TW202128988A - 在培養物中擴增自然殺手細胞的方法、增加自然殺手細胞的細胞毒性之方法、處理受試者的方法、其組成物及其細胞組成物 - Google Patents

在培養物中擴增自然殺手細胞的方法、增加自然殺手細胞的細胞毒性之方法、處理受試者的方法、其組成物及其細胞組成物 Download PDF

Info

Publication number
TW202128988A
TW202128988A TW109141339A TW109141339A TW202128988A TW 202128988 A TW202128988 A TW 202128988A TW 109141339 A TW109141339 A TW 109141339A TW 109141339 A TW109141339 A TW 109141339A TW 202128988 A TW202128988 A TW 202128988A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
cultured
frozen
natural killer
feeder
Prior art date
Application number
TW109141339A
Other languages
English (en)
Inventor
朴商佑
金容萬
丁在燮
姜允美
Original Assignee
南韓商Ｎｋｍａｘ股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020190157727A external-priority patent/KR20210067776A/ko
Application filed by 南韓商Ｎｋｍａｘ股份有限公司 filed Critical 南韓商Ｎｋｍａｘ股份有限公司
Publication of TW202128988A publication Critical patent/TW202128988A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Abstract

揭露一種製造自然殺手細胞之方法。所述方法包括：自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）；自外周血單核細胞中分離CD56+細胞及/或CD3-/CD56+細胞中的至少一者；以及在細胞因子存在的情況下，對CD56+細胞及/或CD3-/CD56+細胞中的所述至少一者與飼養細胞的組合進行共培養。所述方法可更包括冷凍及解凍CD56+細胞及/或CD3-/CD56+細胞。亦揭露一種處理癌症的組成物。所述組成物包含藉由所揭露的方法製造的CD56+自然殺手細胞及細胞因子。

Description

製造自然殺手細胞之方法以及其組成物
[併入參考任何優先權申請案] 本申請案主張於2020年8月7日提出申請的美國臨時申請案第63/062694號以及於2019年11月29日提出申請的韓國專利申請案第KR-10-2019-0157727號的權利，上述申請案中的每一者的揭露內容全文併入本案供參考。
本揭露是有關於一種自然殺手細胞的生產、儲存及/或自然殺手細胞本身。
自然殺手細胞（natural killer cell，NK細胞）是先天免疫細胞的一種類型，已知其非特異性地殺死癌症，識別及殺死病毒、細菌等，並利用例如穿孔素及顆粒酶等酶或藉由Fas-FasL相互作用來殺死病原體。在癌症患者的情況下，據報導該些NK細胞的癌細胞細胞毒性的降低與以下各種類型的癌症的發作相關聯：例如肺癌（卡瑞格P（Carrega P）等人，癌症（Cancer），2008:112:863-875）、肝癌（吉努西M（Jinushi M）等人，肝臟病學雜誌（J Hepatol），2005:43；1013-1020）、乳腺癌（鮑奧利弗T（Bauernhofer T）等人，歐洲免疫學雜誌（Eur J Immunol.），2003:33:119-124）、子宮癌（默克吉婭妮E（Mocchegiani E.）等人，英國癌症雜誌（Br j Cancer.），1999:79:244-250）、血癌（田島F（Tajima F.）等人，白血病（Lekemia）1996:10:478-482）等。
本申請案是有關於製造高純度自然殺手細胞的方法以及一種包含高純度自然殺手細胞及細胞因子的用於處理癌症的細胞治療組成物。本文揭露的任何特徵、結構或步驟可用本文揭露的任何其他特徵、結構或步驟來替換或與其組合，或者被省略。此外，為總結本揭露，本文已經闡述了本發明的某些態樣、優點及特徵。應理解，根據本文所揭露的本發明的任何特定實施例，未必達成任何或所有此種優點。本揭露的任何各別態樣皆不是必要的或不可缺少的。
在一些實施例中，揭露一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法。所述方法包括：自血樣中分離CD56+細胞；在IL-21（及飼養細胞）存在的情況下將分離的所述CD56+細胞共培養第一時段；在所述第一時段後冷凍共培養的所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；以及在IL-21（及飼養細胞）存在的情況下將解凍的所述CD56+細胞共培養第二時段。
本文提供的實施例中的任一者的方法及/或本文揭露的方法中的任一者可包括以下特徵中的一或多者。所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。所述方法可更包括在解凍前將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天。分離的所述CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天（或9至25天）。分離的所述CD56+細胞可在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。解凍的所述CD56+細胞可在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。一或多種飼養細胞可為選自由被輻照尤爾卡特（Jurkat）細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line，EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）（包括例如自體外周血單核細胞）組成的群組中的一或多者。所述CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。在一些實施例中，任何飼養細胞可用於第一擴增、第二擴增或第一擴增及第二擴增（例如，藉由使用Il-21）。所述CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:30或1:100的比率共培養。在一些實施例中，該些比率是針對KL1/EBVLCL的，且對於其他飼養細胞，例如，可使用1:1至1:10。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以10至100奈克/毫升的濃度添加。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以20至80奈克/毫升的濃度添加。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以30至70奈克/毫升的濃度添加。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間被添加多於一次。
在一些實施例中，提供一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法。所述方法包括：自血樣中（例如，自PBMC、新鮮或冷凍的臍帶血及/或其中已經自血樣中分離出CD56+、CD56+CD3-及CD3-細胞的血液中）分離CD56+；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；及擴增解凍的所述CD56+細胞（再次，用任何類型的適宜的飼養細胞）。
本文揭露的實施例中的任一者的方法及/或本文揭露的方法中的任一者可包括以下特徵中的一或多者。冷凍CD56+細胞可在低於-100℃的溫度下進行。所述方法可更包括將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天且少於10年的時段。所述CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天（或9至25天）。所述一或多種飼養細胞在所有實施例中不受限制，且可為選自由以下中的至少一者組成的群組中的一或多者：被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞、mb15-k562、mb21-k562飼養細胞、HuT78及/或PBMC。所述CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。IL-21可以10至100奈克/毫升的濃度添加。IL-21可被添加多於一次。在一些實施例中，NK細胞可與任何飼養細胞類型一起使用，只要在冷凍前使用IL-21即可，且只要在自冷凍解凍後接著進行再刺激過程即可。
在一些實施例中，揭露一種增加自然殺手細胞的細胞毒性的方法。所述方法包括：提供所述自然殺手細胞；冷凍所述自然殺手細胞；解凍冷凍的所述自然殺手細胞；以及在IL-21存在的情況下，對解凍的所述自然殺手細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。任選地，在冷凍所述自然殺手細胞之前，所述自然殺手細胞可與飼養細胞及IL-21共培養（擴增）。
本文揭露的前述段落中的任一者的方法及/或本文揭露的方法中的任一者可包括以下特徵中的一或多者。所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述自然殺手細胞。所述方法可更包括在解凍前將冷凍的所述自然殺手細胞儲存多於一天。所述一或多種飼養細胞為選自由以下組成的群組中的一或多者：被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞、mb15-k562、mb21-k562飼養細胞、HuT78及/或PBMC。解凍的所述自然殺手細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。IL-21可以10至100奈克/毫升的濃度添加。IL-21可被添加多於一次。
在一些實施例中，揭露一種處理受試者的方法。所述方法包括：自受試者收集CD56+細胞；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；將共培養的所述CD56+細胞冷凍至少一天；解凍冷凍的所述CD56+細胞；擴增解凍的所述CD56+細胞；以及對所述受試者施用擴增的所述CD56+細胞，其中來自第二擴增的細胞的細胞毒性是冷凍前共培養的CD56+的細胞毒性的至少X%。
