JP4189007B2 - T細胞の改良トランスフェクション法 - Google Patents
T細胞の改良トランスフェクション法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4189007B2 JP4189007B2 JP2007028118A JP2007028118A JP4189007B2 JP 4189007 B2 JP4189007 B2 JP 4189007B2 JP 2007028118 A JP2007028118 A JP 2007028118A JP 2007028118 A JP2007028118 A JP 2007028118A JP 4189007 B2 JP4189007 B2 JP 4189007B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- nucleic acid
- acid molecule
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本明細書に記載した研究は、NMRDC認可61153NAE.4120.001.1402により一部支持されている。従って、米国政府は、本発明の権利を有する。
真核細胞における外来DNAの発現は、遺伝子発現の調節から遺伝子導入に基づく治療法まで広範囲にわたる生物学的主題の研究を可能にするものである。哺乳動物細胞へ遺伝子導入する多くの方法が考案されている。これらには、クローン化レトロウイルスベクターによるインビボおよびインビトロ感染(Shimotohno, K., および Temin, H.M.(1981)Cell 26: 67-77;Cone, R. D. および Mulligan, R. C.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353;Dubensky, T. W., Campbell, B. A., および Villareal, L. P.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7529-7533;Seeger, C., Ganem. D. および Varmus, H. E.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5849-5852)、リン酸カルシウムによるDNAの共沈(Chu, G., および Sharp, P.(1981)Gene 13; 197-202; Benvenistry, N. および Reshef, L.(1986)Proc Natl. Acad. Sci. USA 83:9551-9555)、DANのリポソーム封入(Felgner, P. I., および Ringold, G. M.(1989)Nature 337: 387-388; Kaneda, Y., Iwai, K., および Uchida, T.(1989)Science 243:375-378)、プラスミドDNAの直接注入(Walff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A.,および Felgner, P. L.(1991)Science 247: 1465-1468)、DEAE−デキストラン(McCutchan, J. H., および Pagano, J. S.(1968)J. Natl. Cancer Inst 41: 351-357)、エレクトロポレーション(Neumann, E., Schaefer-Ridder, M. Wang, Y.,および Hofschneider, P. H.(1982)EMBO J.1:841-845; Cann, A. J., Koyanagi, Y., および Chen, I. S. Y.(1988)Oncogene 3:123-128)、および細胞および組織のDNA−被覆粒子ボンバードメント(Yang, N-S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., および McCabe, D.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572)がある。
本発明は、遺伝子のT細胞中での発現を古典的なトランスフェクション技術と比較して高めた、遺伝子を含む核酸分子でのT細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、特に、古典的なトランスフェクション技術には不応である一次T細胞のトランスフェクションに有用である。この方法は、増殖T細胞をその増殖T細胞を刺激する1またはそれ以上の作用物質と、核酸分子をそのT細胞に導入する前に、接触させることを含む。本発明の一実施態様では、T細胞を、T細胞に対する一次活性化シグナルを提供する第1作用物質およびコスティミュラトリー・シグナル(costimulatory signal)を提供する第2作用物質を組み合わせたもので刺激する。本発明の方法は、特に、遺伝子治療における様々な応用を有する。
図1は、1μg/mlの抗CD3被覆プレートおよび抗CD28で刺激した(0日目)後、1、5、7、9および11日目のCD28+T細胞の相対細胞数および細胞容量グラフ表示を表す。
図2は、抗CD28mAb9.3(αCD28)の存在下、飽和量の固定化抗CD3mAbG19−4(αCD3)で刺激した、新たに単離したCD28+T細胞の成長曲線を表す。
図3は、飽和量の固定化抗CD3mAbG19−4(αCD3)および抗CD28mAb9.3(αCD28)による第1刺激(1日目)または第2刺激(8日目)後、0、6、24および72時間培養した一次CD28+T細胞中のEts−1(ETS−1)およびヒト白血球抗原(HLA)mRNAのレベルを示すノーザン・ブロットである。
図5は、トランスフェクションの10時間前にホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)または、ならし培地単独(MED)で刺激し、トランスフェクション後40時間で収集した、RSV−CATでトランスフェクションさせた、指数増殖しているT細胞由来の細胞抽出物で実施したCATアッセイの結果を表す。正規化したCAT活性は(アセチル化%/タンパク質mg)×50として表す。
図6(パネルA〜D)は、アクリジンオレンジ染色した一次T細胞のフロー・サイトメトリー分析および下記の条件で培養した一次T細胞の増殖アッセイの結果を示す:未処理休止一次T細胞(パネルA)、抗CD3および抗CD28で3日間刺激したT細胞(パネルB)、抗CD3および抗CD28で3日間刺激し、その後、新たな培地で更に3日間インキュベーションしたT細胞(パネルC)、または抗CD3および抗CD28で3日間刺激し、ホルボール−12,13−ジブチレート(PDBU)とイオノマイシンで10時間刺激し、その後、新たな培地で更に2日間と14時間インキュベーションしたT細胞(パネルD)。アクリジンオレンジ染色した細胞のフロー・サイトメトリー分析のグラフ表示は、細胞のDNAおよびRNA含量を示し、これは、細胞周期のG0(%G0)、G1(%G1)、およびS/G2M(%S/G2M)期における細胞数の指標である。
