CN110093417B - 一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法 - Google Patents

一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法。该方法结合肿瘤单细胞的群体多态性位点信息以及基因组拷贝数变化信息分析，充分考虑到单细胞扩增技术可能引入的随机碱基替换及相应基因组扩增和测序技术可能引入的系统性偏差，提高了体细胞突变检测的准确率，对肿瘤基因组的异质性描述以及肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。

Description

一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法
技术领域
本发明涉及单细胞基因组测序、肿瘤基因组分析、单细胞突变分析和生物信息学领域，具体涉及一种检测肿瘤单细胞基因组单倍体拷贝数变异分析基因组异质性及细胞间演化关系方法。
背景技术
基因组测序技术已经被广泛应用于生命科学的基础研究以及相应的一些转化科学应用领域。目前，以solexa测序技术为主的二代短序列测序技术更展示出了它广泛的适用范围和巨大的应用前景。基于目的不同我们能够对DNA进行直接测序，从而组装新物种或者检测已有参考序列的物种基因组的改变，例如：单核苷酸多态性位点(SNP，singlenucleotide polymorphism)，短序列插入或者缺失(INDEL，insertion and deletion)，基因组结构变异(SV，structural variation)以及基因组拷贝数变化(CNV，copy numbervariation)。
癌症是一种基因组疾病。在癌症基因组研究中，我们通常会对比癌组织和正常组织之间基因组差异来探究与癌症发生、发展、迁移以及耐药有关的基因组变化，包括体细胞单核苷酸变异(sSNV)，体细胞短序列插入或者缺失(sINDEL)，体细胞基因组结构变异(sSV)以及体细胞基因组拷贝数改变(sCNA,somatic copy number alteration)。随着癌症研究的逐步深入，对于这种异质性极强的疾病，我们发现利用大量细胞(bulk)测序的技术手段无法直观地探究癌细胞异质性发生的原因。另一方面，在临床医学研究中我们经常无法获取足够量的癌细胞以获取足够量的用来测序的DNA进行研究。因此，单细胞扩增技术被引入到癌症基因组研究中。
单细胞扩增技术旨在将仅有数皮克的微量DNA通过相应的技术手段扩增到二代测序技术所需要的最低纳克水平，以达到精确地研究每个细胞中的基因组状态。目前较为广泛使用的单细胞扩增技术包含但不限于：扩增前引物延伸PCR(PEP-PCR，Primer extensionpreamplification PCR)、退变寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotide primer-PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(MALBAC，Multipe Annealing and Looping BasedAmplification Cycles)等。而无论何种单细胞扩增技术都会存在一定的等位基因丢失(ADO，Allele Drop Out)比率、等位基因扩增比例偏差、区域扩增偏好性、碱基扩增随机性及系统性错误，都对单细胞基因组分析形成了很强的限制。
在肿瘤发生发展过程中会存在广泛的异质性，而这种异质性在sSNV/sINDEL层面已经得到广泛且深入的研究。在常规大量组织测序结果中，这种异质性反映在同一病人不同样本之间特定体细胞突变的突变频率差异上。使用单细胞测序技术就可以明确地得到每个单细胞中的突变构成。但是，单细胞扩增及测序过程引入的大量随机及系统性误差严重影响到了肿瘤单细胞体细胞突变检测工作。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术缺口，提供一种对肿瘤单细胞体细胞突变检测的方法。该方法充分考虑到单细胞扩增技术可能引入的随机碱基替换及相应基因组扩增和测序技术可能引入的系统性偏差，提高体细胞突变检测的准确率，对肿瘤基因组的异质性描述以及肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。