本文揭露的前述段落中的任一者的方法及/或本文揭露的方法中的任一者可包括以下特徵中的一或多者。所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。所述方法可更包括在解凍前將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天。分離的所述CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天（或9至25天）。擴增解凍的所述CD56+細胞可包括：在IL-21存在的情況下對解凍的CD56+與一或多種被輻照飼養細胞進行共培養。所述一或多種飼養細胞可為選自由以下組成的群組中的一或多者：被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞、mb15-k562、mb21-k562飼養細胞、HuT78及/或PBMC。所述CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以10至100奈克/毫升的濃度添加。IL-21可在第一時段及/或第二時段期間被添加多於一次。
在一些實施例中，提供一種組成物。所述組成物包含有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞。CD56+細胞藉由以下方式來製備：自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）；自外周血單核細胞中分離CD56+細胞；在一或多種細胞因子存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；以及在一或多種細胞因子存在的情況下，對解凍的所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
在一些實施例中，揭露一種細胞組成物。所述細胞組成物包含：有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞；IL-2；及IL-21。
在一些實施例中，揭露一種組成物。所述組成物包含源自外周血單核細胞（PBMC）的第一群CD56+細胞；冰；IL-2；及IL-21。當解凍時，所述CD56+細胞具有第二群CD56+細胞的至少80%的細胞毒性，其中所述第二群CD56+細胞尚未冷凍。
在一些實施例中，提供一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法。所述方法可包括：自血樣中分離CD56+細胞；在IL-21存在的情況下將分離的所述CD56+細胞共培養第一時段；在所述第一時段後冷凍共培養的所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；以及在IL-21存在的情況下將解凍的所述CD56+細胞共培養第二時段。
在一些實施例中，提供一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法。所述方法包括：自血樣中分離CD56+；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；及擴增解凍的所述CD56+細胞。
在一些實施例中，提供一種增加自然殺手細胞的細胞毒性的方法，且所述方法包括：提供所述自然殺手細胞；冷凍所述自然殺手細胞；解凍冷凍的所述自然殺手細胞；以及在IL-21存在的情況下，對解凍的所述自然殺手細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
在一些實施例中，提供一種處理受試者的方法，且所述方法包括：自所述受試者收集CD56+細胞；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；將共培養的所述CD56+細胞冷凍至少一天；解凍冷凍的所述CD56+細胞；擴增解凍的所述CD56+細胞；以及對所述受試者施用擴增的所述CD56+細胞，其中來自第二擴增的細胞的細胞毒性是冷凍前共培養的CD56+的細胞毒性的至少80%。
在一些實施例中，提供一種組成物，且所述組成物包含：有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞，其中CD56+細胞藉由以下方式來製備：自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）；自外周血單核細胞中分離CD56+細胞；在一或多種細胞因子存在的情況下，對所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；以及在一或多種細胞因子存在的情況下，對解凍的所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
在一些實施例中，提供一種細胞組成物且所述細胞組成物包含有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞；IL-2；及IL-21。
在一些實施例中，提供一種組成物且所述組成物包含：源自外周血單核細胞（PBMC）的第一群CD56+細胞；冰；以及IL-2、IL-21。當解凍時，所述CD56+細胞具有第二群CD56+細胞的至少80%的細胞毒性，且所述第二群CD56+細胞尚未冷凍。
在一些實施例中，提供一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法，且所述方法包括：提供外周血單核細胞；在IL-21存在的情況下將所述外周血單核細胞共培養第一時段；在第一時段後冷凍共培養的所述PBMC；解凍冷凍的所述PBMC；及在IL-21存在的情況下將解凍的所述外周血單核細胞共培養第二時段。
在一些實施例中，所述組成物包含：IL-2；5%至10%的二甲基亞碸（dimethylsulfoxide，DMSO）；90%至95%的胎牛血清（Foetal Bovine Serum，FBS）；及任選為CD56+細胞的自然殺手細胞。在一些實施例中，所述組成物更包含冷凍存溶液（CryoStor solution）。在一些實施例中，所述組成物用於再擴增前的冷凍細胞。
在一些實施例中，所述組成物包含IL-2；5%至10%的DMSO；80%至95%的哈特曼溶液；1%至10%的人血清白蛋白；及自然殺手細胞。在一些實施例中，所述組成物更包含冷凍存溶液。在一些實施例中，所述組成物用於注射前的冷凍細胞。
本文已經開發並提供一種輔助自然殺手細胞進行冷凍保存並自其恢復的方法。已經發現，若CD56+細胞最初（在初始擴增期間）在IL-21存在的情況下與飼養細胞共培養，則CD56+細胞可在冷凍及解凍後成功擴增。藉由使用IL-21，可產生高純度的CD56+自然殺手細胞，且令人驚訝的是，所述細胞保留了特別大量的細胞毒性。此外，在自然殺手細胞解凍後，所述細胞可被進一步擴增（或者不利用IL-21，或者甚至更有利的是，在額外IL-21存在的情況下）。因此，在預冷凍過程（例如第一擴增）中的IL-21可容許在以後的時間進行優異的再擴增此外，所得產物即使在擴增兩次及冷凍一次後，仍保持令人驚訝的高細胞毒性，當IL-21不僅在第一擴增期間使用，而且亦在第二擴增期間使用時，所述細胞毒性會進一步增強。在一些實施例中，此種冷凍及再擴增過程可重複多次（每次，在再擴增期間任選地利用另一輪IL-21）。
在一些實施例中，提供一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法。所述方法包括：提供外周血單核細胞；在IL-21存在的情況下將所述外周血單核細胞共培養第一時段；在第一時段後冷凍共培養的PBMC；解凍冷凍的PBMC；及在IL-21存在的情況下將解凍的外周血單核細胞共培養第二時段。在一些實施例中，PBMC與飼養細胞的比率為1:0.5:0.5。在一些實施例中，對於PBMC（例如，作為CD56+的替代物），所述比率可為約1:0.5:0.5至1:10:10。在一些實施例中，對於CD56+細胞：所述比率乘以例如10或20（例如，CD56+細胞與飼養細胞的比率為1:1至100）。在一些實施例中，擴增來自CD56+或CD56+/CD3-細胞。
根據一些實施例，一種製造高純度自然殺手細胞的方法可包括：在第一細胞因子（例如IL-21）存在的情況下，將選自CD56+細胞及/或CD3-/CD56+細胞的細胞與飼養細胞一起共培養（「第一培養步驟」或「第一擴增步驟」）；冷凍共培養的細胞（「冷凍步驟」）；解凍冷凍的細胞（「解凍步驟」）；以及將解凍的細胞與添加的飼養細胞一起共培養（「第二培養步驟」或「第二擴增步驟」），任選地利用更多IL-21。本文更詳細地闡述每一步驟。根據所揭露的方法製造的CD3-/CD56+細胞不僅可表現出更高的純度及更高的抗癌活性，而且亦可表現出其他顯著特性，例如具有不同的表面標記或激活受體，例如，CD16、CD25、CD27、CD28、CD69、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、CD266、CD244、NKG2D、KIR2S、KIR3S、Ly94D、NCRs、IFN-a、IFN-b、CXCR3、CXCR4、CX3CR1、CD62L及CD57中的一或多者。
本文所使用的「步驟」是過程的一部分，且不要求在下一「步驟」可開始之前完成一個「步驟」。除非注明，否則步驟可在重疊的時間段內提供，或者視情況同時提供。當然，當一個步驟發生在事件（例如冷凍）之前而另一步驟發生在同一事件之後時，則沒有重疊（例如第一IL-21孵育及第二IL-21孵育）。
在本說明書中，用語「CD56+細胞」可與「CD56+ NK細胞」或「CD56+自然殺手細胞」互換使用，且用語「CD3-/CD56+細胞」可與「CD3-/CD56+ NK細胞」互換使用。CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞可包括其中表達細胞表面上的CD56糖蛋白的細胞，或者更包括其中不表達CD3糖蛋白而表達CD56糖蛋白的細胞。即使是相同類型的免疫細胞在附著至細胞表面的CD類型及表達率方面亦可具有差異，且因此，其功能可為不同的。
在一些實施例中，CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞藉由以下步驟來獲得：自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）（「第一分離步驟」）；自外周血單核細胞中分離選自由CD56+細胞及CD3-/CD56+細胞組成的群組中的細胞（「第二分離步驟」）。
在本說明書中，「血樣」可為但不需要被限制於外周血的全血或使用白細胞除去法自外周血中分離的白細胞。此外，外周血可自正常人、具有癌症風險的患者或癌症患者獲得，但外周血的來源不限於此。
