CN107391965A - 一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，包括如下步骤：(1)质量控制步骤；(2)序列对比步骤；(3)变异检测步骤；(4)变异注释步骤；(5)结果报告步骤。本发明与现有技术相比，具有如下优点：(1)检测结果的可靠性。(2)检测内容的多样化。(3)检测方法的灵活性。(4)数据结果的可视化。

Description

一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法。本发明主要分析具有正常组织和肿瘤组织配对的外显子测序样本数据。

背景技术

我国是一个肺癌的高发国家，目前肺癌特别是非小细胞肺癌已证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关,但是目前的主流分析程序中只能针对其中的单核酸突变、基因融合或者扩增中的一种进行分析，且现有的分析方法中仍然存在一定的假阳性和假阴性的问题，这势必为后期临床为肺癌患者的靶向治疗用药造成困扰，影响患者的治疗效果。因此本方法拟通过更加严格、更加全面的分析方法实现对肺癌组织的各种类型的体细胞突变进行检测，以期为肺癌患者的靶向治疗用药提供更加准确的指导。

现有分析方法存在以下几点问题：

(1)检测结果的可靠性：由于不同方法的过滤和统计方法的不同，现有的分析方法仍然存在一定的假阳性和假阴性问题。

(2)检测指标单一：现有的分析方法中大多只能检测单核苷酸突变(SNP),插入缺失(Indel)，还有一些只能检测基因融合(Gene Fusion)或者拷贝数变异(CNV)。

(3)报告结果单一:现有分析方法中，结果中只有一些简单的图表报告，还有很多数据信息没有有效的呈现。且现有的图表在可视化、形象化角度来说还可以进一步提升。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术所存在的不足而提供一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，包括如下步骤：

(1)质量控制步骤；

(2)序列对比步骤；

(3)变异检测步骤；

(4)变异注释步骤；

(5)结果报告步骤。

在本发明的一个优选实施例中，所述质量控制步骤(1)具体是：

(1.1)利用FastQC查看测序质量结果，查看序列测序得分值分布、GC分布和重复率；统计所有序列的总Total Reads，Total bases、Q20、Q30、GC含量、N字符的数量及相关比例；

(1.2)去除序列中含有的接头序列；

(1.3)对序列首尾的index或者测序质量比较差的reads进行trimming；

(1.4)利用滑动窗口，根据得分值对低质量的Reads进行过滤，如去除N或者低得分值的序列。

在本发明的一个优选实施例中，所述序列对比步骤具体是：

(2.1)通过bwtsw算法对参考基因组构建比对索引；

(2.2)通过BWA-MEM算法将目标序列比对到基因组；

(2.3)利用picard里面的MarkDuplicates去除由于PCR引入的重复序列,并利用samtools提取唯一比对上参考基因组的序列；利用GATK-RealignerTargetCreator来确定在INDEL附近需要进行重比对的区域，利用IndelRealigner在确定的区域内进行重新比对；

(2.4)对(2.3)步骤产生的比对文件的碱基质量进行重新矫正。

在本发明的一个优选实施例中，所述变异检测步骤具体是：

(3.1)本发明步骤通过采用启发式算法的varscan-somatic程序对样本进行单核苷酸突变检测。

(3.2)本发明步骤通过基于de Bruijn graph方法的Scaple程序，对序列区域进行微组装以更加高效的检测目标区域的插入缺失变异。

(3.3)本发明步骤通过Varscan的copynumber、copyCaller程序根据目标区域的测序深度差异，对样本进行拷贝数变异检测；

(3.4)本发明步骤通过factera程序根据不一致的reads clusters对样本进行基因融合检测。

在本发明的一个优选实施例中，所述变异注释步骤具体是：

(4.1)该发明步骤主要进行位置注释，确定变异位点在基因组中的相应位置，并且分析变异位点是否会造成氨基酸改变，编码蛋白的改变。

(4.2)发明步骤主要通过和目前通用的变异数据库进行比较，如和dbSNP、esp6500、exac03等数据库的变异位点进行比较，据此获得相关群体变异频率和变异位点号。

(4.3)该发明步骤主要通过和相关疾病数据库如clinvar，dbnsfp进行比对获得相关变异位点的致病可能性。

在本发明的一个优选实施例中，所述结果报告分析步骤具体是：

(5.1)对测序数据比对结果进行统计，并输出图表；

(5.2)对肺癌突变热点基因的覆盖度进行统计分析，并输出图表；

(5.3)对所检测的变异位点进行统计分析，并输出图表。

由于采用了如上的技术方案，本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)检测结果的可靠性：首先本方法就对照样本和检测样本的测序数据进行了严格的质控，分析过程中对两者的测序深度进行过滤，并对不同的检测类型进行不同条件的过滤和统计检验，使得分析结果更加准确可靠。