本发明的技术方案如下：
一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法，包括以下步骤：
1)取同一病例的至少四个肿瘤单细胞，并以该病例的至少一个正常组织单细胞和正常组织大量细胞为对照样本，同时进行全基因组或者全外显子高深度测序，其中单细胞样本需要进行单细胞扩增后再测序；
2)对测序数据进行质量过滤：除进行测序数据常规质量过滤外，还要根据所使用的单细胞扩增方法进行细致的单细胞扩增引物污染去除工作(该步骤是提高单细胞测序数据比对率，提高突变检测准确率的关键步骤)，包括：(i)容忍一定比例碱基错配去除测序序列5’端单细胞扩增引物；(ii)容忍一定比例碱基错配去除3’端反向单细胞扩增引物及测序引物，同时，如果在3’末端检测到相应引物的反向序列即有相应引物污染则3’端多去除1个碱基，使较短的片段也能够得到较好的比对效果；
3)将进行质量过滤之后的序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列，其中对于全外显子高深度测序数据还需要使用突变检测软件对比对结果进一步进行indel重比对(indel realignment)和碱基质量矫正(base quality recalibration)；
4)对来自同一病例的所有肿瘤单细胞、正常组织单细胞对照及正常组织大量细胞对照的全基因组(或全外显子)高深度测序数据通过群体多态性位点检测方法(populationSNP calling method)进行SNV/INDEL突变检测；
5)根据突变检测结果对源自肿瘤单细胞的体细胞突变进行过滤，从而获得初步的sSNV/sINDEL，过滤原则是：
a.过滤掉在正常组织大量细胞测序结果中覆盖度过低的位点(去除无法确定是否为遗传
多态性的位点)；
b.过滤掉在正常组织大量细胞中有突变的位点(去除遗传多态性位点)；
c.过滤掉在正常组织单细胞中有突变的位点(去除单细胞扩增所引入的系统性偏差)；
d.根据多个肿瘤单细胞突变情况，保留在三个或者三个以上肿瘤单细胞中出现的突变位
点(如同时进行了肿瘤组织大量细胞测序，则还需保留肿瘤组织中确定的突变位点)；
6)对步骤5)的过滤结果进行位点基因功能注释和数据库注释，根据一定过滤标准过滤掉人群中广泛存在的多态性位点并且在肿瘤突变数据库中注释出高频突变位点，例如：过滤掉其中在dbSNP(单核苷酸多态性数据库)中频率大于0.5％，或者在健康人群外显子数据库ESP6500中频率大于0.5％，又或者在千人基因组数据库中频率大于0.5％的人群多态性位点；再提取出其中会影响到基因编码功能的sSNV/sINDEL；
7)对步骤6)提取出的sSNV/sINDEL再进行具体位点序列覆盖状况分析，过滤在多数样本中覆盖序列质量普遍较低，邻近区域突变异常频繁或者所有发生在序列起始位置的突变，从而得到最终的肿瘤单细胞的体细胞突变结果。
上述步骤1)中可进一步取同一病例的肿瘤组织大量细胞为对照样本进行测序，这样在进行步骤5)过滤时保留肿瘤组织中确定的突变位点。
优选的，步骤1)中使用MALBAC单细胞扩增技术进行单细胞扩增。正常组织大量细胞对照样本通常采用血液大量细胞。对于全基因组或全外显子高深度测序，每个样本测序量平均为8-10G原始数据。
优选的，上述步骤2)中所述容忍一定比例碱基错配中的一定比例为10％～15％(例如13％)。
上述步骤3)中，对于全外显子高深度测序数据，可以使用GATK软件包对比对结果进行indel局部重比和碱基质量矫正。
上述步骤5)中，过滤掉在正常组织大量细胞测序结果中覆盖深度低于10的位点，以及在正常组织大量细胞或者正常组织单细胞对照中也发生突变的位点；而保留在肿瘤组织大量细胞对照中整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2，或者至少在三个肿瘤单细胞中能够观察到突变且至少在一个肿瘤单细胞中整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2的位点。
上述步骤7)回溯到每个样本原始的bam文件中，提取覆盖相应突变位点的序列，过滤掉序列比对质量值(mapping quality)低于30的序列，以及左右各200bp的邻近区域内突变数量超过2.5％或者所有发生在序列起始位置的突变。