図8は、HIV−1−CAT発現構築物でトランスフェクションさせたT細胞で、トランスフェクションの10時間前(1o)に培地単独(MED)、ホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)または抗CD3および抗CD28抗体(αCD3+αCD28)で刺激し、トランスフェクション後30時間(2o)で培地単独(MED)、ホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)、抗CD3および抗CD28抗体(αCD3+αCD28)または、ならし培地(COND MED)で刺激し、10時間後に収集した指数増殖しているT細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したCATアッセイの結果を表す。正規化したCAT活性は(アセチル化%/タンパク質mg)×50として表す。
図9は、ノーザン・ブロット分析により測定した、培地単独(MED)で12時間または抗CD3抗体(CD3)で1、6、12および24時間培養したCD28+T細胞中の総RNA含量(パネルA)またはIL−2の場合のmRNAレベル(パネルB)およびHLAの場合のmRNAレベル(パネルC)を表す。パネルDは、培地単独(MED)と共に12時間または抗CD3抗体(CD3)と共に1、6、12、24または48時間インキュベーションしたT細胞により産生されたIL−2の量、および抗CD3と共に培養後48時間での細胞周期のS期、G2またはM期の細胞割合を示す。
図11は、RSV−CATでトランスフェクションさせた休止T細胞で、トランスフェクションの10時間前に培地単独(1日目:MED)、抗CD28(1日目:αCD28)、スタフィロコッカスエンテロトキシンA(1日目:SEA)、またはホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(1日目:PDBU+IONO)で、または、抗CD3および抗CD28で5日間処理し、次いで、トランスフェクション前の10時間、ならし培地(6日目:MED)またはホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(6日目:PDBU+IONO)で処理した休止T細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したCATアッセイの結果を表す。正規化したCAT活性は(アセチル化%/タンパク質mg)×50として表す。
図12は、増殖T細胞をRSV−CATで、またはプラスミドなし(MOCK)でトランスフェクションさせた後0、6、24または48時間の増殖T細胞で、トランスフェクションの10時間前にホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)または、ならし培地単独(MED)で刺激し、RSV−CATのCATコード領域由来のEcoRIフラグメントとハイブリダイズさせたT細胞から抽出した核DNA(NUCLEAR、パネルA)または細胞質DNA(CYTO、パネルB)のサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。1(1c)、10(10c)、100(100c)、および1000(1000c)コピーのRSV−CAT/細胞に相当するプラスミドDNAを対照として使用した。(lin)鎖状プラスミド;(sc)スーパーコイル状プラスミド。分子量マーカーからのフラグメントのサイズ(キロベース、kb)は、サザン・ブロットの左側に表す。
図14は、IL2−CAT発現構築物でトランスフェクションさせたT細胞で、トランスフェクションの10時間前(1o)に培地単独(MED)またはホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)で刺激し、トランスフェクション後30時間(2o)で培地単独(MED)、ホルボール−12,13−ジブチレートおよびイオノマイシン(PDBU+IONO)、抗CD3および抗CD28抗体(αCD3+αCD28)または、ならし培地(COND MED)で刺激し、IL2−CATのCATコード領域由来のEcoRI/BamHIフラグメントとハイブリダイズさせた指数増殖しているT細胞から抽出した核DNAのサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。1、10、100、および1000コピーのIL2−CAT/細胞に相当するプラスミドDNAを対照として使用した。(lin)鎖状プラスミド;(sc)スーパーコイル状プラスミド。M:分子量マーカー。
図16は、RSV−CATまたはHIV−1−CATでトランスフェクションさせた増殖T細胞で、培地単独(MED)、単球(MONO)、スタフィロコッカスエンテロトキシンA(SEA)、または単球およびスタフィロコッカスエンテロトキシンA(MONO+SEA)でトランスフェクション前時間処理し、トランスフェクション後40時間で収集した増殖T細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したCATアッセイの結果を表す。正規化したCAT活性は(アセチル化%/タンパク質mg)×50として表す。
本発明は、遺伝子をT細胞中で発現させるための、遺伝子を含む核酸分子によるT細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、増殖T細胞をその増殖T細胞を刺激する少なくとも1つの作用物質と、核酸分子をそのT細胞に導入する前に接触させ、そうしてその遺伝子をそのT細胞中で発現させることを含む。
本発明は、遺伝子を含む核酸分子でT細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をT細胞中で発現させる方法に関する。用語“T細胞”は、当分野で定義されているTリンパ球を表し、胸腺細胞、未熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含むことを意図する。T細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞、またはCD4−CD8−T細胞であることができる。T細胞はまた、Tヘルパー1(Th1)またはTヘルパー2(Th2)細胞などのTヘルパー細胞であることもできる。CD4などの少なくとも1つのマーカーにより互いに異なるT細胞は、本明細書ではT細胞の“サブセット”と称する。
