WO2006101205A1 - Ｔ細胞の活性化方法及び活性化ｔ細胞製造用キット - Google Patents

Ｔ細胞の活性化方法及び活性化ｔ細胞製造用キット Download PDF

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WO2006101205A1
WO2006101205A1 PCT/JP2006/306011 JP2006306011W WO2006101205A1 WO 2006101205 A1 WO2006101205 A1 WO 2006101205A1 JP 2006306011 W JP2006306011 W JP 2006306011W WO 2006101205 A1 WO2006101205 A1 WO 2006101205A1
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cells
antibody
carrier
activated
cell
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PCT/JP2006/306011
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Inventor
Jun Tomono
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Kaneka Corporation
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
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    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Definitions

  • the present invention relates to a method for activating ⁇ cells, a method for producing activated ⁇ cells, a method for producing an immunotherapeutic agent, and a kit for producing activated T cells.
  • Therapies for cancer can be broadly divided into “surgical therapy”, “chemotherapy”, and “radiotherapy”, and each therapy is performed alone or in combination.
  • a method called “therapy” has attracted attention as the fourth therapy for cancer.
  • Humans originally have the power to cure themselves against illnesses and injuries (immunity ability 'immunity'), and T cells in the blood play a role as the center of their immune ability. It is said that the higher the attack power of a cell disease, the less likely it is to become ill or the stronger it is against the disease.
  • “Immunotherapy” focuses on the human immune system, and treats cancer by enhancing the ability of T cells to kill cancer cells (enhancing immunity).
  • Immunotherapy has been developed that recognizes and destroys antigens such as tumor cells by enhancing the function of the mechanism.
  • lymphocytes collected and isolated from a patient are cultured in the presence of interleukin (IL) -2 or IL-4 to induce lymphokine-active killer (LAK) cells.
  • IL interleukin
  • LAK lymphokine-active killer
  • LAK cells exhibit non-specific cytotoxic activity against antigens such as tumor cells, it is currently difficult to expect a therapeutic effect. In view of this, attention is being paid to a technique for performing the same treatment as LAK therapy using antigen-specific activated T cells that are not antigen-specific killer cells.
  • activated T cells are induced by culturing using a T cell culture carrier in which an anti-CD3 antibody is immobilized on the surface of a culture substrate such as a flask or a petri dish or an insoluble carrier. It has been proposed (see Patent Document 1).
  • This T cell culture carrier is cultivated by each experimenter. Prior to cultivation, an anti-CD3 antibody is added to the carrier to prepare and use a T cell culture carrier immobilized with the anti-CD3 antibody, or the prepared T cell culture carrier is used as an insoluble carrier. The current situation is that they are stored in a solution with anti-CD3 antibody added and kept at low temperature.
  • the T cells activated by the above operation are amplified in a culture medium containing lymphokine such as IL-2 in a cell culture bag.
  • the preparation of the above T cell culture device requires proficiency and many complicated operations.
  • a culture substrate such as a flask or petri dish
  • there is a risk of contamination such as bacteria when added to the cell culture bag for amplification.
  • the T cell culture carrier prepared with the anti-CD3 antibody solution added is used as it is for culturing, the presence of free, non-fixed anti-CD3 antibody suppresses the proliferation of T cells. Is done. Therefore, it is necessary to remove the non-immobilized free anti-CD3 antibody solution at the time of use and culture, and further wash with a suitable washing solution such as phosphate buffered saline (PBS). Become.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 3-80076
  • the present invention is capable of activating T cells so as to be effective for immunotherapy efficiently in a short time, and is capable of contaminating bacteria and the like with a simple operation.
  • T cell activation method and activated T cell production method capable of reducing the risk caused by
  • An object of the present invention is to provide a kit for producing activated T cells.
  • the present invention relates to the following (1) to (9).
  • a method for activating T cells which comprises bringing a solution containing sputum cells into contact with a carrier on which an anti-CD3 antibody or a fragment thereof is immobilized.
  • a method for producing active ⁇ cells comprising cultivating activated ⁇ cells by culturing T cells in a medium containing lymphokine.
  • lymphokine is at least one selected from the group consisting of IL-2, IL-12 and IFN-y force.
  • the cost of the costimulatory signal donor is at least one selected from the group consisting of anti-CD48 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD26 antibody, anti-CD28 antibody and fragments thereof (5) ) Manufacturing method described.
  • a method for producing an immunotherapeutic agent comprising activated T cells as an active ingredient comprising producing activated T cells by the production method according to any one of (2) to (6) above .
  • a kit comprising a carrier for immobilizing an anti-CD3 antibody or a fragment thereof and a column for packing the carrier.
  • an anti-CD3 antibody or an anti-CD3 antibody is used to activate the cells by moving and contacting the solution containing the cells.
  • a carrier on which the fragment is immobilized is used.
  • the anti-CD3 antibody can be immobilized and is suitable for contact with a moving liquid (solution containing sputum cells). If there is, it will not be specifically limited.
  • a moving liquid solution containing sputum cells.
  • inorganic substances for example, glass, silica, metal oxides, etc.
  • synthetic polymers for example, polyolefins such as polyethylene and polypropylene, synthetic polymer plastics such as polystyrene and polysylbenzene, polybules, poly Acrylamide, etc.
  • agarose cross-linked dextran
  • cellulose hydrophilic bull polymer, etc.
  • the surface of these carriers may be porous or rough and smooth.
  • the form of the carrier is not particularly limited, but a form that can be packed in a column or a bag as described below is preferable.
  • a form that can be packed in a column or a bag as described below is preferable.
  • the anti-CD3 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody against CD3.
  • Antibodies manufactured by Osofa Mathical
  • Osofa Mathical can also be used.
  • the anti-CD3 antibody fragment used in the present invention is not particularly limited as long as it is a fragment capable of binding to CD3.
  • Only one kind of the above-mentioned anti-CD3 antibody fragment may be immobilized on a carrier, or multiple kinds of fragments may be immobilized on a carrier, or they can be used in combination with an anti-CD3 antibody.
  • a costimulatory signal donor is preferably immobilized on a carrier.
  • the establishment of an immune response by activation of antigen-specific T cells involves costimulatory signals provided by antigen-presenting cells, not just antigen-specific signals via TCR (T cell receptor). This is because it can exist.
  • the costimulatory signal donor is not particularly limited as long as it transmits a costimulatory signal via a T cell membrane surface protein, membrane surface carbohydrate, membrane lipid or the like.
  • Examples include the B7 molecule family, anti-CD48 antibody, anti-CTLA (cytolytic T lymphocyte associated antigen) 4 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD26 antibody, anti-CD28 antibody and other anti-CD antibodies, and fragments of these antibodies. .
  • the B7 molecule family is not particularly limited, but B7.1, B7.2, MB7.2, etc. are exemplified. These may be derived from cells or prepared by genetic engineering techniques.
  • the antibody fragment is not particularly limited as long as it is a fragment capable of binding to the antigen, and examples thereof include Fab fragments and F (ab ′) fragments.
  • Only one type of the above-mentioned costimulatory signal donor may be fixed to the carrier, or a plurality of types may be fixed to the carrier.
  • an antibody against a sugar chain-binding lectin in addition to the anti-CD3 antibody, an antibody against a sugar chain-binding lectin can be immobilized on a carrier.
  • the anti-sugar chain-binding lectin antibody is not particularly limited, and examples thereof include L-selectin antibody which is a sialyl Lewis sugar chain-binding lectin. Only one kind of the anti-sugar chain-binding lectin antibody may be immobilized on a carrier, or a plurality of kinds may be immobilized on a carrier.
  • the anti-sugar chain-binding lectin antibody can be immobilized on a carrier together with the anti-CD3 antibody and the costimulatory signal donor.
  • Binding of the carrier to an anti-CD3 antibody or the like includes covalent bond, ionic bond, physical bond, Alternatively, it can be performed by biochemical specific binding or the like.
  • the covalent bond include methods such as cyanogen bromide activation method, epoxidation method, acid azide derivative method, condensation reagent method, diazo method, alkylation method, and carrier crosslinking method. Among them, cyanogen bromide activated It is preferable to bind an anti-CD3 antibody or the like to a carrier or an epoxidized carrier by a covalent bond.
  • ligands e.g. protein A, protein G, antibody binding molecules such as antigens, derivatives thereof, partial peptide fragments, etc.
  • an anti-CD3 antibody or the like that has been pre-coated before immobilization can also be used.
  • partial peptide fragments include protein G partial peptide fragments (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-88381).
  • the method for immobilizing an anti-CD3 antibody or the like on a carrier is not particularly limited. Examples of known methods include the following methods. Adjust the solution of the anti-CD3 antibody or the like so that the protein concentration is 0.001 to 0.05 as the absorbance at a wavelength of 280 nm. P H of the solution 5: about LO, salt concentration 0. 01: approximately L OM is exemplified.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt and potassium salt. Then mix or contact an appropriate amount of the solution with a water-insoluble carrier and leave at 0 to 37 ° C for about 1 to 24 hours. After the treatment, remove the solution and wash with an appropriate amount of washing solution.
  • the cleaning liquid examples include distilled water, physiological saline, and albumin and nonionic surfactants such as 0.01-0.lwZv% [for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, trade name Tween] or the like can be used. It is also possible to use a cell culture medium for washing.
  • examples of the carrier on which the anti-CD3 antibody or the like is immobilized include those in which the anti-CD3 antibody or the like is immobilized on the surface of the carrier.
  • an anti-CD3 antibody or the like may be immobilized on the surface of the carrier via a ligand for specifically adsorbing the antibody.
  • these carriers may be used as they are, or those obtained by crosslinking or wrapping between the carriers may be used.
  • the immobilization amount of the anti-CD3 antibody and the like is as follows in terms of density.
  • Anti-CD3 antibody, its fragments, anti-CD antibodies, such as anti-CD28 antibody, in the case of anti-CTLA- 4 antibodies 0. 001 ⁇ 1000 ⁇ g / cm 2 , preferably about 0. 001 ⁇ 10 ⁇ g / cm 2 .
  • Each of the above numbers means the amount per unit area of the carrier.
