IONO stimulierte Zellen keinen Anstieg in der Rate der DNA-Synthese (35 × 10³ CpM gegen 52 × 10³ CpM [3H]TdR-Aufnahme) oder keine Zunahme des durchschnittlichen Zellvolumens, wenn sie mit ihren nicht stimulierten Gegenstücken verglichen wurden. Deshalb wurden keine Unterschiede in den Fähigkeiten zur Proliferation dieser zwei Zellpopulationen zur Zeit der Transfektion gefunden, was auf Unterschiede in der RSV-CAT-Reportergen-Expression hinweist.
Die Rous sarkom-Virus-LTR beinhaltet ein Calcium/Calmodulin abhängiges Proteinkinase-(CaM-Kinase)-Antwortelement, das zur Übertragung selektiver Induktion der Transkription durch aktivierte CaM-Kinase in der Gegenwart erhöhter Mengen Calciumionen in der Lage ist (Kapiloff, M. S., Mathis, J. M., Nelson, C. A., Lin, C. R. und Rosenfeld, M. G. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3710–3714). Um zu bestimmen, ob die Unterschiede in der RSV-CAT-Expression zwischen PDBU/IONO stimulierten und nicht-stimulierten Zellen durch spezifische trans-Aktivierung der RSV-LTR anschließend an die Stimulierung entstehen, wurden die Zellen sowohl mit PDBU/IONO prästimuliert oder mit konditioniertem Medium allein behandelt, transfiziert, dann beide sofort in konditioniertem Medium oder Komplettmedium angezogen. 30 Stunden nach der Transfektion wurden die in Komplettmedium angezogenen Zellen entweder mit PDBU/IONO, αCD3/αCD28 oder mit Medium allein stimuliert bzw. behandelt. 10 Stunden später wurden die Zellen zur CAT-Aktivitätsbestimmung geerntet. Wenn es die einzige Rolle der Signaltransduktion ist, die Transkription von RSV-LTR zu aktivieren, dann sollten nach der Transfektion stimulierte Zellen auch eine gestiegene Reporteraktivität zeigen. Wie in 7 gezeigt wird, führte die PDBU/IONO-Prästimulierung der Zellen zu einem 345-fachen Anstieg der RSV-CAT-Reporteraktivität verglichen mit der nicht stimulierten proliferierenden Kontrolle. Stimulation der Zellen 30 Stunden nach der Transfektion mit entweder αCD3/αCD28 oder PDBU/IONO führte zu jeweils einem kleinen 3- bis 3,5-fachen Anstieg der RSV-CAT-Reporter-Aktivität. Züchten der transfizierten Zellen in Wachstums-kompetentem konditioniertem Medium führte zu einem 2,5-fachen Anstieg in der CAT-Aktivität. Weiterhin führte die PDBU/IONO oder αCD3/αCD28-Stimulierung der Zellen sofort nach der Transfektion zu einem kleinen 4–5-fachen Anstieg der RSV-CAT-Aktivtät. Diese Daten zeigen, dass Stimulierung vor der Transfektion für die RSV-CAT-Aktivität nötig ist, und legen eine Signaltransduktion zur Zeit der Transfektion nahe, was die Reporter-Gen-Expression entweder durch steigende Effizienz der Transfektion oder Kompetentmachen des Transgens zur Expression ermöglicht. Der Gebrauch dieses Reporter-Konstrukts, die Stimulierung der Zellen nach der Transfektion führten nicht zu einem nennenswerten Anstieg der Reportergen-Expression.
In dem folgenden Beispiel wurde gezeigt, dass die Stimulierung der primären T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28 10 Stunden vor der Transfektion zu einer stark verstärkten Expression des Reporter-Konstruktes führte. HIV-1-CAT wurde kürzlich beschrieben (Nabel, G. und Baltimore, D. (1987) Nature 326: 711–713) und in diesem Beispiel benutzt. Proliferierende T-Zellen wurden entweder mit PDBU/IONO, αCD3/αCD28 prästimuliert oder mit konditioniertem Medium allein behandelt, mit HIV-1-CAT transfiziert und jeweils sofort in konditioniertem Medium angezogen oder 30 Stunden nach Transfektion mit PDBU/IONO, αCD3/αCD28 oder Medium allein stimuliert. 10 Stunden später wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität geprüft. Die Ergebnisse der CAT-Tests werden in 8 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Prästimulierung der primären T-Zellen 10 Stunden vor der Transfektion die Expression des HIV-1-CAT-Reporterkonstrukts verglichen mit der Transfektion ohne Prästimulierung stark erhöht. Deshalb ist die Verstärkung der Expression des Reporterkonstruktes nicht vom Typ des Promotors und Enhancers in dem Konstrukt abhängig. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass Prästimulierung der primären T-Zellen zum Verstärken der Expression des transfizierten Reporter-Konstruktes auch mit einer Kombination von anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern durchgeführt werden kann.
