CN110016497B - 一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法 - Google Patents

一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法。对肿瘤单细胞以及多个正常组织单细胞分别进行基因组测序，与参考基因组比对，划分窗口和标准化窗口数据；通过正常单细胞对照作为去除系统性偏差的标准，获得肿瘤单细胞所有区间的基因组拷贝数。本发明方法消除了不同单细胞扩增技术引入的一些特定的系统偏差，提高肿瘤单细胞基因组拷贝数变异检测的精确度，对检测拷贝数异常相关的驱动事件以及解读肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。

Description

一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法
技术领域
本发明涉及单细胞基因组测序、肿瘤基因组分析和生物信息学领域，具体涉及一种基于二代测序技术检测肿瘤单细胞基因组拷贝数状态的方法。
背景技术
基因组测序技术已经被广泛应用于生命科学的基础研究以及相应的一些转化科学应用领域。目前，以solexa测序技术为主的二代短序列测序技术更展示出了它广泛的适用范围和巨大的应用前景。基于目的不同我们能够对DNA进行直接测序，从而组装新物种或者检测已有参考序列的物种基因组的改变，例如：单核苷酸多态性位点(SNP，singlenucleotide polymorphism)，短序列插入或者缺失(INDEL，insertionand deletion)，基因组结构变异(SV，structural variation)以及基因组拷贝数变化(CNV，copy numbervariation)。
癌症是一种基因组疾病。在癌症基因组研究中，我们通常会对比癌组织和正常组织之间基因组差异来探究与癌症发生、发展、迁移以及耐药有关的基因组变化，包括体细胞单核苷酸变异(sSNV)，体细胞短序列插入或者缺失(sINDEL)，体细胞基因组结构变异(sSV)以及体细胞基因组拷贝数改变(sCNA,somatic copy number alteration)。随着癌症研究的逐步深入，对于这种异质性极强的疾病，我们发现有时利用大量细胞(bulk)测序的技术手段无法更加直观地探究癌细胞异质性发生的原因。另一方面，在临床医学研究中我们经常无法获取足够量的癌细胞以获取足够量的用来测序的DNA进行研究。因此，单细胞扩增技术被引入到癌症基因组研究中。
单细胞扩增技术旨在将仅有数皮克的微量DNA通过相应的技术手段扩增到二代测序技术所需要的最低纳克水平，以达到精确地研究每个细胞中的基因组状态。目前较为广泛使用的单细胞扩增技术包含但不限于：扩增前引物延伸PCR(Primer extensionpreamplification PCR,PEP-PCR)、退变寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotideprimer-PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(Multipe Annealing and Looping BasedAmplification Cycles,MALBAC)等。而无论何种单细胞扩增技术都会存在一定的等位基因丢失(AlleleDropOut，ADO)比率，等位基因扩增比例偏差、区域扩增偏好性都大大限制了单细胞基因组拷贝数分析的分辨率和精确度。
现有的大量细胞(bulk)全基因组拷贝数变化分析方法并不完全适合于单细胞研究。而单细胞基因组拷贝数变化分析方法都存在着一定的问题。例如：使用动态区间窗口加上GC含量修正的方法并不能消除不同单细胞扩增技术方法引入的一些特定的偏差；而隐马尔科夫模型的单细胞基因组拷贝数分析方法经常出现过拟合(overfitting)，或者拟合程度不高的情况。
发明内容