  • the activity in the present invention is carried out by bringing a solution containing T cells into contact with a carrier on which an anti-CD3 antibody or the like is immobilized.
  • a carrier on which an anti-CD3 antibody or the like is immobilized.
  • the chance of contact with the anti-CD3 antibody and the above-mentioned costimulatory signal donor is increased, so that the efficiency can be improved in a short time (for example, within 24 hours). It is estimated that T cells can be activated so as to be effective for immunotherapy.
  • the carrier on which the anti-CD3 antibody or the like is immobilized is preferably maintained in a state where the solution containing T cells can be brought into contact with the solution while being moved.
  • a carrier packed in a column or bag is preferred. That's right.
  • the activity of the present invention can be carried out very easily by passing a solution containing T cells through the column.
  • the solution containing T cells can be moved (shaking, stirring, tilting, etc.) in the bag.
  • the T cells used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include peripheral blood lymphocyte cells (PBL), tumor wet lymphocytes, lymph node cells, and cancer-bearing (or tumor) local lymph node cells. Can be mentioned.
  • PBL peripheral blood lymphocyte cells
  • tumor wet lymphocytes tumor wet lymphocytes
  • lymph node cells lymph node cells
  • cancer-bearing (or tumor) local lymph node cells can be mentioned.
  • the activated T cells obtained by the present invention are administered to a patient, it is desirable to use the T cells from which the patient force is also collected.
  • the amount of blood collected to obtain T cells and the number of T cells obtained are not particularly limited.
  • the amount of blood collected is preferably 1 to 50 ml from the viewpoint of burden on patients and separation of T cells.
  • the tumor-specific antitumor effect can be obtained by using local lymph node cells of the target tumor. Can be expected.
  • the T cell-containing solution used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a culture solution containing T cells, a suspension of T cells in a solution (for example, a buffer solution), and the like. It is done.
  • the basic medium used in the culture medium containing T cells is not particularly limited as long as T cells can be cultured, but the minimum basic medium (MEM), KBM400, RPMI1640, Nome F12, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Iskov modified Eagle medium (IMDM), etc. Is mentioned. Even the most powerful is KBM400 and RPMI 1640.
  • the basal medium preferably contains lymphokine.
  • Lymphokines include macrophage migration inhibitory factor (MIF), macrophage chemotactic factor (MCF), skin reaction factor (SRF), macrophage activation factor (MAF), leukocyte migration inhibitory factor (LIF), neutrophils Chemotactic factor (NCF), eosinophil chemotactic factor (ECF), basophil chemotactic factor (BCF), eosinophil stimulation promoting factor (ESP), lymphotoxin (LT), increased vascular permeability Factor (VPF), blastogenic factor (BF or MF), osteoclast activation factor (OAF or IL 1 j8), effector lymphokine such as ⁇ —interferon (IFN— ⁇ ), and colony stimulating factor ( CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-2 receptor monoregulator (ATF) and other immunoregulatory lymphokines .
  • MIF macrophag
  • IL 2 and IL-12 are preferred.
  • IL-2 and IL-12 may be isolated from peripheral blood or prepared by genetic recombination.
  • IFN- ⁇ those prepared by means such as cell culture and gene recombination can be used. What is mentioned later about addition amount can be applied. Only one type of lymphokine may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the basic medium may contain a drug for preventing contamination of germs.
  • a drug for preventing contamination of germs examples include, but are not limited to, penicillin, streptomycin, gentamicin, ampicillin, kanamycin, chloramphenicolole, streptomycin, and the like.
  • a component for further improving the ability to proliferate sputum cells can also be added.
  • a component for further improving the ability to proliferate sputum cells can also be added.
  • insulin, transferrin, fetuin, catalase, ⁇ phosphorylethanolamine, ethanolamine, sodium selenite, 2-mercaptoethanol, corticosterone etc. are mentioned.
  • any of those derived from humans, pigs, hidges, bushes, horses, etc., or recombinants can be used, and the amount of the supplement is 1 to: LOO / z In particular, 10 / z gZml is preferred.
  • the amount of the supplement is preferably 1 to: LOO / z gZml, especially about 10 gZml.
  • the amount of the added salt is preferably 1 to: LOO / zg Zml, particularly about 10 ⁇ g Zml.
  • catalase derived from ushi, nu, mouse, filamentous fungus, etc. can be used, and the amount of added calories is 2-50 ⁇ g / ml, especially about 30 ⁇ g / ml. / ⁇ .
  • the amount of O-phosphorylethanolamine or ethanolamine added is preferably 2 to 200 ⁇ g / m 1, particularly about gZml.
  • 10 _ 1G ⁇ 10 _7 M, in particular 10 _8 M is preferably about.
  • the amount of 2-mercaptoethanol added is preferably 10 9 to 10 _4 M, particularly about 5 X 10 _5 M.
  • 10 _ 9 ⁇ 10 _6 M, in particular 10 _6 M is preferably about.
  • the number of T cells contained in the solution is not particularly limited, but is preferably about 10 3 to 10 7 cells / ml, for example.
  • the time required for the contact between the solution containing T cells and the carrier is not particularly limited as long as it is longer than 0 hours.
  • the contact time may be less than 24 hours, and even if it is less than 7 hours, the activity is sufficiently active. Can be ashamed.
  • the method of the present invention is not limited to contact for a short time, and for example, the contact can be extended for about 10 days.
  • the total amount of the solution is reduced within, for example, 1 hour, preferably within 30 minutes.
  • Contact may be made so as to pass through the column. In this case, let it pass only once, or (one pass) and repeat it several times.
  • the temperature at the time of contact is not particularly limited, and may be any temperature suitable for the activity of T cells. Usually, it is about 30 to 40 ° C, preferably about 36 to 38 ° C.
  • the activation is preferably performed in an atmosphere containing 1 to 10% by volume of carbon dioxide.
  • the amount of the carrier used for T cell activation of the present invention can be appropriately selected depending on the scale and the number of cells.
  • the carrier may be used at a rate of about 1 to 10 7 cm 3 per 1 ml of the solution containing T cells.
  • activated sputum cells obtained by the above method can be proliferated by culturing in a medium containing lymphokine.
  • the culture time is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the required amount of activated sputum cells, for example, about 1 to 50 days.
  • the temperature at the time of growth culture is not particularly limited, and is usually about 30 to 40 ° C, preferably about 36 to 38 ° C, as long as the temperature is suitable for culturing sputum cells.
  • the culture is preferably performed in an atmosphere containing 1 to 10% by volume of carbon dioxide.
  • the medium used for the growth culture the basic medium described above can be used.
  • the medium used for growth culture contains lymphokine in order to induce LAK cells.
  • lymphokines those isolated from peripheral blood or those prepared by gene recombination can be used, and specific examples include those mentioned above.
  • the amount of lymphokine is 10 to: LOOOJRUZml, preferably 10 to: LOOJRUZml.
  • LOOOJRUZml preferably 10 to: LOOJRUZml.
  • LOOUZml preferably 0.1 to: LOOUZml
  • IFN- ⁇ 0.1 to: LOOOIUZml, preferably 10 to 1 OOOIUZml.
  • the medium used for the growth culture may contain a drug for preventing contamination of germs and a component for improving the T cell proliferation ability.
  • the active cocoon step and the growth culture step can be carried out as a series of closed system processes, which can further reduce the risk of contamination such as germs. .
  • the activated T cells obtained by the present invention are advantageous for immunotherapy, and are used to protect against infection, anti-allergy and anti-allergy against mammals such as humans, mice, horses, dogs, mice and rats. Since it has effects such as AIDS and cancer metastasis suppression, it can be used as an immunotherapeutic agent.
  • the above-mentioned immunotherapeutic agent is preferably used for a disease progression or a disease state that is preferably formulated into a liquid preparation for parenteral administration (eg, subcutaneous, intramuscular, intravenous injection) by a conventional method. It contains an amount of activated T cells effective to produce a therapeutic effect.
  • the above-mentioned immunotherapeutic agent may contain a drug useful for immunotherapy. Although it does not specifically limit as a chemical
  • immunotherapeutic agent is useful as an anti-infective agent, anti-allergic agent, anti-AIDS agent, cancer metastasis inhibitor or cancer therapy adjuvant.
  • the kit for producing activated T cells of the present invention is a kit for carrying out the activation and amplification culture described above, a carrier for immobilizing the anti-CD3 antibody and the like, and for filling it. This includes the column. In the kit of the present invention, the carrier may be packed in the column.
  • the kit for producing activated T cells of the present invention further comprises an anti-CD3 antibody, lymphokine, basic medium, and a container for culturing activated T cells (for example, a cell culture bag having gas permeability). ), A device (for example, a tube) for connecting the column and the container may be included. By connecting the column and the vessel for growth culture, activation and growth culture can be carried out as a series of closed system processes.
  • an anti-CD3 antibody When attaching an anti-CD3 antibody to the kit for producing activated T cells of the present invention, it is preferable to attach the anti-CD3 antibody in a state where it can be stably stored.
  • the kit for producing activated T cells of the present invention produces activated T cells by immobilizing the anti-CD3 antibody attached to the kit or the separately obtained anti-CD3 antibody on the carrier. Can be used to do.
  • the present invention can activate T cells so as to be effective for efficient immunotherapy in a short time (eg, within 24 hours). According to the present invention, it is possible to reduce the risk of contamination such as bacteria by a simple operation.
  • T cells can be differentiated and induced into activated T cells such as CD4 + and CD8 + (activated) T cells better than conventional methods. Also, compared to the conventional method, it is activated and is obsolete (that is, it is not necessary for practical use for immunotherapy! / ⁇ ) CD4-CD8-T cells Can be kept low.
  • the T-cell activation method, activated T-cell production method and activated T-cell production kit of the present invention are used for examining pathologies such as autoimmune diseases, bacterial infections, allergies, AIDS, and cancer progression. It is extremely useful for diagnosis. For example, after activating and amplifying T cells collected from patients with various medical conditions according to this method, the amplification rate or the expression ratio of CD4, CD8, etc. on the surface of the amplified T cells is compared. It is also possible to estimate the degree of progression of the disease state.
