CN106929529A - IL‑2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和应用 - Google Patents

IL‑2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种IL‑2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和应用，属于生物基因技术领域。本发明提供的真核表达体系同时包含IL‑2基因的核苷酸序列和IFNγ基因的核苷酸序列，采用载体来负载IL‑2基因和IFNγ基因，能够通过同一真核表达体系同时表达IL‑2蛋白以及IFNγ蛋白，可以减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源性基因序列的引入，并控制作用于病灶中IL‑2蛋白和IFNγ蛋白的比例。该真核表达体系可用于细胞的免疫功能调控和基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能对肿瘤细胞等靶细胞产生特应性治疗效应。

Description

IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种真核表达体系及其制备方法和应用，特别是涉及IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和应用。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(T Cell GrowthFactor，TCRF)。IL-2是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下，由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的在机体免疫反应中具有重要调节作用的一种细胞因子。IL-2是人体免疫调节网络中的核心物质，与其他免疫相关细胞因子有协同和拮抗作用，共同完成人体免疫机能的调节作用；其能够刺激NK、CTL、LAK等细胞的活化和增殖，也能促使T淋巴细胞、NK细胞等产生干扰素、肿瘤坏死因子等，在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等过程中发挥重要作用。在恶性肿瘤的发病过程中，存在免疫逃避导致的免疫监视功能异常。肿瘤患者体内的淋巴细胞，如NK、CTL、LAK等，不能正常发挥对肿瘤细胞的免疫杀伤效果。而前述免疫杀伤细胞的活化和增殖均是以IL-2为基础的[Dhupkar P,Gordon N.Interleukin-2:Old and NewApproaches to Enhance Immune-Therapeutic Efficacy.Adv Exp Med Biol.2017；995:33-51.]。如果能够适时提供外源IL-2，就有可能协助患者的免疫系统改善对体内肿瘤细胞的免疫杀伤功能。这就是IL-2进行肿瘤免疫治疗的免疫学基础。目前的IL-2体内注射免疫治疗方法只是非特异地提高患者体内的IL-2蛋白水平，其免疫调节作用和促肿瘤杀伤能力较弱，而且缺乏特异性调节病灶肿瘤微环境IL-2水平、促进对肿瘤细胞进行特异性免疫治疗的作用[Humrich JY,Riemekasten G.Clinical trials:The rise of IL-2 therapy-anovel biologic treatment for SLE.Nat Rev Rheumatol.2016Dec；12(12):695-696.]。
γ干扰素(IFNγ)属于II型干扰素，是一种分泌型蛋白，分泌进而去除信号肽后其分子由143个氨基酸组成，相对分子量为40kDa，以同源二聚体或四聚体的形式存在。IFNγ主要由T细胞和NK细胞产生，其基因位于人的12号染色体上。IFNγ在临床上常用于抗病毒和抗肿瘤治疗[Textor A,Listopad JJ,Wührmann LL,Perez C,Kruschinski A,Chmielewski M,Abken H,Blankenstein T,Charo J.Efficacy of CAR T-cell therapyin large tumors relies upon stromal targeting by IFNγ.Cancer Res.2014 Dec 1；74(23):6796-805.]。IFNγ的体内应用可实现对多种病毒感染的抑制，从而在免疫调控方面获得广泛的应用。同时，IFNγ在体内具有抑制肿瘤细胞生长，阻碍恶性肿瘤转移和复发的功能。临床研究结果表明，IFNγ对白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤及骨髓瘤等均可以产生明显的抑制效果。IFNγ主要通过调节免疫免疫细胞活性，促进免疫系统对原位肿瘤细胞和转移病灶中肿瘤细胞的杀伤，也可以通过直接诱导肿瘤细胞凋亡、坏死等方式直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过干扰肿瘤细胞生长周期、抑制肿瘤组织的血管生成抑制肿瘤细胞增殖。但是目前的IFNγ体内注射治疗方法只能实现患者体内IFNγ蛋白水平的非特异性提高，难以实现对肿瘤微环境中IFNγ水平的特异性高效靶向调节[Konjevic G,Radenkovic S,Srdic T,Jurisic V,Stamatovic Lj,Milovic M.Association ofdecreased NK cell activity and IFNγexpression with pSTAT dysregulation inbreast cancer patients.J BUON.2011 Apr-Jun；16(2):219-26.]。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系，该真核表达体系通过使被转染靶细胞同时表达IL-2蛋白和IFNγ蛋白实现对靶细胞特异性的基因免疫治疗，既能在病灶局部微环境提高细胞因子含量进而高效发挥免疫调节作用，又能靶向性直接影响肿瘤细胞进而产生针对靶细胞的特异性治疗效果；在实现病灶微环境及靶细胞中IL-2和IFNγ比例可控的前提下，提高IL-2和IFNγ表达水平。
为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)以化学合成的寡核苷酸单链混合物为靶标基因，设计特异性引物如下：
上游引物：GACACGCTAGCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTG(SEQ ID NO.2)
下游引物：GACACGGATCCTTACTGGGATGCTCTTCGACC(SEQ ID NO.3)
在含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通过PCR反应进行扩增，获得第一轮PCR产物；
以第一轮PCR反应液为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，进行第二次扩增；进行电泳回收基因片段；
(2)将步骤(1)电泳所得基因片段在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，得到酶切的基因片段；
(3)载体pIRES2-EGFP在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，得到酶切的载体片段，序列如SEQ ID NO:6所示；
(4)连接基因片段和载体片段，构建pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系。
进一步地，所述步骤(1)中第一轮PCR反应体系为：寡核苷酸单链混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul浓度为25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul5u/ul；ddH2O补足至50ul。扩增时，dNTP浓度为25mmol/L，pfu聚合酶为5u/ul。
进一步地，所述步骤(1)中第一轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反应循环22次；72℃6min。
进一步地，所述步骤(1)中第二轮PCR反应体系为：第一轮PCR产物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul 25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul 5u/ul；ddH2O补足至41ul。
进一步地，所述步骤(1)中第二轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反应循环22次；72℃6min。
