CN108875302B - 一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统和方法,本发明通过采用整体捕获区域的平均测序深度对每一个捕获区间的平均深度进行归一化处理,消除因实验操作误差造成的捕获效率的变化对基因拷贝数鉴定的影响。而传统的归一化方法采用的是区间reads数与所有测序reads数的比值作为每一区间的归一化值,传统方法没能消除不同实验间捕获效率不一致对结果的影响。本发明通过构建正常训练集的方法,能够消除样本内每个捕获区间之间因GC含量、探针浓度等原因造成的各个区间之间的捕获效率不一致的问题,降低假阳性率。

Description

一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统和方法
技术领域
本发明涉及一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统和方法。
背景技术
细胞的DNA通过凋亡、分泌或吞噬等多种机制进入血液循环系统,这种DNA碎片称之为血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)。对于肿瘤病人而言,血浆中的cfDNA除了来自正常的细胞外,还有部分来源于肿瘤细胞,这部分携带肿瘤细胞特异信息的DNA被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)。ctDNA在cfDNA中的占比一般为0.1%-10%,并且随着病情阶段的不同差异很大。
ctDNA片段大小通常为160-180bp,携带有点突变(single nucleotide variants,SNV)、插入缺失(insertion and deletion,INDEL)、拷贝数变异(copy number variation,CNV)、基因融合(Fusion)等突变信息。研究发现,大部分基因拷贝数变异(CNV)都与复杂疾病密切相关。目前,由于血浆中带有基因拷贝数变异的游离DNA(ctDNA)的浓度较低,通常采用基于第二代DNA测序技术的靶向捕获测序方法,对肿瘤DNA变异热点区域进行深度测序(>10000倍)。
现有的基因拷贝数变异分析工具主要是针对来源于白细胞的胚系DNA变异或者来源于肿瘤组织的体细胞DNA变异,该类CNV的变异频率通常大于1%,且通常只支持全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)和全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)。所以对于低浓度拷贝数变异,且聚焦于热点变异区域的捕获ctDNA测序数据,现有的工具并不适合。本方法主要是针对基于第二代DNA测序技术的ctDNA靶向捕获测序数据,进行基因拷贝数的鉴定分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统和方法。本发明通过比较待检测样本和正常训练集样本在各个靶向捕获区间的归一化覆盖水平,实现从血浆游离DNA中鉴定出低浓度ctDNA(0.1%-10%)的基因拷贝数。
为实现上述目的,所采取的技术方案:一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统,包括:
比对模块,用于将K个正常人样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到DNA序列在基因组上的位置信息;用于将待检测样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到DNA序列在基因组上的位置信息;
计算模块,用于计算每个正常人样本捕获区间的平均测序深度Xi,其中i=1,2,3,...,K;计算每个正常人样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xij,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;并对正常人样本i的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度Xi进行归一化处理,得到Aij=xij/Xi,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;对每个捕获区间Aij采用Z-score方法进行异常值的剔除,|Z-score|>3则表示异常;计算正常人样本每个捕获区间的基线值Cj=mean(Aij)和标准差σj=sd(Aij)其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;mean和sd分别表示计算平均值和标准差的方法;计算待检测样本捕获区间的平均测序深度X;计算待检测样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xj,其中j=1,2,3,...,N,并对待检测样本的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度X进行归一化处理,得到Tj=xj/X,其中j=1,2,3,...,N;计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数:Nj=2*Tj/Cj,其中j=1,2,3,...,N;计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数与正常人相应区间基因拷贝数差异显著性检验p-value值:Pj=2*pnorm(-1*|(Tj-Cj)/σj|),其中j=1,2,3,...,N,pnorm为正太分布函数;
输出模块,用于输出待检测样本的各个捕获区间的基因组位置信息、基因信息、基因拷贝数、p-value值以及待检测样本的各个捕获区间是否发生基因拷贝数变异的结果,当满足以下两个条件时:1)Nj>2+1.96σj或者Nj<2-1.96σj;2)Pj<6.33e-05,则认为该捕获区间发生了基因拷贝数变异。