本发明目的就是针对上述现有技术不足，提供一种针对肿瘤单细胞基因组拷贝数异常检测的方法。该方法能够提高肿瘤单细胞基因组拷贝数变异检测的精确度，对检测拷贝数异常相关的驱动事件以及解读肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。
本发明的技术方案如下：
一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
1)对肿瘤单细胞以及多个正常组织单细胞分别进行基因组测序，其中所述正常组织单细胞中包括男性样本单细胞；
2)将测序获得的基因组序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列；
3)根据参考基因组将步骤2)处理后的基因组划分为固定长度的窗口，且窗口滑动步长与窗口长度一致，统计每个窗口内落到相应区间内的序列数量；并统计所有窗口内序列总和，以之乘以一定系数作为分母标准化每个窗口内序列读数；
4)构建正常单细胞对照：取多个正常组织单细胞经过步骤1)至3)获得的数据，其中男性样本单细胞的X和Y染色体读数均乘2，而女性Y染色体噪音读数清零，计算每个区间内的读数中值，获得包含全基因组每一条染色体的单倍体全局(Global)标准曲线；
5)去除肿瘤单细胞系统性偏差：根据步骤4)获得的标准曲线对经过步骤1)至3)获得的肿瘤单细胞数据进行修正，去除系统性偏差；
6)对去除系统性偏差后的肿瘤单细胞数据进行平滑处理，确定相应区间拷贝数数值。
上述步骤1)中对单细胞样本的收集有一定的要求：在获取原发灶肿瘤单细胞或者单循环肿瘤细胞的同时，也要取得多个正常组织单细胞。其中正常组织单细胞用以构建单细胞扩增偏好对照，最初构建体系正常单细胞对照需要至少要有男性单细胞。在对照信息构建完毕以后，在获取样本时正常单细胞就不是必要的了。
随后采用单细胞扩增技术对获取的单细胞中的DNA进行扩增。对于单细胞扩增技术无过多限制，但整个体系需要统一使用同一种单细胞扩增技术，以确保扩增偏好一致。单细胞扩增方法可以采用但不限于PEP-PCR，DOP-PCR，MDA，MALBAC等。
采用基因组测序技术(如二代测序技术)进行全基因组测序。对单细胞扩增后的产物可以通过但不限于使用超声法进行破碎。破碎片段的大小可以为大于40bps(basepairs)的任意长度。测序序列长度可以为大于40bps且测序仪技术允许的任意长度。对于二代测序仪器型号无特殊要求。测序策略可以为单端测序(SE，singleend)或者双端测序(PE，pairend)。对于测序数据量，每个样本测序数据量大于100Mbps。
上述步骤2)将测序完成的基因组序列比对到参考基因组。
首先将测序仪质控合格的测序下级数据去除单细胞扩增引物、测序引物以及低质量序列，然后将序列文件使用比对软件比对到已发表或者其他类型人全基因组参考序列上。其中比对软件可以使用任何一种开源免费或者商业化收费比对软件，例如：maq,BWA,bowtie/bowtie2,stampy,SOAP/SOAP2,novoalign(收费软件)等。参考序列可以是但不限于UCSC，NCBI或Ensemble维护的hg18(GRCh36)，hg19(GRCh37)，hg20(GRCh38)或者染色体组的子集。比对后根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列，提取高质量比对序列以减少错误比对引入的误差。
上述步骤3)根据参考基因组划分窗口，标准化窗口数据。
根据参考序列染色体坐标顺序将基因组划分为固定长度的窗口，窗口长度可以为大于10K的任意长度，且窗口滑动步长与窗口长度一致。统计每个窗口内落到相应区间内的序列数量。统计所有窗口内序列总和，并以之乘以一定系数作为分母标准化每个窗口内序列读数。
上述步骤4)构建正常单细胞对照，作为去除系统性偏差的标准。
