CN111180010B - 肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置。所述方法包括：将取自同一肿瘤患者的肿瘤体细胞样本和白细胞样本进行测序，将测序结果与参考基因组序列进行比对，生成相应的bam文件；去除bam文件中PCR扩增导致的偏差，得到修正的bam文件；将修正的肿瘤体细胞样本bam文件与修正的白细胞样本bam文件进行对比，生成肿瘤体细胞样本全部变异检测信息的vcf文件，并对vcf文件进行注释；根据预设的过滤条件对肿瘤体细胞样本的变异检测信息进行过滤，得到真实的肿瘤体细胞突变位点信息结果。本方法实现了过滤一步操作，保证过滤的准确性，可快速获取肿瘤体细胞突变位点信息，结果真实可靠，为肿瘤患者的精准治疗提供重要依据。

Description

肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置

技术领域

本发明涉及生物信息学，具体地说，涉及肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置。

背景技术

体细胞突变指的是除性细胞外的体细胞发生的突变，一般不会遗传给后代。基因组的不稳定性，会促进细胞中体细胞突变的积累，某些突变会进一步驱动癌症的发生。检测肿瘤细胞的体细胞突变、尤其是肿瘤的驱动突变，是解析肿瘤发生和发展的重要手段，同时可以为肿瘤患者的精准治疗提供重要依据。

目前，寻找肿瘤体细胞突变的常用软件如Varscan、GATK、SomaticSniper等软件，生成的vcf文件中，都混有大量的假阳性突变，如何从原始vcf文件中将假阳性位点过滤掉，一直是生物信息学科研人员需要面对的挑战。

针对肿瘤的体细胞突变的过滤问题，尚无令人满意、被广泛认可的过滤软件可以一步实现这个功能。目前研究者大多根据位点的特定信息，如位点的突变频率、reads数、链偏、碱基的平均质量等，根据经验自行编写程序甚至人工对位点进行过滤，并没有全面考虑待检测位点与周围位点的情况、所在reads碱基平均错误率、突变碱基在reads上的平均距离、复杂突变、位点人群频率等情况，不能实现过滤一步操作，难以保证过滤的准确性。并且，当样本测序质量较差时，软件运行速度缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置，可实现一步到位完成过滤。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种肿瘤体细胞突变位点检测方法，包括以下步骤：

S1、将取自同一肿瘤患者的肿瘤体细胞样本和白细胞样本分别进行测序，将测序得到的fastq文件与参考基因组序列进行比对，分别对应生成肿瘤体细胞样本bam文件和白细胞样本bam文件；

S2、利用软件Picard，分别去除肿瘤体细胞样本bam文件和白细胞样本bam文件中PCR扩增导致的冗余序列，再利用Samtools，保留比对到唯一位置的reads，得到修正的肿瘤体细胞样本bam文件和修正的白细胞样本bam文件；

S3、利用Samtools mpileup和Varscan，用白细胞的数据作为对照，分别获得肿瘤体细胞样本单碱基变异和插入缺失的vcf文件，并用annovar对vcf文件进行注释；

S4、根据预设的过滤条件对肿瘤体细胞样本的变异检测信息进行过滤，得到真实的肿瘤体细胞突变位点信息结果。

本发明中，预设的过滤条件为根据位点的突变频率、reads数、链偏、碱基的平均质量等，以及待测位点与周围位点的情况、待测位点所在reads碱基平均错误率、突变碱基在reads上的平均距离、复杂突变、位点人群频率等情况进行过滤。

预设的过滤条件可以按如下步骤进行：

A、第一轮过滤

A1、保留vcf文件中含有SOMATIC和PASS标签的变异位点，同时读取上述变异位点在白细胞样本中的变异频率，只保留白细胞样本中变异频率＜1％的位点；

A2、读取位点的refgene注释信息，只保留位于外显子和剪切区域的单碱基变异、只保留位于外显子区域的插入缺失变异；

A3、读取vcf文件中每个位点的DP4信息，只保留变异位点所在reads数>8的位点；

A4、读取vcf文件中每个位点的DP4信息，并计算链偏，去除链偏＜10％或＞90％且集中在正链的位点；

A5、去除同义突变；

A6、根据千人基因组、exac03、esp6500siv2数据库注释的结果，去除人群频率＞0.5％的位点；

A7、对于插入缺失突变，根据插入和缺失的碱基长度，从参考基因组序列中截取该位置前后4倍于该插入缺失碱基长度的序列，与插入缺失碱基进行匹配，将匹配＞4次(即插入缺失位于重复区域)的位点过滤掉；