(2)检测内容的多样化：本方法除检测常规的单核苷酸突变(SNP),插入缺失(Indel)外还可以检测基因融合(Gene Fusion)、拷贝数变异(CNV)。

(3)检测方法的灵活性：本方法既可以实现一键式分析，只需要输入数据路径便可以实现全部分析，也可以根据需要进行模块化选择分析，使得分析更具个性化。用户可以根据需要增加或者删减需要分析的基因，也可以按照默认的进行分析，使得分析具有很强的灵活性。

(4)数据结果的可视化:本软件分析结果中除了提供有效的数据表格文件外，还生成了形象直观的信息图，使得更多的数据信息得以展示，也使得结果一目了然。

附图说明

图1本发明分析流程示意图。

图2本发明目标基因测序深度覆盖示例图。

图3本发明目标区域测序深度分布示例图。

图4本发明SNV位点查看示例图。

图5本发明CNV分布结果示例图。

具体实施方式

为了实现本发明目的，本发明包括五大主要步骤，(1)数据质控；(2)序列比对；(3)变异检测；(4)变异注释；(5)统计报告。如图1所示，具体步骤和方法如下：

(1)数据质控步骤

(1.1)首先通过FastQC初步查看测序数据的：碱基质量、GC含量、序列长度分布、序列重复水平等；然后利用perl语言快速、高效的计算测序数据的一系列质量指标，包括总总碱基数目，reads数目，序列长度，Q20、Q30、GC含量、N数量及其相关百分比。

(1.2)本步骤采用AdapterRemoval去除序列两端含有的接头序列，此步骤能有效的提高有效数据，减少后续比对误差。

(1.3)本步骤引入C语言编译程序Seqtk，对序列首尾测序质量比较差的序列进行剪切，相对于传统的剪切程序更加快速、高效。

(1.4)本步骤利用sickle，根据滑动窗口序列测序平均得分值对低于20的序列进行过滤，本步骤可以有效的去除含有连续多个N或者连续测序得分值低的序列。本步骤对测序长度没有局限性，将会根据测序序列的长度智能选取窗口大小，使得实际分析时候更加方便、准确。

(2)序列比对步骤

(2.1)构建索引：在进行比对之前利用samtools和bwtsw算法对参考基因组构建比对索引。

(2.2)序列比对：本步骤通过BWA-MEM算法将目标序列比对到人类基因组，获得sam格式比对结果文件，进行后续分析。

(2.3)优化比对：由于sam格式比较大，会占用较大存储空间和降低后续程序运行速度，因此本步骤利用picard程序将sam格式文件转换为较小的bam文件，然后进行重新排序、构建索引用于进行后续分析。为了进一步的去除PCR引入的重复序列，本步骤利用picard里面的MarkDuplicates对重复序列进行了标记和删除,并利用samtools提取唯一比对上参考基因组的序列，经过以上步骤的分析处理，将获得高质量的比对结果。由于在插入缺失(indel)序列附近出现碱基错配的概率很大，这些错配的碱基很容易被误判为SNP。为了减少由于indel而导致的假阳性SNP,本发明步骤采用GATK的Realigner-TargetCreator程序在INDEL附近寻找需要进行重新比对的区域，利用IndelRealigner在上述确定的区域内重新比对序列。

(2.4)质量矫正：在测序过程中，reads末端碱基的错误率较起始部位更高。另外，在分析过程中一般保留reads碱基质量值在Q20以上的碱基，这些碱基的错误率为1％，会对后续的变异检测结果的可靠性造成一定的影响。再者，一般测序结果中TG的得分值往往要高于AC，消除这种偏差能更好的提高结果的可靠性与正确性。因此本发明步骤利用GATK的BaseRecalibrator程序，结合千人基因组标准INDELs和变异位点数据库dbSNP和，对(2.3)步骤产生的比对文件的碱基质量进行了重新矫正。

(3)变异检测步骤

(3.1)本发明步骤通过采用启发式算法的varscan-somatic程序对样本进行单核苷酸突变检测。为了降低假阴性结果，本步骤对正常样本和检测样本设定每个检测位点的最小测序深度为10，只有当两个样本的相应位点测序深度都达到10时候才进行分析。

(3.2)为了提高indel检测的准确性，本发明步骤使用了scaple对正常样本和肿瘤样本进行插入缺失检测。该程序基于de Bruijn graph方法，对序列区域进行微组装的方法更加高效的检测目标区域的变异。同时采用了可以自主调整的k-mer策略对复杂重复区域的变异进行检测，提高了检测结果的特异性。