本发明结合肿瘤单细胞的群体多态性位点信息以及基因组拷贝数变化信息分析，进行肿瘤单细胞基因组等位基因拷贝数异常区域分析。该方法相对于单纯的基因组拷贝数变化或者体细胞突变更增加一个维度，能够对比来自同一病人的不同肿瘤单细胞之间，有基因组拷贝数异常的区间的关联关系，例如不同细胞发生缺失时缺失的是否为同一染色单体；以及发生拷贝数增加的区域中，是两条染色单体同时增加还是仅单条染色体发生异常；同一区域拷贝数在不同单细胞中差异非常大时，这种差异是何种演化形式等等。本发明为研究肿瘤基因组演化与选择有着重要的意义。
附图说明
图1.本发明检测肿瘤单细胞体细胞突变的一个实例的整体分析流程。
图2.本发明实施例中得到的某一病例样本肿瘤单细胞体细胞突变图谱。
图3.本发明实施例中所有病例单细胞所能检测到的体细胞突变与对照组织交叉验证结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的更加细致的实施描述，其中的参数以及具体实施细节用以解释本发明的可行性及实施效果，并不构成对本发明的限定。
本实施例以十例小细胞肺癌病人的循环肿瘤细胞、单白细胞、常规测序的血液大量细胞(bulk)对照以及肿瘤组织对照为样本，基于二代测序技术对肿瘤单细胞的体细胞突变进行研究。
1.样本需求及单细胞扩增及测序
样本为来自十例小细胞肺癌病例的循环肿瘤细胞(每个病例所取循环肿瘤细胞数量从4到25个不等)，对应的单白细胞(每个病例一个)，对应的血液大量细胞(每个病例一个样本)对照，对应的肿瘤组织(bulk)对照(为原发灶和/或者转移灶组织)，将其中所有单细胞使用MALBAC单细胞扩增技术进行单细胞扩增(所述循环肿瘤细胞亦可为原发灶肿瘤组织单细胞)。分别提取每个样本部分DNA进行外显子捕获，随后对外显子捕获样本使用Hiseq2500/Hiseq4000测序仪采用PE150双端测序，每个样本测序量平均为8-10G原始数据。
2.数据预处理
将测序下机的数据进行质控，单细胞数据使用cutadapter软件容忍2碱基错配去除序列头部MALBAC扩增引物及5N3T(3G)与基因组结合的引物序列，容忍2碱基错配去除尾部MALBAC扩增反向引物及结合序列。所有样本容忍2碱基错配去除序列反向illumina测序所需的adapter序列。并在被去除MALBAC引物或者illumina反向adapter序列的测序序列的3’端额外去除1bp。去除序列长度小于40bp的PE序列对(read pair)。
3.序列比对及比对质量矫正
将预处理后的序列使用BWA比对到Hg19(GRCh37)全基因组上面(基因组序列是从https://www.genome.ucsc.edu/下载的标准hg19基因组序列，只保留1-22，X，Y，M染色体)。使用samtools将比对结果根据染色体坐标顺序排序，并去除PCR重复序列以及低质量序列，以及去除chrM染色体。使用GATK软件包进行indel局部重比，以及碱基质量值矫正。
4.样本整体突变检测
使用GATK软件将来自同一病例所有样本的外显子测序数据作为输入bam files列表的形式进行群体多态性位点检测。
5.体细胞突变初步过滤
以群体多态性位点检测结果中的血液中突变情况为对照，首先过滤掉在血液中覆盖深度低于10的所有位点，随后过滤掉所有血液中也发生突变的位点(即过滤掉遗传的多态性位点，germline mutations)，过滤掉单白细胞对照中有突变的位点(过滤掉单细胞扩增可能引入的系统性误差)。保留肿瘤组织中可靠的突变(整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2)，或者在肿瘤单细胞中至少在三个肿瘤单细胞中能够观察到突变且至少在一个肿瘤单细胞中该位点为可靠覆盖突变(整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2)。
6.体细胞突变注释
使用annovar基因组突变注释软件对突变结果进行注释，并且在选项中需要包含dbSNP，千人基因组突变信息以及ESP6500健康人大规模外显子多态性位点数据库结果。注释结果中筛选出错义(missense)突变，、无义(nonsense)突变以及存在于编码区的INDEL。此外还要确保这些位点在dbSNP或者千人基因组突变或者ESP6500数据库中突变频率低于0.5％。