Beispiel 3 – Expression exogener DNA benötigt TCR-abhängige Signaltransduktion zur Zeit der Transfektion
Um weiterhin die Bedingungen für eine effiziente transgene Expression in primären T-Zellen zu analysieren, wurde der häufig studierte und gut charakterisierte Promotor/Enhancer des zellulären IL-2-Gens für Transfektionsexperimente eingesetzt. Northern-Blot-Analyse wurde benutzt, um die Kinetik der IL-2-Genexpression nach Stimulierung des TCR-CD3-Komplexes mit optimalen Mengen an immobilisiertem αCD3 zu charakterisieren. Außerdem wurden die Überstände dieser Anzucht auch auf den IL-2-Gehalt analysiert und die Zellen auf Zellzyklus-Progression untersucht.
Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Bild B zeigt, dass in der Gegenwart optimaler αCD3-Stimulierung die IL-2m-RNA-Expression bei 6 Stunden Anzucht einen Höhepunkt erreichte, nach 12 Stunden Anzucht hatte die IL-2-mRNA-Menge auf unbestimmbare Mengen abgenommen. Diese kurzzeitige Induktion der IL-2-mRNA-Expression wurde von einer kleinen Menge IL-2 in dem Kulturüberstand (5 U/ml nach 24 Stunden) und starker Proliferation (41% der Zellen in S/G₂M-Phasen des Zellzyklus nach 48 Stunden) (Bild D) begleitet. Zusammenfassend führte die Stimulierung des TCR-CD3-Komplexes zur kurzzeitigen, bei 6 Stunden den Höhepunkt erreichenden Induktion der IL-2-Gen-Transkription und zu einem Abfall auf unbestimmbare Mengen 12 Stunden nach der Stimulierung.
Angesichts der induzierbaren und kurzzeitigen Natur der IL-2-mRNA-Transkription wurde der Bedarf der Signaltransduktion zur Zeit der Transfektion für die IL-2-CAT-Reporter-Gen-Expression getestet. Das pIL2CAT-Plasmid (IL-2-CAT) beinhaltet den IL-2-Promotor/Enhancer (–585 bis +18) unmittelbar 5' des Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gens und wurde kürzlich beschrieben (Bielinska, A., Shivdasani, R. A., Zhang, L. und Nabel, G. J. (1990) Science 250: 997–1000). Proliferierende primäre T-Zellen wurden am Tag 5 des Expansionsprotokolls entweder mit PDBU/IONO prästimuliert oder mit konditioniertem Medium allein behandelt, mit dem IL-2-CAT-Reporter-Plasmid transfiziert, dann sofort in wachstumskompetentem konditioniertem Medium oder Komplettmedium angezogen. 30 Stunden nach Transfektion wurden die in Komplettmedium angezogenen Zellen jeweils mit PDBU/IONO, αCD3/αCD28 stimuliert oder mit Medium allein behandelt. 10 Stunden später wurden die Zellzahl, die Lebensfähigkeit mittels Typtan-Blau-Ausschluß bestimmt und die Zellen zur CAT-Aktivitätsbestimmung geerntet.