本発明の方法は、核酸分子を増殖T細胞に導入する前に、増殖T細胞を少なくとも1つの刺激性作用物質と接触させることを含む。用語“刺激性作用物質”は、T細胞中へトランスフェクションした核酸分子に含まれる遺伝子の発現レベルが、核酸分子をT細胞に導入する前にT細胞を刺激性作用物質と接触させた場合に、核酸分子を導入する前に刺激性作用物質と接触させなかったT細胞におけるよりも高いように、T細胞にシグナルを提供する作用物質類を含むことを意図する。
本発明の特定の実施態様では、遺伝子を含む核酸分子をT細胞に導入する前にT細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の好ましい実施態様では、核酸分子をT細胞に導入する少なくとも2時間前にT細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明のその他の実施態様では、核酸分子をT細胞に導入する少なくとも4時間前にT細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をT細胞に導入する少なくとも6時間前にT細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をT細胞に導入する少なくとも8時間前にT細胞を刺激性作用物質と接触させる。別の実施態様では、トランスフェクションの多くとも約2時間前、トランスフェクションの多くとも約4時間前、トランスフェクションの多くとも約6時間前、トランスフェクションの多くとも約8時間前、トランスフェクションの多くとも約10時間前、トランスフェクションの多くとも約12時間前、トランスフェクションの多くとも約14時間前、トランスフェクションの多くとも約16時間前、トランスフェクションの多くとも約18時間前、トランスフェクションの多くとも約20時間前、トランスフェクションの多くとも約22時間前、トランスフェクションの多くとも約24時間前に、T細胞を刺激性作用物質と接触させる。
本発明は、遺伝子を含む核酸でT細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をT細胞中で発現させる方法に関する。“T細胞をトランスフェクションさせる”の用語は、核酸分子をT細胞に導入できるあらゆる手段を含むことを意図する。用語“トランスフェクション”は、エレクロトポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含む、核酸の哺乳動物細胞への導入に有用な様々な技術を包含する。哺乳動物細胞をトランスフェクションさせる適切な方法は、Sambrook 等(Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))およびその他の実験書に見ることができる。
本発明は、遺伝子を含む核酸分子をT細胞に導入する改良法に関する。用語“核酸分子”は、DNAおよびRNAを含むこと、および一本鎖または二本鎖であり得ることを意図する。用語“遺伝子”は、RNAに転写され得るDNAヌクレオチド配列、あるいは、少なくとも1つのタンパク質に翻訳され得るRNA分子を含むことを意図する。
本発明は、核酸分子中に含まれる遺伝子をT細胞に導入し発現させる改良法に関する。本発明の好ましい実施態様では、T細胞は、一次T細胞である。従って、本発明の方法により、従来の一次T細胞トランスフェクション法に比べて、一次T細胞に導入した遺伝子を高レベルで発現させることが可能である。遺伝子を含む核酸分子で一次T細胞をトランスフェクションさせて、その遺伝子をT細胞中で発現させる能力は、特に遺伝子治療において、多大の応用性を有する。
実施例1 − CD28 + 末梢血Tリンパ球のインビトロ長期培養
直接的トランスフェクション実験は、生体内の推定上の調節配列の機能的重要性を証明することがしばしば要求される。この種の研究は、典型的には形質転換もしくは不滅化した細胞系を使用する。しかしながら、対象とする一次細胞の調節DNA配列を検討するのが好ましい。細胞サイクル調節、特にG0−特異的遺伝子発現の予測的研究のためには、生理学的背景の維持が要求される。これらの実施例は、一次T細胞にトランスフェクションされた外来DNAの発現を促す条件の開発を行うようにデザインされている。
一次T細胞の長期クローン拡張のための反復αCD3/αCD28共刺激を確立し、このプロトコールを用いて増殖させた細胞について、ノーザン・ブロット分析により、内生ets−1 mRNAの発現を分析した。
一次T細胞における効果的な導入遺伝子の発現の要件をさらに吟味するために、広範に研究され、よく特性付けされている細胞性IL−2遺伝子のプロモーター/エンハンサーがトランスフェクションの実験に使用された。ノーザン・ブロット分析が、至適量の固定化αCD3によるTCR−CD3複合体での刺激後のIL−2遺伝子発現の速度論的検討に使用された。さらに、これらの培養物の上清でIL−2含量を分析し、細胞で細胞周期進度を分析した。
トランスジーン発現における細胞性増殖の役割に取り掛かるために、新たに単離した休止T細胞をαCD28(1μg/ml)、SEA(10ng/ml、Toxin Technologies)、PDBU(10ng/ml)/IONO(0.4μg/ml)または培地単独で10時間刺激した。これらの細胞をRSV−CATでトランスフェクションさせ、40時間後CAT活性のために回収した。活性化T細胞はマイトジェン刺激24−36時間後に細胞分裂した。従って、トランスフェクションの時、非常にまれに、もしあれば、T細胞はM期を通して進行している。トランスフェクション40時間後(刺激後約50時間)、SEAまたはPDBU/IONOで刺激したT細胞は増殖に関して(細胞性拡大、凝集)、表現型の変化は示さなかった。しかしながら、これらの集団は細胞数は増加しなかった。図11に示されるように、全てのこれらのトランスフェクション条件に関する正常化CAT活性は、相対的に低かった(0.07−0.26)。PDBU/IONOで刺激した休止細胞は、休止対照と比較して、RSV−CAT活性において、少ない3.7倍の増加を示した。PDBU/IONO刺激および休止細胞の間の低いCAT活性の増加は、単に細胞性活性の効果およびRSV LTR転写の増殖を単に反映し得、一度この受容体プラスミドが最初のシグナル伝達の結果発現可能である。注目すべきは、αCD28またはSEAで刺激された細胞のCAT活性が休止細胞と異ならなかった。αCD28またはSEA単独で、完全なマイトジェン刺激は構築されなかった。SEAによるT細胞増殖の導入に、アクセサリー細胞(主要組織適合性複合体(MHC)クラスII提示が必要)またはCD28のモノクローナル抗体の刺激により提供される第2のコスティミュラトリー・シグナルの添加が必要であった(Green, J. M., Turka, L. A., Junc, C. H., および Thompson, C.B.(1992)Cell. Immunol. 145(1):11-20)。休止T細胞は、MHCクラスII(HLA−Dr)をその表面に発現しない(Mayforth, R. D.(1991)Ph.D. Dissertation, Univ. of Chicago)。従って、増殖刺激非存在下で、休止T細胞は構成性活性受容体プラスミドRSV−CATの発現を証明しない。