7.体细胞突变质量过滤
即使进行了上述过滤，对于单细胞数据来说，仍然会有很大数量的假阳性细胞突变。在此，我们通过回溯到每个样本原始的bam文件中，提取覆盖相应突变位点的序列。通过确保高质量覆盖样本中覆盖到该位点的read的比对质量均值需大于30，并且在临近左右各200bp以内不会出现超过2.5％的即10个高质量突变。
8.肿瘤单细胞的体细胞突变绘图
综上过滤后的结果即可进行每个样本内部异质性分析，以及样本之间突变数量对比。图2为样本内部突变异质性对比，其中白色表示无覆盖，灰色表示有覆盖无突变，浅蓝色表示杂合突变，深蓝色表示纯合突变。图3为不同病例中循环肿瘤单细胞中检测出的突变与对应组织结果对比结果。可以看出，使用本发明方法在循环肿瘤单细胞中检测出的突变基本上能够反应肿瘤组织的突变情况，并且一些循环肿瘤单细胞中特有低频突变可能反映了肿瘤组织演化过程中的异质性。
以上所述仅作为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之类的所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种非诊断目的的检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法，包括以下步骤：
1)取同一病例的至少四个肿瘤单细胞，并以该病例的至少一个正常组织单细胞和正常组织大量细胞以及肿瘤组织大量细胞为对照样本，同时进行全基因组或者全外显子高深度测序，其中单细胞样本需要进行单细胞扩增后再测序，使用MALBAC单细胞扩增技术进行单细胞扩增；
2)对测序数据进行质量过滤，并去除单细胞扩增引物污染，包括：(i)容忍10％～15％比例碱基错配去除测序序列5’端单细胞扩增引物；(ii)容忍10％～15％比例碱基错配去除3’端反向单细胞扩增引物及测序引物，同时，如果在3’端有相应引物污染则3’端多去除1个碱基；
3)将步骤2)处理后的序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列，其中对于全外显子高深度测序数据还需要使用GATK软件包对比对结果进一步进行indel局部重比对和碱基质量矫正；
4)通过群体多态性位点检测方法进行SNV/INDEL突变检测，其中使用GATK软件对所有样本进行群体多态性位点检测；
5)根据突变检测结果对源自肿瘤单细胞的体细胞突变进行过滤，获得初步的sSNV/sINDEL，过滤原则是：a.过滤掉在正常组织大量细胞测序结果中覆盖深度低于10的位点；b.过滤掉在正常组织大量细胞中有突变的位点；c.过滤掉在正常组织单细胞中有突变的位点；d.根据多个肿瘤单细胞突变情况，保留在肿瘤组织大量细胞对照中整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2，或者至少在三个肿瘤单细胞中能够观察到突变且至少在一个肿瘤单细胞中整体覆盖深度不小于10且突变覆盖不小于2的位点；
6)对步骤5)的过滤结果进行位点基因功能注释和数据库注释，过滤掉在单核苷酸多态性数据库中频率大于0.5％，或者在健康人群外显子数据库ESP6500中频率大于0.5％，又或者在千人基因组数据库中频率大于0.5％的人群多态性位点，从而过滤掉人群中广泛存在的多态性位点并且在肿瘤突变数据库中注释出高频突变位点，提取出其中会影响到基因编码功能的sSNV/sINDEL；
7)对步骤6)提取出的sSNV/sINDEL再进行具体位点序列覆盖状况分析，过滤在多数样本中覆盖序列质量普遍较低，邻近区域突变异常频繁或者所有发生在序列起始位置的突变，从而得到最终的肿瘤单细胞的体细胞突变结果，具体做法是：回溯到每个样本原始的bam文件中，提取覆盖相应突变位点的序列，过滤掉序列比对质量值低于30的序列，以及左右各200bp的邻近区域内突变数量超过2.5％或者所有发生在序列起始位置的突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)每个样本测序量平均为8-10G原始数据。
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