在本說明書中，用語「白細胞除去法」可指自收集的血液中選擇性地移除（分離）白細胞，且然後將所述血液再次給予患者的方法，並且在一些實施例中，藉由所述方法分離的白細胞可在不利用額外方法（例如聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）密度梯度方法）的情況下使用。
在本說明書中，用語「外周血單核細胞」可與「PBMC」、「單核細胞」互換使用，且可指一般用於抗癌免疫療法的自外周血分離的單核細胞。外周血單核細胞可使用已知的方法（例如聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度方法）自收集的人血中獲得。
在一些實施例中，外周血單核細胞可為自體的，但根據本文所述的方法，亦可使用同種異體外周血單核細胞來製造用於抗癌免疫療法的高純度NK細胞。此外，在一些實施例中，外周血單核細胞可自正常人獲得，但外周血單核細胞亦可自具有癌症風險的患者及/或癌症患者獲得。
在一些實施例中，自血樣中分離CD56+自然殺手細胞的第二分離步驟可使用選自由CD56微珠及CD3微珠組成的群組中的至少一者來執行，或者使用例如臨床磁性激活細胞分選儀（Clini magnetic activated cell sorter，CliniMACS）、流式細胞術細胞分選儀或MACS分離器、磁性分選系統等設備的分離方法來執行。
例如，使用CD56微珠及/或CD3微珠的分離方法可藉由將CD56微珠添加至PBMC且然後移除非特異性結合來執行，或者藉由將CD3微珠添加至PBMC以移除特異性結合且然後再次添加CD56微珠以移除非特異性結合來執行。在一些情況下，藉由自PBMC中分離CD56+細胞及/或CD3-/CD56+細胞，可移除T細胞或其他非自然殺手細胞。
在本說明書中，用語「飼養細胞」可指不分裂及增殖，但具有製造各種代謝物的代謝活性並因此有助於靶細胞增殖的細胞。
在一些實施例中，飼養細胞可為選自由以下組成的群組中的至少一者：被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、PBMC、HFWT、RPMI 1866、道迪（Daudi）、MM-170、K562或藉由靶向K562而遺傳修飾的細胞（例如K562-mbIL-15-41BB配位體）。例如，在一個實施例中，飼養細胞可為被輻照尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞。在一些實施例中，當NK細胞首先在IL-21存在的情況下擴增且然後冷凍、解凍並且然後經受再擴增時，可使用任何飼養細胞類型，只要其容許進行本文所提供的再擴增即可。
在本說明書中，用語「尤爾卡特細胞」或「尤爾卡特細胞系」可指由舊金山加州大學的亞瑟維斯博士（Dr. Arthur Weiss of the University of California at San Francisco）開發出的血癌（永生化急性T細胞白血病）細胞系。其中表達各種趨化因子受體且能夠製造IL-2的尤爾卡特細胞一般不被視為用於抗癌免疫療法的飼養細胞的可能候選物，此乃因作為自然殺手細胞激活抑制劑的MHC類I在其細胞表面上被高度表達。尤爾卡特細胞可得自美國型培養菌種集（American Type Culture Collection，ATCC）（ATCC TIB-152）。
在本說明書中，用語「EBV-LCL細胞」或「EBV-LCL細胞系」是指艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）（D.M.康樂（D.M.Koelle）等人，臨床研究雜誌（J Clin Invest），1993:91:961-968），其為藉由在測試管中用艾巴氏病毒感染人類B細胞而製成的B細胞系。EBV-LCL細胞可藉由在PBMC中感染EBV的過程中添加環孢菌素A的方法，在一般實驗室中直接製備及使用。在一些實施例中，EBV-LCL細胞可藉由以下步驟來製備。將30×106 個PBMC添加至9毫升培養基中，將混合物添加至T 25培養燒瓶中，且然後添加9毫升EBV上清液。添加80微升環孢菌素A（50微克/毫升），且然後在37℃下培養。培養7天後，移除一半上清液，添加新鮮培養基，且然後添加40微升環孢菌素A。同樣的過程可每7天重複一次，直至培養28天。所述細胞系在培養28天後可使用，且由此，所述細胞系可在不添加環孢菌素A的培養基中培養。
輻照後，可使用尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞作為飼養細胞。
在一些實施例中，在施用之前，所述方法可更包括在準備注射的溶液中將擴增的細胞冷凍第二次。
在一些實施例中，可以1:0.1至5、1:0.1至4、1:0.1至3、1:0.1至2、1:0.1至1.5、1:0.5至1.5、1:0.75至1.25、0.1至5:1、0.1至4:1、0.1至3:1、0.1至2:1、0.1至1.5:1、0.5至1.5:1或0.75至1.25:1的含量比率來包含被輻照尤爾卡特細胞及被輻照EBV-LCL細胞。例如，可以1:1的含量比率來包含被輻照尤爾卡特細胞及被輻照EBV-LCL細胞。
在一些實施例中，可藉由用50至500、50至400、50至300、50至200、50至150、70至130、80至120或90至110戈瑞的輻照進行處理來獲得被輻照尤爾卡特細胞及被輻照EBV-LCL細胞。例如，可藉由用100戈瑞的輻照處理尤爾卡特細胞及/或EBV-LCL細胞來獲得被輻照尤爾卡特細胞及/或被輻照EBV-LCL細胞。
在本說明書中，用語「細胞因子」可與「第一細胞因子」或「第二細胞因子」互換使用，且可指可用於誘導外周血單核細胞分化為NK細胞的免疫活性化合物。在一些實施例中，細胞因子是IL-21（用於第一擴增及第二擴增，以及任何進一步輪次的擴增）。
本文所用的用語「共培養」及「擴增」是可互換的，且標示自然殺手細胞正在被培養以產生擴增的細胞群。用語「再擴增」標示自然殺手細胞已經發生了一輪共培養或擴增。在一些實施例中，共培養或擴增將在飼養細胞及細胞因子（例如IL-21）存在的情況下進行。在本文中的一些情況下，用語「培養」被用作「共培養」的簡寫。
在一些實施例中，細胞因子可為白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-15、IL-21、FMS樣酪胺酸激酶3配位體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3-L）、幹細胞因子（stem cell factor，SCF）、IL-7、IL-18、IL-4、I型干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）及胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF 1），但不限於此。
在一些實施例中，第一細胞因子可為IL-2、IL-21、IL-15、FMS樣酪胺酸激酶3配位體（Flt3-L）、幹細胞因子（SCF）、IL-7、IL-18、IL-4、I型干擾素、GM-CSF、胰島素樣生長因子1（IGF 1）或其任何組合。在一些實施例中，第二細胞因子可為IL-2、IL-21、IL-15、FMS樣酪胺酸激酶3配位體（Flt3-L）、幹細胞因子（SCF）、IL-7、IL-18、IL-4、I型干擾素、GM-CSF、胰島素樣生長因子1（IGF 1）或其任何組合。例如，第二細胞因子可為IL-21。在一些實施例中，貫穿本文提供的步驟中的一或多者可存在多於一種細胞因子。在一些實施例中，Il-21及IL-2二者皆存在於第一輪擴增及第二輪擴增（或其任何後續輪次）中的至少一者中。此外，由於本文提供的各種實施例亦涉及在各輪擴增中的每一者中重複使用細胞因子（例如IL-21），因此可採用此種細胞因子第一次（或在第一輪或步驟期間）及第二次（例如在再擴增步驟期間）。因此，在一些實施例中，第一細胞因子（例如IL-21）可用於第一輪共培養及第二輪共培養二者。例如此亦可替代性地陳述為第一細胞因子及第二細胞因子，其中第一細胞因子及第二細胞因子二者皆為IL-21。 製造自然殺手細胞之方法
圖1是示出使用各種示例性飼養細胞來擴增NK細胞的一些方法的流程圖。在一些實施例中，藉由在IL-21存在的情況下與飼養細胞一起共培養來擴增CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞。飼養細胞可為任何類型的飼養細胞，例如，尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞（「類型1」）、K562細胞（「類型2」）或PBMC（「類型3」）。在一些實施例中，在培養的第17天或約第17天（或在第16至21天或第9至25天中的任何時間）收集細胞，且所製造的細胞在此處或本說明書的別處可被稱為「IL21+」。此種不利用冷凍保存或第二培養步驟的細胞擴增過程在此處或本說明書的別處可被稱為「原始過程」。在一些實施例中，在第14天或約第14天（或在第14至18天或第9至25天中的任何時間）收集細胞，且使所述細胞經受冷凍保存。冷凍保存前的培養在此處或本說明書的別處可被稱為「第一培養步驟」或「第一擴增步驟」或「第一共培養步驟」。可將冷凍保存的細胞解凍並再次擴增，以在IL-21存在（「IL-21+/+」）的情況下或在IL-21不存在（「IL-21+/-」）的情況下與飼養細胞一起共培養。此種第二擴增過程可被稱為「第二培養步驟」或「再刺激過程」或「第二共培養步驟」或第二擴增步驟。可在培養的第17天或約第17天（或在第16至21天或第9至25天中的任何時間）收集細胞。在一些實施例中，可執行進一步的再擴增或再刺激步驟或循環。如圖14B所示，在一些實施例中，可存在第一刺激，隨後是二或更多個再刺激步驟。
在一些實施例中，藉由在IL-21不存在的情況下與飼養細胞一起共培養來擴增CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞。通常，此適用於在利用IL-21進行的初始培養步驟之後的培養步驟。飼養細胞可為用於NK細胞的任何類型的飼養細胞，包括例如，尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞（「類型1」）、K562細胞（「類型2」）或PBMC（「類型3」）。在一些實施例中，在培養的第17天或約第17天（或第16至21天）收集細胞，且所製造的細胞在此處或本說明書的別處可被稱為「IL21-」。在一些實施例中，在第14天或約第14天（或第14至18天）收集細胞，且使所述細胞經受冷凍保存。可將冷凍保存的細胞解凍並再次擴增，以在IL-21存在（「IL-21-/+」）的情況下或在IL-21不存在（「IL-21-/-」）的情況下與飼養細胞一起共培養。此種第二擴增過程可被稱為「第二培養步驟」或「再刺激過程」。可在培養的第17天或約第17天（或第16至21天或第9至25天）收集細胞。如本文所詳述的，在第一擴增中使用IL-21容許NK細胞的冷凍及解凍以及後續優異擴增，任選地利用額外的IL-21（例如，其具有進一步提高細胞毒性的有益效果）。 第一培養（擴增或共培養）步驟
第一培養步驟可包括在培養的第0至6天之間添加細胞因子一次或多次。可使用多於一種細胞因子（例如，亦可採用IL-2）。例如，第一培養步驟可包括在培養的第0天及第3天中的每一者添加所述細胞因子中的一者或二者。