上に証明するように、トランスフェクション時前のTCR−依存性シグナル伝達は、トランスジーン発現に必要である。トランスフェクション後の刺激は、殆どの場合、レポーター活性を明確に増加させない。シグナル伝達の多くの役割のいくつかが予測できる。最も単純なモデルにおいて、トランスフェクション時の増殖細胞のシグナル伝達は、トランスフェクション効果を増加でき、従って、核に到達するレポータープラスミドの量を増加できる。あるいは、シグナル伝達は、トランスフェクションDNAの非転可能コンパートメントから転写可能コンパートメント、例えば、細胞質から核への移動を促進する。両方のシナリオは、シグナル伝達に続く核へのレポータープラスミドの増加の量に関して同じ結果をもたらす。これらの可能性の試験のために、DNA侵入および局在化の動態を、トランスフェクション後の種々の時間の核および細胞質コンパートメント由来のトランスフェクトDNAの救済および定量により試験した。
上記の実施例は、TCR媒介シグナル伝達により抑制可能な細胞性機構の存在を示し、それはインビトロ外来DNAの暴露から、休止T細胞および非シグナル伝達増殖一次T細胞を防御する。レポーター遺伝子発現のためのTCR依存性シグナル伝達の必要性から、スーパー抗原がトランスジーン発現の十分な刺激物として働くかを調査した。
当業者は、慣用の実験のみを使用して、本明細書に記載の具体的態様の多くの同等物ができることを認識するか、気づく。このような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図する。
Claims (21)
- T細胞中で外来核酸分子の発現を増加させる方法であって:
(a)T細胞を少なくとも1つの刺激性作用物質とインビトロで接触させること
(ここで、該刺激性作用物質は、スーパー抗原、ホルボールエステルとカルシウムイオノホアの組み合わせ、及び抗CD3抗体と抗CD28抗体の組み合わせからなる群から選択され、該T細胞は該少なくとも1つの刺激性作用物質と接触する前に増殖している);及び、
(b)T細胞接触から約24時間以内に段階(a)からのT細胞に外来核酸分子をインビトロで導入し、
それにより、T細胞における外来核酸分子の発現を、該少なくとも1つの刺激性作用物質と接触しないT細胞における発現と比較して増加させること;
を含み、
但し、該外来性核酸分子は、ウイルスベクターを使用してT細胞に導入される、
方法。 - ウイルスベクターが、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−1からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ウイルスベクターが、組換えレトロウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 組換えレトロウイルスが複製欠損性である、請求項3に記載の方法。
- T細胞が一次T細胞である、請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
- 抗CD3抗体及び抗CD28抗体がビーズ、組織培養皿、または細胞表面に結合している、請求項1乃至5のいずれかに記載の方法。
- T細胞の刺激後約1乃至24時間の間に、該核酸分子を該T細胞に導入する、請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- T細胞の刺激の約10時間後に、該核酸分子を該T細胞に導入する、請求項7に記載の方法。
- T細胞を更にインビトロで刺激して、その数を増加させる、請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。
- T細胞が、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞、CD4−CD8−T細胞、Th1細胞、及びTh2細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- T細胞が、一次T細胞、T細胞の純粋な集団、T細胞クローン、健常個体由来のT細胞、感染性疾患に罹患した個体由来のT細胞、及び自己免疫疾患に罹患しているまたは罹患しやすい患者由来のT細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- T細胞が、哺乳動物由来である、請求項1に記載の方法。
- 外来核酸分子がDNA分子またはRNA分子である、請求項1に記載の方法。
- 外来核酸分子が、天然核酸分子または合成核酸分子である、請求項1に記載の方法。
- 外来核酸分子が、少なくとも1つのタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が、分泌可能タンパク質である、請求項15に記載の方法。
- 分泌可能タンパク質がサイトカイン、リンホカイン、または成長因子である、請求項16に記載の方法。
- 外来核酸分子が、アデノシンデアミナーゼまたはgp39をコードする、請求項1に記載の方法。
- 外来核酸分子が、1またはそれ以上の機能性RNA分子を発現する、請求項1に記載の方法。
- 機能性RNA分子が、アンチセンスRNA分子またはリボザイムである、請求項19に記載の方法。
- T細胞を少なくとも1つの刺激性作用物質と接触させる前に、T細胞の増殖を刺激する少なくとも1つの増殖作用物質とインビトロで接触させる、請求項1に記載の方法であって、該増殖作用物質が、スーパー抗原、ホルボールエステルとカルシウムイオノホアの組み合わせ、及び抗CD3抗体と抗CD28抗体の組み合わせからなる群から選択される、方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US43509595A | 1995-05-04 | 1995-05-04 | |
US08/475,136 US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 1995-06-07 | Methods for transfecting T cells |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53351096A Division JP4031033B2 (ja) | 1995-05-04 | 1996-05-02 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007125041A JP2007125041A (ja) | 2007-05-24 |