为了去除由于区间之间的GC偏好，MALBAC扩增所引入的系统性误差，我们希望使用一个误差标准用以矫正相应问题。因此我们在前述步骤获取肿瘤细胞基因组数据的同时，将多个正常组织细胞(至少两个正常组织的单细胞，其中至少有一个单细胞为男性来源；所述正常组织细胞例如血液中的白细胞)的单细胞扩增产物经过步骤1)、2)和3)后筛选出扩增质量较好的细胞数据，再通过计算每个区间内不同细胞读数中值以尽量获得消除了随机误差，能够最大限度体现系统误差的正常对照单倍体。其中，对于XY染色体需要进行相应的特殊处理。对于X染色体，来自男性样本的XY染色体需要读数加倍进行计算，而来自女性的Y染色体读数需要被忽略。由此即可获得包含全基因组每一条染色体的单倍体全局(Global)标准曲线。
上述步骤5)去除肿瘤单细胞系统性偏差。
通过步骤4)所得到的全局系统偏好标准值，在步骤5)通过任意偏好修正策略，包括但不限于每个对应窗口以单倍体标准曲线作为分母修正或者通过路易斯回归策略，修正系统偏差。修正后再通过计算整体数值分布情况确定标准二倍体基线。
上述步骤6)进行全基因组数据平滑。
使用局部平滑策略进行数值平滑，确定拷贝数一致的染色体片段，确定相应区间拷贝数数值读数，相应策略包括但不限于隐马尔科夫模型或者环状二元分割(CBS，circularbinary segment)，优选采用CBS算法获得肿瘤细胞所有区间的拷贝数结果。
本发明针对肿瘤单细胞基因组拷贝数异常状况检测的方法，构建正常单细胞对照作为去除系统性偏差的标准，相对于基于动态区间窗口进行GC偏好修正的现有方法，能够消除不同单细胞扩增技术引入的一些特定的系统偏差，提高肿瘤单细胞基因组拷贝数变异检测的精确度。进一步的，在进行全基因组数据平滑时，环状二元分割算法相对于隐马尔科夫模型，能够更加稳定的进行拷贝数数值回归，与原始数据偏差比隐马尔科夫模型更小，对于非整倍体有更加清晰的表述，在单细胞基因组拷贝数分析中效果更好。本发明方法对检测拷贝数异常相关的驱动事件以及解读肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。
附图说明
图1.本发明实施例检测肿瘤单细胞基因组拷贝数的整体分析流程。
图2.本发明实施例中测得的肿瘤细胞原始基因组拷贝数。
图3.本发明实施例中肿瘤细胞基因组拷贝数去除单细胞基因组扩增偏好后的结果。
图4.本发明实施例中肿瘤细胞基因组拷贝数片段化后结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的更加细致的实施描述，其中的参数以及具体实施细节用以解释本发明的可行性及实施效果，并不构成对本发明的限定。
本实施例以小细胞肺癌循环肿瘤细胞以及来自不同病例血液中的多个白细胞作为样本，基于二代测序技术对肿瘤单细胞的基因组拷贝数异常状态进行检测。
1.单细胞扩增及测序
以来自同一小细胞肺癌病例的4个循环肿瘤细胞以及来自八个来自不同病例单白细胞(4位男性，4位女性；正常细胞)作为样本，将所有单细胞使用MALBAC单细胞扩增技术进行单细胞扩增(所述循环肿瘤细胞亦可为原发灶肿瘤组织单细胞，白细胞亦可为活检组织临近的正常组织单细胞等)。使用Hiseq4000测序仪采用PE150双端测序，每个样本测序量平均为500M-1G原始数据。
2.全基因组比对及比对数据预处理
将测序下机的数据进行质控，使用cutadapter软件去除序列头部MALBAC扩增引物及5N3T(3G)与基因组结合的引物序列，去除尾部MALBAC扩增反向引物及结合序列，去除序列反向illumina测序所需的adapter序列。然后将序列使用BWA比对到Hg19(GRCh37)全基因组上面(基因组序列是从https://www.genome.ucsc.edu/下载的标准hg19基因组序列，只保留1-22，X，Y，M染色体)。使用samtools将比对结果根据染色体坐标顺序排序，并去除PCR重复序列以及低质量序列，并去除chrM染色体。
3.窗口化、标准化数据
将经过步骤2的数据使用samtools计算每个覆盖位点的覆盖读数，根据基因组坐标顺序将每条染色体分别依照500000(即500K)窗口区间滑动步长500K划分，统计每个区间内的总体覆盖读数加和。统计所有1-22，X，Y染色体覆盖读数加和，并以该数值除以1000000(1M)作为分母标准化该样本所有样本窗口读数。所得小细胞肺癌循环肿瘤细胞原始基因组拷贝数如图1所示，数据来自四个不同的样本。
