CN102071250A - 一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒及其检测方法，试剂盒由试剂A和试剂B组成，其中试剂A包含PCR缓冲液、Taq聚合酶、dNTP、Oligo-dT引物，试剂B：为标准DL-2000DNA Ladder。检测方法包括：样品DNA的提取；(1)样品基因组DNA的提取；(2)PCR扩增反应；(3)琼脂糖凝胶电泳检测，根据392bp特异扩增条带的有无，来确定样品是否为Ogu胞质。采用本试剂盒从DNA提取到获得检测结果，仅需几个小时，极为方便快捷，苗期就可完成筛选、鉴定，极大地缩短了鉴定周期，在青花菜育种实践中具有重要的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒，可检测青花菜Ogu胞质，适用于该胞质的快速鉴定与分子标记辅助选择。
背景技术
雄性不育是植物中普遍存在的一种自然现象，是指由于遗传或生理上的多种原因造成植物雌性器官正常，而雄性器官不正常，不能产生花粉或花粉败育而不能正常授粉，导致自交不结实，只能异交结实。雄性不育广泛存在于植物界中，迄今为止已很多品种或种间杂种中发现了该现象。
研究表明，雄性不育主要分为细胞核雄性不育(Genic male sterility，GMS)和细胞质雄性不育(简称CMS)两大类。细胞核雄性不育是由核不育基因控制，不受细胞质影响，不存在正反交遗传效应。同时根据不育基因与对应的可育基因之间的显隐性关系，又可分为隐性核不育(张德威等，1979；曹寿椿，1987；杨世周，1995；夏锡铜等，1988)和显性核不育(方智远等，1997)。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)，又称质核互作型雄性不育，其不育性是由核不育基因和细胞质不育基因相互作用而产生的。两种不育类型中，核不育因后代会出现育性分离，在利用上存在一定难度；而细胞质雄性不育的利用则不存在后代育性分离，可大面积的推广利用。
雄性不育在蔬菜杂种优势利用上有着重要的应用价值，利用雄性不育系作母本配制杂交种，可以克服人工杂交或优良自交不亲和系杂交这两种方法的缺点，可以扩大杂种优势的利用范围，降低种子生产成本，保证杂交种的纯度，已成为蔬菜作物育种的主要趋势。
目前，国内外在十字花科蔬菜作物中已经发现和培育出Ogu CMS(萝卜细胞质雄性不育)、Pol CMS(波里马细胞质雄性不育)、Jun CMS(芥菜型油菜细胞质雄性不育)、陕2A CMS等多种不同来源的细胞质不育类型。其中Ogu CMS自发现以来，国内外学者对该不育材料进行大量的回交转育，目前已转育到油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科作物中，因Ogu CMS对环境变化不敏感、不育性稳定、易转育成不同熟性不同品质的不育系等优点，已经成为蔬菜作物中应用最为广泛的不育源之一。
传统CMS鉴定与分类方法如恢保测验(tester lines)、细胞学标记、蛋白质标记、同工酶鉴定等存在鉴定周期长、耗时耗工和操作复杂等不利因素，且往往不能准确鉴定出不育胞质具体类型。目前经检索，国内外尚无青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒出现。为此，本发明针对青花菜Ogu胞质，设计出检测试剂盒，可简单、快捷、低成本和准确地鉴定出青花菜Ogu胞质，可极大地缩短鉴定周期和应用于Ogu胞质的分子标记辅助选择，在青花菜育种实践中具有重要的利用价值。
发明内容
本发明的目的是针对青花菜Ogu胞质，设计出检测试剂盒，可简单、快捷、低成本和准确地鉴定出青花菜Ogu胞质，可极大地缩短鉴定周期和应用于Ogu胞质的分子标记辅助选择，在青花菜育种实践中具有重要的利用价值。
本发明的另一目的是提供一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒的检测方法。
为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是试剂A，包括有特异引物、PCR缓冲液、Taq聚合酶、dNTP以及Oligo-dT特异引物；
试剂B，标准DL-2000ladder。
进一步设置是所述的oligo-dT特异引物包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，其中
Ogu-A序列为5’-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3’，
Ogu-B序列为5’-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3。
进一步设置是所述试剂A各组分配比为：
成分 试剂浓度
特异引物 0.4mM/个
PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50Mm KCl，1.5mM MgCl2
Taq聚合酶 0.04U/μL
dNTP 0.2mM。
实现本发明另一个目的的技术方案是包括以下步骤，
(1)提取样品基因组DNA；
(2)特异引物设计，该特异引物的包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，
Ogu-A序列为5’-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3’，
Ogu-B序列为5’-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3；
(3)吸取样品基因组DNA与试剂A进行PCR扩增；
(4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据392bp特异扩增条带的有无，来确定该样品是否含有Ogu胞质。
所述的步骤(1)包括以下步骤：
a)取0.2g幼嫩叶片于研钵中，用液氮充分研磨成粉末，加入800μL CTAB裂解缓冲液，转移至2.0mL离心管中，轻轻摇匀，于65℃水浴30分钟。
b)取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心5分钟。
c)加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，并将离心管缓慢翻转几次，静置5分钟；16℃，11200rpm离心3min。
d)将上清液吸入新离心管中，加入70μL pH 5.2的3.0M醋酸钠与900μL预冷的无水乙醇并缓慢翻转数次，放于-20℃冰箱2h以上。
e)8℃，11200rpm，离心5分钟，弃上清液，加入200μL预冷的70％乙醇清洗沉淀；
f)8℃，11200rpm，离心2分钟，弃上清液。干燥后，加100μL灭菌的TE缓冲液或ddH2O溶解，-20℃冰箱保存备用。
g)1.2％琼脂糖凝胶电泳检测质量，稀释后用于PCR扩增分析。
进一步设置是所述的步骤(3)的PCR扩增反应体系和程序为：反应体系为16μL，含样品基因组DNA 20ng，引物各0.4μmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，Mg2+1.5mmol·L-1，Taq聚合酶0.64U，反应程序为：94℃预变性5min，94℃40s、56℃50s、72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，10℃保存。