JP4189007B2 true JP4189007B2 (ja) | 2008-12-03 |
Family
ID=27030423
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53351096A Expired - Lifetime JP4031033B2 (ja) | 1995-05-04 | 1996-05-02 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
JP2005372607A Withdrawn JP2006109844A (ja) | 1995-05-04 | 2005-12-26 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
JP2007028118A Expired - Lifetime JP4189007B2 (ja) | 1995-05-04 | 2007-02-07 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53351096A Expired - Lifetime JP4031033B2 (ja) | 1995-05-04 | 1996-05-02 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
JP2005372607A Withdrawn JP2006109844A (ja) | 1995-05-04 | 2005-12-26 | T細胞の改良トランスフェクション法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060246587A1 (ja) |
EP (1) | EP0824594B1 (ja) |
JP (3) | JP4031033B2 (ja) |
AT (1) | ATE292689T1 (ja) |
CA (1) | CA2220226C (ja) |
DE (1) | DE69634563T2 (ja) |
WO (1) | WO1996034970A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9907366D0 (en) * | 1999-03-30 | 1999-05-26 | Medical Res Council | Method for expressing proteins |
WO2002014481A1 (fr) * | 2000-08-16 | 2002-02-21 | Takara Bio Inc. | Procede de culture extensive de lymphocytes t cytotoxiques specifiques de l'antigene |
US6627442B1 (en) | 2000-08-31 | 2003-09-30 | Virxsys Corporation | Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors |
EP1424387B1 (en) | 2001-08-15 | 2009-04-22 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic t lymphocytes |
KR100786054B1 (ko) | 2002-03-25 | 2007-12-17 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 세포상해성 림프구의 제조방법 |
EP1666589B1 (en) | 2003-08-22 | 2010-02-17 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
CA2539716A1 (en) * | 2003-09-22 | 2005-04-07 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods to accelerate hematologic recovery |
WO2006101205A1 (ja) * | 2005-03-25 | 2006-09-28 | Kaneka Corporation | T細胞の活性化方法及び活性化t細胞製造用キット |
JP4929174B2 (ja) | 2005-08-17 | 2012-05-09 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
US20100068192A1 (en) * | 2005-09-30 | 2010-03-18 | Takara Bio Inc. | Method for Production of T Cell Population |
JP6754761B2 (ja) * | 2014-07-11 | 2020-09-16 | セルジーン コーポレイション | Tリンパ球へのベクター導入効率の改善方法 |
US11608511B2 (en) * | 2015-04-13 | 2023-03-21 | Maxcyte, Inc. | Methods for modifying genomic DNA |
US10294454B2 (en) | 2016-08-24 | 2019-05-21 | General Electric Company | Methods and kits for cell activation |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988000970A2 (en) * | 1986-08-08 | 1988-02-11 | Regents Of The University Of Minnesota | Method of culturing leukocytes |
CA2003455C (en) * | 1988-11-23 | 2000-02-22 | Craig B. Thompson | Immunotherapy involving cd28 stimulation |
US5858358A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US5399346A (en) * | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5272082A (en) * | 1992-03-30 | 1993-12-21 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Cytotoxic T-ALL cell lines and uses therefor |