4.构建单细胞对照
将所有病例的单白细胞对照经过1-3步骤后，分男性、女性单独进行处理，其中男性样本单细胞的X和Y染色体读数均乘2加倍，而女性Y染色体噪音读数清零。然后所有单白细胞样本常染色体以及X染色体每个区间内选取中值作为最终读数，Y染色体只选男性样本每个区间内的中值，最终形成包含1-22，X，Y染色体的单倍体读数标准偏好对照。
5.去除肿瘤细胞单细胞基因组扩增偏好
将经过1-3步骤的循环肿瘤细胞数据分别以对应单细胞对照作为分母做除法去除单细胞偏好，并计算常染色体中位数确定基因组拷贝数状态基线。以此数作为分母计算每个区间的去除偏好后的读数并乘以2(假设2为染色体基线)，所得数据如图3所示。
6.全基因组数据平滑
使用R的DNAcopy软件包，利用circularbinary segment(CBS)平滑全基因组读数，最终得到循环肿瘤细胞所有拷贝数区段结果，如图4所示。
以上所述仅作为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之类的所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测肿瘤单细胞基因组拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
1)采用同一种单细胞扩增技术对肿瘤单细胞以及多个正常组织单细胞中的DNA进行扩增，然后分别进行基因组测序，其中所述正常组织单细胞中一定包含男性样本单细胞；
2)将测序数据去除单细胞扩增引物、测序引物以及低质量序列，然后将获得的基因组序列与参考基因组比对，根据染色体坐标顺序对比对结果进行排序，并去除PCR形成的重复序列以及低质量序列，并去除chrM染色体；
3)根据参考基因组将步骤2)处理后的基因组划分为固定长度的窗口，窗口长度大于10K，且窗口滑动步长与窗口长度一致，统计每个窗口内落到相应区间内的序列数量；并统计所有窗口内序列总和，以之乘以一定系数作为分母标准化每个窗口内序列读数；
4)取多个正常组织单细胞经过步骤1)至3)获得的数据，其中男性样本单细胞的X和Y染色体读数均乘2，而女性Y染色体噪音读数清零，然后将所有单细胞样本常染色体以及X染色体每个区间内读数中值，Y染色体只选男性样本每个区间内读数中值，形成包含1-22，X，Y染色体的单倍体读数标准偏好对照，获得包含全基因组每一条染色体的单倍体全局标准曲线；
5)去除肿瘤单细胞系统性偏差：根据步骤4)获得的标准曲线对经过步骤1)至3)获得的肿瘤单细胞数据进行修正，去除系统性偏差，具体是：每个对应窗口以步骤4)获得的单倍体全局标准曲线作为分母修正或者通过路易斯回归策略修正系统偏差；修正后通过计算整体数值分布情况确定标准二倍体基线；
6)对去除系统性偏差后的肿瘤单细胞数据使用局部平滑策略进行平滑处理，确定拷贝数一致的染色体片段，确定相应区间拷贝数数值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)先采用单细胞扩增技术对获取的单细胞中的DNA进行扩增，然后进行全基因组测序，测序序列长度大于40bps。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中窗口长度为500K。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)将经过步骤1)至3)的肿瘤单细胞数据分别以步骤4)获得的对应单细胞的单倍体全局标准曲线对照作为分母做除法去除单细胞偏好，并计算常染色体中位数确定基因组拷贝数状态基线，以此数作为分母计算每个区间的去除偏好后的读数并乘以2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)使用隐马尔科夫模型或者环状二元分割算法获得肿瘤细胞所有区间的拷贝数结果。
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