B、第二轮过滤：经过第一轮过滤所得位点，将位点坐标输出到bed中，利用bam-readcount，读取这些位点的信息，包括位点所在reads上的相对位置、距reads结束的相对位置、突变碱基平均质量值、突变碱基所在reads的碱基平均错误率；

对于插入缺失突变：

B1、如果插入缺失碱基所在reads上的相对位置＜0.3，则过滤掉；

B2、检测插入缺失碱基所在外显子是否含有复杂突变(如果包含复杂突变，保留复杂突变，去掉单一的插入缺失)；

对于单碱基变异位点：

B3、过滤掉突变碱基平均质量值<25的位点；

B4、过滤掉突变位点所在reads上的相对位置<0.3的位点；

B5、将突变位点距reads结束的相对位置<0.3以及突变位点距reads结束的相对位置>0.7的过滤掉；

B6、将突变碱基所在reads的碱基平均错误率＞0.1的过滤掉(如突变碱基所在外显子含有复杂突变，则该条过滤条件忽略)；

C、第三轮过滤：对第二轮过滤所得单碱基变异位点做进一步过滤；

利用bam-readcount读取突变位点前后20～30个碱基(优选20个碱基)的情况，如果位点周围有超过2个、碱基平均质量值＞20、变异频率大于1/2待过滤变异位点、且频率小于30％(多态位点不算做环境噪音)，则过滤掉；

D、第四轮过滤：对第三轮过滤所得单碱基变异位点进行最后过滤；

利用Samtools读取修正的肿瘤体细胞样本bam文件中覆盖到这些单碱基变异位点的reads，计算携带变异位点的reads数，计算该位点距离reads头尾的距离，如果距离相同的reads数大于携带该突变碱基reads数的30％，则过滤掉(防止测序过程中，某个cycle异常导致假阳性)；将剩余的位点输出，即为真实的肿瘤体细胞突变位点。

优选地，所述参考基因组序列为人类基因组hg19。

前述的方法，步骤S1中采用二代及二代以上测序技术进行测序。

前述的方法，步骤S3包括：利用annovar软件，基于refgene、千人基因组(1000g)、exac03、esp6500siv2、cosmic等数据库分别对单碱基变异位点和插入缺失位点的vcf文件进行注释。

本发明中，所有过滤掉的位点都会单输出到一个文件中，并注明该位点被过滤掉的原因，使用方便。

第二方面，本发明提供用于实现上述检测方法的肿瘤体细胞突变位点检测装置，包括：

序列比对模块，用于将肿瘤体细胞样本和白细胞样本测序得到的reads结果分别与参考基因组序列进行比对，并将比对结果对应生成各自样本的bam文件；

去除冗余模块：去除bam文件中由于PCR扩增造成的冗余序列；

查找变异模块：利用软件Samtools和Varscan，利用白细胞数据作为对照，获得肿瘤组织中的体细胞变异的vcf文件；

注释模块：利用annovar软件，对肿瘤组织的vcf文件进行注释；

数据过滤模块，用于对肿瘤体细胞样本的变异检测信息进行过滤，获取真实的肿瘤体细胞突变位点信息并输出结果。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明全面考虑了二代测序数据中，可能造成变异位点假阳性的情况；

(二)本发明将待测位点周围环境纳入过滤考量的范畴。

(三)本发明将位点所在reads的相对位置考虑进来，可有效避免了测序过程中PCR造成的假阳性。

(四)本发明将所有过滤条件集成于同一装置中，方便操作者使用。

(五)利用本发明提供的肿瘤体细胞突变位点检测方法及其装置，实现了过滤一步操作，保证过滤的准确性，可快速获取肿瘤体细胞突变位点信息，结果真实可靠，为肿瘤患者的精准治疗提供重要依据。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1肿瘤体细胞突变位点检测方法

1、通过DNA提取、探针捕获、二代测序技术获得肿瘤组织和对应白细胞的测序文件；

2、将测序得到的序列与人类基因组hg19进行比对获得bam文件，利用Picard和Samtools去除比对到的重复序列和比对到多个位置上的序列；

3、利用Samtools mpileup和Varscan，以白细胞作为对照，分别获得肿瘤组织的单碱基变异和碱基插入缺失的vcf文件；

4、利用annovar软件，用refgene、千人基因组(1000g)、exac03、esp6500siv2、cosmic数据库分别对单碱基变异和插入缺失的vcf文件进行注释，得到注释后的vcf文件；

