WO2006009114A1

WO2006009114A1 - Ｉｌ－１８レセプターアンタゴニスト、および当該アンタゴニストを含む薬学的組成物

Info

Publication number: WO2006009114A1
Application number: PCT/JP2005/013167
Authority: WO
Inventors: Atsuo Sekiyama
Original assignee: Atsuo Sekiyama
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-15
Publication date: 2006-01-26
Also published as: DK1808446T3; EP1808446A4; AU2005264453A1; JP5595632B2; JPWO2006009114A1; EP1808446B1; US20080063644A1; US7887802B2; AU2005264453B2; EP1808446A1; NZ553166A

Abstract

　ＩＬ－１８レセプターアンタゴニストとして機能する、免疫組織化学に使用可能なＩＬ－１８レセプター抗体を提供する。当該抗体を用いてＩＬ－１８依存的な障害、特に紫外線によって生じる皮膚肥厚を予防および／または治療するための薬学的組成物および方法を提供する。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合することを特徴とするＩＬ－１８レセプターαサブユニットに対する抗体、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合することを特徴とするＩＬ－１８レセプターβサブユニットに対する抗体を作製する。

Description

明細書

IL_ 18レセプターアンタゴニスト、および当該アンタゴニストを含む薬学的組成物

技術分野

[0001] 本発明は、インターロイキン 18レセプターアンタゴ-スト、および当該アンタゴ- ストを含む薬学的組成物に関するものである。より詳細には、本発明は、インターロイキン 18レセプター aサブユニットに対する抗体および Zまたは βサブユニットに対する抗体を含むインターロイキン— 18関連障害、特に、紫外線による皮膚肥厚を予防および Ζまたは治療するための薬学的組成物、ならびにストレス関連疾患を処置するための薬学的組成物に関するものである。

背景技術

[0002] 紫外線による皮膚障害は、美容の観点力らも制癌の観点力らも注目されて、る。上皮の大半を占める上皮角化細胞 (ケラチノサイト）は、乾癬、魚鱗癬、膠原病などにおいて併発する種々の皮膚炎において、その増殖および Ζまたは分ィ匕の異常が観察される。これらのことから、ケラチノサイトの増殖および ζまたは分ィ匕の制御は、生体の健康に取って極めて重要であると考えられる。

[0003] 皮膚は、重層した上皮細胞からなる表皮、および密な結合組織からなる真皮から構成される、外部環境と身体の内側の間の障壁を形成する器官である。表皮は、皮膚の最外層を形成する厚さ約 lmmの組織であり、直接外気と接して種々の刺激 (例えば、太陽光線、乾燥、埃など)力皮膚内部を保護する。

[0004] 皮膚の弾力性およびバリヤ一特性を付与するヒトの皮膚の上部層、すなわち表皮は、 4つの明確な分ィ匕段階によって規定される細胞型 (真皮と表皮の接合部の境界である基底細胞層、有棘細胞層、顆粒層、および角化層）からなる。

[0005] 表皮を構成する細胞は、その 80%が角化細胞 (ケラチノサイト)である。分裂能を有するケラチノサイトは、基底細胞層に存在し、分化に伴って有棘細胞層、顆粒層、角化層へ移動する。コルネオサイトと呼ばれる角質層の末期細胞はもはや死んでいる。表皮は常に更新される組織であり、細胞分割と最終分ィヒしたコルネオサイトへの進行のプログラムは非常に厳密に制御されている。基底細胞層では、常に細胞分裂が行なわれており、生じた細胞は形を変えて移動し、約 28日後に角質層から垢として剥がれ落ちる。

[0006] このような 28日周期でターンオーバーする表皮の分ィヒは、皮膚の本質的機能の付与、すなわち、外部環境に対する保護バリヤ一の付与、および身体からの水分の損失の防止に重要である。

[0007] 皮膚は、温湿度、紫外線、化粧品、加齢、疾病、ストレス、食習慣等により微妙な影響を受け、その結果、上述した皮膚機能の減退、皮膚の老化など、種々のトラブルが発生する。

[0008] 紫外線 (UV)は、殺菌作用を有するとともに、ビタミン Dによる骨形性を促進させたり皮膚の免疫機能を改善する効果をもたらす一方、皮膚肥厚、しわまたはたるみの形成、色素沈着等をもたらす。

[0009] 皮膚における紫外線による急性反応としては、日焼け、光線過敏性皮膚炎が挙げられ、慢性反応としては、皮膚の色素異常 (シミ、ソバカスの悪化）、皮膚老化の促進が挙げられる。皮膚が紫外線を浴びると、皮膚の細胞中にァラキドン酸回路の酵素系が誘導され、プロスタグランジン E2が生成する。プロスタグランジン E2は、皮膚細胞に炎症を起こさせる機能を有し、赤く腫れ上がらせて (紅斑)、日焼けを引き起こす。日焼けは、さらに、しみを生じさせるとともに、表皮細胞を肥厚させる。このような表皮肥厚は、ひいては皮膚癌の原因になる。

[0010] 表皮肥厚はケラチノサイトの異常増殖であるので、この増殖を抑制して分ィ匕を促進することによって、表皮肥厚を抑制することができる。

[0011] 皮膚に生じるトラブルを予防、改善する主たる試みとしては、合成あるいは天然の保湿成分の塗布により皮膚の乾燥を防ぎ皮膚の保湿能を高める方法、血行促進剤の塗布により血行促進を改善する方法等がなされてきた。

[0012] しかし、これらの方法は種々の皮膚トラブルの予防、改善効果、その持続性、薬剤の安定性 ·安全性等の点で、種々の問題を有している。すなわち、これらの方法は、一般に、表皮、特に角層表面の水分を補給するものまたは保湿成分の一部を補うものであることから、その効能および効果は一時的なものであり、永続的な皮膚の改善は期待できな、ものであった。

[0013] そこで、表皮肥厚、皮膚の不全角化、脂質代謝異常等に対し顕著な抑制作用を有する物質の開発が望まれている。

[0014] 一般に、細胞の増殖または分ィ匕には、特定の増殖因子または分ィ匕因子が必要とされる。また、細菌および Zまたはウィルスの感染、腫瘍ならびに細胞障害に対して、生体が呈する免疫反応は、免疫担当細胞間の直接的または間接的な相互作用によつて調節されている。サイト力イン (例えば、インターロイキン類、コロニー刺激因子類

、 TNF (腫瘍壊死因子)類、インターフェロン類）は、細胞の分化、増殖および免疫反応に関与していることが明らかになつている。

[0015] インターロイキン 18 (IL— 18)は、免疫担当細胞において IFN— γの産生を誘導する新規な蛋白質として同定された (例えば、特許文献 1を参照のこと)。現在、 IL 18は、炎症性サイト力インであるインターフェロン γの産生を誘導するだけでなぐ抗炎症性サイト力イン (例えば、インターロイキンー4、インターロイキン 5、およびインターロイキン 13)の産生を誘導することが知られている（例えば、非特許文献 1を参照のこと)。

[0016] IL- 18タンパク質は、 24kDaの不活性型（前駆体）として産生されてカスパーゼー 1によって切断されて 18kDaの活性型に変換された後、細胞外へ放出される（例えば、非特許文献 4を参照のこと)。培養細胞において、 IL— 18前駆体は、活性化マク口ファージ、脳ミクログリア、皮膚角化細胞、ランゲルノ、ンス細胞、角膜上皮細胞、腸上皮細胞、子宮腺細胞および骨芽細胞などに発現する (例えば、非特許文献 5を参照のこと）。また、 IL— 18タンパク質は、アルツハイマー病、シユーダレン症候群、クローン病、変形性関節症、リウマチ関節炎、接触性皮膚炎、乾癬、ァテローム性動脈硬化症などにおいて、病変局所に増加することが知られている（例えば、非特許文献 6 を参照のこと)。

[0017] IL- 18レセプターは、 αサブユニットおよび βサブユニットからなり（例えば、非特許文献 7を参照のこと）、アミノ酸配列に基づいて IL 1 βレセプター ZTLRファミリ一に分類される (例えば、非特許文献 5、 6、 8を参照のこと)。 IL— 18活性ィ匕型タンパク質は、 IL— 18レセプターを介して、 NF— κ B依存的転写活性、ならびに AP— 1 依存的転写活性を上昇させることが知られている (例えば、非特許文献 5を参照のこと）。後者は、 JNKおよび p38 MAPKが関与することが知られている（例えば、非特許文献 9を参照のこと）。 1しー18レセプター0；サブュ-ットの1111^^\は、月、胸腺、子宮、副腎、肝臓、脾臓、肺、脾臓、骨格筋、 NK細胞および T細胞などに発現する（例えば、非特許文献 6を参照のこと)。

[0018] IL— 18と疾患との関係について、統合失調症、新生児脳低形成、パニック障害、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス (SLE)、アレルギー性喘息、甲状腺機能亢進症、 I型糖尿病、肝硬変、腎不全、敗血症、アトピー性皮膚炎、前期破水、 HIV感染、マラリア感染などにおいて、患者血清中の IL— 18タンパク質が高値を示すことが知られており（例えば、非特許文献 6を参照のこと）、慢性期の子宮内膜症患者において、腹水中の IL— 18タンパク質濃度が上昇することが知られている（例えば、非特許文献 10を参照のこと)。動物モデルを用いた解析によると、多発性硬化症またはリゥマチ関節炎のモデルにおいて、 IL— 18投与は病態を悪くし、抗 IL— 18抗体の投与は病態を改善または軽減する (例えば、非特許文献 11、 12を参照のこと)。一方、急性の移植片対宿主疾患（GVHD)

、て、 IL— 18投与は、 TNF a産生を低下させて死亡率を低減する力抗 IL— 18抗体の投与は死亡率を増カロさせる（例えば、非特許文献 13を参照のこと)。

[0019] このように、 IL— 18と疾患との間には、一定の関係が存在しない。このことは、 IL- 18の多機能性を示し、生体内での IL— 18の機能を理解することをより困難にさせている。

特許文献 1：特開平 8— 27189号公報（平成 8年 1月 30日公開）

非特許文献 1 :救急医学、第 26卷、 1823— 1826頁、 2002年 12月

非特許文献 2 Journal of Immunology、第 163卷、第 1230〜1236頁、 1999年非特許文献 3 : Anticancer Research,第 19卷、第 4131〜4138ページ、 1999年非特許文献 4 : Science, 275卷、第 206〜209頁、 1997年

非特許文献 5 :Annu Rev Immunol.、第 19卷、第 423〜474頁、 2001年非特干文献 6 : The cytoKine handbooK fourth edition (Academic press)

、第 2卷、第 709〜733頁、 2002年非特許文献 7 : Biol. Chem.、第 272卷、 25737〜42頁、 1997年非特許文献 8 : Life Sci.、第 68卷、第 241〜58頁、 2000年

非特許文献 9 : Biochem. Biophys. Res. Commun.、第 296卷、第 742〜8頁、 2

002年

非特許文献 10 :Fertil. Steril.、第 80卷、第 889〜94頁、 2003年

非特許文献 11 : Immunol.、第 161卷、第 6368〜74頁、 1998年

非特許文献 12 :J. Clin. Invest.、第 104卷、第 1337〜9頁、 1999年

非特許文献 13 : Exp. Med.、第 194卷、第 1433〜40頁、 2001年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0020] 本発明者らは、高密度で培養したケラチノサイトの培養培地中に活性ィ匕型 IL— 18 を添加すると、細胞の接触阻止が阻害されて過剰増殖することを見出した。さらに、本発明者らは、分ィ匕誘導した培養ケラチノサイトの培養上清に IL— 18を添加すると分化が促進され、抗 IL— 18抗体をさらに添加するとこの分ィ匕促進が抑えられることを見出した。すなわち、本発明者らは、 IL— 18がケラチノサイトの増殖および/または分ィ匕に関与して表皮肥厚を制御し得ることを見出した。

[0021] し力しながら、現在入手可能な IL— 18レセプターに対する抗体は、免疫組織化学に用いることができず、実際にレセプタータンパク質が発現している組織は不明であり、生体内で IL— 18が実際に機能していることを確認することが困難である。これまでに行なわれた IL— 18レセプターの発現に関する研究は核酸レベルの解析であり、実際に IL— 18レセプタータンパク質がいかなる組織に発現しているのかを明確には示していない。

[0022] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、 IL 18レセプターアンタゴニストとして機能する、免疫組織ィ匕学に使用可能な IL— 18レセプター抗体を提供することである。換言すれば、本発明の目的は、生体において IL— 18レセプターと結合して IL 18の機能を阻害する抗体を供給し、当該抗体を用いて IL 18依存的な障害、特に紫外線によって生じる皮膚肥厚を予防および Zまたは治療することである。 [0023] さらに、本発明者らは、ストレス依存的に上昇する血中 IL— 18レベルに起因して血中 IL 6レベルが上昇し、その結果、ストレス関連疾患の病態 Z病状が悪ィ匕することを見出した。この知見に基づく本発明の目的は、生体において IL— 18レセプターと結合して IL 18の機能を阻害する抗体を供給し、当該抗体を用いて IL 18/IL - 6依存的な障害、特にストレス関連疾患を処置または予防することである。

課題を解決するための手段

[0024] 本発明者らは、 IL- 18の機能を調べる目的で、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストとして機能しかつ免疫組織ィ匕学に使用可能な抗 IL— 18レセプター抗体を作製した。具体的には、 IL 18レセプター aサブユニットおよび βサブユニットの膜貫通領域近傍の親水性ドメインを抗原として、 IL— 18レセプターの両サブユニットに対するポリクローナル抗体 (抗 _α抗体および抗 β抗体)を作製した。