當與飼養細胞及第一細胞因子共培養時，在第0至6天期間進一步添加另一細胞因子一次或多次的情況下進行共培養可表現出優異的增殖及/或抗癌活性。在一些實施例中，在14天的循環中添加飼養細胞及額外的細胞因子的情況下培養6天可表現出優異的增殖及/或抗癌活性。在一些實施例中，IL-21被使用至少一次，且任選地在冷凍前及冷凍後使用。在一些實施例中，IL-2可作為進一步的細胞因子被包括在內。
在一些實施例中，第一細胞因子（例如，IL-21）可以10至1,000、10至500、10至100、20至100、30至100、40至100、50至100或10至50奈克/毫升的濃度使用。在一些實施例中，額外的細胞因子可以50至1,000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至550、100至550、150至550、200至550、250至550、300至550、350至550、400至550或450至550國際單位/毫升的濃度使用。在一些實施例中，所述濃度為約50奈克/毫升。
使NK細胞增殖的傳統方法利用高濃度的各種細胞因子。相反，在本文闡述的使自然殺手細胞增殖的方法的一些實施例中，僅使用低濃度的一種細胞因子即可以高產率及高純度使自然殺手細胞增殖。
在一些實施例中，共培養（培養、擴增（包括再擴增））可藉由以1:1至100、1:1至90、1:1至80、1:1至70、1:10至65、1:20至65、1:30至65、1:40至65、1:50至65或1:55至65的混合比率包含外周血單核細胞及飼養細胞（例如，尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞）來執行。在一些實施例中，共培養可藉由以各種混合比率包括外周血單核細胞及飼養細胞（例如，尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞）來執行。在一些實施例中，對於PBMC（例如，作為CD56+的替代物），所述比率可為約1:0.5:0.5至1:10:10。在一些實施例中，對於CD56+細胞：所述比率乘以例如10或20（例如，CD56+細胞與飼養細胞的比率為1:1至100）。
共培養可在培養基中執行，且可使用此項技術中一般用於將外周血單核細胞誘導及增殖為自然殺手細胞的任何合適的培養基，而不限於此種培養基。例如，RPMI-1640、DMEM、x-vivo 10、x-vivo 20或塞爾格羅幹細胞生長培養基（Stem Cell Growth Medium，SCGM）培養基可用作此種培養基。此外，培養條件（例如溫度）可遵循此項技術中已知的外周血單核細胞的任何合適的培養條件。
在一些實施例中，第一培養步驟可被執行0至45、0至42、0至40、0至30、0至20、0至19、0至18、0至17、0至16、0至15或0至14天。 冷凍步驟
可將自第一培養步驟培養及提供的自然殺手細胞收集並懸浮在培養基中，且隨後進行冷凍及冷凍保存。在一些實施例中，培養基可包含FBS及/或二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）。例如，培養基可包含90%的FBS及10%的DMSO，或者90%至95%的FBS及5%至10%的DMSO。在一些實施例中，可包含其他可接受的冷凍防腐劑（例如冷凍存溶液（CS10、CS5）等）或其他組分（例如蔗糖或甘油）。在一些實施例中，合適的防腐劑包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯啶酮等。在一些實施例中，可存在IL-2及/或人血清白蛋白。
在一些實施例中，冷凍保存可包括：將所提供的自然殺手細胞轉移至具有異丙醇的冷凍保存容器中，將冷凍保存容器中的自然殺手細胞在超低溫冷凍器中冷凍過夜，以及將自然殺手細胞保存在-192℃或低於-192℃下。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可被保存為在-10℃或低於-10℃、-20℃或低於-20℃、-50℃或低於-50℃、-70℃或低於-70℃、-100℃或低於-100℃、-150℃或低於-150℃、-192℃或低於-192℃、或-200℃或低於-200℃下被冷凍。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可保存一天或大於一天、2天或大於2天、3天或大於3天、7天或大於7天、14天或大於14天、30天或大於30天、60天或大於60天、或180天或大於180天，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。在一些實施例中，溫度為-135℃至-196℃。在一些實施例中，細胞被儲存0.5、1、2、3、4或5年，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。
在一些實施例中，所提供的自然殺手細胞可使用受控速率冷凍器（controlled rate freezer，CRF）來冷卻及/或冷凍。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可在液氮下保存。
在一些實施例中，所提供的自然殺手細胞可使用受控速率冷凍器（CRF）來冷卻及/或冷凍。在一些實施例中，此可以慢的速率（例如，1至8小時，例如，1、2、3、4、5、6、7或8小時或長於8小時）來進行。其亦可藉由使用異丙醇來手動緩慢冷凍，其中。將自然殺手細胞的小瓶置於冷凍容器（例如，樂基因弗羅斯蒂先生（Nalgene Mr. Frosty））中，並在-70℃下儲存過夜。次日，將細胞轉移至液氮（LN2 ）。 解凍步驟
冷凍的自然殺手細胞可在冷凍保存後使用任何合適的方法來解凍。在一些實施例中，冷凍/冷凍保存的自然殺手細胞可使用水浴（例如在37℃下）來解凍。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可解凍一小時或大於一小時、兩小時或大於兩小時、五小時或大於五小時或十小時。在一些實施例中，所述過程在水浴或珠浴中進行。在一些實施例中，解凍過程盡可能快地進行或者在自冷凍狀態（例如，液氮）取出後立即進行。
在一些實施例中，冷凍的天然殺手細胞可在37℃水浴中在10分鐘內解凍，其中冷凍的小瓶或袋可搖動以加速解凍過程。在一些實施例中，細胞亦可使用例如加熱塊、用於小瓶的自動細胞解凍儀器（例如，解凍星（ThawStar）、畢歐希森（Biocision））或用於袋的解凍儀器（例如，VIA解凍（VIA Thaw）、GE醫療保健（GE healthcare））等儀器來解凍。 第二培養（第二共培養、第二擴增或再擴增或任何後續培養步驟）步驟
由於細胞最初在第一培養步驟中用IL-21處理，因此第二擴增步驟成為可能的。因此，所述方法可不僅包括一個擴增步驟，且亦可包括兩個擴增步驟（例如，一或多個再擴增步驟）。較佳地，第二擴增步驟發生在樣品已經冷凍、儲存一段時間、且然後解凍之後。
在第二培養步驟期間，解凍的自然殺手細胞可在添加飼養細胞一次或多次的情況下培養。
在一些實施例中，飼養細胞可在培養的14天循環（或9至25天循環）期間添加一次或多次。
在一些實施例中，在14天循環期間添加飼養細胞一次或多次的情況下進行培養不僅可表現出優異的增殖及/或抗癌活性，而且亦可在冷凍及解凍後保持持續的細胞生長，使得製造足夠數量的自然殺手細胞用於臨床用途。
在一些實施例中，第二培養步驟可包括添加第二輪細胞因子（例如，額外的IL-21或除IL-21之外的其他細胞因子）。
在一些實施例中，第二培養步驟可包括在培養的第0至6天期間添加後續輪細胞因子一次。
本文別處對細胞因子的任何說明皆可應用於第二培養步驟的細胞因子。例如，在一些實施例中，第二細胞因子可以10至1,000、10至500、10至100、20至100、30至100、40至100、50至100或10至50奈克/毫升的濃度使用，及/或額外的細胞因子可以50至1,000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至550、100至550、150至550、200至550、250至550、300至550、350至550、400至550、或450-550國際單位/毫升的濃度使用。用於第二擴增的細胞因子較佳為IL-21。
在一些實施例中，所述組成物是再擴增前的冷凍細胞中的一者，其可包含：IL-2；5%至10%的DMSO；90%至95%的FBS；及任選地作為CD56+細胞的NK細胞。在一些實施例中，所述組成物是冷凍固體。在一些實施例中，所述自然殺手細胞是所述組成物的細胞群的至少90%。在一些實施例中，所述組成物更包含冷凍存溶液。在一些實施例中，所述組成物用於再擴增前的冷凍細胞。
在一些實施例中，所述組成物是再擴增前的冷凍細胞中的一者，其可包含：IL-2；5%至10%的DMSO；80%至95%的哈特曼溶液；1%至10%的人血清白蛋白；及NK細胞。在一些實施例中，所述組成物更包含冷凍存溶液。在一些實施例中，所述組成物用於注射前的冷凍細胞。
在一些實施例中，一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法可包括：自血樣中分離CD56+細胞；在IL-21存在的情況下將分離的所述CD56+細胞共培養第一時段；在所述第一時段後冷凍共培養的所述CD56+細胞；解凍冷凍的所述CD56+細胞；以及在IL-21存在的情況下將解凍的所述CD56+細胞共培養第二時段。
在一些實施例中，所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可在-10℃或低於-10℃、-20℃或低於-20℃、-50℃或低於-50℃、-70℃或低於-70℃、-150℃或低於-150℃、-192℃或低於-192℃、或-200℃或低於-200℃的溫度下儲存。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可在解凍前儲存多於一天。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可儲存2天或大於2天、3天或大於3天、7天或大於7天、14天或大於14天、30天或大於30天、60天或大於60天、或180天或大於180天，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。在一些實施例中，細胞可被冷凍長達所述細胞在解凍時為存活的時間。
在一些實施例中，分離的CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天。例如，分離的CD56+細胞可在冷凍前被共培養14或15天。在一些實施例中，共培養或擴增可視情況進行任何時間。在一些實施例中，共培養或擴增（包括再擴增）可進行9至25天（例如，10至24、11至23、13至22、14至21、14至18、14至16天等）。該些時間範圍可應用於本文提供的擴增及/或再擴增時段（包括用於其他細胞的實施例）中的任一者。
在一些實施例中，分離的CD56+細胞可在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。在一些實施例中，解凍的CD56+細胞可在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。所述一或多種飼養細胞可包括但不限於選自由以下組成的群組中的一或多者：被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞、mb15-k562、mb21-k562飼養細胞、HuT78及/或PBMC。在一些實施例中，用PBMC、CD56+及/或CD56+CD3-細胞來進行擴增。在一些實施例中，CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。例如，CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比率共培養。
在一些實施例中，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以10至100奈克/毫升的濃度添加。例如，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以20至80奈克/毫升、30至70奈克/毫升或40至60奈克/毫升的濃度添加。在一些實施例中，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間被添加多於一次。
在一些實施例中，一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法可包括：自血樣中分離CD56+；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍CD56+細胞；解凍冷凍的CD56+細胞；及擴增解凍的CD56+細胞。
在一些實施例中，CD56+細胞可在低於-100℃的溫度下冷凍。在一些實施例中，CD56+細胞可在-10℃或低於-10℃、-20℃或低於-20℃、-50℃或低於-50℃、-70℃或低於-70℃、-150℃或低於-150℃、-192℃或低於-192℃、或-200℃或低於-200℃的溫度下冷凍。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可在解凍前儲存多於一天。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可儲存2天或大於2天、3天或大於3天、7天或大於7天、14天或大於14天、30天或大於30天、60天或大於60天、或180天或大於180天，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。例如，冷凍的CD56+細胞可儲存多於一天且小於10年。
在一些實施例中，CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天。例如，CD56+細胞可在冷凍前被共培養14或15天。在一些實施例中，共培養或擴增（包括再擴增）可進行9至25天（例如，10至24、11至23、13至22、14至21、14至18、14至16天等）。該些時間範圍可應用於本文提供的擴增及/或再擴增時段（包括用於其他細胞的實施例）中的任一者。
在一些實施例中，所述一或多種飼養細胞可為選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。所述CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。例如，CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比率共培養。
在一些實施例中，IL-21可以10至100奈克/毫升的濃度添加。例如，IL-21可以20至80奈克/毫升、30至70奈克/毫升或40至60奈克/毫升的濃度添加。在一些實施例中，IL-21可被添加多於一次。
在一些實施例中，一種增加自然殺手細胞的細胞毒性的方法可包括：提供所述自然殺手細胞；冷凍所述自然殺手細胞；解凍冷凍的所述自然殺手細胞；以及在IL-21存在的情況下，對解凍的自然殺手細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
在一些實施例中，所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的自然殺手細胞。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可在-10℃或低於-10℃、-20℃或低於-20℃、-50℃或低於-50℃、-70℃或低於-70℃、-150℃或低於-150℃、-192℃或低於-192℃、或-200℃或低於-200℃的溫度下儲存。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可在解凍前儲存多於一天。在一些實施例中，冷凍的自然殺手細胞可儲存2天或大於2天、3天或大於3天、7天或大於7天、14天或大於14天、30天或大於30天、60天或大於60天、或180天或大於180天，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。在一些實施例中，細胞被儲存長達一旦解凍細胞中的任一者保持存活的時間。
在一些實施例中，所述一或多種飼養細胞可為選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。在一些實施例中，解凍的自然殺手細胞可以自然殺手細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
在一些實施例中，IL-21可以10至100奈克/毫升的濃度添加。例如，IL-21可以20至80奈克/毫升、30至70奈克/毫升或40至60奈克/毫升的濃度添加。在一些實施例中，IL-21可被添加多於一次。
在一些實施例中，一種製造自然殺手細胞之方法可包括重複以下步驟：冷凍步驟；解凍步驟；以及第二培養步驟，包括在添加飼養細胞的情況下進行共培養。
在一些實施例中，如圖14A所示（在資料曲線上方的條形時間點中），可應用再刺激或再擴增的多於一個循環。在一些實施例中，存在第一刺激，隨後是細胞培養，隨後是冷凍（任選的），隨後是第二刺激（再刺激），隨後是第二細胞培養步驟，隨後是冷凍（任選的），隨後是第三刺激（第二再刺激），隨後是另一培養步驟。IL-21可用於本文提供的刺激步驟中的每一者中。任選的冷凍步驟可應用於全部細胞或細胞的一部分。在一些實施例中，存在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多輪刺激（例如，一輪刺激，且然後是1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多輪再刺激）。在再刺激中的每一者後，可存在另一細胞培養/擴增步驟。在一些實施例中，細胞培養或再擴增中的每一者可進行9至25天。在每一細胞培養步驟之後可存在冷凍步驟。在一些實施例中，所述過程可為以下的循環：a）刺激（或再刺激），隨後是b）細胞培養，隨後是c）冷凍（任選的），隨後是d）解凍（任選的），以根據需要重複多次。在一些實施例中，IL-21的量在10與100奈克/毫升之間（例如，50奈克/毫升）。圖14A中的刺激/再刺激標示向細胞中添加IL-21。
在一些實施例中，本文提供的過程中的任一者可包括一或多個冷凍步驟。
在一些實施例中，本文提供的關於自然殺手細胞的實施例中的任一者可包括自然NK細胞以及遺傳修飾的NK細胞。 用於處理癌症的細胞治療組成物
根據一些實施例，用於處理癌症的細胞治療組成物可包含外周血來源的CD56+ NK細胞。所述細胞將會經歷至少兩輪擴增或作為至少兩輪擴增的結果，其中至少第一輪擴增是在IL-21存在的情況下進行的。
在本說明書中，用語「外周血來源的」可意指細胞源自「外周血的全血」或「使用白細胞除去法自外周血中分離的白細胞」。外周血來源的CD56+ NK細胞可與外周血單核細胞（PBMC）來源的CD56+ NK細胞互換使用。
在一些實施例中，細胞因子可以18至180,000、20至100,000、50至50,000、50至1,000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至550、100至550、150至550、200至550、250至550、300至550、350至550、400至550、450至550國際單位/毫升的濃度使用。當細胞因子在該些範圍內使用時，其可抑制癌症處理組成物中包含的自然殺手細胞的凋亡，並增加自然殺手細胞的抗癌活性。
在一些實施例中，所述組成物可包含IL-2作為額外的細胞因子（例如，除了IL-21之外）。
在一些實施例中，CD56+ NK細胞可如本文別處所述來獲得。例如，CD56+ NK細胞可藉由與飼養細胞（例如，被輻照尤爾卡特細胞及被輻照EBV-LCL細胞）共培養而獲得。在一些實施例中，CD56+ NK細胞與全細胞（純度）的比率可為85%或大於85%、90%或大於90%、95%或大於95%、或98%或大於98%。
在一些實施例中，癌症可為血癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、前列腺癌或神經母細胞瘤，但不限於此。在一些實施例中，所述過程可應用於例如神經退行性疾病及急性感染中的同種異體自然殺手細胞療法。
在一些實施例中，所述組成物可不包含T細胞，或者可僅包含微量的T細胞。例如，組成物中T細胞與全細胞的比率可小於15%、小於10%、小於5%、小於2%、小於1%或更少。
在本說明書中，用語「T細胞」是指源自胸腺的淋巴細胞，其可「記憶」先前遇到的抗原並向B細胞提供資訊，由此促進抗體的產生，並在細胞免疫系統中發揮重要作用。由於該些T細胞可區分不同抗原之間非常小的差異，以誘導對同種異體抗原的免疫反應，因此自體療法是可能的，但用於同種異體療法可能存在限制。因此，不具有T細胞的細胞治療組成物可適用於同種異體移植。
在本說明書中，用語「細胞治療劑」是指藉由一系列動作（例如在體外增殖及篩選自體、同種異體及異種活細胞，以恢復細胞及組織的功能或藉由其他方法改變細胞的生物學特性）用於處理、診斷及預防的藥物。細胞治療劑自1993年在美國及自2002年在韓國被規定為醫療產品。該些細胞治療劑可大致分類為兩個領域，即，第一，用於組織再生或器官功能恢復的幹細胞治療劑，及第二，用於調節體內免疫反應（例如抑制免疫反應或增強免疫反應）的免疫細胞治療劑。
本文所述的細胞治療組成物的施用途徑可為任何合適的途徑，只要所述組成物到達靶組織即可。施用可為腸胃外施用，例如腹膜內施用、靜脈內施用、肌內施用、皮下施用或皮內施用，但不限於此。
本文所述的細胞治療組成物可與適用於或一般用於細胞療法的藥學上可接受的載體一起配製成合適的形式。「藥學上可接受的」是指生理上可接受的且當對人體施用時，一般不會引起過敏反應（例如腸胃失調、頭暈等）或其類似反應的組成物。藥學上可接受的載體可包括例如腸胃外施用載體（例如水、合適的油、鹽水、葡萄糖水溶液及二醇等），且更包括穩定劑及防腐劑。合適的穩定劑包括抗氧化劑（例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸）、蔗糖、白蛋白等。合適的防腐劑包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯啶酮等。
細胞治療組成物亦可藉由其中細胞治療劑可移動至靶細胞的任何裝置施用。
細胞治療組成物可包含處理疾病的治療有效量的細胞治療劑。用語「治療有效量」意指在研究人員、獸醫、內科醫生或其他臨床醫生考量的組織系統、動物或人類中誘導生物或醫學反應的活性成分或細胞治療組成物的量，且包括誘導待處理疾病或障礙的症狀緩解的量。對於熟習此項技術者而言將顯而易見的是，包含在細胞治療組成物中的細胞治療劑可根據期望的效果進行改變。因此，細胞治療劑的最佳含量可由熟習此項技術者容易地確定，且可根據包括以下的各種因素進行調整：疾病的類型、疾病的嚴重程度、組成物中包含的其他成分的含量、製劑的類型以及患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、施用時間、施用途徑、組成物的分泌比率、處理期及同時使用的藥物。重要的是，藉由考量所有因素，包括能夠藉由最小量獲得最大效果而沒有副作用的量。例如，細胞治療組成物可包含每千克體重1×106 至5×108 個細胞的細胞治療劑。
在一些實施例中，細胞治療組成物的NK細胞相較於其預冷凍的群體而言可具有50%或大於50%、60%或大於60%、70%或大於70%、80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、93%或大於93%、95%或大於95%、或98%或大於98%的細胞毒性。
在一些實施例中，所述組成物包含有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞。CD56+細胞可藉由以下方式來製備：自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）；自外周血單核細胞中分離CD56+細胞；在一或多種細胞因子存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；冷凍CD56+細胞；解凍冷凍的CD56+細胞；以及在一或多種細胞因子存在的情況下，對解凍的CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
在一些實施例中，有效量的CD56+細胞可為每千克體重1×106 至5×108 個細胞。
在一些實施例中，一種細胞組成物可包含有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞；IL-2；及IL-21。
在一些實施例中，一種組成物可包含：源自外周血單核細胞（PBMC）的第一群CD56+細胞；冰；IL-2及IL-21。當解凍時，所述CD56+細胞具有第二群CD56+細胞的至少80%的細胞毒性，其中所述第二群CD56+細胞尚未冷凍。在一些實施例中，細胞毒性為至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一些實施例中，將非冷凍擴增（利用及不利用IL21、IL21+或IL21-）與冷凍但在第一步驟上與IL21+共培養的擴增進行比較，冷凍擴增的平均細胞毒性是非冷凍擴增的97.7%（表C：範圍83%至131%）。在一些實施例中，當將非冷凍擴增（利用及不利用IL21、IL21+或IL21-）與冷凍但在第一步驟上不與IL21+共培養的擴增（IL21--，IL21-+）進行比較時，冷凍擴增的平均細胞毒性可為非冷凍擴增的至少81.4%（表D範圍61%至83%）。當在冷凍擴增（IL21++）的兩個步驟中添加IL21時，平均細胞毒性是非冷凍擴增的114%（表C值98%至131%）。因此，在一些實施例中，IL21+/+（72%）相對於IL21-/+（45%）標示當利用IL21進行第一擴增且亦在第二步驟上利用IL21時，細胞毒性較在第一步驟上不利用IL21時高60%。因此，在一些實施例中，IL21在第一擴增中的存在容許達成高60%的第二冷凍後擴增。對於IL21+/-（62%）相對於IL21-/-（46.1%）而言，其意指當在第一步驟上利用IL21進行第一擴增而在第二步驟上不利用IL21時，細胞毒性較在第一步驟上不利用Il21時可能高至少35%。
在一些實施例中，細胞毒性是將非冷凍擴增（利用及不利用IL21）與冷凍但在第一步驟上與IL21+共培養的擴增進行比較，其中所述冷凍擴增的平均細胞毒性是所述非冷凍擴增的97.7%。在一些實施例中，細胞毒性是將非冷凍擴增（利用及不利用IL21）與冷凍但在第一步驟上不與IL21+共培養的擴增進行比較，其中所述冷凍擴增的平均細胞毒性是所述非冷凍擴增的81.4%。在一些實施例中，在冷凍之前及之後兩種情況下皆添加IL21的情況下，且其中平均細胞毒性是非冷凍擴增的114%。
在一些實施例中，在共擴增期間容許隨後的再擴增的初始IL21處理的優異性質可與下表A至D中的結果一致：表 A ：細胞毒性 k562 溶胞 %
10:1 3:1 1:1 0.5:1
IL21+ 95.8 98.8 74.6 53.3
IL21- 94.2 81.4 55.6 37.7
IL21+/+ 98.1 84.9 72.8 42.9
IL21+/- 99.6 83.2 62.2 33.6
IL21-/+ 89.1 81 45.3 31.2
IL21-/- 91.6 77.3 46.1 30.8
表 B ：與第一步驟中利用 IL21 時的比較
10:1 3:1 1:1 0.5:1 AVG
2步冷凍/2步冷凍 IL21++ /IL21-- 107% 110% 158% 139% 129%
2步冷凍/2步冷凍 IL21++ /IL21+- 98% 102% 117% 128% 111%
2步冷凍/2步冷凍 IL21++ /IL21-+ 110% 105% 161% 138% 128%
2步冷凍/2步冷凍 IL21+- /IL21-- 109% 108% 135% 109% 115%
表 C ：與第一步驟中利用 IL21 時的比較
10:1 3:1 1:1 0.5:1 AVG
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21++ /IL21+ 102% 86% 98% 80% 92%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21++ /IL21- 104% 104% 131% 114% 113%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21+- /IL21+ 104% 84% 83% 63% 84%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21+- /IL21- 106% 102% 112% 89% 102%
總平均值： 97.7%
表 D ：與第一步驟中不利用 IL21 時的比較
10:1 3:1 1:1 0.5:1 AVG
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21--/IL21- 97% 95% 83% 82% 89%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21--/IL21+ 96% 78% 62% 58% 73%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21-+/IL21- 95% 100% 81% 83% 90%
2步冷凍/1步解除冷凍 IL21-+/IL21+ 93% 82% 61% 59% 74%
總平均值： 81.4%
在用於培養、擴增（包括再擴增）NK細胞的實施例中的任一者中，在共培養（培養、擴增（包括再擴增））開始時培養物中的外周血單核細胞的數目在1×104 至1×1015 個細胞的範圍內。在一些實施例中，在共培養開始時培養物中的外周血單核細胞的數目在1×104 至5×104 個細胞、5×104 至1×105 個細胞、1×105 至5×105 個細胞、5×105 至1×106 個細胞、1×106 至1×107 個細胞、1×107 至1×108 個細胞、1×108 至1×109 個細胞、1×109 至1×1010 個細胞、1×1011 至1×1012 個細胞、1×1012 至1×1013 個細胞、1×1013 至1×1014 個細胞、或1×1014 至1×1015 個細胞的範圍內。在一些實施例中，在第一或初始擴增開始時培養物中的外周血單核細胞的數目在1×104 至5×104 個細胞、5×104 至1×105 個細胞、1×105 至5×105 個細胞、5×105 至1×106 個細胞、1×106 至1×107 個細胞、1×107 至1×108 個細胞、1×108 至1×109 個細胞、1×109 至1×1010 個細胞、1×1011 至1×1012 個細胞、1×1012 至1×1013 個細胞、1×1013 至1×1014 個細胞、或1×1014 至1×1015 個細胞的範圍內。在一些實施例中，在再擴增開始時培養物中的外周血單核細胞的數目在1×104 至5×104 個細胞、5×104 至1×105 個細胞、1×105 至5×105 個細胞、5×105 至1×106 個細胞、1×106 至1×107 個細胞、1×107 至1×108 個細胞、1×108 至1×109 個細胞、1×109 至1×1010 個細胞、1×1011 至1×1012 個細胞、1×1012 至1×1013 個細胞、1×1013 至1×1014 個細胞、或1×1014 至1×1015 個細胞的範圍內。相較於傳統途徑而言，本發明方法可提供更大的自然殺手細胞擴增。因此，在上述實施例中的任一者中，在共培養（培養、擴增（包括再擴增））開始時培養物中的外周血單核細胞的數目是在用於擴增NK細胞的傳統途徑（例如，不利用例如IL-21及/或IL-2等細胞因子進行擴增）中難以使用的細胞數目，以提供例如用於治療用途及/或冷凍保存的相似數目的自然殺手細胞。
如本文所揭露的，在一些實施例中，本揭露的方法提供適用於治療用途（例如，免疫療法）的自然殺手細胞。在一些實施例中，本揭露的方法提供自然殺手細胞的冷凍保存，所述自然殺手細胞可隨後被解凍並有效地擴增用於治療用途。因此，在用於培養或擴增（包括再擴增）自然殺手細胞的實施例中的任一者中，自然殺手細胞被擴增以製造用於治療用途的經擴增自然殺手細胞的一個群體及用於冷凍保存的另一群體。在一些實施例中，冷凍保存的自然殺手細胞隨後被解凍並再擴增用於治療用途及/或進一步冷凍保存。
在用於培養或擴增（包括再擴增）自然殺手細胞的實施例中的任一者中，在擴增或再擴增結束時自然殺手細胞的數目大於有效用於治療用途的自然殺手細胞的數目。在一些實施例中，過量的自然殺手細胞被冷凍保存以備將來使用，例如，將來解凍、擴增及對有需要的患者施用。在一些實施例中，自然殺手細胞被擴增或再擴增至細胞數目較用於或將要用於療法（例如，免疫療法）的自然殺手細胞的數目大至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或大於200%的程度，或在前述值中任兩者之間的範圍內的百分比。
在用於培養或擴增（包括再擴增）自然殺手細胞的實施例中的任一者中，所述方法可包括重複冷凍-解凍-擴增循環。在一些實施例中，所述方法包括重複冷凍-解凍-擴增循環一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或更多次。
本文亦提供一種冷凍保存的自然殺手細胞的組成物，其中自然殺手細胞在解凍後保持其生物活性，（例如，細胞毒性）。在一些實施例中，冷凍保存的自然殺手細胞在解凍及再擴增後保持其生物活性，（例如，細胞毒性）。在一些實施例中，冷凍保存的自然殺手細胞的組成物是藉由本文揭露的培養或擴增（包括再擴增）自然殺手細胞的方法中的任一者來製備。在一些實施例中，所述組成物包含免疫細胞群，所述免疫細胞群為至少80%、85%、90%、95%、97%或大於97%的自然殺手細胞。所述組成物可包含合適的冷凍保存介質。在一些實施例中，所述組成物包含二甲基亞碸（DMSO）及血清（例如，FBS、人血清）。在一些實施例中，所述組成物包含1%至15%、2%至15%、5%至15%、5%至10%或約10%的DMSO。在一些實施例中，所述組成物由冷凍保存的免疫細胞群組成或構成，所述免疫細胞群包括至少90%的自然殺手細胞、10%的DMSO及90%的FBS。在一些實施例中，自然殺手細胞源於自受試者獲得的PBMC。在一些實施例中，所述組成物由冷凍保存的免疫細胞群組成或構成，所述免疫細胞群包括至少90%的自然殺手細胞、5%至10%的DMSO及90%至95%的FBS。在一些實施例中，自然殺手細胞源於自受試者獲得的PBMC。在一些實施例中，所述組成物更包含冷凍存溶液。 預防或處理癌症的方法
在一些實施例中，提供一種用於預防或處理癌症的方法。所述方法包括對受試者施用包含外周血來源的CD56+自然殺手細胞及細胞因子的用於抗癌的細胞治療組成物。在一些實施例中，所述細胞是雙重擴增過程的結果，其中至少第一擴增過程是在IL-21存在的情況下發生。
用語「受試者」是指作為處理、觀察或測試的受試者的哺乳動物，且較佳為人。所述受試者可為血癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、前列腺癌或神經母細胞瘤的患者，但不限於此。
在一些實施例中，在成人的情況下，細胞治療組成物可一天施用一次至幾次。細胞治療組成物可每天施用或以2至180天的間隔施用。包含在所述組成物中的細胞治療劑可包括1×106 至1×1011 個外周血來源的CD56+自然殺手細胞，例如，每千克體重約1×106 至1×108 個NK細胞。在一些實施例中，細胞治療組成物中的外周血來源的CD56+自然殺手細胞的純度為至少約90%。在一些實施例中，細胞因子是濃度範圍介於約50至50,000國際單位/毫升的IL-2。
在一些實施例中，細胞治療組成物可與適用於或一般用於細胞療法的藥學上可接受的載體一起配製成合適的形式。「藥學上可接受的」是指生理上可接受的且當對人體施用時，一般不會引起過敏反應（例如腸胃失調、頭暈等）或其類似反應的組成物。藥學上可接受的載體可包括例如腸胃外施用載體（例如水、合適的油、鹽水、葡萄糖水溶液、二醇、鹼性化合物（例如哈特曼溶液）或替代物（例如生理鹽水溶液、勃脈力A等）），且更包括穩定劑及防腐劑。合適的穩定劑包括抗氧化劑（例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸）、蔗糖、白蛋白、人血清白蛋白等。合適的防腐劑包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯啶酮等。
在一些實施例中，細胞治療組成物可藉由任何合適的方法施用，例如經由直腸、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、胸骨內、經皮、局部、眼內或皮內途徑施用。在一些實施例中，包含在所述組成物中的自然殺手細胞可為同種異體的，即自除被處理對象以外的人獲得的。在一些實施例中，所述人可為正常人或癌症患者。在一些實施例中，包含在所述組成物中的自然殺手細胞可為自體的，即自被處理的受試者獲得的。
在一些實施例中，本文揭露的自然殺手細胞及包含本文揭露的自然殺手細胞的細胞治療組成物可用於處理除癌症以外的疾病或病症。據報導，自然殺手細胞在免疫系統的調節中發揮重要作用（例如藉由調節T細胞），因此可施用具有自然殺手細胞的細胞治療組成物來處理與免疫系統相關聯的病症。例如，細胞治療組成物可被施用來處理神經退行性障礙（例如，阿爾茨海默病及帕金森病）或自身免疫性疾病（例如，類風濕性關節炎、多發性硬化、銀屑病、脊椎關節病、系統性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）、乾燥綜合徵、系統性硬化）。
在一些實施例中，一種處理受試者的方法可包括：自受試者收集CD56+細胞；在IL-21存在的情況下，對CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養；將共培養的所述CD56+細胞冷凍至少一天；解凍冷凍的所述CD56+細胞；擴增解凍的所述CD56+細胞；以及對所述受試者施用擴增的所述CD56+細胞，其中來自第二擴增的細胞的細胞毒性是冷凍前共培養的CD56+的細胞毒性的至少80%（例如，至少80%、85%、90%、95%或97%）。
在一些實施例中，所述方法可更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可在-10℃或低於-10℃、-20℃或低於-20℃、-50℃或低於-50℃、-70℃或低於-70℃、-150℃或低於-150℃、-192℃或低於-192℃、或-200℃或低於-200℃的溫度下儲存。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可在解凍前儲存多於一天。在一些實施例中，冷凍的CD56+細胞可儲存2天或大於2天、3天或大於3天、7天或大於7天、14天或大於14天、30天或大於30天、60天或大於60天、或180天或大於180天，包括前述值中任兩者之間的任何範圍。
在一些實施例中，CD56+細胞可在冷凍前被共培養13至16天。例如，CD56+細胞可在冷凍前被共培養14或15天。在一些實施例中，共培養或擴增（包括再擴增）可進行9至25天（例如，10至24、11至23、13至22、14至21、14至18、14至16天等）。該些時間範圍可應用於本文提供的擴增及/或再擴增時段（包括用於其他細胞的實施例）中的任一者。
在一些實施例中，擴增解凍的所述CD56+細胞包括：在IL-21存在的情況下對解凍的CD56+與一或多種被輻照飼養細胞進行共培養。所述一或多種飼養細胞是選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。在一些實施例中，CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。例如，CD56+細胞可以CD56+細胞與飼養細胞的約1:2、1:5、1:10、1:30或1:100的比率共培養。
在一些實施例中，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以10至100奈克/毫升的濃度添加。例如，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間以20至80奈克/毫升、30至70奈克/毫升或40至60奈克/毫升的濃度添加。在一些實施例中，IL-21可在第一時段及/或第二時段期間被添加多於一次。
在一些實施例中，對於人自然殺手細胞，IL-21是人IL-21。
本文提供的一些實施例包括如下特徵及優點： （a）一種製造自然殺手細胞之方法。 （b）由於即使在冷凍保存後亦可製造足夠數量的自然殺手細胞用於臨床用途，因此可增強癌症的預防及處理效果，特別是使用自然殺手細胞的同種異體療法。 （c）已擴增兩次（至少第一次利用IL-21，以及任選地第二擴增亦利用IL-21）的所得細胞的細胞毒性令人驚訝地優於不利用IL-21（一次，且甚至更大的兩次）擴增的細胞。在一些實施例中，細胞位於1至50毫升的冷凍小瓶中，或10至100毫升的冷凍袋中。 實例
提供以下實例來說明某些特定特徵及/或實施例。該些實例不應被解釋為將本揭露限制於所闡述的特定特徵或實施例。
使用LCL+KL-1型飼養細胞且在利用及不利用IL-21處理的情況下執行了高純度自然殺手細胞製造方法的比較測試。在本實例中論述的任何其他飼養細胞皆被提供作為預言實例。
IL-21在兩種生產方法中的有效性將得到驗證：1 ）原始方法 ，所述方法包括在IL-21的處理或未處理下將分離的CD56+細胞與不同類型的飼養細胞培養14至17天（但沒有隨後的再擴增）。2 ）再刺激方法 ，所述方法包括在IL-21處理或未處理的情況下培養自原始方法冷凍保存的經擴增自然殺手細胞與不同類型的飼養細胞。不同類型的飼養細胞及生產方法示於表1及圖1中，且被理解為表示一般用於NK細胞擴增的飼養細胞。表 1. 用於 NK 細胞培養的飼養細胞類型及過程
項 接種比率（NK 細胞: 飼養細胞） 原始方法 再刺激方法
飼養細胞類型 LCL+KL-1細胞 1:30:30 自新鮮或冷凍保存的PBMC中分離出CD56陽性細胞 在第14或15天冷凍保存的NK細胞
K562細胞 1:10
PBMCs 1:10
培養條件 + IL-21 與被輻照飼養細胞及IL-21共培養0至6天
- IL-21 在不利用IL-21的情況下與被輻照飼養細胞共培養
應理解，本實例提供的結果表示，飼養細胞大致跨越一系列比率、儲存時間及額外成分（例如額外細胞因子），只要存在Il-21即可。 實例1：起始材料的分離及原始方法
自人血中獲得了外周血單核細胞（PBMC）。分離的PBMC用於CD56+細胞選擇。藉由用1.077克/毫升聚蔗糖進行密度梯度離心分離而分離了PBMC，用PBS洗滌幾次，且用具有CD56微珠試劑的自體MACS沖洗溶液（AutoMACS Rinsing Solution）（德國美天旎生物技術公司（Miltenyi Biotec, Germany））進行了重懸。根據製造商的說明（德國美天旎生物技術公司）使用磁性激活細胞分選（MACS）系統選擇了CD56+細胞。將CD56+選定細胞重懸於具有或不具有50奈克/毫升IL-21的初始NK細胞培養基中。將懸浮的細胞在添加被100戈瑞輻照的飼養細胞LCL+KL-1、K562或PBMC後種接至培養燒瓶中，且然後在37℃下在5%的CO2中培養了6或7天。與每一飼養類型進行細胞培養的具體條件如下表所示。表 2. 用於 NK 細胞擴增的培養條件
飼養細胞類型 飼養細胞比率（CD56+ 細胞: 飼養細胞） 培養基及補充物
LCL+KL-1 在D0及D3的1:30:30 RPMI培養基，10%的FBS，500國際單位/毫升的IL-2，20微克/毫升的慶大黴素