(3.3)通过varscan-copynumber程序对正常组织样本和肿瘤组织样本，根据二者在相同区域的测序深度的差异，推测肿瘤样本中的相应区域的测序深度的相对改变进行拷贝数变异检测。

(3.4)该发明步骤通过FACTERA对样本进行基因融合检测。对于配对样本比对文件，该程序首先识别出不一致的reads clusters，然后在碱基水平上识别出融合位点，最后进行数据模拟验证。

(4)变异注释步骤

(4.1)该发明步骤主要进行位置注释，确定变异位点在基因组中的相应位置，并且分析变异位点是否会造成氨基酸改变，编码蛋白的改变。

(4.2)该发明步骤主要通过和目前通用的变异数据库进行比较，如和dbSNP、esp6500、exac03等数据库的变异位点进行比较，据此获得相关群体变异频率和变异位点号。

(4.3)该发明步骤主要通过和相关疾病数据库如clinvar，dbnsfp进行比对获得相关变异位点的致病可能性。

(5)统计报告步骤

(5.1)比对统计：对比对结果进行统计。包括总比对reads数目、比对碱基数目、目标区域比对reads数目、目标区域比对碱基数目。

(5.2)覆盖度统计：对肺癌相关基因的覆盖度进行统计分析，相比于传统分析程序，本发明针对外显子测序技术，如果知道探针序列位置也可以将探针序列位置映射到基因相应位置，可以一目了然的查看探针的捕获效果，如图2所示。本发明还会给出目标区域的测序深度覆盖情况，如图3所示。本发明基因信息文件可以根据情况替换或作其它更改。

(5.3)变异统计：该步骤主要对不同的变异进行分类汇总并可视化，主要分为SNV、Indel、CNV、Fusion四大类(结果用IGV进行查看，如图4和图5所示)。

Claims (6)

1.一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)质量控制步骤；

(2)序列对比步骤；

(3)变异检测步骤；

(4)变异注释步骤；

(5)结果报告步骤。

2.如权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，所述质量控制步骤具体是：

(1.1)利用FastQC查看测序质量结果，查看序列测序得分值分布、GC分布和重复率；统计所有序列的总Total Reads，Total bases、Q20、Q30、GC含量、N字符的数量及相关比例；

(1.2)去除序列中含有的接头序列；

(1.3)对序列首尾的index或者测序质量比较差的reads进行trimming；

(1.4)利用滑动窗口，根据得分值对低质量的Reads进行过滤，如去除N或者低得分值的序列。

3.如权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，所述序列对比步骤具体是：

(2.1)通过bwtsw算法对参考基因组构建比对索引；

(2.2)通过BWA-MEM算法将目标序列比对到基因组；

(2.3)利用picard里面的MarkDuplicates去除由于PCR引入的重复序列,并利用samtools提取唯一比对上参考基因组的序列；利用GATK-RealignerTargetCreator来确定在INDEL附近需要进行重比对的区域，利用IndelRealigner在确定的区域内进行重新比对；

(2.4)对(2.3)步骤产生的比对文件的碱基质量进行重新矫正。

4.如权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，所述变异检测步骤具体是：

(3.1)本发明步骤通过采用启发式算法的varscan-somatic程序对样本进行单核苷酸突变检测。

(3.2)本发明步骤通过基于de Bruijn graph方法的Scaple程序，对序列区域进行微组装以更加高效的检测目标区域的插入缺失变异。

(3.3)本发明步骤通过Varscan的copynumber、copyCaller程序根据目标区域的测序深度差异，对样本进行拷贝数变异检测；

(3.4)本发明步骤通过factera程序根据不一致的reads clusters对样本进行基因融合检测。

5.如权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，所述变异注释步骤具体是：

(4.1)该发明步骤主要进行位置注释，确定变异位点在基因组中的相应位置，并且分析变异位点是否会造成氨基酸改变，编码蛋白的改变。

(4.2)发明步骤主要通过和目前通用的变异数据库进行比较，如和dbSNP、esp6500、exac03等数据库的变异位点进行比较，据此获得相关群体变异频率和变异位点号。

(4.3)该发明步骤主要通过和相关疾病数据库如clinvar，dbnsfp进行比对获得相关变异位点的致病可能性。

6.如权利要求1所述的一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，其特征在于，所述结果报告分析步骤具体是：

(5.1)对测序数据比对结果进行统计，并输出图表；

(5.2)对肺癌突变热点基因的覆盖度进行统计分析，并输出图表；

(5.3)对所检测的变异位点进行统计分析，并输出图表。