JP4257946B2

JP4257946B2 - 可溶化ヒトインターロイキン１８レセプターα，その測定方法，測定用キット及び医薬組成物

Info

Publication number: JP4257946B2
Application number: JP2005512489A
Authority: JP
Inventors: 友昭星野
Original assignee: 友昭星野
Priority date: 2003-07-30
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2024-07-26
Also published as: US20060241036A1; JPWO2005012352A1; WO2005012352A1

Description

本発明は、ヒトインターロイキン１８レセプターの作用解明，間質性肺炎や感染、関節リウマチ等の自己免疫疾患等の治療薬等に使用することが期待される可溶化ヒトインターロイキン１８レセプターα及びその測定方法，リュウマチ等の自己免疫疾患の診断方法並びに測定用キットに関する。

インタ−ロイキン１８（以下、ＩＬ−１８と記載する。）は、マクロファ−ジの産性するインタ−フェロンγ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として１９９５年に発見された最も新しいサイトカインである［Ｎａｔｕｒｅ３７８，８８−９１（１９９５）］。ＩＬ−１８は、前駆体（ｐｒｏＩＬ−１８）として合成された後、インタ−ロイキン１β変換酵素［カスパ−ゼ１（ｃａｓｐａｓｅ−１）］等により切断されて活性型（ｍａｔｕｒｅＩＬ−１８）となる。マウスＩＬ−１８の前駆体は１９２個のアミノ酸よりなり、その活性型は１５７個のアミノ酸よりなる。

また、ヒトＩＬ−１８の前駆体は１９４個のアミノ酸よりなり、その活性型は１５８個のアミノ酸よりなる。

ＩＬ−１８の受容体は、ＩＬ−１受容体ファミリ−に属し、ＩＬ−１８ＲαとＩＬ−１８Ｒβとが知られている。

ＩＬ−１８は、１型ヘルパ−Ｔ細胞（Ｔｈ１）やナチュラルキラ−細胞（ＮＫ細胞）に作用してＩＦＮ−γの産性を誘導するほか、細胞傷害性Ｔ細胞活性を増強させることにより細胞傷害活性を増強することが知られており、Ｔｈ１応答をもたらす炎症性サイトカインと考えられている。

これらのことからＴｈ１過剰反応が原因であるインシュリン依存性糖尿病や多発性硬化症およびクロ−ン病等とＩＬ−１８との関連が注目されてきた。

更に、本発明者は、ＩＬ−１８の過剰供給が、間質性肺炎や肺線維症等の肺障害の原因となることを突き止めた（ＷＯ０１／０８０８９１）。

従って、ＩＬ−１８と、ＩＬ−１８レセプター間の相互作用を制御することによって、過剰発現したＩＬ−１８に起因する疾病の予防又は治療に役立つのではないかとの仮説をたて、その候補物質として、生体中に存在することが未だ確認されていなかったＩＬ−１８レセプターαの可溶化フォームを選択し、その測定方法の開発に着手した。

従来、インターロイキン２については、可溶化ヒトインターロイキン２レセプターαの存在が確認され、またその検出手段として、２カ所の異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗体を使った酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が使用されている。

ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮＯｐｔＥＩＡ（ＴＭ）ＨｕｍａｎＩＬ−２ｓＲα（ＣＤ２５）Ｓｅｔカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ＃５５９１０４）（２０００．８．１７，ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ発行）

また、ＩＬ−１８に関しては、人工的に作成した可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαとＩＬ−１８βの組合せが、ＩＬ−１８によるＩＦＮ−γの産生を阻害することが報告されている。

ＴｈｅＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｏｌｕｂｌｅＩＬ−１８Ｒα ａｎｄＩＬ−１８β ＣｈａｉｎｓＩｎｈｉｂｉｔｓＩＬ−１８−ＩｎｄｕｃｅｄＩＦＮ−γ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｓｅａｒｃｈ２２：Ｐ．５９３−６０１，２００２，ＭａｒｙａｎｄＬｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．）