Die Ergebnisse des CAT-Tests sind in 10 gezeigt und werden wie folgt zusammengefasst: 1) in Abwesenheit der Prästimulierung exprimieren proliferierende primäre Zellen extrem geringe Mengen an IL-2-CAT-Reporter; 2) Stimulierung der Zellen 30 Stunden nach Transfektion erhöhte nicht diese geringe Menge der IL-2-CAT-Reporter-Gen-Expression; 3) nach PDBU/IONO-Prästimullierung und Transfektion exprimierten in Lymphokin-reichem konditioniertem Medium oder in Komplettmedium resuspendierte Zellen sehr geringe Mengen des IL-2-CAT-Reporters.; 4) nach sowohl PDBU/IONO-Prästimulierung als auch auf TCR-gerichteter Stimulierung 30 Stunden nach der Transfektion erhöhte sich jedoch die IL-2-CAT-Reporter-Aktivität um das 79-fache verglichen mit den Zellen, die nur eine Prästimulierung erhalten hatten, und ungefähr um das 20-fache verglichen mit der nicht stimulierten proliferierenden Kontrolle. Deshalb benötigte die IL-2-CAT-Reporter-Gen-Expression die TCR-abhängige Signaltransduktion sowohl vor als auch nach der Transfektion. Diese Daten stehen im Einklang mit einem Modell, in dem die Einführung des IL-2-CAT-DNA-Reporter-Konstruktes in ein exprimierbares Kompartiment oder einen Zustand die TCR-abhängige Signaltransduktion vor der Transfektion benötigt. Dennoch tritt, auch wenn das IL-2-CAT-Reporter-Plasmid zur Expression fähig ist, eine geringe oder gar keine IL-2-CAT-Transkription auf, da die anfängliche Signaltransduktion 10 Stunden vor der Transfektion stattgefunden hatte, und durch die vorherige Northern-Blot-Analyse wurde gezeigt (9), dass die IL-2 mRNA-Transkription bis auf geringe Mengen zu diesem Zeitpunkt abnahm. TCR/CD3-abhängige Stimulierung nach der Transfektion führt zu Trans-Aktivierung des für die Expression kompetenten IL-2-Promotors/Enhancers und der CAT-mRNA-Tanskription mit sich ergebender Reporter-Aktivität.
Beispiel 4 Zelluläre Proliferation ist für die transgene Expression nötig
Um sich mit der Rolle der zellulären Proliferation bei der Transgen-Expression zu befassen, wurden frisch isolierte, ruhende T-Zellen mit entweder αCD28 (1 μg/ml), SEA (10 ng/ml, Toxin Technologies), PDBU (10 ng/ml)/IONO (0,4 μg/ml) oder dem Medium allein für 10 Stunden stimuliert. Diese Zellen wurden mit RSV-CAT transfiziert, dann nach 40 Stunden für die CAT-Aktivitätsbestimmung geerntet. Aktivierte T-Zellen durchlaufen die Zellteilung zwischen 24 und 36 Stunden nach der mitogenen Stimulierung. Deshalb sind zur Zeit der Transfektion nur sehr wenige T-Zellen, wenn überhaupt, durch die M-Phase gekommen. 40 Stunden nach Transfektion (etwa 50 Stunden nach der Stimulierung) zeigten die mit SEA oder PDBU/IONO stimulierten T-Zellen phänotypische Änderungen, die mit der Proliferation (zelluläre Vergrößerung, Aggregation) verbunden waren. Jedoch war die Zellzahl dieser Populationen nicht angestiegen. Wie in 11 gezeigt, waren die normalisierten CAT-Aktivitäten für alle diese Transfektionsbedingungen relativ gering (0,07–0,26). Ruhende Zellen, die mit PDBU/IONO stimuliert waren, zeigten einen kleinen 3,7-fachen Anstieg der RSV-CAT-Aktivität verglichen mit der ruhenden Kontrolle. Diese geringe Zunahme der CAT-Aktivität zwischen PDBU/IONO stimulierten und ruhenden Zellen kann einfach die Effekte der zellulären Aktivierung und Proliferation der RSV-LTR-Transkription zeigen, sobald dieses Reporter-Plasmid zur Expression als ein Ergebnis der anfänglichen Signaltransduktion fähig ist. Zu beachten ist, dass die CAT-Aktivitäten der mit αCD28 oder SEA stimulierten Zellen keine Unterschiede zu denen der ruhenden Zellen zeigten. Weder die αCD28 noch SEA allein erzeugen komplette mitogene Stimuli. Die Induktion der T-Zell-Proliferation durch SEA benötigt das Hinzufügen eines zweiten co-stimulierenden Signals, das von akzessorischen Zellen (ein Bedarf für die Haupthistokompatibilitäts-Komplex (MHC) Klasse II-Präsentation) oder durch monoclonale Antikörper-Stimulierung von CD28 bereitgestellt wird (Green, J. M., Turka, L. A., June, C. H. und Thompson, C. B. (1992) Cell. Immunol. 145(1) 11–20). Ruhende T-Zellen exprimieren keine MHC-Klasse II (HLA-Dr) auf ihrer Oberfläche (Mayforth, R. D. (1991) Ph. D. Dissertation, Univ. von Chicago). Deshalb zeigen ruhende T-Zellen in Abwesenheit proliferierender Stimuli keine Expression des konstitutiven aktiven Reporter-Plasmids RSV-CAT.