进一步地，所述步骤(2)中双酶切的酶切条件为：步骤(1)基因片段20ul；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 5ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h。
进一步地，所述步骤(3)中双酶切的酶切条件为：pIRES2-EGFP 1.5ug；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 10ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h。
进一步地，所述步骤(4)中连接反应条件为：酶切的基因片段6ul；酶切的载体片段，5ul；10×T4DNA ligase Buffer 2ul；T4DNA ligase 1ul，5u/ul；ddH2O补足至20ul；连接混合液于16℃水浴连接2h。
另一方面，本发明提供一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系，所述真核表达体系同时包含IL-2基因的核苷酸序列和IFNγ基因的核苷酸序列，其中，所述IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述IFNγ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，所述真核表达体系同时含有IL-2和IFNγ蛋白的编码基因，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
另一方面，本发明提供含有IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的重组菌。
所述重组菌是指将真核表达体系导入目的菌得到的重组菌。
本发明提供一种DNA片段，其包括如下三种之一：1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且具有相同功能的DNA分子。
另一方面，本发明提供IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系在肿瘤免疫治疗中的用途。
本发明真核表达体系的制备方法具有较高的回收率和较好的保持基因的生物活性，适合大规模纯化和制备，易于产业化。
本发明通过将IL-2基因、IFNγ基因插入载体构建成新的表达体系，在目的细胞中同时转染，获得蛋白表达，得到产量和纯度高的IL-2蛋白和IFNγ蛋白。并具有目的细胞中两种蛋白的表达比例可控的特性，控制二者的表达量为1:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供一种共表达IL-2和IFNγ蛋白的真核表达体系，采用载体来同时负载IL-2基因和IFNγ基因，能够通过同一真核表达体系调控IL-2蛋白和IFNγ蛋白表达水平；并可以减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源性基因序列的引入；同时实现IL-2蛋白与IFNγ蛋白相对表达量可控，控制表达量接近1:1的比例，便于对靶细胞进行精确的细胞免疫功能诱导。该真核表达体系可用于对包括肿瘤细胞在内的靶细胞的基因调控，及对靶细胞免疫微环境的诱导，既能靶向性的针对恶性肿瘤细胞等产生特应性抗肿瘤效应，又能发挥细胞因子的免疫诱导和免疫杀伤作用。其中IL-2是发挥免疫调节作用的细胞因子，IFNγ是发挥肿瘤靶向性抑制作用的细胞因子，二者联合使用，在肿瘤细胞中表达后，能够实现对肿瘤免疫微环境中免疫细胞的数量和功能进行调控，并对多种肿瘤细胞进行靶向性治疗，通过克服传统基因表达载体启动子之间的相互抑制现象实现对肿瘤细胞的免疫杀伤。本发明提供的制备方法简单，易于操作。
附图说明
图1步骤一所得的基因片段的电泳图；
图2 pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系图谱；
图3 pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系的鉴定电泳结果图；
图4肝癌细胞表达目的蛋白结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 构建质粒
步骤一、获取含有特异性酶切位点的基因片段
经过DNAworks设计后，以化学合成的寡核苷酸单链混合物为模板(化学合成方法采用固相亚磷酰胺三酯法，参考文献Pon,R.T.Solid-phase supports foroligonucleotide synthesis.Methods in Molecular Biology(Totowa,NJ,UnitedStates)(1993),20(Protocols for Oligonucleotides and Analogs),465–496)，大小987bp，设计特异性引物如下：
上游引物(如SEQ ID NO:2所示)：
GACACGCTAGCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTG
下游引物(如SEQ ID NO:3所示)：
GACACGGATCCTTACTGGGATGCTCTTCGACC
在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通过PCR反应进行扩增，获得第一轮PCR产物，其中，引物浓度为1OD溶于400ul ddH2O，PCR反应体系如下(50μL)：寡核苷酸单链混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul(25mmol/L)；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddH2O补足至50ul。
PCR反应程序如下：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反应22次循环；72℃6min。
以第一轮PCR产物为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，进行第二次扩增，其中，引物浓度为1od溶于400ul ddH2O，
PCR反应体系如下(50μL)：第一轮PCR产物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP1ul(25mmol/L)；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddH2O补足至41ul。
PCR反应反应条件为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反应22次循环；72℃6min。
两次PCR扩增结束之后，进行电泳回收基因片段，电泳检测大小为987bp，其具有如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，电泳情况具体如图1所示。第1排为扩增前的寡核苷酸单链混合物；第2排为第一次扩增产物；第3排为第二次扩增产物。通过两次扩增，将化学合成的少量寡核苷酸单链的量进行提升，以便进一步的插入质粒载体。
步骤二、含有特异性酶切位点的基因片段的酶切
步骤一电泳所得基因片段在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，酶切条件如下：步骤一电泳所得基因片段20ul；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 5ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h，电泳回收目的条带，得到酶切的基因片段。
步骤三、pIRES2-EGFP载体的酶切
载体pIRES2-EGFP在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，酶切条件如下：pIRES2-EGFP 1.5ug；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 10ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h，电泳回收目的条带，得到酶切的载体片段，其具有如SEQ ID NO:6所示的DNA序列。
步骤四、构建真核表达体系
连接基因片段和载体片段，构建pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系(重组载体)。连接反应体系如下(20μL)：酶切的基因片段6ul；酶切的载体片段，5ul；10×T4DNAligase Buffer 2ul；T4DNA ligase 1ul，5u/ul；ddH2O补足至20ul；上述连接混合液于16℃水浴连接2h，构建得到pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系，具体如图2所示。
步骤五、pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系的鉴定
在DH5a感受态细菌中，加入步骤四的连接反应液，取阳性菌菌落液50μL，37℃条件下培养后，进行菌液酶切鉴定，酶切反应体系如下：pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系0.5ug；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各0.3ul，10u/ul；FD Buffer 2ul；ddH2O补足至20ul；酶切反应条件：37℃，水浴2小时。
分别取上述酶切反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图3。
电泳结果显示：
1)电泳后发现，片段分别为表达蛋白的序列部分和真核表达体系载体部分，所述表达蛋白的序列部分大小为987bp，其具有如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，所述真核表达体系载体部分大小为5220bp，其具有如SEQ ID NO:6所示的DNA序列。
2)电泳结果图显示：从左到右8个条带代表的克隆中，1、3、4、5、6、7、8为阳性克隆，2为步骤一的寡核苷酸单链，9为marker。
将阳性克隆的重组载体(即真核表达体系)测序，其含有目的蛋白的编码基因片段，为序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA序列，从5’端至3’端依次包括：
酶切位点：SEQ ID NO:1所示的第1～6位；
IL-2编码基因序列：SEQ ID NO:1所示的第7～465位；
蛋白连接点：SEQ ID NO:1所示的第466～480位；
IFNγ编码基因序列：SEQ ID NO:1所示的第481～981位；
酶切位点：SEQ ID NO:1所示的第982～987位。
实施例2 肝癌细胞表达目的蛋白：
将HepG2人肝癌细胞用0.05％胰蛋白酶工作液消化5min脱壁后，轻轻吹打，分散为单细胞悬液并计数。以0.5×106/孔的细胞数量，以含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养于37℃、5％CO2和相对湿度95％的恒温培养箱中。待细胞融合度达50％时，弃去培养液后，采用PBS液轻柔冲洗细胞3次，准备转染。
将2μg的pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系和pIRES2质粒载体分别稀释在0.1mL Opti-Medium中，20℃放置10min。同时，将10μL的Lipofection2000转染试剂稀释在0.1mL Opti-Medium中，20℃放置10min。分别将稀释的2种质粒体系与稀释的Lipofection2000转染试剂充分混匀后，20℃放置30min，形成2种转染试剂混合物。
分别将2种质粒体系形成的转染试剂混合物，分组加入如前准备好的细胞培养板中，37℃、5％CO2和相对湿度95％的恒温培养箱中培养5h。弃去培养液，采用PBS液轻柔冲洗细胞3次后，继续以含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养于37℃、5％CO2和相对湿度95％的恒温培养箱中培养48h、72h，分别检测pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系和pIRES2质粒载体转染后的IFNγ和IL-2蛋白表达水平，以未转染对照组为阴性对照。
Western blot法检测蛋白表达：
分别收集各时间点的各组细胞，弃去细胞培养液，以PBS洗3次。加入蛋白样品裂解液，充分裂解所有细胞。将裂解好的细胞粘液刮至培养皿的一侧，以移液器转移至1.5毫升离心管中。进一步使用超声细胞破碎仪破碎DNA，破碎实验条件：冰上操作，设置超声130W,20KHz,pulse 20％；超声20s/次，共三次。破碎后，-20℃保存备用。
常规匀浆提取蛋白、蛋白质变性。采用考马斯亮蓝比色法检测蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。电泳完毕后用去离子水冲洗干净，使用三明治电转法，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后置于5％的脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。弃去封闭液，用TBST漂洗2-3次，加入1:500稀释的IFNγ或IL-2蛋白一抗，室温下摇床孵育2h，TBST漂洗后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下摇床孵育1h，TBST漂洗后进行二氨基联苯胺(DAB)显色，最后以凝胶成像仪保存图像，如图4所示。
结果如图4可见，第1、4条带分别为pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系转染48h、72h的蛋白染色结果；第2、5条带为pIRES2质粒载体的蛋白染色结果；第3、6条带为未转染对照组的蛋白染色结果。结果显示，pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系转染后，HepG2肝癌细胞中，IFNγ和IL-2蛋白的表达水平明显升高，且72h时的表达水平均高于48h。pIRES2质粒载体转染后的IFNγ和IL-2蛋白的表达水平与control组没有差别。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第一医院
<120> IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctagcatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 60
aacagtgcac ctacttcaag ttctacaaag aaaacacagc tacaactgga gcatttactg 120
ctggatttac agatgatttt gaatggaatt aataattaca agaatcccaa actcaccagg 180
atgctcacat ttaagtttta catgcccaag aaggccacag aactgaaaca tcttcagtgt 240
ctagaagaag aactcaaacc tctggaggaa gtgctaaatt tagctcaaag caaaaacttt 300
cacttaagac ccagggactt aatcagcaat atcaacgtaa tagttctgga actaaaggga 360
tctgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct gatgagacag caaccattgt agaatttctg 420
aacagatgga ttaccttttg tcaaagcatc atctcaacac taactggcgg cggggggagc 480
atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 540
tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 600
ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 660
gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 720
aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 780
aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 840
tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 900
gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 960
ggtcgaagag catcccagta aggatcc 987
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacacgctag catgtacagg atgcaactcc tgtcttg 37
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacacggatc cttactggga tgctcttcga cc 32
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> 未知
<400> 4
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactaact 459
<210> 5
<211> 501
<212> DNA
<213> 未知
<400> 5
atgaaatata caagttatat cttggctttt cagctctgca tcgttttggg ttctcttggc 60
tgttactgcc aggacccata tgtaaaagaa gcagaaaacc ttaagaaata ttttaatgca 120
ggtcattcag atgtagcgga taatggaact cttttcttag gcattttgaa gaattggaaa 180
gaggagagtg acagaaaaat aatgcagagc caaattgtct ccttttactt caaacttttt 240
aaaaacttta aagatgacca gagcatccaa aagagtgtgg agaccatcaa ggaagacatg 300
aatgtcaagt ttttcaatag caacaaaaag aaacgagatg acttcgaaaa gctgactaat 360
tattcggtaa ctgacttgaa tgtccaacgc aaagcaatac atgaactcat ccaagtgatg 420
gctgaactgt cgccagcagc taaaacaggg aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 480
ggtcgaagag catcccagta a 501
<210> 6
<211> 5220
<212> DNA
<213> 未知
<400> 6
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc ccccccctaa 600
cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc 660
caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac 720
gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt 780
gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg 840
caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata 900
agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga 960
aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt 1020
accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc 1080
gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 1140
acgatgataa tatggccaca accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 1200
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 1260
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 1320
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 1380
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 1440
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 1500
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 1560
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 1620
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 1680
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 1740
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 1800
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 1860
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gcgactctag atcataatca gccataccac 1920
atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca 1980
taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 2040
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 2100
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaagg cgtaaattgt aagcgttaat attttgttaa 2160
aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 2220
aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 2280
acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 2340
agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 2400
gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 2460
cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 2520
caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 2580
agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 2640
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 2700
aatattgaaa aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt 2760
agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 2820
ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2880
catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 2940
aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 3000
agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 3060
aggcctaggc ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 3120
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actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3240
ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg 3300
aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3360
ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3420
tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3480
tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3540
gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 3600
aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg 3660
atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 3720
tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 3780
tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 3840
tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 3900
tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 3960
acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 4020
ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 4080
tagggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac 4140
ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt 4200
tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc 4260
ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc 4320
agccaacgtc ggggcggcag gccctgccat agcctcaggt tactcatata tactttagat 4380
tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 4440
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4500
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4560
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4620
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 4680
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4740
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4800
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4860
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4920
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4980
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 5040
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 5100
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 5160
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg ccccatgcat 5220

Claims (10)

1.一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系，其中，所述真核表达体系同时包含IL-2基因的核苷酸序列和IFNγ基因的核苷酸序列，所述IL-2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述IFNγ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系，其中，所述真核表达体系含有IL-2和IFNγ蛋白的编码基因，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)以化学合成的寡核苷酸单链混合物为靶标基因，设计特异性引物如下：
上游引物：GACACGCTAGCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTG(SEQ ID NO.2)
下游引物：GACACGGATCCTTACTGGGATGCTCTTCGACC(SEQ ID NO.3)
在含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通过PCR反应进行扩增，获得第一轮PCR产物；
以第一轮PCR反应液为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，进行第二次扩增；进行电泳回收基因片段；
(2)将步骤(1)电泳所得基因片段在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，得到酶切的基因片段，大小为987bp，序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)载体pIRES2-EGFP在限制性内切酶Nhe I和BamH I存在下进行双酶切，得到酶切的载体片段，序列如SEQ ID NO:6所示；
(4)连接基因片段和载体片段，构建得到pIRES2-EGFP-IL-2-IFNγ真核表达体系。
4.根据权利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，其中，所述步骤(1)中第一轮PCR反应体系为：寡核苷酸单链混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul 25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul；pfu聚合酶0.4ul 5u/ul；ddH2O补足至50ul；
第一轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反应循环22次；72℃6min。
5.根据权利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，其中，所述步骤(1)中第二轮PCR反应体系为：第一轮PCR产物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dNTP 1ul 25mmol/L；10×pfu Buffer 5ul 5u/ul；pfu聚合酶0.4ul；ddH2O补足至41ul；
第二轮PCR反应的反应条件为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反应循环22次；72℃6min。
6.根据权利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，其中，所述步骤(2)中双酶切的酶切条件为：步骤(1)所得基因片段20ul；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 5ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h。
7.根据权利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，其中，所述步骤(3)中双酶切的酶切条件为：pIRES2-EGFP 1.5ug；限制性内切酶Nhe I和BamH I，各1ul，10u/ul；FD Buffer 10ul；ddH2O补足至50ul；酶切反应体系在37℃恒温水浴锅中反应3h。
8.根据权利要求3所述的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的制备方法，其中，所述步骤(4)中连接反应条件为：酶切的基因片段6ul；酶切的载体片段，5ul；10×T4 DNAligase Buffer 2ul；T4 DNA ligase 1ul，5u/ul；ddH2O补足至20ul；连接混合液于16℃水浴连接2h。
9.含有权利要求3～8任一方法制备的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系的重组菌。
10.权利要求3～8任一方法制备的IL-2和IFNγ蛋白共表达的真核表达体系在免疫治疗中的用途。
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