进一步设置是所述的步骤(4)为待PCR扩增结束后，加入1/4体积的溴酚蓝，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像系统观察，含有Ogu胞质的样品中可扩增出长度为392bp的特异条带。
本发明相较于传统技术具有以下优点：
快速性：传统田间鉴定方法鉴定周期长，费时费力。而采用本试剂盒从DNA提取到获得检测结果，仅需几个小时，且任一生育期均可进行鉴定，方便快捷，极大地缩短了鉴定周期，在育种实践中具有重要的利用价值。
准确性：利用本方法对我所保存的青花菜不育种质资源进行鉴定，20余份不育资源中均扩增出此特征带，测序结果表明扩增片段与orf138的同源为100％。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1为该试剂盒在青花菜中的检测结果图；
图中L为DL-2000DNA Ladder；2，3，10，11，12，13为含Ogu胞质的青花菜样品；1，4，5，6，7，8，9为不含Ogu胞质的青花菜样品。
具体实施方式
下面通过实施例和附图1对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
1、特异引物的设计和合成
根据Ogu CMS相关的基因orf138(Gene bank登录号：Z18896.1)设计引物，于华大基因公司合成该序列。特异引物Ogu-A和Ogu-B分别位于orf138基因的22bp-46bp和394bp-413bp，扩增得到的特异片段长度为392bp。
2、试剂盒的组装
试剂A的配制：
先将装有引物(Ogu-A：5’-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3’和Ogu-B：5’-TTTCT CGGTCCATTTTCCAC-3’)的离心管在离心机上离心2分钟，然后用灭菌的ddH2O溶解。按照表1的组分配成试剂A，置于-20℃冰箱中保存。试剂A现用现配扩增效果更好。
| 成分 | 试剂浓度 |
| 特异引物 | 0.4mM/个 |
| Tris-HC | 10mM |
| KCl | 50Mm |
| MgCl2 | 1.5mM |
| Taq聚合酶 | 0.04U/μL |
| dNTP | 0.2mM |
表一试剂A的具体组成成分
试剂B的配制：该试剂为标准DL-2000DNA Ladder，可从试剂公司购得。
3、样品DNA的提取
按照发明内容中DNA提取步骤，提取待测样品(青花菜)的基因组DNA，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测提取质量，稀释成约20ng/μL工作液，用于PCR扩增分析。
4、PCR检测
分别吸取1μL DNA(约含20ng基因组DNA)和15μL试剂A，混于0.2ml的PCR管中，并加入少许石蜡油，1000rpm，离心30s。按照设定程序(94℃预变性5min，94℃40s、56℃50s、72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，10℃保存)进行PCR扩增。
5、扩增结果检测
PCR扩增结束后，加入4μL溴酚蓝，800rpm，离心30s。然后在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，利用凝胶成像系统观察结果。
6、结果分析
在所选择的13个青花菜样品中，其中7个可育样品中未扩增出特异条带，6个不育样品可扩增出长度为392bp的特异条带(见附图1)，测序结果显示该片段与orf138的同源为100％，多次重复仍获得相同扩增结果，同时特异条带的有无与样品田间育性调查结果完全一致。可见，本试剂盒能快速、准确、特异性好的鉴定出青花菜Ogu胞质，可应用于青花菜Ogu胞质的分子标记辅助选择。
7、说明
由于青花菜基因组信息量巨大，本试剂盒仅提供一种简单、快速的鉴定方法，对于个别样品的检测结果不确定时，建议将所扩增到的条带测序，据以判断其是否为Ogu胞质类型。
Claims (6)
1.一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒，其特征在于包括以下试剂：
试剂A，包括有特异引物、PCR缓冲液、Taq聚合酶、dNTP以及Oligo-dT特异引物；
试剂B，标准DL-2000ladder。
2.根据权利要求1所述的青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述的oligo-dT特异引物包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，其中
Ogu-A序列为5’-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3’，
Ogu-B序列为5’-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3。
3.根据权利要求1或2所述的青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂A各组分配比为：
成分 试剂浓度
特异引物 0.4mM/个
PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50Mm KCl，1.5mM MgCl2
Taq聚合酶 0.04U/μL
dNTP 0.2mM。
4.一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)提取样品基因组DNA；
(2)特异引物设计，该特异引物的包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，
Ogu-A序列为5’-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3’，
Ogu-B序列为5’-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3；
(3)吸取样品基因组DNA与试剂A进行PCR扩增；
(4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据392bp特异扩增条带的有无，来确定该样品是否含有Ogu胞质。
5.根据权利要求4所述的一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)的PCR扩增反应体系和程序为：反应体系为16μL，含样品基因组DNA20ng，引物各0.4μmol·L-1，dNTPs 0.2mmol·L-1，Mg2+1.5mmol·L-1，Taq聚合酶0.64U，反应程序为：94℃预变性5min，94℃40s、56℃50s、72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，10℃保存。
6.根据权利要求4或5所述的一种青花菜Ogu胞质快速鉴定试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的步骤(4)为待PCR扩增结束后，加入1/4体积的溴酚蓝，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像系统观察，含有Ogu胞质的样品中可扩增出长度为392bp的特异条带。
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