[0025] 本発明に係る抗体は、 IL— 18レセプターに結合することを特徴としている。

[0026] 本発明に係る抗体において、上記 IL— 18レセプターが aサブユニットであることが好ましい。

[0027] 本発明に係る抗体において、結合する上記 IL— 18レセプター αサブユニットのアミノ酸配列が配列番号 5〜8の、ずれかに示されるアミノ酸配列であることが好まし!/、。

[0028] 本発明に係る抗体において、上記 IL— 18レセプターが 13サブユニットであることが好ましい。

[0029] 本発明に係る抗体において、結合する上記 IL— 18レセプター βサブユニットのアミノ酸配列が配列番号 9または 10に示されるアミノ酸配列であることが好ましい。

[0030] 本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号 5〜8のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。

[0031] 本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号 5に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドおよび配列番号 6に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。

[0032] 本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号 7に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドおよび配列番号 8に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。

[0033] 本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号 9に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドおよび配列番号 10に示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。

[0034] 本発明に係る抗体は、上記の生成方法によって生成されることが好ましい。

[0035] 本発明に係る薬学的組成物は、請求項 1、 2または 7に記載の抗体を含むことを特徴としている。

[0036] 本発明に係る薬学的組成物は、 IL— 18関連障害を処置または予防するために使用されるのが好ましい。

[0037] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 IL— 18関連障害が IL— 18ZIL— 6 関連障害であることが好まし、。

[0038] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 IL— 18関連障害力 Sストレス関連疾患であることが好ましい。

[0039] 本発明に係る薬学的組成物において、上記ストレス関連疾患が、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、尋常性挫創、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、シエーダレン症候群、鬱病、および心身症からなる群より選択されることが好まし、。

[0040] 本発明に係る薬学的組成物において、上記障害が皮膚肥厚によって特徴付けられることが好ましい。

[0041] 本発明に係る薬学的組成物において、上記障害が紫外線依存的な皮膚の脱落、硬化または肥厚であることが好まし、。

[0042] 本発明に係る薬学的組成物にぉ、て、上記障害が発毛不全であることが好まヽ

[0043] 本発明に係る薬学的組成物は、皮膚表面に塗布可能な形態であることが好まヽ

[0044] 本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含むことが好ましい。

[0045] 本発明に係るヒトの皮膚におけるケラチノサイトの分ィ匕を増強する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴としている。

[0046] 本発明に係るヒトの皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴としている。

[0047] 本発明に係る発毛を促進する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用するェ程を包含することを特徴として、る。

[0048] 本発明に係る薬学的組成物は、アポトーシスによる細胞死を予防および Zまたは治療するために活性ィ匕型 IL— 18を含むことを特徴として、る。

[0049] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞がケラチノサイトであることが好ましい。

[0050] 本発明に係る薬学的組成物は、 IL— 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにスーパーォキシドジスムターゼを含むことを特徴として、る。

[0051] 本発明に係る薬学的組成物は、 IL 18関連障害を予防および Zまたは治療するために p38 MAPKインヒビターを含むことを特徴としている。

[0052] 本発明に係る薬学的組成物は、 IL 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにカスパーゼ 1インヒビターを含むことを特徴としている。

[0053] 本発明に係る薬学的組成物は、 IL 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにカスパーゼー 11インヒビターを含むことを特徴として、る。

[0054] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 IL— 18関連障害が IL— 18ZIL— 6 関連障害であることが好まし、。

[0055] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 IL— 18関連障害力 Sストレス関連疾患であることが好ましい。

発明の効果

[0056] 本発明に係る抗体は、生体において IL— 18レセプター aサブユニットと結合して I L— 18の機能 (例えば、 IFN— yの産生）を阻害するという効果を奏する。また、本発明に係る抗体は、生体において IL— 18レセプター βサブユニットと結合して IL— 18 の機能 (例えば、 IFN- γの産生)を阻害するという効果を奏する。また、本発明に係る抗体は、組織標本に対する免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウェスタンプロット、 ELISAの種々の実験の、ずれにも用いることができると、う効果を奏する。

[0057] 本発明に係る IL— 18を含有する薬学的組成物は、ストレス関連疾患を予防および Zまたは治療するという効果を奏する。また、本発明に係る薬学的組成物は、ケラチノサイト分化誘導を促進し、表皮肥厚を抑制するという効果を奏する。すなわち、本発明に係る薬学的組成物は、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する作用を有しているので、角化改善剤として使用できるという効果を奏する。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、紫外線による表皮肥厚に対し顕著な抑制作用を有しているので、皮膚の正常な機能を回復させることができるという効果を奏する。

[0058] 本発明を用いれば、ケラチノサイトの分ィ匕を増強することができる。また、本発明を用いれば、ケラチノサイトの増殖を阻害することができる。さらに、本発明を用いれば、発毛を促進することができる。

[0059] 表皮肥厚はケラチノサイトの異常増殖であり、特に、紫外線 (UV)依存的な表皮肥厚は、表皮の癌化であると考えられている。すなわち、本発明に係る薬学的組成物を用いれば、ケラチノサイトの異常増殖を抑制して分ィ匕を促進することによって、表皮肥厚を抑制して皮膚癌を予防および Zまたは処置することができる。

[0060] 本発明に係る IL— 18を含有する薬学的組成物を用いれば、アポトーシスによる細胞死を予防および Zまたは治療することができる。

図面の簡単な説明

[0061] [図 1]図 1は、 UV照射されたマウス表皮における IL— 18または IL— 18レセプターの発現過程を示す免疫組織ィ匕学標本である。

[図 2]図 2は、 UV照射されたマウス表皮における表皮肥厚の経過を示す図である。

[図 3]図 3は、 UV照射されたマウス表皮における表皮肥厚に対する抗 IL 18抗体（抗 a抗体および Zまたは抗 β抗体)の効果を示す図である。

[図 4]図 4は、 UV照射されたマウス表皮における ρ38 ΜΑΡΚの活性ィ匕を示す図である。

[図 5]図 5は、 UV照射されたマウス表皮における ΜΕΚ3Ζ6の活性ィ匕を示す図である。

[図 6]図 6は、 UV照射されたマウス表皮におけるサイクリン D1の発現を示す図である [図 7]図 7は、 UV照射されたマウス表皮にお、て生じる発毛に対する抗 IL 18抗体の効果を示す図である。

[図 8]図 8は、培養ヒトケラチノサイトの分ィ匕過程に対する抗 IL— 18抗体の効果を示す図である。

[図 9]図 9は、培養ヒトケラチノサイトの分ィ匕段階で生じるアポトーシスに対する IL— 18 または抗 IL 18抗体の効果を示す図である。

[図 10]図 10は、 UV照射されたマウス表皮において生じるケラチノサイトのアポトーシスを示す免疫組織ィ匕学標本である。

[図 11]図 11は、 UV照射されたマウス表皮におけるケラチノサイトのアポトーシスに対する IL 18の効果を示す図である。

[図 12]図 12は、ストレス負荷時のマウス血漿 IL 18濃度に対する NADPHォキシダーゼアンタゴ-ストの効果を示す図である。

[図 13]図 13は、ストレス負荷時の血清 IL 6レベル上昇に対する抗 IL 18レセプタ一抗体の効果を示す図である。

[図 14]図 14は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な血清 I L 18レベルの上昇を示す図である。

[図 15]図 15は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な血漿 I L— 6レベルの上昇に対する抗 IL— 18レセプター抗体の効果を示す図である。

[図 16]図 16は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な尿中アルブミンレベルの上昇に対する抗 IL 6抗体または抗 IL 18レセプター抗体の効果を示す図である。

[図 17]図 17は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な BUN の上昇に対する抗 IL 6抗体または抗 IL 18レセプター抗体の効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

〔1 :IL— 18レセプターアンタゴ-スト〕

本発明者らは、 IL- 18関連シグナル伝達経路を介して表皮肥厚が制御され得るか否かを IL— 18レセプターアンタゴ-ストを用いて検討した。

[0063] 具体的には、本発明者らは、 IL- 18依存的インターフェロン γ産生を顕著に阻害する IL 18レセプターに対する抗体を作製し、この抗体を IL 18レセプターアンタゴニストとして用、て IL— 18と表皮肥厚との関係を解析した。

[0064] (a) IL— 18レセプター抗体

本発明は、 IL— 18レセプター ocサブユニットに特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト IL— 18レセプター αサブユニットのァミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 U43672 (配列番号 1) )の 120〜140位（配列番号 5)もしくは 142〜 162位（配列番号 6)、またはマウス IL 18レセプター a サブユニットのアミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 U43673 (配列番号 2) )の 99〜 116位（配列番号 7)もしくは 252〜270位（配列番号 8)力もなるポリペプチドに特異的に結合することが好まし、。

[0065] 本発明はさらに、 IL 18レセプター /3サブユニットに特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト IL— 18レセプター /3サブュ- ットのアミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 AF077346 (配列番号 3) )の 21〜 42位 (配列番号 9)もしくは 164〜190位 (配列番号 10)からなるポリペプチドに特異的に結合することが好ま、。

[0066] 本発明に係る抗体は、上述のペプチドを抗原として用いて惹起されることが好まし V、が、これらのペプチドを混合して抗原として用いることもまた好まし、。

[0067] 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン (IgA、 IgD、 IgE、 I gG、 IgMおよびこれらの Fabフラグメント、 F (ab，）フラグメント、 Fcフラグメント）を意

2

味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗ィディオタイブ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されな、。本発明に係る抗体は、 IL— 18レセプターを発現する生物材料を選択するに有用であり得る。

[0068] 「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、 HarLowら、「Antibodies : A laborator y manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 1988)」、岩崎ら、「単クローン抗体ノ、イブリドーマと ELISA、講談社（1991)」）に従えば作製することがでさる。 [0069] ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、 Chow, M .ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 910— 914 ;および Bittle, F. J.ら、 J. G en. Virol. 66 : 2347— 2354 (1985) (本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットへモシァニン (KLH )または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システィンを含有するペプチドは、 m—マレイミドベンゾィル N ヒドロキシスクシンイミドエステル (MBS)のようなリンカ一を使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、ダルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ゥサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキヤリアカップリングペプチドのいずれかで、例えば、約 100 μ gのペプチドまたはキヤリアタンパク質および Freundのアジュバントを含むェマルジヨンの腹腔内および Zまたは皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用して ELISAアツセィにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約 2週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。

[0070] 本明細書中で使用される場合、用語「IL 18レセプターと特異的に結合する抗体」は、 IL 18レセプターに特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント (例えば、 Fabおよび F (ab' ) フラグメント）を含むことを意味する。用語「I

2

L 18レセプター」は、本明細書において他で言及されない限り、レセプターの αサブユニットおよびサブユニットの両方またはいずれか一方が意図される。 Fabおよび F (ab' ) フラグメントは完全な抗体の Fc部分を欠いており、循環によってさらに迅

2

速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない (Wahl ら、 J. Nucl. Med. 24 : 316— 325 (1983) (本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。

[0071] さらに、 IL— 18レセプターのペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体力抗イディォタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、 IL— 18レセプターと特異的に結合する抗体は、動物 (好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイプリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイプリドーマ細胞は、 IL 18レセプターと特異的に結合する抗体に結合する能力が IL 18レセプターべプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリ一ユングされる。このような抗体は、 IL— 18レセプターと特異的に結合する抗体に対する抗ィディォタイプ抗体を含み、そしてさらなる IL— 18レセプターと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。

[0072] Fabおよび F (ab' ) ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中

2

で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン (Fabフラグメントを生じる）またはペプシン (F (ab' ) フラグ

2 メントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される

。あるいは、 IL— 18レセプター結合フラグメントは、組換え DNA技術の適用または合成化学によって産生され得る。

[0073] このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係る IL— 18レセプターぺプチド抗原を認識する抗体フラグメント（例えば、 Fabおよび F (ab' ) フラグメント）を備

2

えていればよいといえる。すなわち、本発明に係る IL— 18レセプターペプチド抗原を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子の Fcフラグメントとからなる免疫グロプリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

[0074] つまり、本発明の目的は、本発明に係る IL— 18レセプターを認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類 (IgA、 IgD、 IgE、 IgGまたは IgM)、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0075] (b)抗原ペプチド

本発明者らは、 IL— 18レセプタータンパク質の特定領域力もなるポリペプチド力 I L— 18の免疫組織化学に使用可能でありかつ IL— 18レセプターアンタゴ-ストとして機能し得る抗体を惹起することを見出し、本発明を完成するに至った。

[0076] 本発明は、ヒト IL— 18レセプター aサブユニットのアミノ酸配列（GenBank

ァクセッション番号 U43672 (配列番号 1) )の 120〜140位（配列番号 5)もしくは 14 2〜162位（配列番号 6)、またはマウス IL— 18レセプター αサブユニットのアミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 U43673 (配列番号 2) )の 99〜116位（配列番号 7)もしくは 252〜270位（配列番号 8)力もなるポリペプチド、またはヒ HL— 18レセプター 13サブユニットのアミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 AF077346 (配列番号 3) )の 21〜42位（配列番号 9)もしくは 164〜 190位（配列番号 10)からなるポリペプチドを提供する。

[0077] 本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。

[0078] 用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

[0079] 本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主 (例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む)力組換え技術によって産生された産物を含む。

[0080] 本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド (本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織など力単離精製された場合であつてもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。

[0081] また、本発明に係るポリペプチドは、付カ卩的なポリペプチドを含むものであってもよい。付カ卩的なポリペプチドとしては、例えば、 Hisや Myc、 Flag等のェピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付カ卩的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域力宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドの N末端に付加され得る。