WO1994012196A1 (en) * | 1992-11-25 | 1994-06-09 | Tanox Biosystems, Inc. | Conjugates and constructs including anti-cd28 and anti-cd3 binding molecules |
CA2161095A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-27 | Solis Therapeutics, Inc. | Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents |
ES2240962T3 (es) * | 1993-06-04 | 2005-10-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Metodo para estimular selectivamente la proliferacion de celulas t. |
FR2707091B1 (fr) * | 1993-06-30 | 1997-04-04 | Cohen Haguenauer Odile | Vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression de gènes dans des cellules eucaryotes. |
JPH09500788A (ja) * | 1993-07-26 | 1997-01-28 | ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティテュート・インコーポレイテッド | B7−2:ctla4/cd28カウンターレセプター |
US5733543A (en) * | 1994-04-29 | 1998-03-31 | Nabel; Gary J. | Introduction of HIV-protective genes into cells by particle-mediated gene transfer |
EP0764203A1 (en) * | 1994-06-03 | 1997-03-26 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE NAVY | Methods for selectively stimulating proliferation of t cells |
CA2191733A1 (en) * | 1994-06-07 | 1995-12-21 | Daniel A. Vallera | Methods for inhibiting antigen specific t cell responses |
US6576236B1 (en) * | 1994-07-01 | 2003-06-10 | Dana Farber Cancer Institute | Methods for stimulating T cell responses by manipulating a common cytokine receptor γ chain |
US5833979A (en) * | 1994-07-20 | 1998-11-10 | Cytotherapeutics, Inc. | Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs |
US5827642A (en) * | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
EP0782627A1 (de) * | 1994-08-31 | 1997-07-09 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. | Genetisch veränderte t-zellen |
US6692964B1 (en) * | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
US7067318B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
-
1996
- 1996-05-02 AT AT96913327T patent/ATE292689T1/de active
- 1996-05-02 CA CA002220226A patent/CA2220226C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 DE DE69634563T patent/DE69634563T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 EP EP96913327A patent/EP0824594B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 JP JP53351096A patent/JP4031033B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 WO PCT/US1996/006200 patent/WO1996034970A1/en active IP Right Grant
-
2005
- 2005-12-26 JP JP2005372607A patent/JP2006109844A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-06-28 US US11/476,288 patent/US20060246587A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-02-07 JP JP2007028118A patent/JP4189007B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2220226A1 (en) | 1996-11-07 |
JP4031033B2 (ja) | 2008-01-09 |
DE69634563D1 (de) | 2005-05-12 |
US20060246587A1 (en) | 2006-11-02 |
EP0824594A1 (en) | 1998-02-25 |
EP0824594B1 (en) | 2005-04-06 |
WO1996034970A1 (en) | 1996-11-07 |
ATE292689T1 (de) | 2005-04-15 |
JP2006109844A (ja) | 2006-04-27 |
CA2220226C (en) | 2008-10-21 |
JP2007125041A (ja) | 2007-05-24 |
DE69634563T2 (de) | 2006-02-16 |