本发明提供了一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的方法,包括以下步骤:
将K个正常人样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算总捕获区间的平均测序深度Xi,其中i=1,2,3,...,K;计算每个样本的N个连续捕获间的平均测序深度xij,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N,并对正常人样本i的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度Xi进行归一化处理,得到Aij=xij/Xi,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;对每个捕获区间Aij采用Z-score方法进行异常值的剔除,|Z-score|>3则表示异常;计算正常人样本每个捕获区间的基线值Cj=mean(Aij)和标准差σj=sd(Aij),其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;mean和sd分别表示计算平均值和标准差的方法;
将待检测样本测序得到的序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算捕获区间的平均测序深度X;计算待检测样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xj,其中j=1,2,3,...,N,并对待检测样本的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度X进行归一化处理,得到Tj=xj/X,其中j=1,2,3,...,N;
计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数:Nj=2*Tj/Cj(j=1,2,3,...,N);
计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数与正常人相应区间基因拷贝数差异显著性检验p-value值:Pj=2*pnorm(-1*|(Tj-Cj)/σj|),其中j=1,2,3,...,N;其中pnorm为正太分布函数;
进行基因拷贝数发生变异的判断,当满足以下两个条件时:1)Nj>2+1.96σj或者Nj<2-1.96σj;2)Pj<6.33e-05,则认为该捕获区间发生了基因拷贝数变异。
本发明的有益效果在于:
1、本发明通过大量的正常训练集构建稳定的正常人背景基线作为对照,对拷贝数异常的样本数据更为敏感,能够检测出低浓度(<1%)的基因拷贝数变异,既适用于血液cfDNA样本也可以对组织DNA样本的基因拷贝数进行鉴定。
2、本发明通过采用整体捕获区域的平均测序深度对每一个捕获区间的平均深度进行归一化处理,消除因实验操作误差造成的捕获效率的变化对基因拷贝数鉴定的影响。而传统的归一化方法采用的是区间reads数与所有测序reads数的比值作为每一区间的归一化值,传统方法没能消除不同实验间捕获效率不一致对结果的影响。
3、本发明通过构建正常训练集的方法,能够消除样本内每个捕获区间之间因GC含量、探针浓度等原因造成的各个区间之间的捕获效率不一致的问题,降低假阳性率。而传统的方法是采用内参基因来计算各个捕获区间的拷贝数,但该拷贝数变异引起的原因也有可能是捕获效率的差别照成的,而本发明的方法较好的解决了这个问题。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
目前,由于血浆中带有基因拷贝数变异的ctDNA的浓度较低,通常采用基于第二代DNA测序技术的靶向捕获测序方法,对肿瘤多个DNA变异热点区域进行深度测序。其中由于各个捕获区域的GC含量和捕获探针浓度差异,导致测序片段在各个捕获区间的捕获效率存在差异,所以需要大量正常的对照样本构建每个区间的基线值。
首先:通过对大量正常人的cfDNA进行变异热点区域(如FGFR1和MET基因在肺癌病人中拷贝数增加的发生率分别在20%和2-4%)深度测序,构建拷贝数正常水平的基线值。
1.1、将K(K≥40)个正常人样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算总捕获区间的平均测序覆盖深度Xi(i=1,2,3,...,K)。
1.2、计算每个样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xij(i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N),并对样本i的各个捕获区间采用该样本总体的平均测序深度Xi进行归一化处理,得到Aij=xij/Xi(i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N)。
1.3、对每个捕获区间Aij(i=1,2,3,...,K)采用Z-score方法进行异常值的剔除(|Z-score|>3则表示异常)。
1.4、计算得到正常人样本每个捕获区间的基线值Cj=mean(Aij)和标准差σj=sd(Aij)(i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N)。mean和sd分别表示计算平均值和标准差的方法。
其次:对待检测样本进行处理分析。
2.1、将待检测样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算捕获区间的平均测序深度X。
2.2、计算样本的N个连续捕获间的平均测序深度xj(j=1,2,3,...,N),并对待检样本的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度X进行归一化处理,得到Tj=xj/X(j=1,2,3,...,N)。
最后:计算待检测样本的每个捕获区间的基因拷贝数