  • Example 1 Activation and amplification of human-derived T cells with an anti-CD3 antibody-immobilized carrier
  • a cyanogen bromide activated agarose carrier (CNBr activated Sepharo se6MB (trade name), manufactured by Amersham Biosciences) was used.
  • the lg carrier was weighed, suspended in 3.5 ml ImM hydrochloric acid, and washed with about 200 ml ImM hydrochloric acid on a glass filter. 5 ml of coupling buffer (0.1 M NaHCO, 0.5 M NaCl, pH 8.3
  • the carrier is recovered with a glass filter, washed with about 100 ml of buffer A (0.1 M carbonate buffer, PH4 containing 0.5 M NaCl), and then about 100 ml of buffer B (0.5 M Washed with 0.1 M Tris buffer containing NaCl, pH 8). Thereafter, this AB washing operation was repeated two more times. After that, about 100 ml PBS buffer solution (NaH PO ⁇ 0.175 g, Na HP
  • This suspension was added to a column prepared by cutting a cell culture bag (NIPRO culture bag 1000N, manufactured by Nipro) to complete a T cell activity column.
  • This column consists of a small bag of 3cmX16cm connected to the top and bottom by a three-way stopcock and a carrier attached to the upper small bag (Fig. 1).
  • an anti-CD3 antibody immobilized on a flask was prepared.
  • Anti-CD3 antibody (OKT-3, manufactured by Ortho Pharmaceutical Corporation) is diluted with phosphate buffered saline solution (PBS) to a concentration of 5 ⁇ gZml, and then added to a flask (manufactured by Asahi Techno Glass) with a surface area of 25 cm 2. Injected. This solution was spread evenly on the bottom of the flask and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the OKT-3 diluted solution was removed by aspiration, washed 3 times with PBS, and air-dried at room temperature in a clean bench to prepare a control flask for T cell activity.
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • T cell activity column 5 ml of this T cell suspension (about 1 X 10 6 cells) is added to the T cell activity column and the T cell activity control flask prepared in (1) to add T cell activity. I started. For the T cell activity column, pass the culture medium every hour from the upper small bag to which the carrier has been added to the lower small bag (so that the entire amount passes in about 10 minutes) The operation of returning to the upper small bag again was repeated. The control flask was subjected to activity while still standing.
  • the number of T-cell amplified cells that is, the efficiency of activating T-cell proliferation (activation efficiency) is higher than that of the conventional flask. It can be seen that, when using, it is clearly good and shows sufficient amplification even when the activity time is not long and the force is 7 hours.
  • Example 2 Activation and amplification of three human-derived T cells using an anti-CD3 antibody-immobilized carrier
  • the three human-derived T cells (three specimens were designated as sample A, sample B, and sample C, respectively) ) was prepared in the same manner as in Example 1 (2), and these were prepared using the T cell activity column and the T cell activity column control flask prepared in the same manner as in Example 1 (1). I was ashamed.
  • Example 1 In the same manner as in Example 1 (2), after 7 hours or 2 hours of activity treatment, 1 ml of the culture solution was collected, and T cells were amplified in the same manner.
  • Fig. 3-1 shows the case where the activation time is 7 hours, as shown in Fig. 3-2.
  • An anti-CD3 antibody was immobilized on an agarose carrier activated with cyanogen bromide according to Example 1 (1) (CNBr activated Sepharose 6MB (trade name), manufactured by Amersham Biosciences).
  • CNBr activated Sepharose 6MB (trade name), manufactured by Amersham Biosciences).
  • the amount of antibody used was lmg ⁇ 500 g ⁇ 100 g ⁇ 5 g. Let these be CNBrlOOO, CNBr500, CNBrlOO, and CNBr5, respectively.
  • Fig. 4 shows the growth curve when human-derived T cells were treated for 2 hours and cultured for 2 weeks in the same manner as in Example 1 (2).
  • a cellulose carrier (prepared by the method described in Japanese Patent No. 1905101, average particle size 450 m) was thoroughly washed with water, suspended in water, and the sedimentation volume after 2 hours was measured.
  • Cellulose carrier: Water: 2N NaOH: Epoxychlorohydrin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1: 1: 0. 53: 0.18 (volume ratio) is removed and the carrier and water are put into a reaction vessel (Made of polyethylene) and shaken at 40 ° C for about 15 minutes. To this, 2N NaOH was stirred for 30 minutes, then epichlorohydrin was added and shaken. After the reaction for 2 hours, the filtrate was sufficiently washed until the filtrate became neutral to produce an epoxy carrier.
  • Example 4 The carrier prepared in (1) was collected on a glass filter, washed with about 300 ml of sterilized water, and further with about 300 ml of carbonate buffer (0.05 M NaHCO 3, 0.1 M NaOH, pHIO).
  • the carrier is suspended in about 7 ml of carbonate buffer, 5 ml of which is placed in a 15 ml tube (Asahi Techno Glass), and 5 ⁇ g of anti-CD3 antibody (OKT-3, orthosoft). (Manufactured by Pharmaceutical Corporation) and mixed at 37 ° C for 17 hours while rotating (lOrpm). Then, let stand, discard the supernatant, and add 10 ml of glycine buffer (0.05M NaHCO3, 0.1M NaOH, 0.2M glycine, pHIO), and keep at 37 ° C for 4 hours.
  • carbonate buffer 5 ml of which is placed in a 15 ml tube (Asahi Techno Glass), and 5 ⁇ g of anti-CD3 antibody (OKT-3, orthosoft). (Manufactured by Pharmaceutical Corporation) and mixed at 37 ° C for 17 hours while rotating (lOrpm). Then, let stand, discard the supernatant, and add 10 ml of glycine buffer (0.05M NaHCO3,
  • Example 1 (2) Using the T cell activity column (epoxy) prepared in Example 4 (2) and the T cell activity column (CNBr5) prepared in Example 3, Example 1 (2) and In the same manner, the culture solution containing human-derived T cells was passed through the small bag in the upper column once in a small bag for about 20 minutes to carry out the activation (one-pass stimulation). Thereafter, the result of amplification for 2 weeks in the same manner as in Example 1 (2) is shown in FIG.
  • T cell 2X10 5 pieces of amplified were harvested by centrifugation (430xG, 5 min) and 200 1 ⁇ Ka ⁇ chilled PBS buffer solution.
  • 101 antibody reagents Tritest CD4ZCD8 ZCD3, Nippon Betaton Dickinson
  • 500 1 of 13 ⁇ 43 buffer was added, and the mixture was gently stirred and centrifuged (430Xg, 5 minutes) to recover the cells.
  • the supernatant was removed, 1 ml of PBS buffer was added thereto, and the mixture was stirred.
  • the cells were collected by centrifugation (430 Xg, 5 minutes), and the cells were suspended in 5001 PBS buffer.
  • FACS analysis BD FACSCanto, Nippon Betaton Dickinson
  • Example 6 Activation and amplification of human-derived T cells using a carrier to which a protein A ligand has been added and an anti-CD3 antibody immobilized thereon
  • Example 4 The carrier prepared in (1) is collected on a glass filter, washed with about 300 ml of sterilized water, and further with about 300 ml of carbonate buffer (0.05 M NaHCO, 0.1 M NaOH, pHlO).
  • the recovered carrier was added to 5 ml of glycine buffer (0.05 M NaHCO, 0.1 M NaOH, 0.2
  • Example 6 Protein A carrier prepared in (1) was supplemented with 10 ⁇ g of anti-CD3 antibody (OKT-3, manufactured by Ortho Pharmaceutical Corporation), and 15 ml tube at room temperature for 2 hours. The mixture was mixed while rotating (10 rpm) in (Asahi Techno Glass). Thereafter, only the carrier was recovered on a glass filter and washed twice with about 100 ml of PBS buffer. Thereafter, the carrier was washed twice with a medium (KBM400, manufactured by Eugene Bio) containing about 5 ml of IL-2. After that, the carrier was finally suspended in 5 ml of the same medium (the medium contained here was discarded when the cells were added). This was designated as protein A-anti-CD3 antibody carrier (1).
  • KBM400 manufactured by Eugene Bio
  • Protein A-immobilized agarose carrier (Protein A Sepharose 6MB (trade name), manufactured by Amersham's Pharmacia) with an anti-CD3 antibody immobilized thereon was prepared, and this was prepared as protein A-anti-CD3.
  • Antibody carrier (2) was used.
  • Each of these was added to a column prepared by cutting a cell culture bag (NIPRO culture bag 1000N, manufactured by Nipro) to complete a T cell activity column.
  • This column consists of a small bag of 3cmX16cm connected to the top and bottom by three-way stopcocks, with a carrier attached to the upper small bag.
  • an anti-CD3 antibody immobilized on a flask was prepared.
  • Anti-CD3 antibody (OKT-3, manufactured by Ortho Pharmaceutical Corporation) is diluted with phosphate buffered saline solution (PBS) to a concentration of 5 ⁇ gZml, and 1 ml is added to a 25 cm 2 surface area flask (Asahi Techno Glass). Injected. This solution was spread evenly on the bottom of the flask and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the OKT-3 diluted solution was removed by suction, washed 3 times with PBS, and air-dried at room temperature in a clean bench to prepare a control flask.
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • Example A and sample B human origin Activity of 2 specimens of T cells (sample A and sample B) was performed.
  • the column containing protein A-anti-CD3 antibody carrier (1) or the column containing protein A-anti-CD3 antibody carrier (2) all the culture solution passes from the upper small bag to the lower small bag. The activation was performed with a one-pass stimulation (the total amount was passed in about 20 minutes). The control flask was activated for 3 days.
  • Fig. 6 shows a growth curve when cultured until 14 days after the activation treatment. From this figure, it can be seen that the activity by one-pass stimulation using protein A—anti-CD3 antibody carrier is the same as the conventional method in terms of the number of T cell amplification cells, ie, the efficiency of proliferating activated T cells (activity efficiency). It can be seen that the results are similar to or better than those for the 3-day activity using the flask method.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the T cell activity column used in the examples.