JPH11505419A (ja) | 1999-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4189007B2 (ja) | T細胞の改良トランスフェクション法 | |
US6692964B1 (en) | Methods for transfecting T cells | |
US7172869B2 (en) | Methods for transfecting T cells | |
Berger et al. | Analysis of transgene-specific immune responses that limit the in vivo persistence of adoptively transferred HSV-TK–modified donor T cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation | |
EP3360961B1 (en) | Method for preparing genetically-modified t cells which express chimeric antigen receptor | |
Berger et al. | Pharmacologically regulated Fas-mediated death of adoptively transferred T cells in a nonhuman primate model | |
WO2020108644A1 (en) | Cd19-and cd22-based combined car-t immunotherapy | |
EP0463080A1 (en) | Cd8-based pharmaceuticals | |
Berger et al. | CD28 costimulation and immunoaffinity-based selection efficiently generate primary gene-modified T cells for adoptive immunotherapy | |
JP2008101003A (ja) | bcl−XLタンパク質レベルを調節することによる、T細胞生存の調節法 | |
US5688690A (en) | Human cytotoxic lymphocyte signal transduction surface protein (P38) and monoclonal antibodies thereto | |
JPH11503024A (ja) | 細胞表面のクラスi mhcタンパク質の低レベルを有する遺伝子学的に修飾された細胞の移植 | |
WO2021046205A1 (en) | Adoptive cell therapy and methods of dosing thereof | |
EP1384781B1 (en) | Methods for inhibiting T-cell survival, by inhibiting BCL-XL protein level | |
Gardner et al. | Robust, but transient expression of adeno-associated virus-transduced genes during human T lymphopoiesis | |
AU762356B2 (en) | Improved methods for transfecting T cells | |
Pullen et al. | Bone marrow-derived macrophage expression of endogenous and transfected class II MHC genes during differentiation in vitro. | |
Strair et al. | Retroviral mediated transfer and expression of exogenous genes in primary lymphoid cells: assaying for a viral transactivator activity in normal and malignant cells | |
Rosenzweig et al. | In vitro T lymphopoiesis: a model system for stem cell gene therapy for AIDS | |
Li | Mechanisms of Glucocorticoids in the modulation of Graft-versus-Host Disease and the Graft-versus-Leukemia Reaction | |
US6268214B1 (en) | Vectors encoding a modified low affinity nerve growth factor receptor | |
EP1009442B1 (en) | Improvements in or relating to regulation of t cell activation | |
CN117778328A (zh) | 一种通用型bcma car-t细胞的增殖方法 | |
AU627710B2 (en) | Rapid immunoselection cloning method | |
WO2023102712A1 (zh) | 一种基因生物制剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071009 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20080422 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080722 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080812 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080911 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110919 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110919 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120919 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130919 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |