RU2178173C1 - Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток - Google Patents
Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2178173C1 RU2178173C1 RU2001108418/14A RU2001108418A RU2178173C1 RU 2178173 C1 RU2178173 C1 RU 2178173C1 RU 2001108418/14 A RU2001108418/14 A RU 2001108418/14A RU 2001108418 A RU2001108418 A RU 2001108418A RU 2178173 C1 RU2178173 C1 RU 2178173C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- probes
- hpv
- probe
- solution
- type
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Обнаружение производится в биопсийных гистологических срезах, которые обрабатывают раствором протеиназы К, инкубируют, дегидратируют спиртом и наносят специфический олигонуклеотидный зонд, далее инкубируют с буфером-детектором, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом. Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный "Микро-вирус". Изобретение позволяет повысить специфичность определения вирусов в инфицированных клетках. 2 с. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Такое обнаружение производится в биопсийных гистологических препаратах.
Среди вирусов, инфекционных для человека и животных, существует большое количество таких, которые в ходе инфекционного цикла включают свой генетический материал (т. е. молекулу ДНК) в состав хромосомы инфицированной клетки, после чего генетическая информация вируса передается потомству данной инфицированной клетки. По этой схеме построен инфекционный цикл вирусов папилломы (вызывает инфекционную папиллому, кандилому и ряд злокачественных опухолей) и полиомы человека, вируса иммунодефицита человека (вызывает СПИД), интеграция часто наблюдается при инфекции вирусами герпеса различных типов, в т. ч. т. н. вирусом Эпштейна-Барр или герпес-4 (вызывает инфекционный мононуклеоз и ряд злокачественных опухолей)) и др. Эти группы вирусов в высшей степени важны, поскольку вызываемые ими заболевания широко распространены и представляют существенную опасность, а их диагностика и клинический прогноз в настоящее время несовершенны.
Основной метод определения вирусной ДНК, используемый в настоящее время, - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Его принципиальный недостаток - невозможность определить, в каких именно клетках или тканях больного присутствует вирус (т. е. можно определить только сам факт наличия вируса в крови больного или биопсийном материале).
Принцип способа и набора для определения инфекционных и онкогенных вирусов основан на
- денатурации ДНК в клеточных ядрах (на микроскопических срезах) и последующей ренатурации со специфическим олигонуклеотидным зондом - такая ренатурация происходит только при наличии в данной клетке вирусной ДНК;
- присоединении к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
- получении окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрация при помощи светового микроскопа.
- денатурации ДНК в клеточных ядрах (на микроскопических срезах) и последующей ренатурации со специфическим олигонуклеотидным зондом - такая ренатурация происходит только при наличии в данной клетке вирусной ДНК;
- присоединении к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
- получении окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрация при помощи светового микроскопа.
Принцип специфической денатурации-ренатурации является фундаментальным принципом физико-химии нуклеиновых кислот. В общем он описан во многих руководствах по нуклеиновым кислотам, например "Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот", под ред. А. С. Спирина, 1990. В применении к вирусу папилломы человека (ВПЧ) он описан:
Boshart M. et. al. A new type of papillomavims DNA, its presence in genital cancer biopsies. . . EMBO J. 1984, 3, 1151-1157.
Boshart M. et. al. A new type of papillomavims DNA, its presence in genital cancer biopsies. . . EMBO J. 1984, 3, 1151-1157.
Lorincz A. T. et. al. A new type of papillomavims associated with cancer. . . Virology 1987, 159, 187-190.
Принцип использования биотиновой модификации с последующим присоединением фермента и получением окрашенного продукта также является общепринятым; в применении к ВПЧ он описан:
Brigati D. J. et. al. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue. . . Virology 1983, 126, 32-50.
Brigati D. J. et. al. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue. . . Virology 1983, 126, 32-50.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа и набора, которые способны решить проблему специфического определения вирусов в инфицированных клетках.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, проводят на гистологических срезах. Последние обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37oС 15 минут, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18-зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 50% SSC 0,5х, рН 7,0 и раствором, содержащим трис-HCL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37oС в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-НСl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18-зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 50% SSC 0,5х, рН 7,0 и раствором, содержащим трис-HCL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37oС в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-НСl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.
Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный заявителем "Микро-вирус", который содержит
а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) раствор промывочный для гибридизации:
формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) буфер-детектор. Сигма, А 4955.
а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) раствор промывочный для гибридизации:
формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) буфер-детектор. Сигма, А 4955.
г) стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).
д) биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).
е) NBT-BCIP - реагент, 200 мкл. Сигма, В1911.
ж) протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.
з) реакционный буфер:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5, NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
левамизол 0,1 мМ.
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5, NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
левамизол 0,1 мМ.
и) смесь солей для промывочного раствора - на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0, NaCl 150 mM.
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0, NaCl 150 mM.
Тест-набор "Микро-вирус" предназначен для обнаружения интегрированного вируса и определения типа этого вируса в инфицированных клетках.
Вирус папилломы человека (ВПЧ). Тест-наборы "Микро-вирус" ВПЧ-универсал для определения ВПЧ любого типа, "Микро-вирус" ВПЧ-6/11 для определения ВПЧ типов 6 и 11, "Микро-вирус" ВПЧ-16/18 для определения ВПЧ типов 16 и 18 предназначены для определения перечисленных типов ВПЧ.
При анализе и лечении папилломы человека необходимо знать, какой тип вируса вызвал данную папиллому. Во-первых, в зависимости от типа вируса используются разные протоколы лечения. Во-вторых, вирусы типов 6 и 11 являются высокоонкогенными для папилломы и при их обнаружении необходима антиопухолевая терапия. Эти вирусы выявляются набором ВПЧ-6/11, а если папиллома вызвана другим, менее опасным типом ВПЧ, он выявляется набором ВПЧ-универсал.
При кандиломе высокоонкогенными являются типы 16 и 18, а тип 6 - среднеонкогенным. Таким образом, необходимую информацию для прогноза и лечения также можно получить, используя набор "Микро-вирус".
Помимо этого при начале опухолевого процесса, вызванного вирусом папилломы, в человеческих хромосомах остаются только два гена ВПЧ, т. н. вирусные онкогены Е6 и Е7. Набор ВПЧ-универсал позволяет зарегистрировать этот факт (в наборе есть соответствующий олигонуклеотидный зонд на ген Е6) и сделать вывод о переходе инфекционного процесса в опухолевый, что необходимо для правильного лечения такого заболевания.
При использовании тест-набора "Микро-вирус" инфицированная клетка непосредственно видна под микроскопом, что дает возможность прямо определить тип ткани, локализацию в пораженном органе, морфологические изменения инфицированной клетки и т. д. Эта информация, необходимая для определения диагноза, прогноза развития заболевания, оптимального пути лечения, не может быть получена ни методом ПЦР, ни каким-либо другим путем.
Единственный существующий в настоящее время метод определения ВПЧ, основанный на аналогичном принципе, используется в наборе PathoGene фирмы Enzo.
Однако набор "Микро-вирус" отличается от него:
- стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора "Микро-вирус" раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения вируса;
- использование коротких олигонуклеотидных зондов (длина 30 нуклеотидов) дает возможность использовать одну отмывку раствором для гибридизации вместо трех, что ускоряет определение;
- набор "Микро-вирус" позволяет не проводить дополнительное окрашивание клеток, что создает оптимальное соотношение сигнала и фона и предохраняет от маскировки специфического сигнала дополнительным клеточным красителем;
- используемый для набора "Микро-вирус" химические синтез и модификация специфических зондов выгодно отличаются от энзиматических, применяемых в PathoGene, поскольку позволяют достичь более высокой регулярности модификации зондов, т. е. более высокой специфичности и воспроизводимости результатов;
- модификация производится по стандартной методике с использованием препарата "Biotin-x-x-NHS" производства компании "Сигма";
- наличие в наборе "Микро-вирус" специфического зонда для определения вирусного онкогена Е6 позволяет использовать его для диагностики вирус-зависимой злокачественной опухоли.
- стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора "Микро-вирус" раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения вируса;
- использование коротких олигонуклеотидных зондов (длина 30 нуклеотидов) дает возможность использовать одну отмывку раствором для гибридизации вместо трех, что ускоряет определение;
- набор "Микро-вирус" позволяет не проводить дополнительное окрашивание клеток, что создает оптимальное соотношение сигнала и фона и предохраняет от маскировки специфического сигнала дополнительным клеточным красителем;
- используемый для набора "Микро-вирус" химические синтез и модификация специфических зондов выгодно отличаются от энзиматических, применяемых в PathoGene, поскольку позволяют достичь более высокой регулярности модификации зондов, т. е. более высокой специфичности и воспроизводимости результатов;
- модификация производится по стандартной методике с использованием препарата "Biotin-x-x-NHS" производства компании "Сигма";
- наличие в наборе "Микро-вирус" специфического зонда для определения вирусного онкогена Е6 позволяет использовать его для диагностики вирус-зависимой злокачественной опухоли.
В отличие от набора PathoGene "Микро-вирус" предназначен для диагностических целей.
Кроме того, в состав набора "Микро-вирус" для ВПЧ входят новые олигонуклеотидные зонды, имеющие оригинальную нуклеотидную последовательность.
Специфические олигонуклеотидные зонды
В каждый из этих тест-наборов включены специфические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определяемому типу вируса:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд (37-46 по L1)
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд (48-77 по L1)
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд (95-124 по L1)
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд (30-59 по L1)
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд (138-167 по Е6)
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд (45-74 по Е7)
примечание: в скобках приведены названия генов и цифрами указаны порядковые номера нуклеотидов в этих генах, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям зондов. Зонды для набора "Микро-вирус" ВПЧ (всего 7 вариантов набора):
ВПЧ-универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
Конкретный пример осуществления способа 1.
В каждый из этих тест-наборов включены специфические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определяемому типу вируса:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд (37-46 по L1)
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд (48-77 по L1)
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд (95-124 по L1)
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд (30-59 по L1)
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд (138-167 по Е6)
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд (45-74 по Е7)
примечание: в скобках приведены названия генов и цифрами указаны порядковые номера нуклеотидов в этих генах, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям зондов. Зонды для набора "Микро-вирус" ВПЧ (всего 7 вариантов набора):
ВПЧ-универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
Конкретный пример осуществления способа 1.
Готовят парафиновые срезы гистологического материала толщиной 4-6 мкм. При этом используют высокоадгезивные стекла, предварительно обработанные раствором полилизина или силана.
Срезы высушивают в вертикальном положении 18 часов при температуре 60-80oС. При необходимости готовые срезы хранят при 4oС.
Далее срезы выдерживают при температуре 60-80oС 5-15 мин и проводят депарафинирование обработкой:
Ксилол - 10 мин
Ксилол - 2 мин
100% спирт - 1 мин
100% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
5-% спирт - 1 мин и
дистиллированной водой - 1 мин.
Ксилол - 10 мин
Ксилол - 2 мин
100% спирт - 1 мин
100% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
5-% спирт - 1 мин и
дистиллированной водой - 1 мин.
Стекла высушивают 5-10 мин при температуре 37oС и на каждый срез наносят по 100 мкл раствора протеиназы К в рабочем разведении и инкубируют при 37oС 15 мин во влажной камере.
Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении растворяют 5 мг лиофилизированной протеиназы К в 2 мл промывочного раствора. Полученный раствор является концентратом 10х, его разделяют на аликвоты 100-300 мкл и хранят замороженным при -20oС. Срок хранения замороженного раствора - 1 год, повторное замораживание не допускается.
Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении размораживают концентрат 10х и разводят в 10 раз промывочным раствором. При комнатной температуре рабочий раствор стабилен 1 час, хранение рабочего раствора не допускается.
При комнатной температуре сливают со срезов раствор протеиназы К, промывают дистиллированной водой и дегидратируют по следующей схеме:
Н2О дистиллированная - 1 мин
50% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин.
Н2О дистиллированная - 1 мин
50% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин.
Срезы высушивают при температуре 37oС 5-10 мин. При необходимости подготовленные срезы можно хранить при 4oС до 1 недели.
Затем наносят на срез 50 мкл ВПЧ ДНК зонда. Аккуратно без пузырей накрывают покровным стеклом и стекла инкубируют при температуре 95oС 3-10 мин, далее срезы, не снимая покровных стекол, помещают во влажную камеру для инкубации при 37oС на 90-120 мин, осторожно удаляют со срезов покровные стекла и наносят на срезы 100 мкл промывочного раствора для гибридизации и инкубируют 2 мин.
Осторожно сливают со стекол раствор и еще раз наносят на срез промывочный раствор для гибридизации и инкубируют во влажной камере при 37oС 10 мин. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин при комнатной температуре. На срезы наносят реагент-детектор по 100 мкл и инкубируют во влажной камере при 37oС 30 мин.
Приготовление реагента-детектора:
В буфер-детектор добавляют раствор стрептавидина 1: 5 по объему и раствор биотинированной щелочной фосфатазы 1: 10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37oС 30 мин. После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.
В буфер-детектор добавляют раствор стрептавидина 1: 5 по объему и раствор биотинированной щелочной фосфатазы 1: 10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37oС 30 мин. После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.
Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин. На срезы наносят раствор NBT/BCIP реагента по 100 мкл на срез и инкубируют во влажной камере в темноте! при 37oС 30 мин.
Приготовление NBT/BCIP реагента:
Готовят 2% NBT/BCIP реагент в реакционном буфере, приготовленный раствор берегут от прямых солнечных лучей. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин, затем дистиллированной водой 1 мин, дегидратируют:
96% спирт - 1 мин
100% спирт - мин
100% спирт - 1 мин
Ксилол - 1 мин
и заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат исследуют под световым микроскопом.
Готовят 2% NBT/BCIP реагент в реакционном буфере, приготовленный раствор берегут от прямых солнечных лучей. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин, затем дистиллированной водой 1 мин, дегидратируют:
96% спирт - 1 мин
100% спирт - мин
100% спирт - 1 мин
Ксилол - 1 мин
и заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат исследуют под световым микроскопом.
Конкретный пример 2.
СОСТАВ НАБОРА.
а) Пробы олигонуклеотидные для обнаружения ВПЧ, универсальная и тип-специфические, растворы по 1 мл, 10 о. е. /мл;
Раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл.
Раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл.
Формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) Буфер-детектор, 10 мл. Сигма, А 4955.
SSC 0,5x, рН 7,0
в) Буфер-детектор, 10 мл. Сигма, А 4955.
г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 2 мл.
д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 1 мл.
е) NBT/BCIP - реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.
ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.
з) Реакционный буфер, 10 мл:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5; NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
Левамизол 0,1 мМ.
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5; NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
Левамизол 0,1 мМ.
и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM.
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM.
к) Контрольные препараты (3 шт. )
Claims (2)
1. Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что гистологические срезы обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37oС 15 мин, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 80% SSС 0,5х, рН 7,0, и раствором, содержащим трис-НСL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37o в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-HCl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 80% SSС 0,5х, рН 7,0, и раствором, содержащим трис-НСL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37o в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-HCl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.
2. Набор для индикации инфекционных и онкогенных вирусов интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что он содержит а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
Раствор: SSC2x (рН 7,0), формамид 50%, декстрансульфат 5%,
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл, формамида 50%, SSC 0,5х, рН 7,0.
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
Раствор: SSC2x (рН 7,0), формамид 50%, декстрансульфат 5%,
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл, формамида 50%, SSC 0,5х, рН 7,0.
в) Буфер-детектор. Сигма, А4955.
г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.
д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.
е) NBT|BCIP-реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.
ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.
з) Реакционный буфер: трис-НСl 50 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%, левамизол 0,1 мМ
и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л: трис-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.
и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л: трис-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001108418/14A RU2178173C1 (ru) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001108418/14A RU2178173C1 (ru) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2178173C1 true RU2178173C1 (ru) | 2002-01-10 |
Family
ID=20247783
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001108418/14A RU2178173C1 (ru) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2178173C1 (ru) |
-
2001
- 2001-03-30 RU RU2001108418/14A patent/RU2178173C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRIGATI D.J. et al (Virology, 1983, 126, 32-50). * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100245283B1 (ko) | 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method) | |
JPH11503026A (ja) | インジツーハイブリダイゼーション溶液及び方法 | |
CN105385757B (zh) | 用于室温原位检测生物样品中的目标核酸的方法和试剂盒 | |
WO1989002934A1 (en) | Human papillomavirus type diagnosis with nucleotide probes | |
JP6284487B2 (ja) | 膀胱癌の診断及びその再発のモニタリングのための材料及び方法 | |
US20160046984A1 (en) | Robust Detection of Nucleic Acids in Situ | |
WO2015125027A2 (en) | Kit and method for detecting bladder cancer | |
JP2001502881A (ja) | 高分子ペプチドプローブ及びその使用 | |
RU2178173C1 (ru) | Способ и набор для определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток | |
CN115094063A (zh) | 一种肺癌早期智能诊断的多价可激活适配体探针及其制备与应用 | |
WO2017114005A1 (zh) | Terc基因和/或myc基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
RU2192011C1 (ru) | Набор "микровирус" для обнаружения днк вич, интегрированной в хромосомы инфицированных клеток | |
WO2001016374A2 (en) | Methods and reagents for in situ amplification | |
RU2788860C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий | |
CN111057790B (zh) | miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途 | |
CA2865541A1 (en) | Nucleic acid detection method | |
US20130171622A1 (en) | Compositions and methods for detecting viral infection using direct-label fluorescence in situ hybridization | |
KR101891736B1 (ko) | 동일한 pcr 산물을 이용하여 인유두종 바이러스의 정성 검사 및 유전형 검사를 수행하기 위한 키트 및 방법 | |
Van der Ploeg et al. | Non-radioactive in situ hybridization procedures using mercury-and acetylaminofluorene labelled probes | |
CN114196788A (zh) | 利用荧光原位检测技术快速检测非洲猪瘟病毒的方法 | |
JP2001204470A (ja) | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット | |
HUT75069A (en) | A nucleic acid diagnostic method using riboprobes, rnase digestion, and molecular weight exclusion chromatography | |
PLOEG et al. | Non-radioactive in situ hybridization procedures using mercury-and acetylaminofluorene labelled probes. | |
KR20020063072A (ko) | 피시알에 의한 파필로마 바이러스의 검출용 키트 및 그검출방법 | |
GENERSCH et al. | 21 In Situ Formats |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060331 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20070820 |
|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100422 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110331 |