  • FIG. 2-1 Cell number growth curve after 7 hours of T cell activity treatment in column 1 or control flask in Example 1
  • FIG. 2-2 Cell number growth curve after 1 day of T cell activity treatment in column 1 or control flask in Example 1
  • FIG. 2-3 Cell number growth curve after T cell activation treatment in Example 1 for 7 hours in a column or 3 days in a control flask
  • FIG. 3-1 Cell number growth curve after 2 hours of activity treatment of 3 specimens of T cells (sample A, sample B and sample C) in Example 2 in a column or control flask
  • FIG. 3-2 Cell number growth curve after activity of 7 T cell specimens (sample A, sample B, and sample C) in Example 2 for 7 hours in a column or control flask
  • FIG. 4 Cells after 2 hours of activation treatment using columns (CNBrlOOO, CNBr500, CNBrlOO and CNBr5) prepared in Example 3 with the amount of antibody used at the time of fixation being lmg, 500 / zg, 100 / zg Number growth curve
  • FIG. 5 Cell number growth curve after treatment with an active syrup by one-pass stimulation using column (epoxy) or column (CNBr5) in Example 4.
  • Example 6 the activity of 2 T cell specimens (sample A and sample B) was treated with a column containing protein A—anti-CD3 antibody carrier (1) (one-pass stimulation), protein A—anti Cell number growth curve after using CD3 antibody carrier (2) column (one-pass stimulation) or control flask (3 days)

Abstract

短時間に効率よく、免疫療法に有効なようにＴ細胞を活性化することが可能で、簡便な操作で雑菌等のコンタミネ－ション等による危険性を低減させることが可能な方法を提供するものであり、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させることからなるＴ細胞の活性化方法、及び、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させてＴ細胞を活性化し、得られた活性化Ｔ細胞を、リンホカインを含む培地中で培養して活性化Ｔ細胞を増殖させることからなる活性化Ｔ細胞の製造方法に関する。

Description

明 細 書
T細胞の活性ィヒ方法及び活性ィヒ T細胞製造用キット
技術分野
[0001] 本発明は、 τ細胞の活性化方法、活性化 τ細胞の製造方法、免疫治療剤の製造方 法、及び、活性化 T細胞製造用キットに関する。
背景技術
[0002] ガンに対しての療法は大きく分けて「手術療法」、「化学療法」、「放射線療法」の 3つ があり、それぞれの療法が単独あるいは併用で行われているが、近年「免疫療法」と 呼ばれる方法が、ガンに対する第 4の療法として注目を集めてきた。人間は本来、病 気やけがに対して自分で治そうとする力（免疫能'免疫力）を持っており、血液中の T 細胞がその免疫能の中心としての役割を担っており、 T細胞の病気に対する攻撃力 が高いほど病気になりにくい、あるいは病気に対抗する力が強いとされている。「免疫 療法」はこの人体の免疫システムに着目した療法であり、 T細胞の持つガン細胞を殺 す能力を高める（免疫能を高める）ことによりガンを治療していくという療法である。
[0003] 近年の免疫学の進歩に伴い、種々の免疫担当細胞による免疫学的監視機構が明ら 力にされてきた。該機構の機能を高めることにより、腫瘍細胞などの抗原を認識し、破 壊する免疫療法が開発されている。例えば、患者から採取、分離されたリンパ球をィ ンターロイキン (IL)—2や IL— 4の存在下で培養して、リンホカイン活性ィ匕キラー（L AK)細胞を誘導し、この LAK細胞を再び患者の体内に戻す LAK療法 (養子免疫法 )が開発されている。
[0004] しかしながら、 LAK細胞は、腫瘍細胞などの抗原に対して非特異的な細胞障害活性 を示すので、あまり治療効果を期待できないのが現状である。そこで、抗原非特異的 なキラー細胞ではなぐ抗原特異的な活性化 T細胞を用いて、 LAK療法と同様の治 療を行う手法が注目されつつある。
[0005] 従来、活性化 T細胞の誘導には、フラスコ、シャーレなどの培養基材または不溶性担 体の表面に抗 CD3抗体が固定ィヒされた T細胞培養用担体を用いて培養する方法が 提案されている（特許文献 1を参照)。この T細胞培養用担体としては、各実験者が培 養前に、担体に抗 CD3抗体を添加することにより、抗 CD3抗体を固定ィヒした T細胞 培養用担体を調製し使用するか、又は、この調製した T細胞培養用担体を不溶性担 体に抗 CD3抗体を添加した溶液状態のまま、低温で静置して保存したものを使用し ているのが現状である。以上の操作で活性ィ匕された T細胞を、細胞培養用バッグに 入れた IL— 2などのリンホカインを含んだ培養液中にカ卩ぇ増幅させて 、る。
[0006] しかしながら、実験者にとって、上記 T細胞培養器の調製は、熟達と多くの煩雑な操 作を要するものである。また、フラスコ、シャーレなどの培養基材を用いた場合、増幅 用の細胞培養用バッグに加える際、雑菌などのコンタミネーシヨン等の危険性がある 。また、抗 CD3抗体溶液を添加したままで調製された T細胞培養用担体は、それを そのまま培養に使用すると、固定ィ匕されていないフリーの抗 CD3抗体の存在により T 細胞の増殖性が抑制される。そのため、使用時、培養時に、固定化されていないフリ 一の抗 CD3抗体溶液を除去したり、さらに、リン酸緩衝食塩水溶液 (PBS)等適当な 洗浄液を使用し洗浄したりする処理が必要となる。しかし、この抗 CD3抗体溶液の除 去及び洗浄処理においても、 T細胞培養用担体としての培養フラスコ等の開口部又 は蓋に付着した液滴を介した雑菌のコンタミネーシヨン等による危険性がある。
[0007] さらには、これまでの培養基材ゃ担体を利用した場合、培養基材上に静置した状態 で、 T細胞を活性ィ匕するには 1日〜 3日程度の期間を要していた。これらに加えて、 従来の T細胞活性ィ匕では、増幅させた T細胞の表現形を調べると、治療に効果のな い細胞の比率が高い場合が度々みられる傾向があった。そのため、臨床応用のため には、より短期間で効率的に活性ィ匕が可能な手法、及び、簡便な操作で雑菌等のコ ンタミネーシヨン等による危険性の少な ヽ T細胞培養用担体及び T細胞製造用キット が望まれている。
特許文献 1：特開平 3— 80076号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、上記現状に鑑み、短時間に効率よぐ免疫療法に有効なように T細胞を 活性ィ匕することが可能で、し力も、簡便な操作で雑菌等のコンタミネ一シヨン等による 危険性を低減させることが可能な、 T細胞の活性化方法、活性化 T細胞の製造方法 、及び、活性化 T細胞製造用キットを提供することを目的とするものである。
また、上記方法によって、ガン、感染症等の治療に効果的な活性化 Τ細胞を含む免 疫治療剤を製造する方法を提供することを目的とするものである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、 Τ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗 CD3 抗体又はそのフラグメントを固定ィ匕した担体に接触させることによって、活性化した τ 細胞が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記（1)〜（9)に関する。
(1) (a) Τ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定 化した担体に接触させることからなる、 T細胞の活性ィ匕方法。
[0010] (2) (a) T細胞を含む溶液を移動させつつ、抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定 化した担体に接触させて T細胞を活性ィ匕し、（b)得られた活性化 T細胞を、リンホカイ ンを含む培地中で培養することにより活性化 τ細胞を増殖させることからなる、活性ィ匕 τ細胞の製造方法。
(3)該リンホカインが、 IL— 2、 IL— 12及び IFN— y力もなる群より選ばれる少なくと も一つである、上記（2)記載の製造方法。
(4)該担体がカラムに充填されて!、る、上記（2)又は（3)記載の製造方法。
(5)さらに副刺激シグナル供与体が、該担体に固定化されている、上記（2)〜 (4)の V、ずれかに記載の製造方法。
(6)該副刺激シグナル供与体力 抗 CD48抗体、抗 CTLA— 4抗体、抗 CD2抗体、 抗 CD26抗体、抗 CD28抗体及びそれらのフラグメントからなる群より選ばれる少なく とも 1種である、上記（5)記載の製造方法。
[0011] (7)上記（2)〜（6)の 、ずれかに記載の製造方法によって活性化 T細胞を製造する ことを含む、活性化 T細胞を有効成分とする免疫治療剤の製造方法。