しかしながら、これらの可溶化レセプターは、ＩＬ−１８レセプターの細胞外ドメインを可溶化フォームと仮定した上で、それにシグナルペプチド等の配列を人為的に不可したものであり、天然型の可溶化レセプターそのものではない。また、マウスガン細胞株で発現しているため、その立体構造や糖鎖構造も人間の産生するものが異なる可能性もある。つまり、天然型の存在は、依然として知られていなかったため、測定方法も未確立であった。

しかも、ＩＦＮ−γの産生阻害についても、試験管レベル（ｉｎｖｉｔｒｏ）での実験かつ人工的に作成した可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαとβの組合せでなくてはならないとの報告であった。可溶化ＩＬ−１８レセプターα単独で生体で（ｉｎｖｉｖｏ）の治療剤としての可能性を示唆するものではなかった。

本発明者は、ヒトＩＬ−１８レセプターα（ヒトＩＬ−１８レセプターのαサブユニット）に、可溶化型が存在するとの考えに基づき、ＥＬＩＳＡ法を用いて検出を試みてきた。

そして用いる２種類の抗体（ｃａｐｔｕｒｅ「捕獲」抗体、ｄｅｔｅｃｔ「検出」抗体）としては、可溶化前のヒトＩＬ−１８レセプターαと可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαとの構造が類似性を有するとの仮説に基づき、ヒトＩＬ−１８レセプターαの既存のモノクローナル抗体の中から候補を選択した。しかしながら、既存のモノクローナル抗体は、いずれもヒトＩＬ−１８レセプターαを認識する際の結合部位となるエピトープが共通すると考えられており、２種類の既存のモノクローナル抗体を用いたいわゆるサンドイッチ法を用いて検出することは不可能であった。

本発明者等は、上述の問題を解決するべく研究を重ねた結果、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法を確立し、更には、生体内に可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαが存在することを確認し、当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαが疾病の治療薬として有用であることを確認し本発明を完成したものであって、その目的とするところは、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαを認識し、かつエピトープの共通しない抗体の組み合わせを選択し、それを用いたＥＬＩＳＡ法及び測定用キットを提供すること及び、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターα等を有効成分とする医薬組成物を提供することにある。

上述の目的は、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターα，下記（Ａ）の抗体を用いることを特徴とする、酵素免疫測定法による可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，（Ａ）が以下の（ａ）であることを特徴とする、当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，（ａ）が、以下の（ａ１）〜（ａ３）のいずれかであることを特徴とする、当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，もう一方の抗体が、以下の（Ｂ）であることを特徴とする、当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，（Ｂ）が以下の（ｂ）であることを特徴とする、当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，下記（１）の抗体を固層化した第一次抗体と、下記（２）の第二次抗体とを用い、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαを検出することを特徴とする当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法，当該いずれかの可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法を用いることを特徴とする、自己免疫疾患の診断方法，下記の（Ａ）の抗体を、固層化抗体又は標識化抗体として含有することを特徴とする、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターα測定用キット，一方が固層化され、他方が標識化された（１）及び（２）２種の抗体を含有することを特徴とする、可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターα測定用キット，（Ｘ），（Ｙ）又はこれらをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物，（Ｘ），（Ｙ）又はこれらをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする、ＩＬ−１８に起因する疾患、リウマチ関連疾患、ＳＬＥを含む自己免疫疾患及び感染症の予防又は治療剤，（Ｘ），（Ｙ）又はこれらをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする肺障害及び呼吸器関連疾患の予防又は治療，及び（ｘ）又は（ｙ）を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物によって達成される。

（Ｘ）可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターα
（Ｙ）１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαと同じ活性を有するタンパク質
（ｘ）ヒトＩＬ−１８レセプターα遺伝子
（ｙ）１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなりかつ当該可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαと同じ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子