Um zu zeigen, dass diese Zellen RSV-CAT exprimieren können, wurde ein anderes Aliquot der gleichen Zellen mit αCD3/αCD28 stimuliert und zur Anzucht gebracht. 5 Tage später wurden diese Zellen entweder mit PDBU/IONO für 10 Stunden stimuliert oder mit konditioniertem Medium allein für 10 Stunden behandelt, mit RSV-CAT transfiziert und dann 40 Stunden später zur CAT-Aktivitätsbestimmung geerntet. Ein Vergleich der relativen CAT-Aktivitäten der Zellen, die entweder am Tag 1 (ruhende Zellen) oder Tag 6 (proliferierende Zellen ) mit oder ohne PDBU/IONO-Prästimulation transfiziert wurden, wird in 11 gezeigt. PDBU/IONO-Prästimulierung der proliferierenden Zellen führte zu einem 13,4-fachen Anstieg der CAT-Aktivität verglichen mit der proliferierenden, nicht-stimulierten Kontrolle und einem 23,7-fachen Anstieg gegenüber PDBU/IONO-stimulierten ruhenden Zellen. Deshalb fördert die zelluläre Proliferation zum Zeitpunkt der Transfektion stark die RSV-CAT-Reporter-Expression. Zusammen mit den vorstehenden Transfektionsergebnissen zeigen diese Daten, dass die Proliferation für die Transgenexpression erforderlich, aber nicht ausreichend ist.
Beispiel 5 Unterschiede in der Reporter-Genaktivität beruhen nicht auf Unterschieden in der Transfektions-Effizienz
Wie vorstehend gezeigt, ist die TCR-abhängige Signaltransduktion vor dem Zeitpunkt der Transfektion zur transgenen Expression notwendig. Stimulierung nach der Transfektion erhöht in den meisten Fällen nicht nennenswert die Reporter-Aktivität. Der kritische Faktor ist der Aktivierungszustand der Zelle, unabhängig von der Proliferation, zur Zeit der Transfektion. Man kann sich jede Zahl von Rollen in der Signaltransduktion vorstellen. Im einfachsten Modell könnte die Signaltransduktion von proliferierenden Zellen zur Zeit der Transfektion die Transfektionseffizienz erhöhen und so die Menge an Reporter-Plasmid, die den Kern erreicht. Alternativ dazu könnte die Signaltransduktion die Bewegung von transfizierter DNA von einem nicht-transkribierbaren zu einem transkribierbaren Kompartiment, z. B. von dem Cytoplasma zum Kern, ermöglichen. Beide Szenarien führen zu gleichen Ergebnissen, einem erhöhten Gehalt des Reporter-Plasmids in dem Kern, gefolgt von der Signaltransduktion. Um diese Möglichkeiten zu überprüfen, wurden die Kinetik des DNA-Eintritts und die Lokalisation überprüft, indem transfizierte DNA aus dem Kern und den cytoplasmatischen Kompartimenten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion isoliert und quantifiziert wurde.
Proliferierende primäre T-Zellen wurden am Tag 5 mit PDBU/IONO prästimuliert oder mit konditioniertem Medium allein behandelt, mit dem RSV-CAT-Reporter-Plasmid transfiziert und anschließend in Komplettmedium angezogen. 0, 6, 24 und 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellzahl und die Überlebensrate mittels Coulter-Zählung bzw. Trypan-Blau-Ausschluß bestimmt.
Nach der Trennung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen mittels Dounce-Homogenisierung wurde die DNA aus diesen beiden Fraktionen extrahiert, wobei fortlaufende Ammoniumacetat/Isopropanol-Fällungen gefolgt von SDS-Solubilisierung und Proteinase K-Verdau benutzt wurden. Das DNA-Isolations-Protokoll ist für die Gewinnung von DNA mit sowohl großem wie auch kleinem Molekulargewichts quantitativ. Um die relative Kopienzahl des Transgens im Kern und in den cytoplasmatischen Kompartimenten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion zu bestimmen, wurden Kern- und cytoplasmatische DNA von 10⁵ Gesamtzelläquivalenten in 1% Agarosegelen nach Größe aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen, wie es kürzlich beschrieben wurde (Thompson, C. B. und Neiman, P. E. (1987) Cell 48: 369–378). Die Blots wurden entweder mit einem EcoRI-Fragment der CAT-codierenden Region von pRSV-CAT oder einem EcoRI/BamHI-Fragment der CAT-codierenden Region von pIL2CAT hybridisiert.
Die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse sind in 12 gezeigt. Etwa 10⁵ Kopien des Plasmids/Zelle wurden in den ersten 30 Minuten nach Aussetzen gegen den DNA/DEAE-Dextran-Komplex aufgenommen. Dieses entspricht etwa 10% der gesamten transfizierten DNA. Von dieser Menge waren etwa 90% in der Kernfraktion lokalisiert. Ähnliche oder leicht erhöhte Mengen des Transgens waren im Kern oder in den cytoplasmatischen Fraktionen der Zellen nach 6, 24 und 48 Stunden nach Transfektion vorhanden. Auffallend war, dass es keinen nennenswerten Unterschied in den DNA-Mengen in entweder dem Kern oder den cytoplasmatischen Fraktionen zwischen PDBU/IONO prästimulierten und nicht-stimulierten Zellen zu irgendeinem Zeitpunkt gab. Insgesamt machte die Southern-Blott-Analyse keine nachweislichen Unterschiede in der Menge an DNA, die das Kern-Kompartiment ereichte, zwischen Signal transduzierten und nicht-Signal transduzierten Zellen deutlich.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen wurden primäre T-Zellen mit dem RSV-CAT oder IL-2-CAT-Reporter-Plasmid transfiziert, wie es in den 7 bzw. 10 beschrieben ist. Die Plasmid DNA wurde dann aus dem Kern-Pellet nach hypotonischer Lyse der Zellen isoliert.
Wie in den 13 und 14 gezeigt, waren 40 Stunden nach der Transfektion etwa 10⁵ Kopien/Zelle des RSV-CAT-Plasmids im Kern präsent, was 10% der gesamten transfizierten DNA entspricht. Wie vorher gab es keinen sichtbaren Unterschied in der Menge der DNA, die im Kern von PDBU/IONO prästimulierten Zellen, nicht-stimulierten Zellen vorhanden war, oder im Kern der Zellen vorhanden war, die nach der Transfektion entweder mit PDBU/IONO, αCD3/αCD28 oder konditioniertem Medium stimuliert wurden. Es ist zur Kenntnis zu nehmen, dass die Southern-Analyse der isolierten DNA nach der hypotonischen Lyse der Zellen keinen Beweis für Plasmid-Degradierung 40 Stunden nach der Transfektion ergab.
Nachdem diese Ergebnisse unter Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren zur DNA-Isolierung rekapituliert wurden, war es noch immer nicht möglich, die Möglichkeit, dass die Gewinnung der Plasmid-DNA nicht gänzlich quantitativ war außer acht zu lassen. Um diese Ergebnisse unabhängig zu bestätigen, wurden PDBU/IONO-prästimulierte Zellen und nicht-stimulierte Zellen mit ³²P-radiomarkiertem linearisiertem RSV-CAT transfiziert. Diese Zellen wurden dann in Kern und cytoplasmatische Fraktionen 0, 6, 24 und 48 Stunden nach der Transfektion getrennt. Diese Fraktionen wurden dann in einem Flüssigkeitsscintillatonszähler gezählt.
Die Ergebnisse, die in 15 dargestellt sind, zeigen, dass innerhalb von 30 Minuten nach der Transfektion 15,2% der gesamten, transfizierten CpMS von den PDBU/IONO-prästimulierten Zellen aufgenommen wurden. Dieses verglichen mit 11,9% für die nicht-stimulierten Zellen. Von diesen Zählimpulsen wurden 92% in der Kernfraktion der prästimulierten Zellen und 84% in nicht-stimulierten Zellen gefunden. Zu späteren Zeitpunkten stieg der Prozentsatz der gesamten in der Kernfraktion gewonnen CpM von 14% zur Stunde 0 auf 17,1% nach 48 h in den mit PDBU/IONO-prästimulierten Zellen und von 10% zur Stunde 0 bis 13,9% nach 48 Stunden in nicht-stimulierten Zellen an. Dieser Anstieg der Kernzählimpulse stimmte einem kleinen Abfall des Prozentgehaltes der Gesamt-CpM, die aus den cytoplasmatischen Fraktionen sowohl der prästimulierten als auch der nicht-stimulierten Zellen gewonnen wurden, überein; vielleicht spiegelt es die Bewegung der DNA vom Cytoplasma zum Kern wider. Jedoch können die kleinen Unterschiede des Prozentgehalts der Gesamt-CpM, die in den Kernfraktionen der nicht Signal-transduzierten und PDBU/IONO-Signal-transduzierten Zellen gefunden wurden, den dramatischen 67- bis 345-fachen Anstieg der RSV-Reporter-Gen-Expression zwischen diesen beiden Populationen nicht erklären. Die Ergebnisse der Zählimpulsbestimmung transfizierter, radiomarkierter DNA sind in enger Übereinstimmung mit der Southern-Blot-Analyse bezüglich sowohl der absoluten Mengen des Plasmids, das von den Zellen aufgenommen wurde, als auch der folgenden Aufteilung der DNA zwischen Kern- und cytoplasmatischen Kompartimenten. Kurz gefasst, die PDBU/IONO-Prästimulierung der Zellen scheint nicht die Reporter-Gen-Expression durch Anstieg der Transfektionseffizienz oder dem Ermöglichen der Bewegung der DNA vom Cytoplasma zum Kern zu erhöhen.
Beispiel 6 Superantigen-induzierte TCR-Aktivierung ändert das nukleäre Schicksal der DNA, die eine retrovirale LTR enthält
Die vorher beschriebenen Beispiele zeigen, das ein zellulärer Mechanismus existiert, der durch TCR-vermittelte Signaltransduktion unterdrückbar ist, die ruhende und nicht-Signal-transduzierte proliferierende primären T-Zellen vor der Expression exogener DNA in vitro schützt. Angesichts der Notwendigkeit der TCR-abhängigen Signaltransduktion für die Reporter-Gen-Expression wurde untersucht, ob das Superantigen als ausreichender Stimulus für die verstärkte transgene Expression dienen kann.
Zehn Stunden vor der Transfektion wurden primäre menschliche T-Zellen in exponentiellem Wachstum mit konditioniertem Medium allein, 5 × 10⁶ bestrahlten autologen Monocyten, SEA (10 ng/ml) oder SEA (10 ng/ml) plus 5 × 10⁶ bestrahlten autologen Monocyten behandelt. Die Zellen wurden mit RSV-CAT oder HIV-1-CAT transfiziert und 40 Stunden nach der Transfektion geerntet und auf CAT-Aktivität geprüft.
Die Ergebnisse des CAT-Tests sind in 16 dargestellt. In den Transfektionen mit HIV-1-CAT führte die PDBU/IONO-Prästimulierung zu einem 15-fachen Anstieg der CAT-Aktivität verglichen mit der nicht-stimulierten proliferierenden Kontrolle. Co-Inkubation der T-Zellen mit 5 × 10⁶ bestrahlten autologen Monocyten führte zu einem kleinen 2,3-fachen Anstieg der CAT-Aktivität. Die Behandlung mit 10 ng/ml SEA führte zu einem 32-fachen Anstieg der CAT-Aktivität, während die Co-Inkubation der T-Zellen mit SEA + 5 × 10⁶ bestrahlten autologen Monocyten zu einem 16-fachen Anstieg führte. Deshalb erhöht SEA, entweder allein oder in Verbindung mit APCs, die MHC Klasse II (HLA-DR) exprimieren, die HIV-1-CAT-Reporter-Genexpression. Gänzlich analoge Ergebnisse wurden bei der Transfektion mit RSV-CAT festgestellt (16). Der proliferierende Zustand von SEA und SEA + MONO stimulierten Zellen, wie durch die Tritium-Thymidin-Aufnahme und die Zellgröße gemessen, war nicht messbar anders als bei nicht-stimulierten proliferierenden Zellen. Deshalb resultiert die erhöhte HIV-1-CAT- und RSV-CAT-Reporter-Expression von dem Effekt des Superantigens auf die Signaltransduktion und nicht von der Proliferation an sich.