[0012] (8)上記（2)〜（6)の 、ずれかに記載の製造方法を実施するための活性化 T細胞製 造用キットであって、
抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定ィヒするための担体と、それを充填するための カラムとを含むキット。 (9)さらに抗 CD3抗体を含む、上記 (8)記載の活性化 T細胞製造用キット。
以下、本発明について説明する。
[0013] (1)T細胞の活性ィ匕
本発明による Τ細胞の活性化方法及び活性化 Τ細胞の製造方法にお ヽて、 Τ細胞を 含む溶液を移動させつつ接触させることによって Τ細胞を活性ィ匕させるために、抗 C D3抗体又はそのフラグメントを固定ィ匕した担体を使用する。
[0014] 抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定するための担体としては、抗 CD3抗体を固 定ィ匕することが可能であり、移動する液体 (Τ細胞を含む溶液）との接触に適するもの であれば、特に限定されない。例えば、無機物質 (例えば、ガラス、シリカ、金属酸ィ匕 物など）、合成高分子（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフイン、ポリ スチレン、ポリ塩ィ匕ビュル等の合成高分子プラスチック、ポリビュル、ポリアクリルアミド など）、ァガロース、架橋デキストラン、セルロース、親水性ビュルポリマーなど力も作 られたものが例示される。これらの担体の表面は多孔質であっても、粗面'滑面であ つてもかまわない。
[0015] 上記担体の形態としては特に限定されないが、後述のようにカラムやバッグに充填で きる形態のものが好ましぐ例えば、粒子状、粒子の集合体、繊維状 (例えば、不織 布）、膜状またはホロ一ファイバー状等が挙げられる。そのサイズ、形状については特 に制限はない。
[0016] 本発明で使用する抗 CD3抗体は、 CD3に対する抗体であれば、ポリクローナル抗 体、モノクローナル抗体のいずれであってもよぐ安定性、コスト、品質等に優れた巿 販の ΟΚΤ— 3抗体 (製造元：ォーソファーマシューティカル)も使用できる。
[0017] 本発明で使用する抗 CD3抗体のフラグメントとしては、 CD3に結合することができる フラグメントであれば特に限定されないが、例えば、 Fabフラグメント、 F (ab' ) フラグ
2 メントなどが例示される。
上記抗 CD3抗体のフラグメントは、 1種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を 担体に固定してもよぐまた、抗 CD3抗体と組合せて使用することもできる。
本発明にお ヽては、抗 CD3抗体又はそのフラグメントのうち 1種類のみを担体に固定 しても良いし、複種類を担体に固定してもよい。 [0018] 本発明にお 、ては、抗 CD3抗体に加えて、副刺激シグナル供与体も担体に固定ィ匕 することが好ましい。抗原特異的な T細胞の活性化による免疫反応の成立には、 TC R (T cell receptor)を介した抗原特異的シグナルだけではなぐ抗原提示細胞か ら供与される副刺激シグナル (costimulatory signal)も存在することが可能である ためである。
[0019] 上記副刺激シグナル供与体としては、 T細胞の膜表面蛋白質、膜表面糖質又は膜 脂質などを介して副刺激シグナルを伝達するものであれば特に限定されな ヽ。例え ば、 B7分子ファミリー、抗 CD48抗体、抗 CTLA (cytolytic T lymphocyte asso ciated antigen) 4抗体、抗 CD2抗体、抗 CD26抗体、抗 CD28抗体などの抗 C D抗体類、それら抗体のフラグメントなどが挙げられる。
上記 B7分子ファミリ一としては特に限定されないが、 B7. 1、B7. 2、 MB7. 2などが 例示される。これらは細胞由来のものでもよぐ遺伝子工学的手法により調製されたも のでもよい。
上記抗体のフラグメントとしては、その抗原に結合可能なフラグメントであれば特に限 定されず、例えば、 Fabフラグメント、 F (ab' ) フラグメントなどが例示される。
2
上記副刺激シグナル供与体は、 1種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を担 体に固定してもよい。
[0020] 本発明にお 、ては、抗 CD3抗体に加えて、糖鎖結合レクチンに対する抗体も担体に 固定ィ匕することができる。上記抗糖鎖結合レクチン抗体としては特に制限はないが、 例えば、シァリルルイス糖鎖結合レクチンである Lーセレクチン抗体などが例示される 。上記抗糖鎖結合レクチン抗体は、 1種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を 担体に固定してもよい。上記抗糖鎖結合レクチン抗体は、抗 CD3抗体及び上記副 刺激シグナル供与体と共に担体に固定ィ匕することもできる。
[0021] 上記担体と抗 CD3抗体等 (抗 CD3抗体、そのフラグメント、副刺激シグナル供与体、 及び、抗糖鎖結合レクチン抗体を示す）との結合は、共有結合、イオン結合、物理的 結合、又は、生化学的特異結合などによって行うことができる。共有結合の場合、臭 化シアン活性ィ匕法、エポキシ化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジァゾ法、アル キル化法、担体架橋法などの方法が例示される。なかでも、臭化シアン活性化された 担体、又は、エポキシ化された担体に対して、共有結合によって抗 CD3抗体等を結 合させることが好ましい。生化学的特異結合の場合、担体に抗 CD3抗体等を特異的 に吸着させるためのリガンド (例えば、プロテイン A、プロテイン G、抗原などの抗体接 着分子、それらの誘導体、部分ペプチド断片など)を、抗 CD3抗体等の固定化の前 に、あら力じめコーティングしたものも使用することができる。部分ペプチド断片として は、プロテイン Gの部分ペプチド断片（特開平 2003— 88381号公報)などが例示さ れる。
[0022] 担体に抗 CD3抗体等を固定ィ匕する方法としては特に限定されない。公知の方法とし ては、以下の方法が例示される。抗 CD3抗体等を、波長 280nmでの吸光度として 0 . 001〜0. 05の蛋白濃度となるように溶液を調整する。溶液の PHは 5〜： LO程度、塩 濃度は 0. 01〜： L OM程度が例示される。上記塩としては特に限定されず、ナトリウ ム塩、カリウム塩等が挙げられる。その後に当該溶液の適量と水不溶性担体とを混和 あるいは接触させ、 0〜37°Cで 1〜24時間程度静置する。処理後に溶液を除き、適 量の洗浄液を用いて洗浄する。
[0023] 上記洗浄液としては、蒸留水、生理食塩液、またはこれらに 0. 01-0. lwZv%程 度のアルブミン、非イオン系界面活性剤〔例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪 酸エステル、商品名トウィーン (Tween)〕などを添加したものが使用され得る。また洗 浄の際に、細胞培養用培地を用いることも可能である。
[0024] 具体的には、抗 CD3抗体等を固定ィ匕した担体としては、担体の表面に抗 CD3抗体 等を固定ィ匕したものが例示される。その場合、前述のように、抗体を特異的に吸着す るためのリガンドを介して抗 CD3抗体等が担体の表面に固定ィ匕されていてもよい。さ らに、これらの担体は、そのまま用いてもよいし、担体間を架橋させたもの、又は、包 括させたものを用いてもょ 、。
[0025] 抗 CD3抗体等の固定化量は、密度表示で以下の通りである。抗 CD3抗体、そのフラ グメント、抗 CD28抗体などの抗 CD抗体類、抗 CTLA— 4抗体の場合は、 0. 001〜 1000 μ g/cm2程度、好ましくは 0. 001〜10 μ g/cm2である。 B7分子ファミリーの 場合は、 10〜： L015個 Zcm2程度、好ましくは 10〜： L09個 Zcm2である。上記の各数 値は担体の単位面積あたりの量を意味する。 [0026] 本発明における活性ィ匕は、抗 CD3抗体等を固定ィ匕した担体に、 T細胞を含む溶液 を移動させつつ接触させることによって実施する。本発明では T細胞を含む溶液を移 動させること〖こよって、抗 CD3抗体及び上述の副刺激シグナル供与体と接触する機 会が増加するために、短時間（例えば 24時間以内）に効率よぐ免疫療法に有効な ように T細胞を活性ィ匕できるものと推測される。
[0027] 抗 CD3抗体等を固定ィ匕した担体は、 T細胞を含む溶液を移動させつつ接触させるこ とができる状態に保持していればよぐ例えば、カラムやバッグに充填したものが好ま しい。特に、カラムに充填している状態のもの力 活性ィ匕処理が容易であることから好 ましい。この場合、本発明の活性ィ匕は、 T細胞を含む溶液を、当該カラムに通液する ことで極めて容易に実施することができる。ノッグを使用する場合には、当該バッグ 内において、 T細胞を含む溶液を移動 (振盪、攪拌、傾斜等)させることによって実施 することができる。また、抗 CD3抗体等をフィルター又は不織布に固定ィ匕し、これに T 細胞を含む溶液を通過、移動させることにより、本発明の方法を実施することも可能 である。
[0028] 本発明で使用する T細胞としては特に限定されないが、例えば、末梢血リンパ球細 胞 (PBL)、腫瘍湿潤リンパ球、リンパ節細胞、担癌 (または腫瘍)局所リンパ節細胞 などが挙げられる。なお、本発明により得られた活性化 T細胞を患者に投与する場合 には、該患者力も採取された T細胞を用いることが望ま 、。
[0029] 本発明にお 、て、 T細胞を取得するのに必要な採血量及びそこ力 得られる T細胞 の数は、特に制限されない。採血量は、患者への負担、 T細胞の分離などの観点か ら、 l〜50mlであることが望ましい。また、得られた活性化 T細胞を癌転移抑制剤又 は癌療法補助剤として使用する場合には、標的となる腫瘍の局所リンパ節細胞を使 用することによって、腫瘍特異的な抗腫瘍効果を期待できる。
[0030] 本発明で使用する、 T細胞を含む溶液としては特に限定されな ヽが、例えば、 T細胞 を含む培養液、 T細胞を溶液 (例えば、緩衝液）に懸濁したもの等が挙げられる。 T細 胞を含む培養液にぉ ヽて用いる基本培地としては T細胞を培養できるものであれば 特に限定されないが、最小基本培地（MEM)、 KBM400、 RPMI1640、 ノヽム F12、 ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)、イスコフ改変イーグル培地（IMDM)など が挙げられる。な力でも KBM400、及び、 RPMI 1640力 子ましい。