（Ａ）Ｈ４４マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体と同じエピトープを認識し得る、抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（ａ）Ｈ４４マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体と同じエピトープを認識し得る、マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（ａ１）Ｈ４４マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（ａ２）ＭＡＢ８４０マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（ａ３）１１７−１０Ｃマウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（Ｂ）抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体
（ｂ）ラビット抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体
（１）抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体
（２）抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体

尚、以下において、「ヒトＩＬ−１８レセプターα」を「ｈＩＬ−１８Ｒα」，「可溶化（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＩＬ−１８レセプターα」を「ｓＩＬ−１８Ｒα」，「可溶化（ｓｏｌｕｂｌｅ）ヒトＩＬ−１８レセプターα」を「ｓｈＩＬ−１８Ｒα」と記載することがある。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαは、ＩＬ−１８及びＩＬ−１８Ｒシグナルの作用解明，間質性肺炎や感染等の治療薬等に使用することが期待される。また、本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαの測定方法は、今まで不可能であった、ｓｈＩＬ−１８Ｒαの測定ができる点で有意義である。また、本発明の診断方法によって、リュウマチ等の自己免疫疾患の診断が可能となる。更に、本発明のキットは、測定が簡便であり、医療現場で非常に有用である。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒα（Ｘ）は、ヒトの血清中等に存在する、分子量が約６０ｋＤａのタンパク質であり、ＩＬ−１８の他、Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαモノクローナル抗体の様な、抗ｈＩＬ−１８Ｒαモノクローナル抗体，及び抗ｈＩＬ−１８Ｒαポリクローナル抗体との結合能を有するものである。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαは、後述の本発明の酵素免疫測定法によって、またはヒト及びほ乳類の血清、尿，組織抽出物等や気管支肺胞洗浄液等の生体から、ＨＰＬＣや抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー等を用いて分離・精製することができる。また、ＩＬ−１８Ｒαを過剰発現させた細胞株（例えばヒトＮＫ細胞ＮＫ０細胞株やＩＬ−１８Ｒα遺伝子を過剰発現させた細胞株）の培養液から可溶化ＩＬ−１８受容体をＨＰＬＣや抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。

また、ヒトリンパ球を刺激した培養上清中から、ＨＰＬＣや抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いることによっても精製することができる。

更に、ＩＬ−１８Ｒαを過剰発現させた細胞株（例えばヒトＮＫ細胞ＮＫ０細胞株やＩＬ−１８Ｒα遺伝子を過剰発現させた細胞株）やヒリンパ球の培養液にプロテアーゼ（例えばメタロプロテアーゼ、ＴＮＦ−αの変換酵素（ＴＡＣＥ））を加えてから、ＨＰＬＣや抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製することもできる。

また、ｓｈＩＬ−１８Ｒαは、そのタンパク質のアミノ酸配列やＸ線等による結晶構造解析等から、遺伝子組み換えによる酵母や大腸菌等からの抽出や、化学合成等により、人工的に合成することも可能である。

本発明において用いられる（Ｙ）１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該ｓｈＩＬ−１８Ｒαと同じ活性を有するタンパク質，あるいは、（ｙ）１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなりかつ当該ｓｈＩＬ−１８Ｒαと同じ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の、「当該ｓｈＩＬ−１８Ｒαと同じ活性」とは、ｓｈＩＬ−１８Ｒαと同様にヒトＩＬ−１８抗原と結合し得る能力を意味するものである。

本発明において、酵素免疫測定法の一方の抗体として用いられる、（Ａ）Ｈ４４マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体（以下、Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαと記載する。）と同じエピトープを認識し得る、抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体としては、マウス，ラット，ラビット，ヒトもしくはハムスター抗体が挙げられるが、（ａ）マウス抗体が好ましく、具体的には、以下の３種類が例示される。

（ａ１）Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα
（ａ２）ＭＡＢ８４０マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ，以下、ＭＡＢ８４０マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαと記載する。）
（ａ３）１１７−１０Ｃマウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体（ＨａｙａｓｈｉｂａｒａＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．社製，Ｏｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ，以下、１１７−１０Ｃマウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαと記載する。）

これらは、もう一方に用いられる、マウス，ラット，ラビット，ヒトもしくはハムスター抗ｈＩＬ−１８Ｒαモノクロナール抗体又は後述のポリクローナル抗体と、異なるエピトープを認識し得るものであれば良い。

（ａ１）Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαは公知のモノクローナル抗体であり、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓｅｒｏｔｅｃ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能である。

（ａ２）ＭＡＢ８４０マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαは公知のモノクローナル抗体であり、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから入手可能である（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＣａｔａｌｏｇＮｏ．ＭＡＢ８４０）。

（ａ３）１１７−１０Ｃ抗ｈＩＬ−１８Ｒαは公知のモノクローナル抗体であり、ＨａｙａｓｈｉｂａｒａＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．から入手可能である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．４１，ＩｓｓｕｅｏｆＯｃｔｏｂｅｒ１０，ｐｐ．２５７３７−２５７４２，１９９７）。

本発明において用いられる抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体とは、公知のポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体とは、異なるエピトープを認識し得る抗体の集合体であり、ポリクローナル抗体全体としては、種々のエピトープの認識が可能である。従って、この本発明で用いる抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体は、上述のモノクローナル抗体とは、異なるエピトープを認識することができ、またその認識するエピトープの位置が、抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体の認識するエピトープの位置と、立体障害の起こりにくい位置にあると予想される。

本発明の測定方法においては、上述の（Ａ）Ｈ４４マウス抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体（以下、Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαと記載する。）と同じエピトープを認識し得る、抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体以外にも、（１）抗ヒトＩＬ−１８レセプターαモノクローナル抗体を用いることができるが、その際には、当該抗体が認識するエピトープと、異なるエピトープを認識し得るモノクローナル抗体や、（２）抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体等を用いることができる。

（１）としては、マウス抗体が好ましく、（２）としては、ラビット抗体が好ましい。

尚、このラビット抗ヒトＩＬ−１８レセプターαポリクローナル抗体は、瀬谷司先生（大阪成人病センター、ＫｏｉｚｕｍｉＨ，Ｓａｔｏ−ＭａｔｓｕｍｕｒａＫＣ，ＮａｋａｍｕｒａＨ，ＳｈｉｄａＫ，ＫｉｋｋａｗａＳ，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＭ，ＴｏｙｏｓｈｉｍａＫ，ＳｅｙａＴ．ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＩＬ−１８ａｎｄＩＬ−１８ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎ：ｖａｒｉｏｕｓｆｏｒｍｓｏｆＩＬ−１８ａｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ＡｒｃｈＤｅｒｍａｔｏｌＲｅｓ２００１；２９３：３２５−３３３．）から入手可能である。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαの測定方法においては、上記のモノクローナル抗体のうち一種と、上記のポリクローナル抗体を用いることができ、いずれを第一次抗体としても良いが、ｃａｐｔｕｒｅ抗体として固層化するためには、選択性の高い、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。従って、本発明の生体試料中のｓｈＩＬ−１８Ｒα測定用キットにおいても、第一次抗体として、上記いずれかのモノクローナル抗体を固層化したものを用いることが好ましい。

本発明において、第一次抗体の固層化対象には、ガラス、プラスチック、微粒子、磁性微粒子，の不溶性物質を利用することができ、その形状もチューブ等の器壁、ビーズ、蛋白性微粒子、鉄製微粒子，マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等とすることができるが、マイクロプレートが一般的である。

本発明において、第二次抗体として用いられる抗体は、例えば次のような方法で検出することができる。
第二次抗体に、ビオチンを結合させておき、サンドイッチ法の実施後に、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、ビオチンにアビジンを結合させる。西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素基質を加え、その酵素活性を測定することで、サンドイッチ法により捕捉された可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαを測定する。
このほか、第二次抗体の標識には、公知の放射性アイソトープ、酵素、蛍光物質、化学発光物質，着色物質等を利用することもできる。

本発明の自己免疫疾患の診断方法は、上記の可溶化ヒトＩＬ−１８レセプターαの測定方法を用いて実施することができる。
自己免疫疾患としては、関節リュウマチ，間質性肺炎，膠原病等が挙げられる。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒα測定用キットには、第一次抗体と第二次抗体の他、固層化対象，標識，緩衝液等を適宜組み合わせることができる。また、本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒα測定用キットには、更に、抗体から、ｓｈＩＬ−１８Ｒα抗原を遊離させるための酸溶液（例えばｐＨ３．０，２５ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ，１５０ｍＭＮａＣｌ等）を加えることもできる。

本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαの測定方法及びｓｈＩＬ−１８Ｒα測定用キットは、生体試料中のｓｈＩＬ−１８Ｒα測定のほか、試験管レベルのｓｈＩＬ−１８Ｒα測定にも使用することができる。

本発明の（Ｘ）ｓｈＩＬ−１８Ｒα又は（Ｙ）１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該ｓｈＩＬ−１８Ｒαと同じ活性を有するタンパク質は、ＩＬ−１８に起因する疾患の予防又は治療剤や、肺障害等の予防又は治療剤に用いることができ、また、後述するようにグラム陰性菌大腸菌等のグラム陰性及び陽性菌等の細菌由来の毒素に起因する疾病の治療効果も有することから、各種の医薬組成物として有用である。

また、後述する実施例で確認したように、生体にＩＬ−１８Ｒαを過剰発現させたＴＧマウスの血清中には、可溶性ＩＬ−１８受容体が多量に存在する。従って、ヒトにｈＩＬ−１８Ｒα遺伝子を導入し、ｈＩＬ−１８Ｒを過剰発現させることによって、血清中にｓｈＩＬ−１８Ｒを大量に産生させることができ、それによって上記の様な各種の疾病に対する遺伝子治療が可能となる。

（ＥＬＩＳＡ法による血清又はＢＡＬ中ｓｈＩＬ−１８Ｒα抗原の確認）
ＰＢＳ緩衝液に溶解した４μｇ／ｍｌのＨ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαを、ＥＬＩＳＡｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ製）に１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、４℃で一晩置き、第一次抗体であるＨ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒαを、プレートに固層化した後、０．５％のＴｗｉｎ２０（界面活性剤）を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで２回洗浄した。

第二次抗体のプレートへの非特異的接着防止のため、のＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬製）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２時間置き、ブロッキングを行った後、再び、０．５％のＴｗｉｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで２回洗浄した。尚、室温で２時間に変えて、４℃で一晩置いても良い。

被検試料である、人間の血清（４倍希釈）及びＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液の原液）を、各々１００μｌ／ｗｅｌｌ分注した。また、標準のｈＩＬ−１８Ｒα抗原溶液として、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩＬ−１８Ｒα（Ｒ＆Ｄ製）１００μｇ／ｍｌを希釈して、種々の倍率の希釈溶液を作成し、同様にそれぞれ別のｗｅｌｌに分注した。分注後、室温で２時間後、第一次抗体に、標準ｈＩＬ−１８Ｒα抗原又は血清及びＢＡＬ中のｓｈＩＬ−１８Ｒα抗原を結合させた後０．５％のＴｗｉｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した。

次に、４０％のＢｌｏｃｋＡｃｅに２μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解した、第二次抗体であるビオチン結合ラビット抗ｈＩＬ−１８Ｒαポリクローナル抗体溶液を、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温で９０分置き、第二次抗体をｓｈＩＬ−１８Ｒα抗原に結合させた後、０．５％のＴｗｉｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで各ｗｅｌｌを４回洗浄した。

０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを、各ｗｅｌｌに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間置き、ビオチンにアビジンを結合させた後、０．５％のＴｗｉｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで各ｗｅｌｌを５回洗浄した。

西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素基質であるＡＢＴＳ（ＥＬＩＳＡＰＯＤＳｕｂｓｔｒａｔｅＡ．Ｂ．Ｔ．ＳＫｉｔ，ナカライ，京都）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分間置き、酵素反応を起こさせた後、停止液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えて酵素反応をストップさせた。

４５０ｎｍ（ｍａｉｎ）及び６５０ｎｍ（ｓｕｂ）の吸光度を測定し、標準ｈＩＬ−１８Ｒα抗原の量と比較することによって、被検試料である、血清及びＢＡＬ中の、ｓｈＩＬ−１８Ｒαの量を測定した。

健常人の血清中のｓｈＩＬ−１８Ｒαは１５９．２±８９．５ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝４５）であった。また関節リュウマチ（ＲＡ）患者の血清中ｓｈＩＬ−１８Ｒαは２３３．５±１０９．２ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝３４）であった。リュウマチ（ＲＡ）患者の血清中ｓｈＩＬ−１８Ｒαは健常人の血清より有意に高かった（ｐ＝０．００２１６，ｕｎｐａｉｒｅｄＳｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔ）。また間質性肺炎患者の血清中ｓｈＩＬ−１８Ｒαは３３６１．８±２３０７．３ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝２１）でＢＡＬ中のｓｈＩＬ−１８Ｒαは２．２＋−１．５ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝３３）であった。

このことは、血清やＢＡＬ液中の、ｓｈＩＬ−１８Ｒαの存在を示している。また、健常人に比べて、リュウマチ患者や間質性肺炎患者で、血清中のｓｈＩＬ−１８Ｒαが明らかに多かったことから、本発明のｓｈＩＬ−１８Ｒαの測定方法が、リュウマチや間質性肺炎患者等の病気の診断方法として有用であることが分かった。

（血清中ｓｈＩＬ−１８Ｒα抗原の存在の確認及び親和性確認試験）
Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα抗体をＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＨＰカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にカップリングしヒト血清をこのアフィニティカラムを用いてアフィニティカラムクロマトグラフィにかけ、親和性を確認した。結合バッファーは１０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ６．８，洗浄バッファーは１０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ，５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ６．８，溶出バッファーは１００ｍＭｇｌｙｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒｐＨ２．５，中和バッファーは１ＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ８．０を用いた。ヒト血清サンプルを結合バッファーで２倍希釈し０．４５μｍｆｉｌｔｅｒで濾過し、結合バッファーであらかじめ平衡化したＨ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα抗体アフィニティカラムにかけた。洗浄バッファーでアフィニティカラムを洗浄する。溶出バッファーをカラムに流し、溶出バッファー１ｍｌごとに５０μｌ中和バッファーの入ったチューブに入れて回収（回収順にＦｒａｃｔｉｏｎ番号１，２，３…とする）しＵＶ２８０ｎｍでモニターした。回収したＦｒａｃｔｉｏｎを４℃でＰＢＳ緩衝液で透析した。ＵＶ２８０ｎｍでモニターはＦｒａｃｔｉｏｎ番号１−８でそれぞれ０．０６８７，０．３５９８，０．７０７３，０．０９４９，０．０３７７，０，０，０だった。透析したＦｒａｃｔｉｏｎ番号１−８を、上述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法でｓｈＩＬ−１８Ｒαを測定したところ、＜２００，１７９７，１７７８，１２５９，＜２００，＜２００，＜２００，＜２００ｎｇ／ｍｌであった。つまりＦｒａｃｔｉｏｎ番号２，３，４にｓｈＩＬ−１８Ｒαが存在することが確認できた。このようにヒト血清から採取したｓｈＩＬ−１８Ｒαは、Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα抗体アフィニティカラムクロマトグラフィにかけて、親和性を確認した。

（ウェスタンブロッティングによる抗原特異性及び分子量確認試験）
上記で透析したＦｒａｃｔｉｏｎ番号１−８を、Ｈ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα抗体を用いてウェスタンブロッティングで解析した。図１に示すようにＦｒａｃｔｉｏｎ番号２，３，４に約６０ｋＤａの分子量にＨ４４マウス抗ｈＩＬ−１８Ｒα抗体が認識するｓｈＩＬ−１８Ｒαの存在が確認された（Ｆｒａｃｔｉｏｎ番号２，４のものも、添付図面では、影が薄いが確認されている）。この結果は上記のアフィニティカラムクロマトグラフィ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果と一致した。以上の結果から、血清に確かにｓｈＩＬ−１８Ｒαが存在していることが、確認された。

ヒトリンパ球を２ｘ１０６個／ｍＬの細胞密度で１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ−１６４０で浮遊した。このリンパ球を未刺激、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、もしくはマイトジェンＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。培養上清中にｓｈＩＬ−１８Ｒが１７６５ｎｇ／ｍＬ，２７９３ｎｇ／ｍＬ，２８８５ｎｇ／ｍＬが検出された。一方リンパ球を加えていない１０％ＦＣＳＰＭＩ−１６４０中のｓｈＩＬ−１８Ｒは１７０ｎｇ／ｍＬ以下であった。つまり刺激リンパ球から多量のｓｈＩＬ−１８Ｒが産生された。そこでＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、もしくはマイトジェンＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）等でリンパ球を刺激し、その培養上清中から、ＨＰＬＣや抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて精製することによって、可溶化ＩＬ−１８受容体を得た。この結果、ｓｈＩＬ−１８Ｒは、もともと細胞の培養液中にも存在するものであるが、ＬＰＳやＰＭＡ等の刺激により、過剰に発現していることが分かった。

［可溶化ＩＬ−１８Ｒαによる治療効果の確認］
（動物モデルにおける、可溶化ＩＬ−１８Ｒαの過剰発現誘導）
図２の様にＶＡ−ｈＣＤ２ｖｅｃｔｏｒ（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１８５（１９９５），１３３−１４０）のＳｎａＢＩサイトにマウスＩＬ−１８ＲαのｃＤＮＡ１．６Ｋｂを挿入し、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩで切り出しＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスの受精卵に常道に従い注入した。トランスジェニック（ＴＧ）マウスをＮｏ．１７，２７，５１，５６の４ライン樹立した。この４ラインの１０週齢のＴＧマウスとコントロールｗｉｌｄｔｙｐｅ（ＷＴ）Ｂ６マウス（ＷＴ＃１，ＷＴ＃２）から脾細胞を取り出し２ｘ１０６個／ｍＬの細胞密度で１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ−１６４０で浮遊した。
抗マウスＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ），ヒトＩＬ−２（２００Ｕ／ｍＬ），マウスＩＬ−１８（２００ｎｇ／ｍＬ），ヒトＩＬ−２（２００Ｕ／ｍＬ）プラスマウスＩＬ−１８（２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で１８時間培養しＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）で測定した。図３に示すようにＷＴに比べＴＧマウスの脾細胞は著明にヒトＩＬ−２（２００Ｕ／ｍＬ）プラスマウスＩＬ−１８（２００ｎｇ／ｍＬ）に反応しＩＦＮ−γを産生した。
また抗ＩＬ−１８Ｒα抗体を用いた膜表面抗原解析でＴＧマウスはＷＴマウスに比べリンパ球上にＩＬ−１８Ｒαを強く発現した。
可溶性ＩＬ−１８Ｒα受容体を、我々が樹立したＥＬＩＳＡ法で測定すると、ＷＴマウスの血清では、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）で測定しても検出限界以下であった。一方、ＴＧマウスの血清を限界希釈法ではｘ４希釈以上で測定すると、可溶性ＩＬ−１８Ｒα受容体の検出が可能であった。つまり、可溶性ＩＬ−１８α受容体はＴＧマウスの血清中に大量に存在していた。