5、过滤：

步骤一：

5.1、保留vcf文件中含有SOMATIC和PASS标签的变异位点，同时读取位点在白细胞中的变异频率，只保留白细胞中变异频率小于1％的位点；

5.2、读取位点的refgene注释信息，只保留位于外显子和剪切区域的单碱基变异、只保留位于外显子区域的插入缺失变异；

5.3、读取vcf中每个位点的DP4信息，只保留支持变异位点reads数>8的位点；

5.4、读取vcf中每个位点的DP4信息，并计算链偏，去除链偏小于10％或大于90％集中在正链的位点；

5.5、去除同义突变；

5.6、利用千人基因组、exac03、esp6500siv2数据库注释的结果，去除人群频率大于0.5％的位点；

5.7、插入缺失，根据插入和缺失的碱基长度，从参考基因组截取该位置前后4倍碱基长度的序列，和插入缺失碱基进行匹配，将匹配大于4次(即插入缺失位于重复区域)的位点过滤掉；

步骤二：

将经过步骤一过滤的位点，位点坐标输出到bed中，利用bam-readcount，读取这些位点的信息，包括该位点位于reads的平均相对位置、据reads结束相对位置、突变碱基平均质量值、突变碱基所在reads的碱基平均错误率；

首先判断经过步骤一过滤掉的插入缺失的位点：

5.8、插入缺失所在reads的相对位置如小于0.3，则过滤掉；

5.9、检测插入缺失所在外显子是否含有复杂突变(如果包含复杂突变，保留复杂突变，去掉单一的插入缺失)；

继续判断经过步骤一的过滤掉的单碱基变异位点：

5.10、过滤掉突变碱基平均质量值<25的位点；

5.11、过滤掉突变碱基在reads上相对位置<0.3的位点；

5.12、将突变位点距离reads结束的相对距离<0.3和>0.7的过滤掉；

5.13、将突变碱基所在reads平均错误率大于0.1的过滤掉(如突变碱基所在外显子含有复杂突变，则该条过滤条件忽略)；

步骤三：

将经过步骤二过滤的单碱基变异位点，进行下一步过滤：

5.14、利用bam-readcount，将突变位点前后20碱基的情况读取，如果位点周围有超过2个、质量大于20、且变异频率大于1/2待过滤变异位点、且频率小于30％(多态位点不算做环境噪音)，则过滤掉；

步骤四：

将经过步骤三过滤的单碱基变异位点，进行下一步过滤：

5.15、利用Samtools，将bam中覆盖到该位点的reads读取，计算携带该变异位点的reads，该位点距离reads开始和结束的距离，如果距离相同的reads大于携带该突变碱基reads的30％，则过滤掉(防止测序过程中，某个cycle异常导致假阳性)。

步骤五：

将所有剩余位点输出，即为最终检出真实的肿瘤体细胞突变位点。

实施例2肿瘤体细胞突变位点检测方法的应用实例

将来自于肿瘤患者肺癌患者新鲜穿刺组织的肿瘤组织作为样本，并取白细胞作为对照。采用探针捕获、进行二代测序。组织平均深度6000×，白细胞平均深度500×，Samtools Mpileup->Varscan(查找变异的软件)，共检测出5475个单碱基变异位点，940个碱基的插入缺失，按照实施例1的方法进行过滤，保留出了1个复杂突变、3个单碱基变异、利用Genome Browser检查，确定均为真实的突变，过滤掉的位点经过Genome Browser检查，均为假阳性，证明该过滤方法具有良好效能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.肿瘤体细胞突变位点检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将取自同一肿瘤患者的肿瘤体细胞样本和白细胞样本分别进行测序，将测序得到的fastq文件与参考基因组序列进行比对，分别对应生成肿瘤体细胞样本bam文件和白细胞样本bam文件；

S2、利用软件Picard，分别去除肿瘤体细胞样本bam文件和白细胞样本bam文件中PCR扩增导致的冗余序列，再利用Samtools，保留比对到唯一位置的reads，得到修正的肿瘤体细胞样本bam文件和修正的白细胞样本bam文件；