[0031] 上記基本培地には、リンホカインが含まれていることが好ましい。リンホカインとしては 、マクロファージ遊走阻止因子（MIF)、マクロファージ走ィ匕性因子（MCF)、皮膚反 応因子（SRF)、マクロファージ活性ィ匕因子 (MAF)、白血球遊走阻止因子 (LIF)、 好中球走化性因子 (NCF)、好酸球走化性因子 (ECF)、好塩基球走化性因子 (BC F)、好酸球刺激促進因子 (ESP)、リンホトキシン (LT)、血管透過性亢進因子 (VPF )、幼若化因子 (BFまたは MF)、破骨細胞活性ィ匕因子 (OAFまたは IL 1 j8 )、 γ— インターフェロン（IFN— γ )などのエフェクターリンホカイン、および、コロニー刺激因 子（CSF)、 IL— 1、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 IL— 12、 IL— 2レセプタ 一調節因子 (ATF)などの免疫調節性リンホカインが挙げられる。なかでも、 IL 2、 I L— 12および IFN— yが望ましい。 IL— 2および IL— 12は、末梢血から分離したも のでもよいし、遺伝子組換えにより調製したものでもよい。 IFN- γは、細胞培養、遺 伝子組換えなどの手段により調製されたものを利用できる。添加量について後述する ものを適用できる。リンホカインとしては、 1種類のみを用いてもよいし、二種以上を併 用することちでさる。
[0032] 上記基本培地には、雑菌のコンタミネーシヨンを防止するための薬剤が含まれていて もよい。上記薬剤としては特に限定されないが、例えば、ペニシリン、ストレブトマイシ ン、ゲンタマイシン、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフエニコーノレ、ストレプトマイ シンなどが挙げられる。
[0033] 上記基本培地には、 Τ細胞増殖能をさらに向上させるための成分を添加することもで きる。上記成分としては特に限定されないが、例えば、インシュリン、トランスフェリン、 フェツイン、カタラーゼ、 Ο ホスホリルエタノールァミン、エタノールァミン、亜セレン 酸ナトリウム、 2—メルカプトエタノール、コルチコステロンなどが挙げられる。
[0034] インシュリンとしては、ヒト、ブタ、ヒッジ、ゥシ、ゥマなど由来のもの、または組換え体の いずれでも使用でき、その添カ卩量は、 1〜： LOO /z
Figure imgf000009_0001
特に 10 /z gZml程度が好 ましい。
トランスフェリンとしては、ヒト、ゥシ、ゥマ、ィヌ、マウス、モルモット、ゥサギなど由来の ものが使用でき、その添カ卩量は、 1〜： LOO /z gZml 特に 10 gZml程度が好ましい フェツインとしては、例えばゥシ由来のものが使用でき、その添カ卩量は、 1〜： LOO /z g Zml、特に 10 μ gZml程度が好ましい。
カタラーゼとしては、例えばゥシ、ィヌ、マウス、糸状菌など由来のものが使用でき、そ の添カロ量 ίま、 2〜50 μ g/ml、特に 30 μ g/ml程度力好まし!/ヽ。
O—ホスホリルエタノールァミンまたはエタノールァミンの添カ卩量は、 2〜200 μ g/m 1、特に gZml程度が好ましい。
亜セレン酸ナトリウムの添カ卩量は、 10_ 1G〜10_7M、特に 10_8M程度が好ましい。 2—メルカプトエタノールの添カ卩量は、 10一9〜 10_4M、特に 5 X 10_5M程度が好ま しい。
コルチコステロンの添カ卩量は、 10_ 9〜10_6M、特に 10_6M程度が好ましい。
[0035] 本発明で T細胞を活性ィ匕するにあたって、溶液に含まれる T細胞の個数は特に限定 されないが、例えば、 103〜107個/ ml程度が好ましい。
[0036] 本発明にお 、て、 T細胞を含む溶液と担体との接触に必要な時間は、 0時間より多け れば特に限定されない。本発明においては、きわめて短時間の接触であっても効率 的に活性ィ匕を達成できるので、接触時間は、 24時間未満でよぐさらには、 7時間未 満であっても十分に活性ィ匕することができる。しかしながら、本発明の方法は短時間 の接触に限定されるものではなぐ例えば、 10日程度まで延長して接触させることも 可能である。抗 CD3抗体等を固定ィ匕した担体をカラムに充填し、当該カラムに、 T細 胞を含む溶液を通液させる場合には、例えば 1時間以内、好ましくは 30分以内で上 記溶液全量がカラムを通過するようにして接触を行えばよい。この場合、一回のみ通 液させてもょ 、（ワンパス）し、複数回繰り返して通液を行ってもょ 、。
[0037] 接触時の温度としては特に限定されず、 T細胞の活性ィ匕に適した温度であればよぐ 通常、 30〜40°C程度であり、 36〜38°C程度が好ましい。活性化は、炭酸ガスを 1〜 10容量％含有する雰囲気中にて行うのが好ましい。
本発明の T細胞活性化に使用する担体の量は、スケールや細胞数により適宜選択 できる。例えば、 T細胞を含む溶液 lml当たり、 l〜107cm3程度の割合で担体を使 用すればよい。 [0038] (2)活性化 T細胞の増殖培養
本発明においては、以上の方法によって得られた活性化 Τ細胞を、リンホカインを含 む培地中で培養することにより、増殖させることができる。
培養時間は特に限定されず、活性化 Τ細胞の必要量に応じて適宜決定すればょ 、 力 例えば、 1〜50日間程度である。
増殖培養時の温度としても特に限定されず、 Τ細胞の培養に適した温度であればよ ぐ通常、 30〜40°C程度であり、 36〜38°C程度が好ましい。培養は、炭酸ガスを 1 〜10容量％含有する雰囲気中にて行うのが好ましい。
[0039] 増殖培養に使用する培地としては、上述した基本培地を使用することができる。
増殖培養に使用する培地は、 LAK細胞を誘導するために、リンホカインを含有する ものである。リンホカインとしては、末梢血から分離されたもの、または、遺伝子組換え により調製されたものを使用することができ、具体的には、上述したものを挙げること ができる。リンホカインの配合量は、例えば IL— 2の場合、 10〜： LOOOJRUZml、好 ましくは 10〜： LOOJRUZmlであり、 IL— 12の場合、 0. 1〜： LOOOUZml、好ましくは 0. 1〜： LOOUZmlであり、 IFN- γの場合、 0. 1〜： LOOOIUZml、好ましくは 10〜1 OOOIUZmlである。
[0040] 増殖培養に使用する培地には、上述と同様、雑菌のコンタミネーシヨンを防止するた めの薬剤や、 T細胞増殖能を向上させるための成分を含有するものであってよい。 本発明においては、活性ィ匕工程と増殖培養工程を一連の閉鎖系プロセスとして実施 することができ、これによつて、さらに、雑菌等のコンタミネーシヨン等が生じる危険性 を低減することができる。
[0041] (3)免疫治療剤の製造方法
本発明により得られた活性化 T細胞は、免疫治療に有利なものであり、ヒト、ゥシ、ゥ マ、ィヌ、マウス、ラットなどの哺乳動物に対して、感染防御、抗アレルギー、抗 AIDS 、癌転移抑制などの作用を有するので、免疫治療剤に用いることができる。
[0042] 上記免疫治療剤は、常法により、非経口投与の液状製剤 (例えば、皮下、筋肉内、 静脈注射剤）に調剤されることが好ましぐ疾病の進度または病状に対して所望の治 療的効果を生ぜしめるに効果的な量の活性化 T細胞を含有するものである。 [0043] 上記免疫治療剤には、活性化 T細胞に加えて、免疫治療に有用な薬剤を配合しても よい。併用し得る薬剤としては特に限定されないが、例えば、 IL— 2、 IL—12、 IFN yなどが例示される。さらに、必要に応じて、懸濁化剤、保存剤、 pH緩衝剤、等張 剤、局所麻酔剤、抗生物質などを配合することができる。
上記免疫治療剤は、感染防御剤、抗アレルギー剤、抗 AIDS剤、癌転移抑制剤また は癌療法補助剤などとして有用である。
[0044] (4)活性化 T細胞調製用キット
本発明の活性化 T細胞製造用キットは、上述した活性化及び増幅培養を実施するた めのキットであり、上記抗 CD3抗体等を固定ィ匕するための担体、及び、それを充填 するためのカラムを含むものである。本発明のキットにおいて、上記担体は上記カラ ムに充填された状態にあってもよい。
[0045] 本発明の活性化 T細胞製造用キットは、さらに、抗 CD3抗体、リンホカイン、基本培 地、活性化 T細胞を増殖培養するための容器 (例えばガス透過性をもった細胞培養 用バッグ）、上記カラムと上記容器を接続するためのデバイス (例えば、チューブ)な どを含むものであってもよい。上記カラムと上記増殖培養用容器を接続することによ つて、活性化と増殖培養を一連の閉鎖系プロセスとして実施することができる。
本発明の活性化 T細胞製造用キットに抗 CD3抗体を添付する場合には、当該抗 CD 3抗体は安定に保存できる状態にして添付することが好ましい。
本発明の活性化 T細胞製造用キットは、上記担体に、当該キットに添付されている抗 CD3抗体、又は、別途入手した抗 CD3抗体を固定ィ匕することによって、活性化 T細 胞を製造するのに使用することができる。
発明の効果
[0046] 本発明は、上記構成によって、短時間（例えば 24時間以内）に効率よぐ免疫療法に 有効なように T細胞を活性ィ匕することが可能である。本発明によれば、簡便な操作で 雑菌等のコンタミネ一シヨン等が生じる危険性を低減することができる。
[0047] 本発明によれば、 T細胞を、従来法と比較してより良好に、 CD4+、 CD8+ (活性化） T細胞などの活性化 T細胞に分化、誘導することができる。また、従来法と比較して、 活性化されて ヽな 、（つまり免疫治療に実用上必要とされな!/ヽ) CD4—CD8—T細胞 の割合を低く抑えることができる。
[0048] 本発明の T細胞の活性化方法、活性化 T細胞の製造方法及び活性化 T細胞製造用 キットは、 自己免疫疾患、細菌感染、アレルギー、 AIDS、癌の進行状況などの病状 を検査、診断する際にも極めて有用である。例えば、様々な病状の患者より回収した T細胞を本法に従って活性化、増幅した後、その増幅率、又は、増幅した T細胞表面 の CD4、 CD8などのサイト力インの発現比率を比較することで病状の進行度を推し 量ることも可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0049] 以下、本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、本発明 はこれらによって何ら限定されるものではない。
[0050] 実施例 1 抗 CD3抗体固定ィ匕担体によるヒト由来 T細胞の活性化、及び、増幅
(1)抗 CD3抗体固定化担体の調製
担体として、臭化シアン活性化されたァガロース担体（CNBr activated Sepharo se6MB (商品名）、アマシャム'バイオサイエンス製)を使用した。 lgの担体を計りとり 、これを 3. 5mlの ImM塩酸に懸濁し、ガラスフィルター上で約 200mlの ImM塩酸 で洗浄した。 5mlのカップリング緩衝液（0. 1M NaHCO、0. 5M NaCl、 pH8. 3
3
)に担体を懸濁し、 lmgの抗 CD3抗体（OKT—3、オルソ ファーマシューティカル コーポレイシヨン製)を添加し、室温で 2時間、 15ml容チューブ (旭テクノグラス製）内 で回転（lOrpm)させながら混和した。その後、ガラスフィルター上で担体のみを回収 し、これを 2mlの 0. 2Mグリシンを含むカップリング緩衝液に懸濁し、室温で 2時間静 し 7こ。
[0051] 次に、担体をガラスフィルターで回収し、緩衝液 A (0. 5M NaClを含む 0. 1M炭酸 緩衝液、 PH4)約 100mlで洗浄した後、約 100mlの緩衝液 B (0. 5M NaClを含む 0. 1Mトリス緩衝液、 pH8)で洗浄した。その後、この A—Bの洗浄操作をさらに 2回 繰り返した。その後、約 100mlの PBS緩衝液（NaH PO ·Η Ο 0. 157g、 Na HP
2 4 2 2
O 1. 98g、NaCl 8. lg、 1, 000ml)で洗浄し、さらに約 5mlの IL— 2を含有した
4
培地（KBM400、ユージンバイオ製）で洗浄したのち、最終的に 5mlの同培地で担 体を懸濁した (なお、ここで含まれる培地は細胞を添加する際には破棄した)。 [0052] この懸濁液を、細胞培養用のバッグ（NIPROカルチャーバッグ 1000N、二プロ製） を切断して作製したカラムに加え、 T細胞活性ィ匕用カラムを完成した。なお、このカラ ムは 3cmX16cmの小バッグを 3方活栓で上下 2つ連結したもので、上部の小バッグ に担体を添カ卩したものである（図 1)。
[0053] また、従来法としてフラスコに抗 CD3抗体を固定したものを調製した。抗 CD3抗体（ OKT—3、オルソ ファーマシューティカル コーポレイシヨン製）をリン酸緩衝食塩水 溶液 (PBS)で 5 μ gZmlの濃度に希釈し、表面積 25cm2のフラスコ（旭テクノグラス 製）に lml注入した。この溶液をフラスコの底面にまんべんなく広げ、室温で 1時間放 置した。その後 OKT— 3希釈液を吸引除去し、 PBSで 3回洗浄し、クリーンベンチ内 で室温にて力るく風乾させ、 T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコを調製した。
[0054] (2)ヒト T細胞の調製、並びに、担体によるヒト T細胞の活性化、及び、増幅
10mlの注射器を用いて採血したヒト抹消血全血 8mlを、へパリンを含有した真空採 血管 (滅菌済みバキュティナ採血管、 日本べタトン 'ディッキンソン製）に回収し、 1, 6 OOXgで 15分間遠心した。その後、 T細胞画分を分取し、遠心（1, 600Xg、 10分間） により T細胞を回収し、また血しょう画分を回収した。この T細胞を PBS緩衝液で 1度 洗浄し、ここに、細胞数が約 2X105個 Zmlとなるように、 IL— 2を含有した培地 (KB M400、ユージンバイオ製）を添カ卩した。なお、この培地には血しょう画分を 8% (wZ w)になるように力！]えた。
[0055] この T細胞懸濁液 5ml (約 1 X 106個）を、 (1)で調製した T細胞活性ィ匕用カラム及び T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコに加えて、 T細胞の活性ィ匕を開始した。なお、 T 細胞活性ィ匕用カラムについては、培養液を 1時間ごとに、担体を加えた上部の小バッ グから下部の小バッグに全て通過させ (約 10分間で全量通過するように）、再度上部 の小バッグに戻すという操作を繰り返した。コントロールフラスコについては静置した 状態で活性ィ匕を行った。
[0056] 7時間、又は、 1日の活性ィ匕処理を行った (T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコの場 合、 3日間の活性ィ匕処理も行った)後、 lmlの培養液を 12穴プレート（日本べタトン' ディッキンソン製）に分取し、それぞれ 3日後に上記培地を lml添カ卩 (培養液量 2ml) し、 5日後にこの全量を 6穴プレート（日本べタトン 'ディッキンソン製）に移して上記培 地を 2ml添カ卩 (培養液量 4ml)し、 7日後にシャーレ (旭テクノグラス製)）に移して 10 mlの上記培地を添加して全量 14mlとした後、さらに 9日間の培養を行った (活性ィ匕 処理終了後の培養期間が合計で 16日間となる)。それぞれについて、活性化処理終 了直後と、活性化処理後の培養日数が 3、 4、 5、 7、 10、 12、 14及び 16日目で細胞 数を計測した。
[0057] T細胞活性ィ匕用カラム及び従来の T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコによる活性ィ匕 処理終了後 16日目まで培養した時の増殖曲線を、活性化処理時間が 7時間の場合 について図 2—1に、活性ィ匕処理時間が 1日の場合について図 2— 2に示した。 さらに、 T細胞活性ィ匕用カラムにより活性ィ匕処理を 7時間行った場合の増殖曲線、及 び、 T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコにより活性ィ匕処理を 3日行った場合の増殖 曲線を図 2— 3に示した。
[0058] 図 2— 1及び図 2— 2から、 T細胞の増幅細胞数、即ち、活性化 T細胞を増殖させる効 率 (活性化効率）は、従来のフラスコの場合と比較して、カラムを使用した場合に、明 らかに良好であり、活性ィヒ時間がわず力 7時間であっても十分な増幅を示すことが分 かる。
[0059] 図 2— 3から、フラスコを用いて常法通り 3日間の活性ィ匕を行った場合には、活性化に よる日数が長くなるば力りでなぐカラムによる 7時間の活性ィ匕の場合と比較しても細 胞増幅数が少なぐ細胞増幅の立ち上げが遅いことが分かる。
[0060] 実施例 2 抗 CD3抗体固定ィ匕担体によるヒト由来 T細胞 3検体の活性化、及び、増幅 3人のヒト由来 T細胞（3検体をそれぞれ、サンプル A、サンプル B及びサンプル Cとし た)を実施例 1 (2)と同様に調製し、これらを、実施例 1 (1)と同様に調製した T細胞活 性ィ匕用カラム及び T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコを用いて活性ィ匕した。
実施例 1 (2)と同様の方法で、 7時間、又は、 2時間の活性ィ匕処理を行った後、 1ml の培養液を回収し、同様にして T細胞の増幅を行った。
[0061] T細胞活性ィ匕用カラム及び従来の T細胞活性ィ匕用コントロールフラスコによる活性ィ匕 処理終了後 2週間培養した時の増殖曲線を、活性化処理時間が 2時間の場合につ いて図 3—1に、活性化処理時間が 7時間の場合について図 3— 2に示した。
これらの図から、カラムを使用した場合、従来のフラスコの場合と比較して、 3検体共 に、短時間の活性化処理で十分な増幅を示すことが分かる。さらには、 2時間という 極めて短い活性ィ匕処理であっても十分な効果があることが分かる。
[0062] 実施例 3 抗 CD3抗体固定量による、ヒト由来 T細胞の活性ィ匕への影響
実施例 1 (1)に従って臭化シアン活性ィ匕されたァガロース担体 (CNBr activated Sepharose6MB (商品名）、アマシャム ·バイオサイエンス製）に抗 CD3抗体を固定 した。この場合、使用した抗体量は lmgゝ 500 gゝ 100 gゝ 5 gとした。これらを、 それぞれ、 CNBrlOOO、 CNBr500、 CNBrlOO、 CNBr5とする。
[0063] これらを用いて実施例 1 (2)と同様にして、ヒト由来 T細胞の活性ィ匕処理を 2時間行つ た後、 2週間培養した時の増殖曲線を図 4に示す。
この図から、抗体の固定量がわずかであっても十分な増幅が得られることが分かる。
[0064] 実施例 4 異なる担体を用いたワンノ ス刺激でのヒト由来 T細胞の活性ィ匕
(1)エポキシィ匕担体の作製
セルロース担体 (特許第 1905101号に記載の方法で調製、平均粒径 450 m)を水 で十分に洗浄した後、水に懸濁させ 2時間後の沈降体積を測定した。セルロース担 体：水： 2N NaOH :ェピクロロヒドリン（和光純薬製） = 1 : 1 : 0. 53 : 0. 18 (体積比） をはカゝり取り、担体と水を反応容器 (ポリエチレン製）内で 40°Cで約 15分間振とうした 。これに 2N NaOHをカ卩ぇ 30分間攪拌した後、ェピクロロヒドリンをカ卩えて振とうした 。 2時間反応後、ろ液が中性になるまで十分に水洗し、エポキシィ匕担体を作製した。
[0065] (2)エポキシ化担体への抗 CD3抗体の固定
実施例 4 (1)で作製した担体をガラスフィルター上に集め、約 300mlの滅菌水で洗 浄し、さらに炭酸緩衝液（0. 05M NaHCO 、 0. 1M NaOH, pHIO)約 300mlで
3
洗浄した。洗浄後、担体を約 7mlの炭酸緩衝液に懸濁し、その内、 5mlを 15ml容チ ユーブ (旭テクノグラス製）にカロえ、これに 5 μ gの抗 CD3抗体（OKT— 3、オルソ フ ァーマシューティカル コーポレイシヨン製）を添カ卩し、 37°Cで 17時間、回転（lOrpm )させながら混和した。その後、静置し、上清を廃棄し、 10mlのグリシン緩衝液 (0. 0 5M NaHCO 、 0. 1M NaOH, 0. 2M グリシン、 pHIO)をカ卩え、 37°Cで 4時間
3
静置した。その後、滅菌水約 100mlで洗浄し、 PBS緩衝液で洗浄後、最後に IL— 2 を含有した培地 (KBM400、ユージンバイオ製）で洗浄した。この担体を 5mlの同培 地に懸濁したものを用いて、実施例 1 (2)と同様にして、 T細胞活性ィ匕用カラム (ェポ キシ)を作製した。
[0066] (3)ワンパス刺激での T細胞の活性ィ匕
実施例 4 (2)で調製した T細胞活性ィ匕用カラム (エポキシ)、及び、実施例 3で作製し た T細胞活性ィ匕用カラム (CNBr5)を用いて、実施例 1 (2)と同様にして、ヒト由来 T 細胞を含む培養液を、上部の小バッグから下部カラムの小バッグに 1回、約 20分か けて通過させることによって活性ィ匕を行った (ワンパス刺激)。この後、実施例 1 (2)と 同様にして 2週間増幅させた結果を図 5に示す。
図 5から、担体の種類を変えた場合でも十分に活性化させることが可能であり、また、 ワンパス刺激という簡便な短時間処理によっても効率的な T細胞の増幅が可能であ ることが分力ゝる。
[0067] 実施例 5 増幅したヒト由来 T細胞の表現形 (CD4、 CD8)
実施例 4 (3)で T細胞活性ィ匕用カラム (CNBr5)又は T細胞活性化用カラム (ェポキ シ）を用いたワンパス刺激による活性ィ匕後に増幅させた T細胞について、 CD4陽性 及び CD8陽性比率を測定した。また、従来のフラスコ法 (活性化時間： 3日）で増幅さ せた T細胞にっ 、ても測定した。
[0068] 増幅した T細胞 2X105個分を遠心（430Xg、 5分間）により回収し、冷却した PBS緩 衝液を 200 1添カ卩した。このチューブに 10 1の抗体試薬（トライテスト CD4ZCD8 ZCD3、 日本べタトン 'ディッキンソン製)を添加し、氷中で 15分間反応させた。その 後、 500 1の1¾3緩衝液を加ぇ、軽く攪拌後遠心 (430Xg、 5分間）して細胞を回収 した。上清を除き、そこに PBS緩衝液を lml加え、攪拌した後、遠心 (430Xg、 5分間 )して細胞を回収し、その細胞を 500 1の PBS緩衝液に懸濁した。この細胞懸濁液 を用いて FACS解析（BD FACSCanto、 日本べタトン 'ディッキンソン製）を行い、 CD3陽性、 CD4陽性、 CD8陽性細胞の比率を算出した。その結果を表 1に示す。
[0069] [表 1] CD4"CD8" CD4+CD8" CD4"CD8+ CD3+ フラスコ（活性化処理時間 3日間） 50.6 8.5 40.1 92.6 カラム (C NBr5) (ワンパス刺激） 8.4 23.6 66.1 96.3 カラムはポキシ）（ワンパス刺激） 12 21 65 93.9
[0070] リンパ球療法の場合、 CD8陽性 T細胞の比率が高い方が望ましいとされている。表 1 から、カラムによる活性ィ匕によって十分な CD8陽性 T細胞の比率が確保され、また、 従来のフラスコ法に比べ、リンパ球療法には不要な CD4陰性 CD8陰性の割合が格 段に少なぐ有効な T細胞の存在比が高いことが分かる。
[0071] 実施例 6 プロテイン Aリガンドを付加した担体に抗 CD3抗体を固定ィ匕したものを用 いたヒト由来 T細胞の活性化、及び、増幅
(1)エポキシ化担体へのプロテイン Aの固定（プロテイン A担体の作製）
実施例 4 (1)で作製した担体をガラスフィルター上に集め、約 300mlの滅菌水で洗 浄し、さらに炭酸緩衝液（0. 05M NaHCO、 0. 1M NaOH、 pHlO)約 300mlで
3
洗浄した。洗浄後、担体を約 7mlの炭酸緩衝液に懸濁し、その内、 5mlを 15ml容チ ユーブ (旭テクノグラス製）に加え、これ〖こ 50 μ g分のプロテイン A (Zymed製)を添カロ し、 37°Cで 17時間、回転（lOrpm)させながら混和した。その後、静置し、上清を廃 集 た。
回収した担体を、 5mlのグリシン緩衝液（0. 05M NaHCO、 0. 1M NaOH、 0. 2
3
M グリシン、 pHlO)を加え、 37°Cで 4時間静置した。その後、滅菌水約 100mlで洗 浄し、その後、 PBS緩衝液約 100mlで 2回洗浄し、最後に 5mlの PBS緩衝液に懸濁 した。これをプロテイン A担体とした。
[0072] (2)プロテイン A担体への抗 CD3抗体の固定（プロテイン A—抗 CD3抗体担体の作 製）
実施例 6 (1)で作製したプロテイン A担体に 10 μ gの抗 CD3抗体 (OKT— 3、オルソ ファーマシューティカル コーポレイシヨン製）を添カ卩し、室温で 2時間、 15ml容チュ ーブ (旭テクノグラス製）内で回転（lOrpm)させながら混和した。その後、ガラスフィ ルター上で担体のみを回収し、 PBS緩衝液約 100mlで 2回洗浄した。その後、担体 を、約 5mlの IL— 2を含有した培地 (KBM400、ユージンバイオ製）で 2回洗浄した のち、最終的に 5mlの同培地で担体を懸濁した（なお、ここで含まれる培地は細胞添 加する際には破棄した)。これをプロテイン A—抗 CD3抗体担体（1)とした。
[0073] 同様にして、プロテイン Aを固定化したァガロース担体（ProteinA Sepharose6M B (商品名）、アマシャム'フアルマシア製）に抗 CD3抗体を固定ィ匕したものも作製し、 これをプロテイン A—抗 CD3抗体担体（2)とした。
[0074] これらをそれぞれ、細胞培養用のバッグ（NIPROカルチャーバッグ 1000N、二プロ 製)を切断して作製したカラムに加え、 T細胞活性ィ匕用カラムを完成した。なお、この カラムは 3cmX16cmの小バッグを 3方活栓で上下 2つ連結したもので、上部の小バ ッグに担体を添カ卩したものである。
[0075] 従来法としてフラスコに抗 CD3抗体を固定したものを調製した。抗 CD3抗体 (OKT —3、オルソ ファーマシューティカル コーポレイシヨン製）をリン酸緩衝食塩水溶液（ PBS)で 5 μ gZmlの濃度に希釈し、表面積 25cm2のフラスコ（旭テクノグラス製）に 1 ml注入した。この溶液をフラスコの底面にまんべんなく広げ、室温で 1時間放置した 。その後 OKT— 3希釈液を吸引除去し、 PBSで 3回洗浄し、クリーンベンチ内で室温 にて力るく風乾させコントロールフラスコを調製した。
[0076] (3)プロテイン A—抗 CD3抗体担体を用いた T細胞の活性ィ匕
実施例 1 (2)と同様にして、プロテイン A—抗 CD3抗体担体（1)を含むカラム、プロテ イン A—抗 CD3抗体担体（2)を含むカラム、又は、コントロールフラスコを用いて、ヒト 由来 T細胞 2検体 (サンプル A及びサンプル B)の活性ィ匕を行った。なお、プロテイン A—抗 CD3抗体担体（1)を含むカラム、又は、プロテイン A—抗 CD3抗体担体（2) を含むカラムについては、培養液を、上部の小バッグから下部の小バッグに全て通過 させるワンパス刺激で活性化を行った (約 20分間で全量通過させた)。コントロールフ ラスコについては、 3日かけて活性ィ匕を行った。
[0077] 活性化処理後 14日目まで培養した時の増殖曲線を図 6に示す。この図から、プロテ イン A—抗 CD3抗体担体を用いたワンパス刺激による活性ィ匕は、 T細胞の増幅細胞 数、即ち、活性化 T細胞を増殖させる効率 (活性ィ匕効率）において、従来のフラスコ 法による 3日間の活性ィ匕の場合と比較して同程度か、それ以上の結果を示すことが 分かる。 図面の簡単な説明
[0078] [図 1]実施例で用いた T細胞活性ィ匕用カラムの模式図
[図 2-1]実施例 1で T細胞活性ィ匕処理をカラム又はコントロールフラスコで 7時間行つ た後の細胞数増殖曲線
[図 2-2]実施例 1で T細胞活性ィ匕処理をカラム又はコントロールフラスコで 1日行った 後の細胞数増殖曲線
[図 2-3]実施例 1で T細胞活性化処理を、カラムで 7時間行った後、又は、コントロー ルフラスコで 3日行った後の細胞数増殖曲線
[図 3-1]実施例 2で T細胞 3検体 (サンプル A、サンプル B及びサンプル C)の活性ィ匕 処理をカラム又はコントロールフラスコで 2時間行った後の細胞数増殖曲線
[図 3-2]実施例 2で T細胞 3検体 (サンプル A、サンプル B及びサンプル C)の活性ィ匕 処理をカラム又はコントロールフラスコで 7時間行った後の細胞数増殖曲線
[図 4]実施例 3において固定時の抗体使用量を lmg、 500 /z g、 100 /z g、 として 作製したカラム（CNBrlOOO、 CNBr500、 CNBrlOO及び CNBr5)で活性化処理 を 2時間行った後の細胞数増殖曲線
[図 5]実施例 4においてカラム（エポキシ)又はカラム（CNBr5)を用いたワンパス刺激 により活性ィ匕処理を行った後の細胞数増殖曲線
[図 6]実施例 6で、 T細胞 2検体 (サンプル A及びサンプル B)の活性ィ匕処理を、プロテ イン A—抗 CD3抗体担体（ 1 )を含むカラム (ワンパス刺激）、プロテイン A—抗 CD3 抗体担体（2)を含むカラム（ワンパス刺激）、又は、コントロールフラスコ（3日間）を用 いて行った後の細胞数増殖曲線
符号の説明
[0079] 1、上部の小バッグ
2、下部の小バッグ
3、三方活栓
4、担体

Claims

請求の範囲
[1] (a) T細胞を含む溶液を移動させつつ、抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定ィ匕し た担体に接触させることを特徴とする、 Τ細胞の活性ィ匕方法。
[2] (a) Τ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定ィ匕し た担体に接触させて T細胞を活性ィ匕し、（b)得られた活性化 T細胞を、リンホカインを 含む培地中で培養することにより活性化 T細胞を増殖させる、
ことを特徴とする活性化 T細胞の製造方法。
[3] 該リンホカインが、 IL— 2、 IL— 12及び IFN— y力もなる群より選ばれる少なくとも一 つである、請求項 2記載の製造方法。
[4] 該担体がカラムに充填されている、請求項 2又は 3記載の製造方法。
[5] さらに副刺激シグナル供与体が、該担体に固定化されている、請求項 2〜4のいずれ 力 1項に記載の製造方法。
[6] 該副刺激シグナル供与体が、抗 CD48抗体、抗 CTLA— 4抗体、抗 CD2抗体、抗 C
D26抗体、抗 CD28抗体及びそれらのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも
1種である、請求項 5記載の製造方法。
[7] 請求項 2〜6の ヽずれか 1項に記載の製造方法によって活性化 T細胞を製造すること を含む、活性化 T細胞を有効成分とする免疫治療剤の製造方法。
[8] 請求項 2〜6の 、ずれか 1項に記載の製造方法を実施するための活性化 T細胞製造 用キットであって、
抗 CD3抗体又はそのフラグメントを固定ィヒするための担体と、それを充填するための カラムとを含むキット。
[9] さらに抗 CD3抗体を含む、請求項 8記載の活性化 T細胞製造用キット。
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