以上の結果は、我々が樹立したＴＧマウスには
１．ＩＬ−１８に反応可能なＩＬ−１８受容体αを過剰に発現し
２．その一部が可溶化して
３．血清中に可溶性ＩＬ−１８受容体αが大量に存在
することを証明している。
以後の実験にはライン番号５１を用いた。以下、ＣＤ２−ＩＬ−１８Ｒα＃５１とする。

（過剰発現可溶化ＩＬ−１８Ｒαによる、毒素に対する治療効果の確認）
８から１１週齢の雌のＴＧマウス（ＣＤ２−ＩＬ−１８Ｒα＃５１）及びコントロールｗｉｌｄｔｙｐｅＢ６マウスを各１０匹ずつ用いた。グラム陰性菌大腸菌由来のｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｌｉｄｅ（ＬＰＳ）（Ｅ．ｃｏｌｉｓｅｒｏｔｙｐｅｏ５５：Ｂ５ｃａｔａｌｏｇＮｏ．Ｌ４００５，Ｓｉｇｍａ［Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ］）４０μｇ／ｇ体重をｄａｙ１に腹腔内投与した。図４に示すようにＬＰＳに対する感受性はＴＧマウスの方がＷＴマウスより低い。つまりＴＧマウスはＬＰＳに対し抵抗性を持った。この結果は過剰の可溶性ＩＬ−１８受容体は生体で菌由来の毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ｅｘｏｔｏｘｉｎ）に対し治療効果を持つことが判明した。

（可溶化ＩＬ−１８Ｒαによる抗ガン剤の副作用に対する予防・治療効果の確認）
６週齢の雌のＴＧマウス（ＣＤ２−ＩＬ−１８Ｒα＃５１）及びコントロールｗｉｌｄｔｙｐｅＢ６マウス各５匹にＢＬＭ（ブレオマイシン，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）２ｍｇをｄａｙ１に腹腔内投与した。更にＢＬＭ２ｍｇをｄａｙ８に腹腔内投与した。Ｄａｙ２８でマウスの肺を２０％ホルマリンで還流し固定した。作製したパラフィンブロックはＨＥ染色を行った。ＷＴマウス（図５，左）に比べＴＧマウス（図５，右）は、ＢＬＭによる肺障害（間質性肺炎、肺線維症）を顕著に抑制した。この結果は、過剰の可溶性ＩＬ−１８受容体は肺障害に対し治療効果を持つことを示している。

ウェスタンブロッティングによる、透析試料の抗原特異性及び分子量確認結果を表す図である。マウスＩＬ−１８Ｒα遺伝子を含む、ＴＧマウス作成用遺伝子の模式図である。脾細胞の、ＩＦＮ−γ産生量を表す図である。ＴＧマウス及びＷＴマウスのＬＰＳ感受性を表す図である。ｓｈＩＬ−１８Ｒαによる肺障害の抑制効果を表す図である。

Claims

下記（Ｘ）又はこれをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。
（Ｘ）可溶化ヒトインターロイキン１８レセプターα
下記（Ｘ）又はこれをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする、インターロイキン１８に起因する疾患の予防又は治療剤。
（Ｘ）可溶化ヒトインターロイキン１８レセプターα
下記（Ｘ）又はこれをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上を有効成分として含むことを特徴とする、肺障害の予防又は治療剤。
（Ｘ）可溶化ヒトインターロイキン１８レセプターα
下記（ｘ）を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。
（ｘ）ヒトインターロイキン１８レセプターα遺伝子