3.1、计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数:Nj=2*Tj/Cj(j=1,2,3,...,N)。
3.2、计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数与正常人相应区间基因拷贝数差异显著性检验p-value值:Pj=2*pnorm(-1*|(Tj-Cj)/σj|)(j=1,2,3,...,N),其中pnorm为正太分布函数。
3.3、进行基因拷贝数发生变异的判断,当满足以下两个条件:1)Nj>2+1.96σj或者Nj<2-1.96σj;2)Pj<6.33e-05,则认为该捕获区域发生了基因拷贝数变异。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的系统,其特征在于,包括:
比对模块,用于将K个正常人样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到DNA序列在基因组上的位置信息;用于将待检测样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到DNA序列在基因组上的位置信息;
计算模块,用于计算每个正常人样本捕获区间的平均测序深度Xi,其中i=1,2,3,...,K;计算每个正常人样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xij,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;并对正常人样本i的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度Xi进行归一化处理,得到Aij=xij/Xi,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;对每个捕获区间Aij采用Z-score方法进行异常值的剔除,|Z-score|>3则表示异常;计算正常人样本每个捕获区间的基线值Cj=mean(Aij)和标准差σj=sd(Aij)其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;mean和sd分别表示计算平均值和标准差的方法;计算待检测样本捕获区间的平均测序深度X;计算待检测样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xj,其中j=1,2,3,...,N,并对待检测样本的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度X进行归一化处理,得到Tj=xj/X,其中j=1,2,3,...,N;计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数:Nj=2*Tj/Cj,其中j=1,2,3,...,N;计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数与正常人相应区间基因拷贝数差异显著性检验p-value值:Pj=2*pnorm(-1*|(Tj-Cj)/σj|),其中j=1,2,3,...,N,pnorm为正太分布函数;
输出模块,用于输出待检测样本的各个捕获区间的基因组位置信息、基因信息、基因拷贝数、p-value值以及待检测样本的各个捕获区间是否发生基因拷贝数变异的结果,当满足以下两个条件时:1)Nj>2+1.96σj或者Nj<2-1.96σj;2)Pj<6.33e-05,则认为该捕获区间发生了基因拷贝数变异。
2.一种检测细胞游离肿瘤基因拷贝数变异的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将K个正常人样本测序得到的DNA序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算总捕获区间的平均测序深度Xi,其中i=1,2,3,...,K;计算每个样本的N个连续捕获间的平均测序深度xij,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N,并对正常人样本i的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度Xi进行归一化处理,得到Aij=xij/Xi,其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;对每个捕获区间Aij采用Z-score方法进行异常值的剔除,|Z-score|>3则表示异常;计算正常人样本每个捕获区间的基线值Cj=mean(Aij)和标准差σj=sd(Aij),其中i=1,2,3,...,K;j=1,2,3,...,N;mean和sd分别表示计算平均值和标准差的方法;
将待检测样本测序得到的序列比对到人类参考基因组,得到各序列在基因组上的位置信息,并计算捕获区间的平均测序深度X;计算待检测样本的N个连续捕获区间的平均测序深度xj,其中j=1,2,3,...,N,并对待检测样本的各个捕获区间采用该样本总体的平均深度X进行归一化处理,得到Tj=xj/X,其中j=1,2,3,...,N;
计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数:Nj=2*Tj/Cj(j=1,2,3,...,N);
计算待检测样本每个捕获区间的基因拷贝数与正常人相应区间基因拷贝数差异显著性检验p-value值:Pj=2*pnorm(-1*|(Tj-Cj)/σj|),其中j=1,2,3,...,N;其中pnorm为正太分布函数;
进行基因拷贝数发生变异的判断,当满足以下两个条件时:1)Nj>2+1.96σj或者Nj<2-1.96σj;2)Pj<6.33e-05,则认为该捕获区间发生了基因拷贝数变异。
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