[0082] 合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、 Houg htenは、 4週間未満で調製されそして特徴付けられた HA1ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す 10〜20mgの 248の異なる 13残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。 Houghten, R. A. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5131— 5135 (1985)。この「Simultaneous Multi pie Peptide Synthesis (SMPS)」プロセスは、さらに Houghtenら（1986)の米国特許第 4, 631, 211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の榭脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、 50 0〜： L000以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Houghtenら、前出、 513 4)。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

[0083] 本発明に係るポリペプチドは、免疫組織ィ匕学に有効でありかつ IL— 18レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を作製するための方法およびキットにおいて有用である。

[0084] このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号 5〜10のいずれ力 1 つからなるペプチドを含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号 5〜10のいずれか 1つからなるペプチドと、特定の機能 (例えば、タグ)を有する任意のアミノ酸配列と力もなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号 5〜10のいずれか 1つからなるペプチドおよび当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しな、ように適切なリンカ一ペプチドで連結されて、てもよ、。

[0085] つまり、本発明の目的は、免疫組織化学に有効でありかつ IL 18レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を作製するためのポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される免疫組織化学に有効でありかつ IL— 18レセプターアンタゴ-ストとして機能し得る抗体を作製し得るポリべプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0086] (c)抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド

本発明は、本発明に係る上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デォキシリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。

[0087] 本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド (例えば、 IL— 18レセプタータンパク質をコードする cDNA全長力もなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。本明細書を参照すれば配列番号 2に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号 2に基づく DNAフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント (オリゴヌクレオチド)；^、 Applied Bio systems Incorporated ι,ΑΒΙ, 850 Lincoln Ce nter Dr. , Foster City, C A 94404) 392型シンセサイザーなどによって合成される。

[0088] 本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、 PCR等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの cDNAのうち、 5，側および 3，側の配列 (またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノム DNA (または cDNA)等を铸型にして PCR等を行い、両プライマー間に挟まれる DNA領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含む DNA断片を大量に取得できる。

[0089] また本発明に係るポリヌクレオチドは、その 5 '側または 3 '側で上述のタグ標識 (タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。 [0090] つまり、本発明の目的は、免疫組織化学に有効でありかつ IL 18レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレォチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレォチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0091] (d)抗原ペプチドの生成

[1]ポリペプチドの生産方法

本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。

[0092] 一実施形態にお!、て、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。

[0093] 本実施形態の 1つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよぐ宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

[0094] このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを^ aみ込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なる力タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

[0095] 本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液力当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法 (例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法)で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液力周知の方法 (例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトダラフィ一、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によつて精製する工程が好ま、が、これらに限定されな、。

[0096] 別の実施形態にお!、て、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドをィ匕学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づ、て周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドをィ匕学合成できることを、容易に理解する。

[0097] このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、 IL— 18レセプタ一タンパク質のアミノ酸配列、または IL— 18レセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づ、て公知慣用技術を用いればょ、と、える。

[0098] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0099] [2]糸且換え発現のためのベクターおよび細胞

本発明は、免疫組織ィ匕学に有効でありかつ IL— 18レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。好ましくは、本発明に係るベクターは、組換え発現に用いるベクターであり得る。

[0100] 本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。

[0101] ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 [0102] 発現ベクターは、好ましくは少なくとも 1つの選択マーカーを含む。このようなマーカ一としては、真核生物細胞培養につ、てはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および E. coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

[0103] 上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよい。

[0104] 上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなぐ従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli)等の細菌、酵母 (出酵母 Saccharomyces cerevisiae^分裂酵母； schizosaccharomyces pombe)、虫 (Caenorhabditis elegans 、ァフリ 7ッメカェノレ (Xenopus laevis )の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。

[0105] 上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなぐ電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウィルスを用いた発現系を用いればよい。

[0106] このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクタ一も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0107] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0108] 本発明はさらに、免疫組織ィ匕学に有効でありかつ IL— 18レセプターアンタゴ-ストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を提供する。細胞の作製方法 (生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。

[0109] 遺伝子が細胞に導入されたカゝ否かの確認は、 PCR法、サザンハイブリダィゼーション法、ノーザンノヽイブリダィゼーシヨン法などによって行うことができる。例えば、形質転換細胞力も DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行う。 PCR は、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキヤピラリー電気泳動などを行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液などによって染色し、そして増幅産物を 1本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いて PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。

[0110] 本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならな、。

[0111] 〔2： IL— 18レセプターアンタゴ-ストを含む薬学的組成物〕

本発明者らは、紫外線照射後の皮膚に対して IL— 18レセプターアンタゴ-ストの投与が表皮肥厚の回避に有効であることを見出した。本発明者らはさらに、マウスに UVを照射した後に肥厚したケラチノサイトにおいて、 1しー18 (1；¥照射6〜12日後）、 IL—18レセプター αサブユニット（UV照射 9〜12日後）、および j8サブユニット（U V照射 6〜9日後）の発現量が増加することを見出した。

[0112] IL- 18の機能を阻害する抗体、または IL— 18レセプターアンタゴ-ストを UV照射 4日後のマウスに塗布することによって、その後 5日間に形成される UV依存性のケラチノサイト肥厚が抑制された。 [0113] 本発明は、 IL— 18レセプターアンタゴニストを含む薬学的組成物、より詳細には、 I L 18レセプター αサブユニットに対する抗体および Ζまたは βサブユニットに対する抗体を含む IL 18関連障害を予防および Ζまたは治療するための薬学的組成物、特に、皮膚肥厚を予防および Ζまたは治療するための薬学的組成物を提供する。さらに本発明は、ヒトの皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害する方法、およびケラチノサイトの分ィ匕を増加させる方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「IL— 18関連障害」は、 IL 18依存的な細胞内シグナル伝達機構が関与して生じる疾患、障害、または疾病が意図される。従って、「IL— 18関連障害」は、活性ィ匕型 IL— 18の存在によって特徴付けられる。

[0114] 本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ-ストは、表皮細胞 DNA合成を抑制し、分化誘導を促進し、表皮肥厚を抑制する作用を有する。すなわち、本発明に係る IL 18レセプターアンタゴ-ストは、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する作用を有し、角化改善剤として使用できる。角化改善剤は、内服、外用その他いずれの方法によっても投与可能であり、また有効成分として、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴニストの他に通常使用される抗炎症剤、ビタミン類等を必要に応じ適宜配合できる。

[0115] (a)皮膚外用剤

本明細書中で使用される場合、用語「皮膚」は、顔、首、胸、背中、腕、脚、手および頭皮の皮膚が意図される。

[0116] 一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ-ストを含む皮膚外用剤であり得る。皮膚外用剤としては、薬用皮膚外用剤、化粧薬用皮膚外用剤、化粧用組成物等の種々の使用形態をとることができる。本明細書中で使用される場合、用語「皮膚外用剤」は、薬用皮膚外用剤または化粧薬用皮膚外用剤が意図され、化粧用組成物については後で詳述される。

[0117] 皮膚外用剤としては、経皮投与用の固体、半固体または液状の製剤、あるいは、座剤などが挙げられる。例えば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、ノップ剤などの経皮投与用の貼付剤などとして用いることもできる。 [0118] 薬用皮膚外用剤および化粧薬用皮膚外用剤としては、例えば、薬効成分を含有する各種の軟膏剤が挙げられる。軟膏剤としては、油性基剤をベースとするもの、油 Z 水、水 Z油型の乳化系基剤をベースとするもののいずれであってもよい。上記油性基剤としては、特に制限はなぐ例えば、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、および天然または合成のグリセライド等が挙げられる。また、上記薬効成分としては、特に制限はなぐ例えば、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤、ビタミン類等を必要に応じて適宜使用することができる。

[0119] 本実施形態に係る皮膚外用剤は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本実施形態に係る皮膚外用剤における IL— 18レセプターアンタゴ-ストの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該皮膚外溶剤を用いて所望の投与量範囲で IL 18レセプターアンタゴ-ストを投与できるような量であれば特に限定されない。

[0120] 本実施形態に係る皮膚外用剤への IL— 18レセプターアンタゴニストの配合量は、特に制限されないが、通常、乳化系または油性の皮膚外用剤の場合にはそれぞれ全組成量の 0. 0001〜5重量％ (以下、「％」で示す）、特に 0. 0001-0. 1%が好ましい。

[0121] 本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ-ストは、紫外線その他種々の因子の影響による表皮肥厚などに対し顕著な抑制作用を有しており、しかも、皮膚の正常な機能を回復させ、更に恒常性を維持させるものである。従って、本実施形態に係る皮膚外用剤を使用すれば、皮膚の角化しやすい部分における角化を抑制することができる。

[0122] (b)化粧用組成物

他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、化粧用組成物であり得る。本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧品で通常使用されるいずれの形態で存在してちょい。

[0123] 本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧料成分として一般に使用されている油分、保湿剤、紫外線吸収剤、美白剤、アルコール類、キレート剤、 pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、植物エキス、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。化粧用組成物としては、種々の用途および形態、例えば、水 Z油または油 Z水型の乳化化粧料、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、ヘアートニック、整髪剤、養毛剤、育毛剤、入浴剤として用いることができる。本実施形態に係る化粧用組成物は、常用の方法により上記種々の形態のものに調製することができる。

[0124] 本実施形態に係る化粧用組成物は、必要に応じて、ゲル化した水溶液、ローションタイプの分散物、二相ローション、水性相に脂肪相を分散することによって得られるェマルジヨン（oZwェマルジヨン）、またはその逆のェマルジヨン（wZoェマルジヨン）、または三重工マルジヨン (wZoZw若しくは oZwZoェマルジヨン）、またはィォン性および Zまたは非イオン性タイプのべシクル分散物の形態で存在し得る。

[0125] 本実施形態に係る化粧用組成物は、流体であっても固体であってもよい。流体で提供される場合、白色または着色クリーム、軟膏、乳液、ローション、美容液、ペースト、またはムースの外観を有してもよい。さらに本実施形態に係る化粧用組成物は、エアロゾルの形態で適用されてもよい。本実施形態に係る化粧用組成物はまた、固体形態、特にスティックの形態で提供され得る。

[0126] 本実施形態に係る化粧用組成物は、組成物中の IL— 18レセプターアンタゴニスト

(好ましくは、抗 IL— 18レセプター抗体)の機能を補助する目的で、希釈剤、分散剤、または担体として機能する薬学的、特に化粧的に受容可能な賦形剤を含むことが好ましい。

[0127] 水以外の、または水に付加される賦形剤は、液体または固体皮膚軟化剤、溶剤、湿潤剤、増粘剤、および粉末であり得る。

[0128] 一実施形態において、本実施形態に係る化粧用組成物に使用され得る化粧的に受容可能な賦形剤は、一般に、組成物の重量の 5%〜99. 9%、好ましくは 25%〜8 0%を構成し、そして、他の化粧補助剤の不存在においては、組成物の残余部分を構成する。好ましくは、賦形剤の重量の少なくとも 80重量％が水である。好ましくは、水力新規組成物の少なくとも 50重量％、最も好ましくは 60〜80重量％を構成する

[0129] 好ましい局面において、本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧品で一般に使用されるアジュバント (例えば、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性剤、防腐剤、抗酸化剤、溶媒、香料、フィラー、スクリーン剤、顔料、脱臭剤、および染料など）を含み得る。これらの各種のアジュバントの量は、当該分野において通常使用される量であり、例えば組成物の全重量に対して 0. 01%〜80%、好ましくは、 0. 01〜50⁰/₀、より好ましく ίま、 0. 05〜30⁰/₀である。これらのアジュノント ίま、各々の性質に依存して、脂肪相中に、水性相中に、または液体べシクル中に導入され得る。いずれの場合でも、上記アジュバントの種類およびその割合は、本実施形態に係る化粧用組成物の所望の特性を損なわないように選択され得る。

[0130] 本実施形態に係る化粧用組成物がェマルジヨンである場合、脂肪相の割合は、組成物の全重量に対して 5〜80重量％、好ましくは 5〜50重量％の範囲であり得る。ェマルジヨン形態で組成物において使用される油、乳化剤、および共乳化剤は、当該分野において従来使用される公知の物質から選択される。本実施形態に係る化粧用組成物は、組成物の全重量に対して 0. 3〜30重量％、好ましくは 0. 5〜20重量 %の範囲の割合で、乳化剤および共乳化剤を含み得る。

[0131] 本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な油としては、鉱物油（流動ヮセリンまたは水素化ポリイソブテン）、植物起源の油（アボカド油またはダイズ油）、鉱物起源の油（ラノリン）、シリコーン油（シクロメチコーンまたはジメチコーン）、およびフルォロ油（パーフルォロポリエーテル）が挙げられる力これらに限定されない。脂肪アルコール（セチルアルコール）、脂肪酸、およびワックス（カルナゥバワックスまたはォゾケライト)もまた、脂肪物質として使用され得る。

[0132] 本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な乳化剤および共乳化剤の例としては、例えばポリエチレンダルコールの脂肪酸エステル、例えば PEG— 100ステァラート、およびグリセロールの脂肪酸エステル、例えばグリセリルステアラートが挙げられる。

[0133] 本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な親水性ゲル化剤としては、力ルボキシビニルポリマー（カーボマー）、アクリル酸ポリマー、例えばアタリラート Zァルキルアタリラートコポリマー、ポリアクリルアミド、特に架橋化ポリアクリルアミドーメチルプロパンースルホン酸、ポリサッカリド、天然ゴムおよびクレーが挙げられる力これらに限定されない。親油性ゲル化剤としては、変性クレー、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカ、およびポリエチレンが挙げられる。

[0134] 本実施形態に係る化粧用組成物は、日焼け止めを含有するのが好ま、。「日焼け止め」は、紫外線をブロックするために一般に使用される物質が意図される。そのような化合物の例としては、 PABA、シンナメート、およびサリチレートの誘導体である。日焼け止めとして、例えば、ォクチノレメトキシシンナメートおよび 2—ヒドロキシー4ーメトキシベンゾフエノン (ォキシベンゾンとしても既知）を使用することができる。乳化剤中における日焼け止めの正確な量は、日光の紫外線からの所望される保護の程度に依存して、変化させることができる。

[0135] 皮膚軟化剤が、本実施形態に係る化粧用組成物に含まれ得る。そのような皮膚軟化剤のレベルは、合計組成物重量の 0. 5%〜50%、好ましくは 5%〜30%である。皮膚軟化剤は、一般的化学種において、エステル、脂肪酸およびアルコール、ポリオールおよび炭化水素として分類することができる。

[0136] 上記エステルは、モノーまたはジ—エステルであり得る。受容可能な脂肪酸ジエステルの例としては、ジブチルアジペート、ジェチルセバケート、ジイソプロピルジメレート、およびジォクチルスクシネートが挙げられる。受容可能な分岐鎖脂肪酸エステルとしては、 2—ェチルーへキシルミリステート、イソプロピルステアレート、およびイソステァリルパルミテートが挙げられる。受容可能な三塩基性酸エステルとしては、トリイソプ口ピルトリリノレエートおよびトリラウリルシトレートが挙げられる。受容可能な直鎖脂肪酸エステルとしては、ラウリルパルミテート、ミリスチルラタテート、およびステアリルォレエートが挙げられる。好ましいエステルとしては、ココ一カプリレート Z力プレート（ココ一力プリレートおよびココ一力プレートのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルェ一テルアセテート、ジイソプロピルアジペート、およびセチルオタタノエートが挙げられる。

[0137] 好適な脂肪アルコールおよび酸としては、 10個〜 20個の炭素原子を有する化合物が挙げられる。セチル、ミリスチル、ノルミチン、ステアリルアルコールおよび酸のような化合物が特に好ましい。

[0138] 皮膚軟化剤として機能するポリオールは、線状および分岐鎖アルキルポリヒドロキシル化合物（例えば、プロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。ポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのようなポリマーポリオール）であり得る。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透促進剤として特に好ましい。

[0139] 皮膚軟化剤として機能する炭化水素は、 12個〜 30個の炭素原子を有する炭化水素鎖を有する炭化水素であり得る。好ましい例としては、鉱油、石油ゼリー、スクァレン、イソパラフィンが挙げられる。

[0140] 本実施形態に係る化粧用組成物は、粉末を含み得る。これらの粉末としては、白亜、タルク、カオリン、スターチ、スメクタイトクレー、化学的修飾珪酸アルミニウムマグネシゥム、有機的修飾モントモリロナイトクレー、水和珪酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、アルミニウムスターチォクテニルスクシネート、およびそれらの混合物が挙げられる。

[0141] 他の補助少量成分もまた、本実施形態に係る化粧用組成物に含まれ得る。これらの成分としては、着色剤、不透明剤、および香料が挙げられる。これらの他の補助少量成分の量は、組成物に対して 0. 001〜20重量％であり得る。

[0142] 本実施形態に係る化粧用組成物は、ヒトの皮膚に局所適用される製品、特に、皮膚を整え、潤いを与え、滑らかにし、そして、線のある皮膚、シヮのある皮膚、または老化した皮膚の外観を予防しまたは減少させる薬剤として使用されることが意図される。

[0143] 本実施形態に係る化粧用組成物の使用に際して、少量の、例えば 1〜： LOOmlの組成物を、好適な容器またはアプリケーター力も皮膚の露出面に適用し、必要に応じて、手または指または好適な器具を使用して、皮膚に拡げ、そして擦り込む。

[0144] 一実施形態において、本発明に係る局所皮膚処置用の薬学的組成物は、ローション、クリーム、またはゲルとして製剤化され得る。本実施形態に係る薬学的組成物は、それの粘度および意図される使用に適した容器に包装され得る。本実施形態に係る薬学的組成物は、例えば、ローションまたはクリームは、ボトルまたはロール—ボールアプリケーター、または噴射剤被動エアゾールデバイス（propellant— driven ae rosol device)または指での操作に好適なポンプ付き容器に包装され得る。本実施形態に係る薬学的組成物がクリームの場合は、非変形性ボトルまたはスクイーズ容器、例えば、チューブまたは蓋付き広口瓶に収容されても、カプセルに封入されてもよい。本実施形態に係る薬学的組成物は、化粧的に受容可能な組成物を含有する密閉容器に収容された形態で提供され得る。

[0145] 商業ベースで組成される場合、本実施形態に係る化粧用組成物は、従来の様々な着色料、香料、増粘剤 (キサンタンガムなど)、防腐剤、湿潤剤、皮膚軟化剤、緩和剤、界面活性剤、分散剤、浸透促進剤などを含むことができ、さらに利点が得られ、かつ局所製剤の触り心地および Zまたは外見が改善されるように添加可能である。同様に、この組成物は、クリーム、ローション、軟膏、石鹼または液体ソープ、シャンプー、マスクなどに組成可能である。

[0146] (c)医薬組成物

さらに他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物であり得る。医薬組成物中に使用される医薬用担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、上述した皮膚外用剤およびィ匕粧用組成物として提供される薬学的組成物以外の形態を有する組成物が意図される。

[0147] 経口剤の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセル口ース、コーンスターチ、無機塩等が医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合してもよい。

[0148] 非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等をカロえることにより調製することができる。

[0149] 本実施形態に係る医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物における IL— 18レセプターアンタゴ-ストの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬糸且成物を用いて後述の投与量範囲で IL 18レセプターアンタゴ-ストを投与できるような量であれば特に限定されない。 [0150] 本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。投与方法も特に限定はなぐ内用、外用および注射によることができる。本実施形態に係る医薬組成物は、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤として使用可能であるので、しわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、またはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤として適用可能であり、これらの用途に用いる場合、上述した皮膚外用剤として皮膚に塗布して投与するのが特に好適であり、それにより所望の効果を得ることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。

[0151] 本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人 1 日当り 0. l〜2000mgZkgである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

[0152] 本実施形態に係る医薬組成物を使用すれば、 UV誘導性の皮膚炎、熱傷後の皮膚の過形成、接触性皮膚炎などに伴うケラチノサイトの過剰増殖を防ぐことができる。

[0153] (d)食用組成物

別の実施形態において、本発明は、 IL— 18レセプターアンタゴニストを含有、添カロおよび Zまたは希釈してなる、皮膚肥厚の改善用もしくは予防用の食用組成物（すなわち、食品、飲料または飼料)を提供する。本実施形態に係る食用組成物は、 IL — 18レセプターアンタゴ-ストの生理作用により、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストに感受性を示す個体における、皮膚肥厚に伴う症状改善もしくは予防に極めて有用である。

[0154] 本実施形態にぉ、て、「含有」とは、食用組成物（すなわち、食品、飲料、または飼料）中に IL— 18レセプターアンタゴ-ストが含まれるという態様を、「添加」とは、食用組成物の原料に、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストを添加するという態様を、「希釈」とは IL— 18レセプターアンタゴニストを、食用組成物の原料で希釈するという態様をいう。また、上述した本発明に係る化粧用組成物についての記載における「含有」の語は、本発明の態様にいう含有、添加、希釈の意を含む。

[0155] 本実施形態に係る食用組成物の製造法は特に限定されるものではなぐ調理、カロェおよび一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴニストが含有、添カ卩および/または希釈されて、れば良!、。

[0156] 本実施形態に係る食用組成物としては特に限定はな、が、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類カ卩ェ品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぶら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ノ、ム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、力まぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等)、乳製品 (原料乳、クリーム、ョーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜'果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等)、菓子類 (チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等)、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料 (緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒ一、清涼飲料、乳酸飲料等)、調味料 (しょうゆ、ソース、酢、みりん等)、缶詰'瓶詰め •袋詰め食品 (牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば'うどんの汁、濃縮スープ類)、乾燥食品（即席麵類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品 (すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等)、固形食品、液体食品 (スープ等)、香辛料類等の農産 ·林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。

[0157] 本実施形態に係る食用組成物における本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ- ストの含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点力適宜選択できるが

、例えば、食品 100重量部当たり好ましくは 0. 0001重量部以上、より好ましくは 0. 0 01〜10重量部であり、たとえば、飲料 100重量部当たり好ましくは 0. 0001重量部以上、より好ましくは 0. 001〜10重量部である。

[0158] 本実施形態に係る食用組成物の製造方法に特に限定はなぐ一般の食品製造方法に準じて製造することができ、製造された飼料中に IL— 18レセプターアンタゴニストの有効量が含有、添加および Zまたは希釈されて、ればよ、。

[0159] 本発明に係る食品、飲料または飼料としては、本発明に係る IL— 18レセプターァンタゴ-ストが含有、添加および Zまたは希釈されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状に限定はなぐタブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、本発明に係る IL 18レセプターアンタゴ-ストは、当該生理作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品、飲料または飼料の製造素材として極めて有用である。

[0160] さらに、別の実施形態において、皮膚肥厚改善もしくは予防を行う薬剤を製造するための、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴニストの使用が提供される。

[0161] なお、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ-ストはラットへの腹腔内投与において 5gZkg体重を単回投与しても死亡例は認められない。また、副作用の発生も認められない。

[0162] (e)発毛 '育毛用外用剤

さらに別の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、発毛 '育毛用外用剤であり得る。剃毛後に UV照射した野生型マウスケラチノサイトの照射部位において、再発毛が照射 12日後以降に観察される。しかし、 IL— 18レセプターアンタゴニストを塗布または腹腔内投与すると、照射 7日後に再発毛が観察された。

[0163] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤は、外用剤として従来力公知の剤形とすることができる。特に、ノスタ剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤、散剤、粉末剤、浴剤などの剤形とすることが好ましい。また、上記剤形を利用した、例えば、シャンプ一、リンス、コンディショナー、ヘアートニック、ヘアークリーム、ヘアーリキッド、ヘアーミルク、ヘアーミスト、ヘアーフォーム、ヘアージエル、ヘアースプレー等の態様で使用することができる。

[0164] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤の調製は、上記の剤形に応じ、 IL 18と、製剤学的に慣用されている外用剤成分とを、常法により混合、均一化することにより行うことができる。

[0165] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤の調製において用いられる外用剤成分のうち、基剤成分の具体例としては、例えば以下の成分が挙げられる。

[0166] 脂肪類としては、例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ハードフアット等の合成油、オリブ油、ダイズ油、ナタネ油、ラッカセィ油、ベニバナ油、ヌカ油、ゴマ油、ツバキ油、トゥモロコシ油、メンジッ油、ヤシ油等の植物油、豚脂、牛脂等の動物油及びこれらの硬化油等を挙げることができ、これらの一種を単独で、または二種以上を組み合わせて使用することができる。

[0167] ロウ類としては、例えば、ラノリン、ミツロウ、カルナパロウ、鯨ロウ等の天然ロウや、モンタンロウ等の鉱物ロウ、合成ロウ等を使用することができ、炭化水素としては、例えば、ワセリン（白色ワセリン、黄色ワセリン）、パラフィン、流動パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクヮラン、ポリエチレン末、ゲルィ匕炭化水素等を使用することができる。これらは一種を単独で使用してもよぐまたは二種以上を組み合わせて使用することができる。

[0168] 高級脂肪酸としては、例えば、ステアリン酸、ベへニン酸、パルミチン酸、ォレイン酸等が使用することができる。また、高級アルコールとしては、例えば、セタノール、ステァリルアルコール、ォレイルアルコール、コレステロール等を使用することができ、さらに、多価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、 1, 3 ブチレングリコール等を使用することができる。これらは一種を単独で使用してもよぐまたは二種以上を組み合わせて使用することができる。

[0169] 合成及び天然高分子としては、例えば、カラギーナン、デンプン、デキストリン、デキストリンポリマー（力デキソマー）、トラガント、アラビアゴム、ローカストビーンガム、ぺクチン、ゼラチン、キサンタンガム、プルラン、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセル口ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ポリビュルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビュルポリマー等を使用することができる。また、界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル等を使用することができる。また、これらは一種を単独で使用してもよぐまたは二種以上を組み合わせて使用してもょ、。

[0170] 低級アルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール等を使用することができる。ケトン類としては、例えば、アセトン、メチルェチルケトン等を使用することができる。粉体としては、例えば、カオリン、タルク、酸化亜鉛、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、無水ケィ酸、デンプン等を使用することができる。セルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等を使用することができる。無機塩類としては、例えば、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アルミニウム、ポリリン酸ナトリウム、塩ィ匕アンモ-ゥム、硫酸鉄、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、チォ硫酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、硫化ナトリウム、ホウ砂、酸ィ匕カルシウム、炭酸マグネシウム、塩ィ匕カリウム等を使用することができる。また、これらは一種を単独で使用してもよぐまたは二種以上を組み合わせて使用してちょい。

[0171] より具体的に、各剤形と添加成分の関係を示せば、以下のとおりである。

[0172] パスタ剤は、油性パスタ剤あるいは水性パスタ剤の剤形で使用することができ、油性パスタ剤の場合には、基剤成分として例えば脂肪類、ロウ類、炭化水素等を使用することができる。また、水性パスタ剤には、基剤成分として例えば合成及び天然高分子、多価アルコール、界面活性剤等を使用することができる。

[0173] 軟膏剤の場合には、基剤成分として、例えば、脂肪類、多価アルコール、炭化水素等を使用することができる。

[0174] クリーム剤の場合には、基剤成分として、例えば、界面活性剤、高級アルコール、高級脂肪酸、炭化水素、多価アルコール、水 (精製水を含む)等を使用することができる。

[0175] 液剤及びゲル剤の場合には、基剤成分として、例えば、水 (精製水を含む）、低級アルコール、ケトン類、脂肪類、多価アルコール、界面活性剤、炭化水素、合成及び天然高分子等を使用することができる。

[0176] 散剤及び粉末剤の場合には、基剤成分として、例えば、粉体成分、セルロース誘導体、合成及び天然高分子等を使用することができる。

[0177] 浴剤の場合には、有効成分であるホスホェノールピルビン酸成分を単独で使用してもよく、更に構成成分として、無機塩類等を配合して使用することができる。

[0178] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤には、必要に応じて pH調整剤として、例えば水酸ィ匕ナトリウム等のアルカリ金属の水酸ィ匕物等を使用してもよぐまた、防腐-保存剤として、例えば、安息香酸ナトリウム等の安息香酸アルカリ金属塩、パラォキシ安息香酸エステル、ソルビン酸等を配合してもよい。さら〖こ、これも必要により、抗酸ィ匕剤として、例えばトコフエロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシァ-ソル等を用いてもよい。

[0179] また、本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤には、更に発毛 ·育毛効果を増強させるために、必要に応じて育毛促進効果が期待される他の化合物を配合してもよい。このような化合物としては、例えば、ビタミン類（レチノール、レチナール、レチノイン酸などのビタミン A類、レチノール脂肪酸エステルなどのビタミン Aエステル類、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、 a一力ロチン、 13一力ロチン、 γ—力ロチン、リコペン、チアミン硝酸塩、チアミン塩酸塩、チアミンジスルフイド化合物、リボフラビン、フラビンヌクレオチド、フラビンテトラプチレート、リボフラビンテトラ-コチネート、塩酸ピリドキシン、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキサミン、シァノコバラミン、ニコチン酸、二コチン酸アミド、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ベンジル、パントテン酸、パントテン酸塩、パントテュルアルコール、パントテュルェチルエーテル、ビォチン、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸塩、ァスコルビン酸エステル、ビタミン D類、トコフエロール、酢酸トコフエロール、ュビキノン、プラストキノン、ビタミン Κ類等）、コリン、必須脂肪酸 (リノ一ル酸、リノレン酸、ァラキドン酸）、エイコサトリェン酸、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン、抗高血圧剤（ミノキシジル、ジァゾキサイド等）、 TCA回路関連物質 (c—AMP、コハク酸、クェン酸、 ATP、 FAD、 NAD、 NADP、 L—リンゴ酸、メチルマロ-ル Co A、フマル酸、サクシ-ル CoA、コェンザィム A、 GDP、 GTP、 ADP、 AMP、ォキザ口酢酸、ァセチル CoA等）、植物抽出物（ヒノキチオール、チヨウジ抽出物、アロエ抽出物、カンゾゥ抽出物、サンショウ抽出物、ァカャジォゥ抽出物、センプリ抽出液、ホップ抽出液、ローズマリー抽出液、セージ抽出液、タイム抽出液、人参抽出液、ニンニク抽出液等)及び合成薬効成分 (塩ィヒカプロニゥム等)等が挙げられ、これらの一種を単独で、または二種以上を組み合わせて使用してもよ、。

[0180] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤は、エマルシヨン型の製剤とすることもでき、この場合のエマルシヨンの形態は wZo型、 oZw型、 wZoZw型、 oZwZo型の!、ずれの形態であっても構わな!/、。

[0181] また、本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤自体をそのまま患部に塗布してもよい力例えば、この外用剤を、伸縮性を有する布ゃ不織布あるいはプラスチックシート等に塗布した、、わゆるパップ剤やプラスター剤等の貼付剤として患部に適用してもよい。

[0182] 本実施形態に係る発毛 ·育毛用外用剤は、皮膚に対して安全であり、使用感も良好で、臨床的に優れ、かつ優れた発毛 ·育毛作用を発揮することができるものである。従って、本発明の発毛'育毛用外用剤は、発毛'育毛の促進や薄毛'脱毛 (抜け毛 )の予防、あるいは男性型脱毛症、病後'産後の脱毛、円形脱毛症、発毛不全、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症、びまん性脱毛症、若禿 (壮年性脱毛症）および老人禿（老人性脱毛症)等の治療に十分な効果を発揮することができるものである。

[0183] このように、本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴニストを含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0184] (f)ストレス関連疾患における IL— 18の関与

神経系、内分泌系および免疫系が互いに相互作用して大きな宿主防御ネットヮークを構成するということが、これまでに示されている。これらの相互作用を制御すること力自己免疫疾患および炎症性疾患に対する重要な治療戦略となり得ることが提唱されている。 [0185] 本発明者らは、上述したように、 UV照射、すなわち、酸化ストレスによって、照射部位に IL— 18の発現が亢進し、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストによって当該酸化ストレスによってもたらされる障害を抑制することを見出した。このことは、 UV照射に限らない種々のストレスに応じて IL— 18の発現が増大し、 IL— 18の発現に起因してストレス関連疾患が発症することを示唆する。

[0186] 従って、本発明者らは、種々のストレス負荷に IL— 18がどのように関与するのかを調べた。その結果、本発明者らは、神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用に、 IL— 18が関与することを見出した。具体的には、本発明者らは、固定化ストレスに曝されたマウスの血漿中に多量の活性ィ匕型 IL— 18 (18kDタンパク質）が分泌されることを見出した。

[0187] 本明細書中で使用される場合、用語「ストレス関連疾患」は、外界からの非感染性、非化学性、非傷害性の侵襲、およびそれらに対する個体の反応 (すなわち、ストレス）に起因する疾患または障害が意図され、物理的、生理学的、心理的、精神的、年齢的な侵襲によって惹起、悪ィヒおよび Zまたは進行し得る疾患、ならびにこれらの侵襲によって発症の危険性が増大する疾患が意図される。

[0188] ストレスとの関連が示唆されている疾患としては、心身症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、脾炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、ァカラシァ、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイツプル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルぺス感染、 HIV感染、 B型肝炎ウィルス感染、 C型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、ァメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、ァテローム性動脈、硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアツク病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎

(RA)、滑膜炎、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺炎、全身性エリテマト一デス、グッドパスチヤ一症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、 I型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、 II型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、 SLE、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シエーダレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、または放射性障害、一酸化炭素中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害などが挙げられる。

[0189] このようなストレス関連疾患において、特に、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、尋常性挫創、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、シエーダレン症候群、鬱病、および心身症において、サイト力インの一種である IL— 6が関与することが示唆されている。これらの疾患において、ストレスに応じて血清中の IL— 6濃度が上昇する。このうち、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症においては、それぞれのモデル動物を用いる実験において、抗 IL— 6レセプター抗体を用いることによって疾患が改善することが報告されている。しかし、人間（患者）において抗 IL— 6レセプター抗体を適用した場合、効果が持続しないば力りか効果が一定しなヽと、う不具合を生じる。

[0190] ストレスによって放出される血中 IL— 18濃度の上昇は副腎を起源とする。上記ストレス関連疾患の患者において、ストレスとは関係なぐ IL— 18が上昇 (アトピー性皮膚炎はまれに低下）して、ることが報告されて、る。ストレスによって放出される IL— 1 8上昇と炎症または感染によって放出される IL— 18上昇では、 IL— 18産生を活性化するプロモーター部位が異なることが示されており、よって、ストレス関連疾患において見られる IL— 18上昇がストレスに起因するものかどうかは全く不明であった。

[0191] (g)ストレス関連疾患に対する IL— 18レセプターアンタゴ-ストの効果

本発明者らは、動物モデル (野生型、コラーゲン誘発性リウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウス）にさらにストレスを加えた場合、血漿中 IL— 18 の有意な上昇が数時間以内に観察され、この上昇が、活性酸素を除去する酵素であるスーパーォキシドジスムターゼ（SOD)、 p38 MAPKインヒビター、カスパーゼー 1 1インヒビター、カスパーゼ 1インヒビターによって抑制されることを見出した。このことは、 IL 18を上方制御する特定の経路が存在し、炎症性原疾患の程度に関係なくこの経路が活性ィ匕することを示す。また、この結果は、 ACTH分泌能、副腎皮質機能、および Zまたは一般的なタンパク質合成能力 ^sもともと障害されていない限り、どの疾患においてもストレスによって血中 IL— 18濃度が上昇することを示す。

[0192] 多発性硬化症、シユーダレン症候群、リウマチ様関節炎 (RA)または全身性エリテマト一デス（SLE)のモデルマウスにおいて、病勢悪化前に血中 IL— 18濃度の上昇、引き続く血中 IL 6濃度の上昇が認められた。特に、コラーゲン誘発性のリウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウスに対して、 1日おきに 3時間のストレスを負荷した場合、病態の完成が早まるとともに病勢が悪ィ匕した。また、ストレスの直前（10分前）に IL 18レセプターアンタゴニスト (抗 a抗体 +抗 j8抗体)を腹腔内へ 25 μ g/kg (各抗体を 12. 5 μ gずつ）投与した群にぉ、ては、 RAにおヽて運動および Zまたは歩行の改善、 SLEにおいてループス腎炎（BUNおよび尿中ァルブミン)の有意な改善がみられ、ストレス性の悪ィ匕が回避された。この結果は、巿販の抗 IL 6抗体（Santa Cruz 1265)、抗 IL 6レセプター抗体（Santa Cruz 6 60)を用いた場合においても観察された力これらの抗 IL— 6抗体または抗 IL— 6レセプター抗体よりも有効であった。

[0193] また、野生型、全身性エリテマトーデスモデルマウスを用いた実験において、ストレス開始 30分後に IL— 18レセプターアンタゴニスト (抗 a抗体 +抗 /3抗体)を投与した場合に血中 IL 6濃度上昇の抑制が観察された。

[0194] 以上の結果より、ストレス関連疾患において、ストレスに起因する血中 IL— 18濃度の上昇、引き続く血中 IL— 6濃度の上昇が生じて病勢が悪ィ匕すること、 IL—18レセプターアンタゴ-スト（特に、抗レセプター抗体）を用いると IL— 18だけでなく IL— 6 の血中濃度を抑えることができること、ならびに、 IL— 18または IL— 6のレセプターァンタゴ-ストを用いるとこれらの血中濃度を抑えて、その結果、病勢の悪化を抑えることができることが示された。

[0195] 血中 IL 18は、血中 IL 6と比較して半減期が非常に長い。よって、ストレス関連疾患の治療標的を IL— 18にすること（すなわち、抗 IL— 18レセプター抗体を用いて処置すること）によって、抗 IL— 6抗体または抗 IL— 6レセプター抗体を用いてストレス関連疾患を処置する場合よりも有効である。このことは、抗 IL 6抗体または抗 IL 6レセプター抗体より抗 IL 18レセプター抗体 (抗 ex抗体 +抗 β抗体）の方がストレス関連疾患の治療において効果的であったことと一致する。

[0196] 上述したように、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴ-ストは、ストレス関連疾患を処置することができる。従って、本発明はまた、本発明に係る IL— 18レセプターアンタゴニストを含むストレス関連疾患を処置するための薬学的組成物を提供する。

[0197] 本発明に係る薬学的組成物は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物であってもよい。本発明に係る薬学的組成物の剤型、投与形態、および組成物中に含まれる担体は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物の項に記載されて！、るものを適宜選択すればょ、。

[0198] 本明細書中で使用される場合、「IL 18ZIL— 6関連障害」は、ストレス関連疾患のような血中 IL 18レベルの上昇および血中 IL 6レベルの上昇によって特徴付けられる疾患、障害、または疾病が意図される。

[0199] 〔3 : IL— 18を含む薬学的組成物〕

(a)アポトーシスに対する IL— 18の効果

本発明者らは、インターフェロン γ誘導因子として同定された IL— 18の新たな機能としてアポトーシスを抑制および Ζまたは阻害する機能を見出した。

[0200] 通常、正常な培養細胞は、単層培養を行なうと、細胞の接触阻止によって増殖が阻害されるが、癌細胞のような細胞周期が異常な細胞では、細胞の接触阻止が生じず増殖し続ける。

[0201] 本発明者らは、高密度で培養したケラチノサイトの培養培地中に活性ィ匕型 IL— 18 を添加すると、細胞の接触阻止によるアポトーシスが抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、分ィ匕誘導した培養ケラチノサイトの培養上清に抗 IL— 18抗体を添加すると分ィ匕過程において生じるアポトーシスが抑制されることを見出した。そこで、本発明者らは、アポトーシスが IL— 18関連シグナル伝達経路を介して制御され得るカゝ否かを検討した。

[0202] UV照射後の皮膚障害としては、急性期の炎症反応、表皮遺伝子の障害、ケラチノサイトの過剰増殖による皮膚肥厚および落屑の発生、組織免疫の抑制が挙げられる。上記障害に対して、 IL—18は、以下の効果を有することが見出された： •急性期にお、ては、過剰なアポトーシスによる上皮の脱落を防ヽだ；

•中期、後期においては、ケラチノサイトの過剰増殖を引き起こし、皮膚組織中の免疫抑制を惹起した (IL 4および IL 10の誘導)。

[0203] 培養ケラチノサイトを用いた実験結果より、 IL—18は、分化誘導初期の細胞に対して p38 MAPK、 MEK3Z6を介するシグナル伝達を引き起こす。 IL 18は、分化の各段階において、生存因子、分化誘導因子、増殖誘導因子としての機能を発揮する。一方、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストを用いて IL— 18を阻害することによって、皮膚の過形成またはケロイド形成が防がれた。

[0204] 本発明に係る IL— 18を含む薬学的組成物は、皮膚の角化を促す作用があることから、日焼けなどにより引き起こされる皮膚の色素沈着の原因物質であるメラニン代謝を早めることによって皮膚の色素沈着の改善効果 (美白効果)を有し、美白剤として使用できる。角化改善剤および美白剤は、内服、外用その他いずれの方法によつても投与可能であり、また有効成分として、 IL 18の他に通常使用される抗炎症剤、ビタミン類等を必要に応じ適宜配合できる。

[0205] 一実施形態において、本発明は、 IL 18を含む抗アポトーシス作用を有する組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗アポトーシス作用」は、アポト一シスを生じる細胞が減少すること、すなわち、アポトーシスを抑制および Zまたは阻害することが意図される。

[0206] 本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、 IL— 18を含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0207] 〔4 :IL 18関連障害を予防および Zまたは治療するための薬学的組成物〕

上述したように、本発明者らは、動物モデル (野生型、コラーゲン誘発性リウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウス）にさらにストレスを加えた場合、血漿中 IL— 18の有意な上昇が数時間以内に観察され、この上昇が、活性酸素を除去する酵素であるスーパーォキシドジスムターゼ（SOD)、 p38 MAPKインヒビタ一、カスパーゼ一 11インヒビター、カスパーゼ一 1インヒビターによって抑制されることを見出した。さらに、 IL— 18レセプターアンタゴ-ストによって、ストレス依存的な血中 IL 18濃度の上昇が抑えられた。これらのことより、スーパーォキシドジスムターゼ（ SOD)、 p38 MAPKインヒビター、カスノーゼー 11インヒビター、またはカスノーゼ 1インヒビターが、 IL 18関連障害、好ましくは、ストレス関連疾患を処置するために有効であることがわ力つた。

[0208] 1つの局面において、本発明に係る薬学的組成物は、 IL— 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにスーパーォキシドジスムターゼを含むことを特徴としている。

[0209] 他の局面において、本発明に係る薬学的組成物は、 IL 18関連障害を予防および/または治療するために p38 MAPKインヒビターを含むことを特徴として、る。

[0210] さらに他の局面において、本発明に係る薬学的組成物は、 IL— 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにカスパーゼー 1インヒビターを含むことを特徴としている。

[0211] なおさらなる局面において、本発明に係る薬学的組成物は、 IL— 18関連障害を予防および Zまたは治療するためにカスパーゼ 11インヒビターを含むことを特徴としている。

[0212] 本発明に係る薬学的組成物は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物であってもよい。本発明に係る薬学的組成物の剤型、投与形態、および組成物中に含まれる担体は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物の項に記載されて！、るものを適宜選択すればょ、。

[0213] 本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、スーパーォキシドジスムターゼ（SOD) 、 p38 MAPKインヒビター、カスパーゼ 11インヒビター、またはカスパーゼー 1ィンヒビターを含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。 [0214] 本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明される力これらに限定されるべきではない。

実施例

[0215] (実施例 1 :抗 IL— 18レセプター抗体の生成）

抗ペプチド抗体実験プロトコール (秀潤社、 1994年）に従って、 IL— 18レセプター aサブユニットおよび βサブユニットに対する抗体を作製した。具体的には、配列番号 5〜10に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを作製 (MBL社)し、これらの合成ペプチドを MBS法を用いて KLH (Calbiochem (374805) )とカップリングした後、カップリングした抗原 (200 μ g)をフロイント完全アジュバンド（ャトロン） 1. 5mlと混濁させて抗原液を調製し、この抗原液を背部への皮下注射によってゥサギ Ciapanese white)を免疫した。

(表 1：抗レセプター抗体を生成するためのペプチド抗原）

[0216] [表 1]

[0217] 続いて、上記カップリング抗原（200 g)とフロイント不完全アジュバント（ャトロン） 1 . 5mlとを混濁させてさらなる抗原液を調製した。最初の抗原液注射の 1週間後以降にこのさらなる抗原液を追加免疫として 1週間ごとに 5回皮下注射した。その 1週間後に 22Gの留置針を用いて耳下静脈より静脈血（20mほたは 100ml)を採取した。採取した静脈血は 37°C、一時間静置した後に 3， OOOrpmで 30分間（4°C)で遠心分離を行なって、血清画分を抽出して目的の抗体を含む抗血清を得た (抗 α抗血清 (Α 〜D)および抗 β抗血清 (Εおよび F) )。

[0218] 必要に応じて、各抗原ペプチドを結合させた CNBr活性ィ匕セファロース 4Β (フアルマシア)カラムを用いて、抗血清力も抗体をァフィ-ティ精製した。 [0219] (実施例 2 :抗 IL— 18レセプター抗体の検討）

抗 IL— 18レセプター aサブユニット抗体として ACRIS社の MsAgGl (H44クローン：抗ヒト）、 GT社の 70625 14— P398 (抗ヒト）および 112624 14— P398 (抗ヒト )が現在市販されているが、抗 IL— 18レセプター j8サブユニット抗体は、市販されていない。

[0220] 実施例 1で得られた抗 ex抗血清 (A〜D)を、市販の抗 IL— 18レセプター αサブュニット抗体と比較した。

[0221] 上記の市販の抗 IL— 18レセプター aサブユニット抗体は、培養 KG— 1細胞サンプルでのフローサイトメトリー、培養 KG— 1細胞サンプルでのウェスタンブロット、 ELI SA、培養 KG— 1細胞の分泌する IL— 18による IFN— yの産生能の中和などに用いられているが、組織標本に対する免疫組織化学、および組織抽出物に対するゥェスタンプロットに用いることができな、。

[0222] 1 X 10⁵細胞 Zプレートの市販のヒトのケラチノサイト KG— 1細胞（Cambrex社、米国）の培養培地に組換えヒト IL— 18 (40ng/ml)を添カ卩した。組換えヒト IL— 18として、 J. Immunol. 156 : 4274— 9 ( 1996)および Nature 378 : 88— 91 ( 1995)に記載の組換えタンパク質を使用した。

[0223] 市販の抗 IL— 18レセプター atサブユニット抗体 (ACRIS社の MsAgGl)と実施例 1で得られた抗 a抗血清 (A〜D)とを同一タンパク質量で用いて、 KG— 1細胞に対する組換え IL— 18依存的な IFN— yの産生能の中和を比較した。

[0224] 実施例 1で得られた抗 α抗血清の中和活性はいずれも、市販の αサブユニット抗体とほど同程度であった。この抗 a抗血清 (A〜D)は、 aサブユニット抗体以外の抗体も含んでいるため、市販の αサブユニット抗体より十分強い中和活性を有することがわかった。また、実施例 1で得られた抗 j8抗血清 (Eおよび F)の、ずれも、抗 α抗血清 (A〜D)と同程度の中和活性を有した。

[0225] 次、で，これらの抗 α抗血清 (A〜D)および抗 β抗血清 (Εおよび F)を用いて，フローサイトメトリー、免疫沈降、ウェスタンブロット、 ELISA (脳ホモジネート可溶性画分、培養 KG— 1細胞、およびマウス腹腔マクロファージ）、免疫組織ィ匕学 (OCT凍結、新鮮凍結、パラフィン包埋切片）を行った。いずれの抗血清を用いても、上記実験にお、て明瞭な結果を得ることができた。

[0226] さらに、ペプチド α— Αとペプチド α— Βとの混合抗原、ペプチド α— Cとペプチド a Dとの混合抗原、およびペプチド |8— Eとペプチド |8— Fとの混合抗原を用いて免疫して得た抗血清をさらにァフィ-ティ精製した (それぞれ、抗ヒト α抗体、抗マウス α抗体および抗 j8抗体)。これらの抗体を用いて，上述の抗血清と同様に、上記実験において明瞭な結果を得ることができた。特に、ウェスタンプロット解析において、上記抗血清を用いる場合よりもノックグラウンドが低ぐ解析に用いるサンプルのタンノク質量が 1Z10であっても明瞭な結果を得ることができた。 ELISA解析において、上記抗血清を用いる場合よりも、解析に用いるサンプルのタンパク質量が 1Z5〜1 Z2であっても明瞭な結果を得ることができた。さらに、抗ヒト α抗体、抗マウス α抗体および抗 j8抗体はいずれも、抗原との親和性が市販の抗体よりの 5倍以上高ぐ KG —1細胞における IL— 18によるインターフェロン γ産生を有意に阻害した (ND (50

50

%中和用量）： 0. 075-0. 2 gZml:市販の抗体の 3倍以上）。

[0227] 最近、 IL— 18レセプター βサブユニットに対する抗体力市販された（GT社の 13 2016 14 Ρ398 (抗ヒト）。データシートには、 ELISA,ウェスタンブロット、および I L— 18依存的な IFN— γの産生能の中和が可能と記載され、 ND が 0. 3〜1. Ο μ

50

gZmlであると記載される。

[0228] しかし、中和活性 (ND )の測定時に本発明者らが使用した組換えヒト IL— 18は、

50

市販のラット IL— 18 (GT社)と比べて 5倍以上の IFN— γ産生効果を有することに注意しなければならない（データは示さず)。このことは、組換え IL— 18生成時に起こるタンパク質のフォールデイングの差に起因すると考えられる。従って、本発明者らが使用した組換えヒト IL— 18を使用して行えば、 GT社の抗 IL— 18レセプター βサブユニット抗体による ND の値は、データシートに記載されている値よりもさらに大きく

50

なるはずである。

[0229] 以上のように実施例 1で作製した抗 a抗血清および抗 β抗血清は、 Vヽずれも IL 18による IFN— γの産生能の中和、組織標本に対する免疫組織化学、 ELISA,フローサイトメトリー、免疫沈降、培養細胞サンプルおよび組織抽出物に対するウェスタンブロットに用いることができた。さらに、複数のペプチドを混合して免疫することによつて惹起した抗 (X抗体および抗 β抗体は、実施例 1で作製した抗 (X抗血清および抗 β抗血清よりも優れていることがわ力つた。

[0230] (実施例 3 :UV照射したマウスケラチノサイトにおける IL— 18および IL— 18レセプターの発現）

以下の実施例にぉ、て、上述の抗 a抗体および抗 β抗体を用いた。

[0231] 野生型マウス (C57ZB6 :ォス）の背部を剃毛した後、紫外線 (UV) 300mJを照射した。 UV照射後のマウス背部における皮膚の厚さの変化を調べるとともに、抗 IL— 1 8抗体 (MBL)および実施例 2で作製した抗 IL 18レセプター抗体 (抗 a抗体および抗 β抗体）を用いた免疫組織科学によって、 IL— 18および IL— 18レセプターの発現を調べた。

[0232] マウスをジェチルエーテルで麻酔した後、頸動脈を切断して失血死させた。 4%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝ィ匕水溶液 (_ΡΗ7. 4)で灌流固定した後、マウス背部の皮膚 (真皮層および皮下組織を含む)を採取した。皮膚を、 4%パラホルムァルデヒドを含むリン酸緩衝ィ匕水溶液 (ΡΗ7. 4)中に 48時間浸潤して固定した後に脱水し、ノフィンに浸潤してパラフィン包埋した。

[0233] 包埋した皮膚組織を、断面が皮膚表面に対して垂直になるように 4 m厚の切片にスライスし、シランコートしたスライドガラス上に固着させた。以下の操作を、スライドガラス上に固着した切片に対して行った。

[0234] 切片を、キシレン、 100%エタノール、 95%エタノール、 90%エタノール、 80%エタノール、および 70%エタノール中に順々に浸潤させて、切片の脱パラフィン処理および親水化を行った。続いて、この切片について、 0. 01%過酸化水素水中にて内因性ペルォキシダーゼを失活させ、蒸留水で洗浄した後、 5%牛血清アルブミン (BSA )を含有するリン酸緩衝化水溶液 (A液）中に 1時間ブロッキングした。

[0235] 次、で、この切片を、上記 A液を用いて作製した各一次抗体反応液（5 μ gZmlの抗 IL 18抗体、抗 a抗体または抗 j8抗体をそれぞれ含む）中にて、 4°Cで 24時間ィンキュペートした。一次抗体反応後にリン酸緩衝化水溶液で洗浄し、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)を結合体化した抗ャギ IgG、抗マウス IgG、または抗ゥサギ IgG (Santa Cruz社)を A液中に含む二次抗体反応液（1 μ g/ml)中にて室温で 3時間インキュベートした。二次抗体反応後にリン酸緩衝ィ匕水溶液で洗浄した。

[0236] 20mgの 3— 3ジァミノベンチジン（DAB、片山化学）を含む 0. 05M Tris緩衝ィ匕生理食塩水を用いて、上記反応後の切片を発色させた。発色を停止した後に切片を洗浄し、エタノール（70%、 80%、 90%、 95%および 100%)およびキシレンに順々に浸潤して脱水し、ソフトマウント（和光純薬)を用いてカバーガラスで封入した。

[0237] 得られた免疫組織標本を光学顕微鏡を用いて観察した結果を、図 1に示す。免疫組織ィ匕学の結果、 UV照射部位において、ケラチノサイトが高度に増殖しており、 IL 18だけでなく IL 18レセプター aサブユニットおよび 13サブユニットの発現量が増加した (それぞれ、 6〜12日後、 9〜12日後、 6〜9日後）。

[0238] (実施例 4 : UV照射によるマウスの皮膚障害に対する抗 IL 18レセプター抗体の効果）

野生型マウス (C57ZB6：ォス）の背部を剃毛し、紫外線 (UV) 300mJを照射した 4 日後に、抗 IL— 18レセプター抗体 (抗 oc抗体と抗 β抗体を混合して用いた)を UV照射部位に塗布し（250pgZcm²)、その 5日後の皮膚の厚みを測定した。

未処置のマウスにおいて UV照射 4日後以降に観察される表皮肥厚力抗 IL 18レセプター抗体の塗布によって抑制された（図 2A)。

[0239] IL- 18ノックアウト (KO)マウスに対して同様に UV照射を行ったところ、野生型で観察される UV照射 4日後以降の表皮肥厚が見られな力つた（図 2B)。

[0240] これらの結果は、 UV照射後の表皮肥厚には IL— 18が関与し、抗 IL— 18レセプタ一抗体は UV照射後の表皮肥厚を抑制することを示す。

[0241] 次に、抗 α抗体と抗 j8抗体のいずれが上記の結果をもたらすのかを検討した。

[0242] 上述したように、野生型マウスの背部を剃毛し、紫外線 (UV) 300mJを照射した 4 日後に、抗 IL 18レセプター抗体 (抗 α抗体、抗 |8抗体、または混合)を UV照射部位に塗布した（250pgZcm²)。マウス照射部位における皮膚肥厚は、いずれの抗 IL 18レセプター抗体を用いても抑制されたが抗 a抗体の方が抗 β抗体より効果的であった（図 3)。抗 a抗体と抗 β抗体との混合適用では UV照射前の厚みを維持しており、混合適用が最も効果的であることがわ力つた。

[0243] (実施例 5 :紫外線照射によるマウスケラチノサイトにおける変化）マウス背部を剃毛した後、紫外線 (uv) 300miを照射し、照射後の皮膚の脱落、肥厚、修復の過程を、ケラチノサイトに注目して観察した。

[0244] 野生型マウス (C57ZB6 :ォス）に紫外線を照射すると、表皮において以下のような変化が観察された：

1)早期変化（24時間以内に観察される）

(a)表皮の腫脹と発赤

(b)アポトーシス性の表皮ケラチノサイト層脱落

2)中期変化 (2〜5日目〖こ観察される）

(c)表皮の角化および落屑の発生

(d) IL— 18レセプタータンパク質および IL— 18タンパク質の発現量の亢進

(e)ケラチノサイトの増殖および Zまたは分ィ匕の活性化、ならびにこれに伴う上皮肥厚 3)後期変化 (5〜15日目に観察される）

(f)上皮肥厚（10日目にピーク）

(g)再発毛（12日目以降)。

[0245] 同様に IL— 18 (— Z— )マウス（C57ZB6バックグラウンド：ォス）に対して紫外線を照射した場合、上記 (b)が顕著に亢進したが、（c)、（e)、（f)は軽度であり、（は、 4〜6日目に観察された。

[0246] (実施例 6： UV照射部位における細胞内シグナル伝達分子の活性化）

UV照射後の野生型マウス (C57ZB6：ォス）の皮膚にぉ、て、皮膚の肥厚とともに、増殖および Zまたは分ィ匕に関与するシグナル伝達分子 (MEK3Z6および p38 MAPK)が集積する。また、 UV照射後の皮膚において、細胞周期のマーカータンパク質であるサイクリン D1が、高度に産生される。しかし、 IL— 18 (— Z— )マウス（C 57/B6バックグラウンド:ォス）においては、このような現象が観察されない（図 4A、図 5Aおよび図 6A)。これらのことは、 UV照射後のケラチノサイトにおいて、 IL—18 依存的に MEK3Z6および p38 MAPKを介するシグナル伝達経路が活性ィ匕されてサイクリン D1を発現し、ケラチノサイトの増殖および Zまたは分ィ匕が制御されていることが示唆された。そこで、 UV照射した野生型および IL— 18 KOマウスにおいて、 MEK3Z6に対する抗体、 p38 MAPKに対する抗体（ともに活性ィヒ型を認識するリン酸ィ匕抗体）、およびサイクリン Dlに対する抗体を用いて、 UV照射部位のケラチノサイトにおけるこれらシグナル伝達分子の活性ィ匕を調べた。

[0247] 実施例 3と同様に UV照射後のマウス背部における皮膚の厚さの変化を調べるとともに、上記シグナル伝達分子に関する免疫組織ィ匕学標本を作製した。

[0248] 具体的には、抗サイクリン D1抗体（400倍、 cell signaling technology)、抗リン酸化型 MEK3Z6抗体（400倍、 SantaCruz)、抗 p38 MAPK抗体（100倍、 cell signaling technology)および抗リン酸化型 p38 MAPK抗体（400倍、 cell si gnaling technology)を一次抗体に用いた以外は、実施例 3で行った手法と同様に免疫組織標本を作製した。

[0249] 野生型では、 MEK3Z6、 p38 MAPKのリン酸化が生じたが、 IL— 18 KOマウスでは、 MEK3/6, p38 MAPKのリン酸化が生じておらず、サイクリン D1の発現量も野生型と比較して低下して、た（図 4B、図 5Bおよび図 6B)。

[0250] さらに、 UV照射部位による IL—18依存的な MEK3Z6、p38 MAPKの活性化、サイクリン D1の発現は、照射部位への抗 IL— 18レセプター抗体の塗布によって抑制された（図 4B、図 5Bおよび図 6B)。

[0251] 以上の結果より、マウスケラチノサイトの UV照射部位では、 IL— 18依存的な MEK

3/6、 p38 MAPKの活性化、サイクリン D1の発現が生じ、その結果、ケラチノサイトの増殖および Zまたは分ィ匕が生じることが示された。

[0252] (実施例 7 :UV照射部位における再発毛に対する IL— 18レセプターアンタゴ-ストの効果）

実施例 3と同様に野生型マウス (C57ZB6：ォス）および IL— 18 (— Z—）マウス (C 57ZB6バックグラウンド:ォス）の背部を剃毛した後、紫外線 (UV) 300mJを照射し、 UV照射直後に照射部位または腹腔内に抗 IL— 18抗体を塗布または投与した。

[0253] UV照射後のマウス背部の皮膚 (2 X 2. 6cm)を経時的に採取した。採取した皮膚標本を実体顕微鏡下で 2mm四方に区分し、それぞれの区分における発毛域の割合を顕微鏡的に観察した。全区分における発毛域の割合を統計学的に処理して、その皮膚標本における発毛域の割合として評価した。

[0254] UV照射直後に抗 IL— 18レセプター抗体を塗布 (250pg/cm²)したマウスの UV 照射部位において、再発毛が促進された。具体的には、 UV照射 12日後以降に観察される再発毛が、抗 IL— 18レセプター抗体の塗布によって UV照射 7日後に観察された。同様の結果を、 2000pgZマウスでの腹腔内投与によって得た（図 7)。

[0255] 以上の結果は、 IL 18の機能阻害によって発毛が促進されることを示す。

[0256] 本実施例における塗布と腹腔内投与とによる効果を比較した場合、腹腔内投与の方がやや効果的であつたが、塗布に用いる基剤を変更することによって効果が異なつた。このことから、基剤を選択すれば塗布の場合でも腹腔内投与の場合と同様の効果が期待できる。

[0257] (実施例 8：培養ヒトケラチノサイトに対する IL - 18の効果）

市販のヒトのケラチノサイト KG— 1細胞 (Cambrex社、米国）を、ケラチノサイト増殖培地（クラボウ）を分注した直径 6cmのプレート中に播種した（2 X 10⁵細胞 Zプレート )。細胞を 10日間増殖させた後、培地に組換え IL— 18を添加した (最終濃度 500pg /ml)。組換え IL— 18として、 J. Immunol. 156 :4274— 9 (1996)および Nature 378 : 88- 91 (1995)に記載の組換えタンパク質を使用した。無添加または PBS 添加の場合、ケラチノサイトは接触阻止によるアポトーシスが誘導された。しかし、 IL —18を添加した場合、接触阻止によるアポトーシスは、少なくともさらに 10日間抑制された (結果は示さず)。

[0258] 次に、分ィ匕したケラチノサイトに対する IL— 18の効果を観察した。上述したように K G 1細胞を、ケラチノサイト増殖培地 (クラボウ）を分注した直径 6cmのプレート中に播種した（2 X 10⁵細胞/プレート)。細胞が 70%コンフルェントに達するまで 6日間増殖させた後、 1. 2mM CaClを培地に添加して細胞を分ィ匕させた。分化誘導時

2

に抗 IL— 18抗体 (MBL社)を培地に添カ卩（最終濃度 1 μ g/ml)すると、抗 IL— 18 抗体無添加時に観察される分ィ匕ケラチノサイトのアポトーシスが抑制された（図 8)。

[0259] 分化誘導時に IL一 18 (最終濃度 500pgZml)、抗 IL— 18抗体 (最終濃度 500pg

Zml)を培地に添カ卩して、 12日後に TUNEL染色した細胞を計数し、アポトーシスが誘導された細胞数を算出した。結果を図 9に示す。

[0260] 無添加または PBS添カ卩 (ネガティブコントロール)の場合、分ィ匕したケラチノサイトにおいて、分ィ匕誘導 12日目以降にもさらにアポトーシスが誘導される細胞 (アポトーシス細胞）が観察される力 IL— 18を添加した場合は、観察されるアポトーシス細胞の数が有意に減少した。

[0261] また、抗 IL— 18抗体を添加した場合は、観察されるアポトーシス細胞の数が有意に増カロした。ケラチノサイトの分化を誘導すると、 IL— 18が大量に産生されて培養上清中に分泌される (結果は示さず)。よって、抗 IL— 18抗体が、ケラチノサイト分化誘導に伴って分泌された IL— 18の機能を阻害したと考えられる。

[0262] 以上の結果より、 IL— 18は、未分化状態または分化した状態に関わらず、ヒトケラチノサイトにおいて誘導されるアポトーシスを阻害するということが示された。

[0263] (実施例 9 :UV依存的または放射線依存的なケラチノサイトのアポトーシスに対する IL—18の効果）

実施例 8に示したように、培養ケラチノサイトにおけるアポトーシスが IL— 18によつて抑制された。そこで、 UV照射したマウスケラチノサイトにおける UVによる DNA損傷依存的なアポトーシスに対する IL— 18の効果を調べた。

[0264] 実施例 3と同様に作製した皮膚切片に対して、プロティナーゼ K液を用いて 37°Cで 5分間タンパク質分解処理を施した。 PBS (—）で洗浄した後、アポトーシスによる断片化によって露出している DNA末端を、 TdT液中で標識した（37°Cで 2時間）。この切片を洗浄した後、 HRPを結合体ィ匕した抗 TdT抗体を含む反応液中でインキュべートし（37°Cで 30分）、アポトーシスによる DNA断端にペルォキシダーゼを結合させた。インキュベート後に洗浄し、実施例 3と同様に発色させた後、脱水および封入した

[0265] ァボトーシス細胞数の評価を、 TUNEL染色によって行った。アポトーシス検出キット（和光純薬)をその指示書に従って用いて、 TUNEL染色を行った。アポトーシス細胞数は TUNEL染色陽性細胞として計数できる。アポトーシス細胞の数は光学顕微鏡下（X 100)にて同一切片中の 6視野を計数し、 6視野の平均数をその切片中のァボトーシス細胞数とした。

[0266] 実施例 5に示したように、野生型マウス (C57ZB6 :ォス）に紫外線を照射すると、表皮における早期変化（24時間以内に観察される）としてアポトーシス性の表皮ケラチノサイト層脱落 (上記 (b) )が観察されるが、 IL— 18 (-Z-)マウス (C57ZB6バックグラウンド:ォス）に対して紫外線を照射した場合は、この現象が顕著に亢進した（図 10)。

[0267] UV照射直後に IL— 18を塗布（500pgZcm²)したマウスにおいて、アポトーシス細胞は優位に減少していた（図 11A)。同様の結果を、 250pg/cm²での塗布および 2 OOOpgZマウスでの腹腔内投与によって得た。また、 IL— 18 KOマウスにおいては、 UV照射によるアポトーシスの誘導は高度に生じた（図 11A)。

[0268] UVの代わりに放射線 (4Gray)を照射して、同様にアポトーシス細胞を観察した。

放射線照射直後に IL— 18を塗布（500pgZcm²)したマウスにおいて、アポトーシス細胞は優位に減少していた（図 11B)。同様の結果を、 1500pgZマウスでの腹腔内投与によって得た。また、 IL— 18 KOマウスにおいては、 UV照射によるアポトーシスの誘導は高度に生じた（図 11B)。

[0269] 以上の結果は、 IL— 18を用いれば、皮膚に対する UVまたは放射線によってもたらされる上皮皮膚障害 (特に、上皮のアポトーシス性脱落)を、予防および Zまたは処置できることを示す。

[0270] UV照射後のマウス皮膚障害に対して、組換え IL— 18を塗布または腹腔内投与して、その効果を調べた。具体的には、 UV照射した直後のマウスに対して、皮膚に IL - 18を塗布 (250pg/cm²)または腹腔内投与（lOOOpgZマウス）した場合、実施例 6に示した (a)〜 (g)の変化のうち、落屑の発生以外が緩和した。

[0271] 上記濃度の IL 18を長期（3週間以上)塗布すると、皮膚の硬化を伴わない経度の皮膚肥厚が生じた (ケラチノサイト分ィ匕促進による落屑は多い)。しかし、 UV照射に起因する皮膚障害はやや緩和された。

[0272] 以上の結果より、低濃度の IL— 18を、 UVまたは放射線の照射直後に塗布または腹腔内投与することが適切であることが示された。

[0273] (実施例 10：ストレス関連疾患に対する IL 18の効果）

神経系、内分泌系および免疫系が互いに相互作用して大きな宿主防御ネットヮークを構成するということが、これまでに示されている。これらの相互作用を制御すること力自己免疫疾患および炎症性疾患に対する重要な治療戦略となり得ることが提唱されている。神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用に、 IL— 18が関与することを見出した。

[0274] マウスの血漿 IL— 18に対する一酸ィ匕窒素 (NO)の関与を調べた。マウス（野生型または iNOS (NO合成酵素）ノックアウトマウスに固定化ストレスを与えて、血漿中の N02Z3レベルおよび IL— 18レベルを調べた。また、組換え IL— 18を注射した iN OSノックアウトマウスにおける血漿 IL— 18レベルの時間経過を観察した。野生型マウスにおいて、血漿中の N02Z3濃度が上昇した力 iNOSノックアウトマウスにおいては、上昇しなかった。野生型マウスにおいて、血漿中の IL— 18レベルが 50pgZm l→1000pg/mlへ上昇した力 iNOSノックアウトマウスにおいては、 3000pgZml にまで上昇した。ィムノブロッテイングの結果より、血漿中の IL— 18タンパク質は、 18 kDの活性化型であった。 iNOSノックアウトマウスと野生型マウスとの間で血漿 IL— 1 8レベルの変化を比較したところ、血漿 IL 18レベルの減少において差異が存在した。

[0275] 以上の結果より、 (1)固定化ストレスに曝露されたマウスにおいて、血漿中の N02 Z3濃度が上昇すること、（2)固定化ストレスに曝露されたマウスにおいて、血漿中の活性ィ匕型 IL— 18レベルが上昇すること、が示された。 iNOSは、ストレス誘導性の血漿 IL— 18レベルの上方制御を特に阻害することがわかった。

[0276] さらに、マウスの血漿 IL 18レベルに対する固定化ストレスの影響を調べた。ストレスを受けたマウスでの血漿 IL 18レベルに対する ACTHおよび抗 ACTH抗体の影響もまた調べた。ィムノブロッテイング法を用いて血漿中および副腎中の IL— 18タンパク質の特徴付けを行った。固定化ストレスによって、血漿中および副腎中の IL—1 8タンパク質レベルが増加した（> 1000pgZml)。抗 ACTH抗体は、上記増加レべルの IL— 18タンパク質を有意に抑制した。 ACTH投与によって、副腎中の IL— 18 タンパク質レベルが増加した力 ACTH自体の誘導では血漿中の IL 18タンパク質レベルは上昇しなかった。ィムノブロッテイングの結果より、副腎中の IL— 18タンパク質は、主に 24kDの不活性化型であり、血漿中の IL— 18タンパク質は、 18kDの活性ィ匕型であった。

[0277] 以上の結果より、固定化ストレスに曝露したマウスにおいて、（1)血漿において活性化型の IL—18HPA軸を介して上方制御されること、（2)副腎において不活性ィ匕型（ 24kD)の IL— 18が誘導され、そして切断されて 18kDの活性ィ匕型として血中に分泌されること、（3)不活性ィ匕型力活性ィ匕型への切断が、血漿中の IL— 18の上方制御に関する重要な要因であること、が示された。すなわち、神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用に IL— 18が関与することが示された。

[0278] (実施例 11：ストレス負荷時の血漿 IL— 18濃度に対する NADPHォキシダーゼァンタゴ二ストの効果）

野生型マウス（C57ZB6 :ォス）、 CYBB (NADPHォキシダーゼ遺伝子）（一 Z— )マウス（C57/B6バックグラウンド：ォス）を、 27ミリ径のプラスティックチューブ中に 6 時間拘束した後、麻酔下で心臓採血した。遠心分離を行って血漿を採取し、血漿中の IL— 18濃度を ELISA法（Quantikine R&D社）を用いて測定した。野生型マウスの 1群に対して、ストレス開始 1時間後に DIPHENYLENEIODNIUM (DPI： NA DPHォキシダーゼインヒビター）を 30 μ gZ匹腹腔内投与してその効果を検討した（図 12)。

[0279] 血漿中の IL— 18濃度の上昇は、野生型では DPI投与によって 400pgZmlに抑制され、 CYBB遺伝子欠損マウスでは 300pgZmlにとどまった。これらの結果は、 NA DPHォキシダーゼを抑制することによって、ストレス依存的な血漿 IL 18の上昇を抑制することができることを示す。また、ストレスによる血漿 IL— 18の上昇に関しては、活性酸素のアンタゴ-ストである NADPHォキシダーゼアンタゴ-ストが抑制剤として機能することが示された。

( * * ;p< 0. 001 (ストレスなしのコントロールに対して）、 # ;ρく 0. 01 (ストレス負荷野生型に対して）、 η= 9)。

[0280] また、同様の実験を静脈内注射によって行った力同様の結果を得た (データは示さず)。

[0281] (実施例 12：ストレス依存的な血清 IL 6レベル上昇に対する抗 IL 18レセプター抗体の効果）

野生型マウス（C57/B6：ォス）、 IL— 18 (― Ζ )マウス（C57ZB6バックグラウンド:ォス)を実施例 11と同様の方法で拘束した後、 1匹ずつのケージに解放した。解放 6時間後に実施例 11と同様の方法で血清を採取して、血清中の IL 6濃度を測定した（図 13)。

[0282] IL— 18 ( Z—)マウスでは血清中 IL— 6の上昇が極めて低レベルであり、ストレス依存的な血清中 IL— 6レベルの上昇に対して IL— 18が関与していることが示された

[0283] なお、図中には示していないが、 3時間のストレスに起因する IL— 6レベルの上昇は、ストレス負荷の 10分前に抗 IL— 18レセプター抗体 (抗 α抗体 +抗 β抗体）を 25 IX gZkg腹腔内投与することによって抑制された。

( * * ;p< 0. 001、 * ;p< 0. 01 (ストレスなしの野生型に対して）、 # # ;p< 0. 00 1、 # ;p< 0. 01 (同一時間点におけるストレスなしの野生型に対して）、 n=4〜9)。

[0284] (実施例 13：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な血清 IL— 18レベルの上昇）

腎炎および Zまたは関節炎などを自然発症するマウスとして、全身性エリテマトーデスのモデルマウスと広く認知されて、る MRLZlprマウス（日本チヤ一ルス ·リバ一、 12週）に対して、実施例 11と同様にストレスを負荷した後の血清中 IL— 18レベルを調べた（図 14)。

[0285] MRLZlprマウスにおいて、ストレス依存的な血清中 IL 18レベルの上昇が認められた。図には示していないが、この上昇は、野生型マウスと同様に、 SOD、 DPI, p 38 MAPKインヒビター、カスノーゼ 1インヒビター、カスノーゼ 11インヒビターによつて抑制された。

( * * ;p< 0. 01 (ストレスなしのコントロールに対して）、 n=6)

(実施例 14：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な血漿 IL 6レベルの上昇）実施例 13で用いた MRLZlprマウス（12週）に 3時間のストレスを負荷した後の血漿中 IL 6レベルを調べた。さらに、拘束開始 10分前に種々の抗 IL— 18レセプター抗体を投与して、これらの抗体の効果を調べた。抗 IL 18レセプター抗体としては、抗 α抗体、抗 j8抗体、およびこれらの混合物を用いた（図 15)。

[0286] ストレスに起因して血漿中 IL 6レベルは上昇したが、ストレス負荷の 10分前に抗 I L— 18レセプター抗体 (抗 a抗体 +抗 β抗体)を 25 μ gZkg腹腔内投与することによってこの血漿中 IL 6レベルの上昇は抑制された。抗抗体または抗 β抗体のみの投与によっても抑制されたが、混合物の投与の方が効果的であった。

[0287] (実施例 15：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な尿中アルブミンレベルの上昇に対する抗 IL 18レセプター抗体の効果）

実施例 13で用いた MRLZlprマウスに（12週）に対して、隔日で 3時間づつのストレス負荷を 3週間にわたって行い、ストレス負荷後の一日尿中のアルブミン量を測定した。また、拘束開始 10分前に抗 IL— 18レセプター抗体 (抗 α抗体 +抗 |8抗体)を 25 μ gZkg腹腔内投与して抗体の効果を調べた。さらに、抗 IL 6抗体 (Santa Cr uz社、 SC1265)を投与して、その効果を調べた（図 16)。

[0288] MRLZlprマウスにおいて、ストレス負荷により尿中アルブミン量は上昇しており、抗体投与群の尿中アルブミン量は抑制されていた。抗 IL 18レセプター抗体投与群のける尿中アルブミン量は、抗 IL 6抗体投与群のものよりも低値であり、これは非ストレス負荷群のレベルと同程度であった。

(* * ;p<0. 01、 * ;p<0. 05 (ストレスなしのコントロールと比較して） # # ;p<0. 01、 # ;p<0. 05 (ストレス負荷群に対して）、 +; p<0. 05 (抗 IL 6抗体投与群に対して）、 n=9)。

[0289] (実施例 16：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な BUNの上昇に対する抗 I L 18レセプター抗体の効果）

実施例 15と同様に、 MRLZlprマウスに（12週）における BUN (血中尿素窒素）を測定した（図 17)。

[0290] MRLZlprマウスにぉ、て、ストレス負荷群では BUNは上昇した力抗体投与群では BUN上昇は抑制された。ストレス負荷の 10分前に抗 IL— 18レセプター抗体 (抗 a抗体 +抗 β抗体)を 25 μ gZkg腹腔内投与した群における BUNは、抗 IL— 6抗体投与群のものよりも低値であり、これは非ストレス負荷群のレベルと同程度であった

。（* * ;p<0. 01、 * ;p<0. 05 (ストレスなしのコントロールに対して）、 # # ;p<0 . 01、 # ;pく 0. 05 (ストレス負荷群に対して）、 +; p<0. 05 (抗 IL— 6抗体投与群に対して）、 n=9)。

[0291] 本発明は上述した実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

産業上の利用可能性

本発明に係る薬学的組成物は、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する角化改善剤として使用できる。また、本発明に係る薬学的組成物は、紫外線による表皮肥厚に対する顕著な抑制作用によって皮膚の正常な機能を回復させることができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、ケラチノサイトの異常増殖を抑制して分ィ匕を促進することによって、表皮肥厚を抑制して皮膚癌を予防および Zまたは処置することができる。

Claims

請求の範囲

[I] 配列番号 5〜8のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。

[2] 配列番号 9または 10に示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。

[3] 配列番号 5〜8の、ずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする抗体の生成方法。

[4] 配列番号 5に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドおよび配列番号 6に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする抗体の生成方法。

[5] 配列番号 7に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドおよび配列番号 8に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする抗体の生成方法。

[6] 配列番号 9に示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドおよび配列番号 10に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする抗体の生成方法。

[7] 請求項 3〜6の、ずれか 1項に記載の抗体の生成方法によって生成されることを特徴とする抗体。

[8] 請求項 1、 2または 7に記載の抗体を含むことを特徴とする IL 18関連障害を予防および Zまたは治療するための薬学的組成物。

[9] 上記 IL— 18関連障害力ストレス関連疾患であることを特徴とする請求項 8に記載の薬学的組成物。

[10] 上記ストレス関連疾患が、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、尋常性挫創、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、シェ一ダレン症候群、鬱病、および心身症力なる群より選択されることを特徴とする請求項 9に記載の薬学的組成物。

[II] 上記障害が皮膚肥厚によって特徴付けられることを特徴とする請求項 8に記載の薬学的組成物。

[12] 上記障害が紫外線依存的な皮膚の脱落、硬化または肥厚であることを特徴とする請求項 8に記載の薬学的組成物。

[13] 上記障害が発毛不全であることを特徴とする請求項 8に記載の薬学的組成物。

[14] 皮膚表面に塗布可能な形態であることを特徴とする請求項 8〜13のいずれか 1項に記載の薬学的組成物。

[15] 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項 8〜14のいずれ力 1項に記載の薬学的組成物。

[16] 請求項 8に記載の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴とするヒトの皮膚におけるケラチノサイトの分ィ匕を増強する方法。

[17] 請求項 8に記載の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴とするヒトの皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害する方法。

[18] 請求項 13に記載の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴とする発毛を促進する方法。

[19] アポトーシスによる細胞死を予防および Zまたは治療するための、活性化型 IL 1

8を含む薬学的組成物。

[20] 上記細胞がケラチノサイトであることを特徴とする請求項 19に記載の薬学的組成物

[21] IL- 18関連障害を予防および Zまたは治療するための、スーパーォキシドジスムターゼを含む薬学的組成物。

[22] IL— 18関連障害を予防および Zまたは治療するための、 P38 MAPKインヒビタ一を含む薬学的組成物。

[23] IL- 18関連障害を予防および Zまたは治療するための、カスパーゼー 1インヒビタ一を含む薬学的組成物。

[24] IL- 18関連障害を予防および Zまたは治療するための、カスパーゼ 11インヒビターを含む薬学的組成物。

[25] 上記 IL— 18関連障害力ストレス関連疾患であることを特徴とする請求項 21〜24の

V、ずれか 1項に記載の薬学的組成物。