Solch ein Mechanismus und seine Repression können beträchtliche Konsequenzen auf die Ereignisse, die mit retroviralen Infekten verbunden sind, haben. Zum Beispiel ist nach einer Infektion ruhender T-Zellen mit HIV eine anschließende T-Zellaktivierung zur Integration des HIV-1-Genoms in das Wirtsgenom und zur Produktion des infektiösen Virus nötig (Stevenson, M., Stanwick, T. L., Dempsey, M. P. und Lamonica, C. A. (1990) EMBO J. 9(5): 1551–1560; Zack, J. A., Arrigo, S. J., Weitsmann, S. R., Go, A. S., Haislip, A. und Chen, I. S. Y. (1990) Cell 61: 213–222; Bukrinsky, M. L., Stanwick, T. L., Dempsey, M. P. und Stevenson, M. (1991) Science 254: 423–427). Diese schlagen ein Modell vor, in dem HIV-1 in einem nicht-produktiven extrachromsomalen Zustand in ruhenden Zellen bis zur späteren Antigen- oder mitogen-induzierten T-Zellaktivierung bleibt. Kürzlich wurde berichtet, dass zur Replikation von HIV in ruhenden Zellen die Tyrosinphosphorylierung des HIV-1-Matrix-Proteins nötig ist (Gallay, P., et al., (1995) Cell 80: 379).
Superantigene, Moleküle, die von T-Zellen erkannt werden, die spezifische TCR Vß-Genprodukte exprimieren, überbrücken MHC Klasse II und den TCR, was verschiedentlich zu Zellaktivierung, Deletion oder Anergien führt. Diese Gruppe von Protein-Antigenen ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit, eine große Zahl peripherer Blut-T-Zellen zu aktivieren. Säuger-Retroviren können Superantigene codieren, um die Bildung der zellulären Immunreaktivität zu blockieren oder die Replikation zu ermöglichen, als Konsequenz auf die direkte Zellaktivierung. Neuere Berichte lassen vermuten, dass die Expression eines HIV-1-Superantigens die T-Zellen-Abreicherung, die bei HIV-1-Infektion beobachtet wird, vermittelt könnte (Imberti, I., Sottini, A., Bettinardi, A., Puoti, M. und Primi, D. (1991) Science 254: 860–862; Cameron, P. U., Freudenthal, P. S., Barker, J. M., Gezelter, S., Inaba, K. und Steinman, R. M., (1992) Science 257: 383–387; Laurence, J., Hodtsev, A. S. und Posnett, D. N. (1992) Int. Conf. AIDS Jul 19–24; 8(1): Th72; Pantaleo, G., Rebai, N., Graziosi, C., Lane, H. C., Sekaly, R. P. und Fauci, A. S. (1992) Int. Conf. AIDS Jul 19–24, 8(1): Th71). Die Natur der Signaltransduktionswege, die von der Superantigen-Aktivierung der T-Zellen induziert wird, bleibt ein Gegenstand der Kontroverse (Liu, H., Lampe, M. A:, Iregui, M. V. und Cantor, H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(19): 8705–8709; Kanner, S. B., Odum, N., Grosmaire, L., Masewicz, S., Svejgaard, A. und Ledbetter, J. A. (1992) J. Immunol. 149(11): 3482–3488; Oyaizu, N., Chirmule, N., Yagura, H., Pahwa, R., Good, R. A. und Pahwa, S. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(17): 8035–8039). Die Wirksamkeit von SEA, entweder allein, oder in Verbindung mit APCs, die MHC Klasse II exprimierend, bei Erhöhung entweder der HIV-1-LTR oder RSV-LTR gesteuerten Reporter-Gen-Expression in proliferierenden T-Zellen zeigt, dass Superantigenbeteiligung des TCR das minimale Signal, das für die exogene DNA nötig ist, in ein exprimierbares nukleäres Kompartiment ein zu dringen, bilden kann.