S3、利用Samtools mpileup和Varscan，用白细胞的数据作为对照，分别获得肿瘤体细胞样本单碱基变异和插入缺失的vcf文件，并用annovar对vcf文件进行注释；

S4、根据预设的过滤条件对肿瘤体细胞样本的变异检测信息进行过滤，得到真实的肿瘤体细胞突变位点信息结果；

预设的过滤条件按如下步骤进行：

A、第一轮过滤

A1、保留vcf文件中含有SOMATIC和PASS标签的变异位点，同时读取上述变异位点在白细胞样本中的变异频率，只保留白细胞样本中变异频率＜1％的位点；

A2、读取位点的refgene注释信息，只保留位于外显子和剪切区域的单碱基变异、只保留位于外显子区域的插入缺失变异；

A3、读取vcf文件中每个位点的DP4信息，只保留变异位点所在reads数>8的位点；

A4、读取vcf文件中每个位点的DP4信息，并计算链偏，去除链偏＜10％或＞90％且集中在正链的位点；

A5、去除同义突变；

A6、根据千人基因组、exac03、esp6500siv2数据库注释的结果，去除人群频率＞0.5％的位点；

A7、对于插入缺失突变，根据插入和缺失的碱基长度，从参考基因组序列中截取该位置前后4倍于该插入缺失碱基长度的序列，与插入缺失碱基进行匹配，

将匹配＞4次的位点过滤掉；

B、第二轮过滤：经过第一轮过滤所得位点，将位点坐标输出到bed中，利用bam-readcount，读取这些位点的信息，包括位点所在reads上的相对位置、距reads结束的相对位置、突变碱基平均质量值、突变碱基所在reads的碱基平均错误率；

对于插入缺失突变：

B1、如果插入缺失碱基所在reads上的相对位置＜0.3，则过滤掉；

B2、检测插入缺失碱基所在外显子是否含有复杂突变；

对于单碱基变异位点：

B3、过滤掉突变碱基平均质量值<25的位点；

B4、过滤掉突变位点所在reads上的相对位置<0.3的位点；

B5、将突变位点距reads结束的相对位置<0.3以及突变位点距reads结束的相对位置>0.7的过滤掉；

B6、将突变碱基所在reads的碱基平均错误率＞0.1的过滤掉；

C、第三轮过滤：对第二轮过滤所得单碱基变异位点做进一步过滤；

利用bam-readcount读取突变位点前后20～30个碱基的情况，如果位点周围有超过2个、碱基平均质量值＞20、变异频率大于1/2待过滤变异位点、且频率小于30％，则过滤掉；

D、第四轮过滤：对第三轮过滤所得单碱基变异位点进行最后过滤；

利用Samtools读取修正的肿瘤体细胞样本bam文件中覆盖到这些单碱基变异位点的reads，计算携带变异位点的reads数，计算该位点距离reads头尾的距离，如果距离相同的reads数大于携带该突变碱基reads数的30％，则过滤掉；将剩余的位点输出，即为真实的肿瘤体细胞突变位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预设的过滤条件为根据位点的突变频率、reads数、链偏、碱基的平均质量、待测位点与周围位点的情况、待测位点所在reads碱基平均错误率、突变碱基在reads上的平均距离、复杂突变、位点人群频率情况进行过滤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述参考基因组序列为人类基因组hg19。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中采用二代及二代以上测序技术进行测序。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3包括：利用annovar软件，基于refgene、千人基因组、exac03、esp6500siv2、cosmic数据库分别对单碱基变异位点和插入缺失位点的vcf文件进行注释。

6.用于实现权利要求1-5任一项所述方法的肿瘤体细胞突变位点检测装置，其特征在于，包括：

序列比对模块，用于将肿瘤体细胞样本和白细胞样本测序得到的reads结果分别与参考基因组序列进行比对，并将比对结果对应生成各自样本的bam文件；

去除冗余模块：去除bam文件中由于PCR扩增造成的冗余序列；

查找变异模块：利用软件Samtools和Varscan，利用白细胞数据作为对照，获得肿瘤组织中的体细胞变异的vcf文件；

注释模块：利用annovar软件，对肿瘤组织的vcf文件进行注释；

数据过滤模块，用于对肿瘤体细胞样本的变异检测信息进行过滤，获取真实的肿瘤体细胞突变位点信息并输出结果。