Diese Beispiele zeigen die Existenz eines aktiven Mechanismus, der durch die TCR-vermittelte Signaltansduktion unterdrückbar ist und der die ruhenden und proliferierenden T-Lymphocyten vor der Expression exogener DNA schützt. T-Zellen exprimieren nur exogene DNA nach der Signaltransduktion vor der Transfektion. Dieses Ergebnis hat Auswirkungen auf das Gebiet der somatischen Zell- Gentherapie, da die zelluläre Proliferation allein für die effiziente Expression der exogenen DNA unzureichend sein kann. Deshalb stellt die Erfindung ein Verfahren zur effektiven Expression eines Gens, das in proliferierende T-Zellen eingeführt wird, bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung werden T-Zellen von einem Individuum erhalten, zum Proliferieren ex vivo stimuliert, genetisch mit dem Verfahren der Erfindung transduziert und dem Individuum wieder verabreicht. In dieser besonderen Ausführungsform werden die T-Zellen mit einem Wirkstoff oder einer Kombination von Wirkstoffen in Kontakt gebracht, die die T-Zellen-Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion stimulieren, wie zum Beispiel einem anti-CD3-Antikörper, einer Kombination von Phorbolester und Ionomycin oder einem anderen Wirkstoff, der den T-Zellrezeptor umgeht.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Blockieren oder zur Abnahme der Expression exogener DNA bereit, wie zum Beispiel viraler DNA. Deshalb können primäre T-Zellen, die exogene DNA enthalten, wie zum Beispiel virale DNA, zur Proliferation stimuliert werden, während die virale Replikation gehemmt wird durch zum Beispiel Stimulierung der Proliferation der T-Zellen mit einem Wirkstoff, der den erforderlichen Mechanismus zur exogenen Genexpression, wie hier beschrieben, nicht aktiviert.

Claims

Verfahren zur Erhöhung der Expression eines exogenen Nucleinsäuremoleküls in T-Zellen, umfassend: (a) das in vitro-Inkontaktbringen von T-Zellen mit mindestens einem stimulierenden Wirkstoff; und (b) die in vitro-Einführung des exogenen Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen aus Schritt (a) weniger als 24 Stunden nach dem Inkontaktbringen der T-Zellen, wobei die Expression des exogenen Nucleinsäuremoleküls in T-Zellen erhöht ist im Vergleich zur Expression in T-Zellen, die nicht mit dem mindestens einen stimulierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht worden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die T-Zellen proliferieren, bevor sie mit dem mindestens einen stimulierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die T-Zellen in vitro in Kontakt gebracht werden mit mindestens einem proliferativen Wirkstoff, welcher die Proliferation von T-Zellen vor ihrem Inkontaktbringen mit dem mindestens einen stimulierenden Wirkstoff anregt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die T-Zellen primäre T-Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff eine Kombination eines ersten Wirkstoffs, welcher ein primäres Aktivierungssignal für die T-Zellen zur Verfügung stellt, und eines zweiten Wirkstoffs, welcher ein co-stimulierendes Signal für die T-Zellen zur Verfügung stellt, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste Wirkstoff mit dem T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplex interagiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste Wirkstoff ein Anti-CD3-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste Wirkstoff mit einem CD2-Molekül auf den T-Zellen interagiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste Wirkstoff ein Antigen auf einer Antigen-präsentierenden Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der zweite Wirkstoff ein Anti-CD28-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der zweite Wirkstoff eine stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28 ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die stimulierende Form eines natürlichen Liganden von CD28 das B-Lymphocyten-Antigen B7-1 oder B7-2 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste oder zweite Wirkstoff ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der erste Wirkstoff und der zweite Wirkstoff Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff oder der erste und zweite Wirkstoff an einer Oberfläche haften.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Oberfläche eine Perle, eine Zellkulturschale oder eine Zelloberfläche ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der mindestens eine stimulierende Wirkstoff ein Super-Antigen oder eine Kombination eines Phorbolesters und eines Calcium-Ionophors ist, oder einen Protein-Tyrosinkinase-Aktivator umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die T-Zellen zwischen etwa 1 und 24 Stunden vor Einführen des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen mit dem mindestens einen stimulierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die T-Zellen mit dem mindestens einen stimulierenden Wirkstoff etwa 10 Stunden vor Einführen des Nucleinsäuremoleküls in die T-Zellen in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die T-Zellen überdies in vitro stimuliert werden, um ihre Anzahl zu erhöhen.