自體PBMCs1) 在D0及D7時的1:5 賽爾格羅（CellGro）SCGM培養基，1%的自體血漿或10%的FBS，10奈克/毫升的抗CD3單克隆抗體OKT3，500國際單位/毫升的IL-2，20微克/毫升的慶大黴素
K562 1:10 賽爾格羅SCGM培養基，10%的FBS，500國際單位/毫升的IL-2，20微克/毫升的慶大黴素
參考：免疫網路（Immune Netw.）2018年8月；18(4):e31
在培養第6或7天時，藉由離心分離自培養燒瓶中收集了細胞，且評估了細胞數目。用NK細胞培養基對細胞進行了重懸，種接至培養袋中，且然後在37℃下在5%的CO2 中培養了17或18天。每隔3或4天，用新培養基對細胞進行次培養。 實例2：D14細胞的冷凍保存
在培養第14或15天時，藉由離心分離自培養袋中收穫了細胞，且評估了細胞數目。將細胞重懸於含有90%的FBS、10%的DMSO（具有或不具有500國際單位/毫升的IL-2）的培養基中，以5.0至10.0×106 個細胞/毫升的濃度等分至小瓶中，且然後將細胞在-196℃液氮罐中冷凍保存了1周、1、3、6、12、24個月或更長時間。 實例3：再刺激方法的冷凍的細胞解凍及細胞培養
將來自原始方法的冷凍保存的細胞在37℃水浴中解凍，並重懸於含有針對每種飼養細胞條件的補充物（具有或不具有50奈克/毫升IL-21）的初始NK細胞培養基中。將懸浮的細胞在LCL+KL-1、K562或自體PBMC下添加被100戈瑞輻照的飼養細胞後種接至培養燒瓶中，且然後在37℃下在5%的CO2中培養了6或7天。此過程被稱為再刺激方法。在培養第6或7天時，藉由離心分離自培養燒瓶中收集了細胞，且評估了細胞數目。用NK細胞培養基對細胞進行了重懸，種接至培養袋中，且然後在37℃下在5%的CO2 中培養了17或18天。每隔3或4天，用新培養基對細胞進行次培養。自D0的最初方法至藉由再刺激過程的最終收穫，總細胞培養時段被選取為31至33天。 實例4：群體倍增水準及細胞生長
基於如圖1及表3所示的實驗設計，使用CD56+細胞進行了遵循六種不同條件的NK細胞培養。其顯示出實驗設計類型1（即NK細胞與作為飼養細胞的被輻照LCL及KL-1共培養）的結果。所述過程的特定條件如表3所示。表 3. 培養條件
ID 第一步驟擴增 冷凍保存擴增的NK 細胞後的再擴增
IL21+. (+) IL-21 N/A
類型1.IL21+/+ (+) IL-21 (+) IL-21
類型1.IL21+/- (+) IL-21 (-) IL-21
IL21-. (-) IL-21 N/A
類型1.IL21-/+ (-) IL-21 (+) IL-21
類型1.IL21-/- (-) IL-21 (-) IL-21
藉由相對於種接細胞數目的擴增倍數及每一次培養日下的群體倍增水準（PDL）來評估NK細胞的細胞擴增率，其被計算為3.32（log N - log No），其中N是每一遍次結束時的細胞數目，而No是初始平板培養的細胞數目。藉由用台盼藍染色細胞評估了每一培養步驟中NK細胞的數目。
將來自兩個不同供體的製造批次進行PDL及擴增倍數比較。如表4、5及圖2A至圖3B所示，藉由利用IL-21的原始方法而得到的來自一個供體的NK細胞的PDL及擴增倍數顯示出較不利用IL-21時高的生長速率。但是，來自另一供體的批次在所述兩種條件下顯示出相似的生長速率。表 4. 原始方法的 PDL
供體 ID D0 D6 D10 D14 D17
供體1 IL21+. 0.00 4.98 9.64 11.46 12.15
IL21-. 0.00 3.32 6.17 8.40 8.62
供體2 IL21+. 0.00 5.80 9.40 11.10 11.94
IL21-. 0.00 5.80 9.49 11.10 11.48
表 5. 原始方法的擴增倍數
供體 ID D0 D6 D10 D14 D17
供體1 IL21+. 1 32 800 2,833 4,560
IL21-. 1 10 72 340 394
供體2 IL21+. 1 56 680 2,200 3,960
IL21-. 1 56 720 2,200 2,860
藉由IL-21的處理或未處理，用飼養細胞再刺激來自原始方法的在D14時的冷凍保存的細胞，並培養達17或18天。自D0的最初方法至藉由再刺激過程的最終收穫（如圖1所示），總細胞培養時段被選取為31至33天。
將來自兩個供體的若干製造批次進行PDL及擴增倍數比較。如表6、7及圖4A至圖5B所示，利用IL-21的再刺激方法的NK細胞的PDL及擴增倍數提供了較不利用IL-21的條件更高的生長速率。因此，IL-21，尤其是在第一輪擴增中，對於容許更有效的後續擴增步驟非常有用。
在原始方法中，來自供體2的NK細胞被證明在利用IL-21與不利用IL-21之間的生長速率沒有差異，但在第31天，藉由再刺激方法在IL-21條件下的生長速率顯示出高於不利用IL-21的條件下的生長速率。表 6. 再刺激方法的 PDL
供體 ID D0 D6 D10 D14 D20 D24 D28 D31
供體1 類型1. IL21+/+ 0.00 4.98 9.64 11.46 16.94 19.42 21.67 22.40
類型1. IL21+/- 0.00 4.98 9.64 11.46 16.72 19.95 21.89 22.82
類型1. IL21-/+ 0.00 3.32 6.17 8.40 12.35 15.15 17.25 18.25
類型1. IL21-/- 0.00 3.32 6.17 8.40 11.02 14.25 16.63 18.12
供體2 類型1. IL21+/+ 0.00 5.80 9.40 11.10 16.89 20.47 22.57 23.57
類型1. IL21+/- 0.00 5.80 9.40 11.10 16.94 20.53 22.48 23.33
類型1. IL21-/+ 0.00 5.80 9.49 11.10 16.50 19.94 21.53 22.11
類型1. IL21-/- 0.00 5.80 9.49 11.10 16.50 18.79 20.44 21.16
表 7. 再刺激方法的擴增倍數
供體 ID D0 D6 D10 D14 D20 D24 D28 D31
供體1 類型1. IL21+/+ 1 32 800 2,833 126,754 708,333 3,355,263 5,592,105
類型1. IL21+/- 1 32 800 2,833 108,974 1,024,359 3,923,077 7,453,846
類型1. IL21-/+ 1 10 72 340 5,231 36,615 156,923 313,846
類型1. IL21-/- 1 10 72 340 2,092 19,615 102,000 287,692
供體2 類型1. IL21+/+ 1 56 680 2,200 122,222 1,466,667 6,285,714 12,571,429
類型1. IL21+/- 1 56 680 2,200 126,923 1,523,077 5,923,077 10,661,538
類型1. IL21-/+ 1 56 720 2,200 93,077 1,015,385 3,046,154 4,569,231
類型1. IL21-/- 1 56 720 2,200 93,077 456,923 1,438,462 2,369,231
實例5：NK細胞的純度
已知NK細胞表達CD56，且缺乏CD3。為探究藉由原始方法及再刺激方法在擴增前及擴增後NK細胞的純度，應用流式細胞術分析。用抗CD56-FITC及抗CD3-PE的螢光染料標記抗體來染色NK細胞，且然後藉由使用流式細胞術進行分析。
隨著NK細胞培養在兩種條件（利用及不利用IL-21處理）下藉由原始方法及再刺激方法的進行，在來自2個不同供體的擴增的NK細胞中，NK細胞（CD56+CD3-）的比例迅速增加且在第31天超過99%（表7）。其他細胞類型的細胞表面標記（例如CD3+、CD20+及CD14+）在最終培養階段顯示出非常低的群體（表8）。表 8. 在培養擴增的 NK 細胞上的 NK 細胞標記表達（ CD3-CD56+ ）模式
供體 ID 冷凍前 解凍後
D0 D10 D14 D17 D24 D28 D31
供體1 類型1. IL21+/+ 75.23 98.31 99.24 99.27 99.35 99.65 99.60
類型1. IL21+/- - - - - 98.67 99.24 99.70
類型1. IL21-/+ 75.23 94.30 96.29 95.63 90.93 96.38 98.09
類型1. IL21-/- - - - - 94.42 92.59 97.28
供體2 類型1. IL21+/+ 82.83 98.60 98.20 98.83 98.68 99.36 99.86
類型1. IL21+/- - - - - 98.16 99.69 99.84
類型1. IL21-/+ 82.83 99.03 98.64 99.39 96.84 99.47 99.81
類型1. IL21-/- - - - - 97.43 99.21 99.63
表 9. 在培養擴增的 NK 細胞上的其他細胞標記表達（ CD3 、 CD20 、 CD14 ）模式
供體 ID 表面標記 冷凍前 解凍後
D0 D10 D14 D17 D24 D28 D31
供體1 類型1. IL21+/+ CD3 24.1 0.38 0.2 0.48 0.28 0.06 0.22
CD20 0.43 0.04 0.68 0.45 0.57 0.12 0.05
CD14 0.28 0.30 1.72 0.23 0.12 0.12 0.19
類型1. IL21+/- CD3 - - - - 0.13 0.11 0.08
CD20 - - - - 0.16 0.14 0.05
CD14 - - - - 0.03 0.27 0.23
類型1. IL21-/+ CD3 24.1 2.03 2.21 3.38 0.85 0.26 0.61
CD20 0.43 0.54 1.11 0.38 0.45 0.59 0.14
CD14 0.28 1.85 1.75 0.61 0.28 0.17 0.44
類型1. IL21-/- CD3 - - - - 0.95 1.13 1.40
CD20 - - - - 0.88 0.51 0.21
CD14 - - - - 0.66 0.13 0.38
供體2 類型1. IL21+/+ CD3 16.96 1.13 1.40 1.08 0.86 0.41 0.10
CD20 1.35 0.34 0.20 0.02 0.49 0.45 0.04
CD14 0.47 0.25 0.20 0.04 0.53 0.27 0.05
類型1. IL21+/- CD3 - - - - 1.08 0.14 0.10
CD20 - - - - 0.85 0.12 0.03
CD14 - - - - 0.60 0.00 0.08
類型1. IL21-/+ CD3 16.96 0.59 1.08 0.55 0.87 0.11 0.07
CD20 1.35 0.15 0.06 0.12 0.80 0.13 0.06
CD14 0.47 0.22 0.10 0.13 0.57 0.12 0.05
類型1. IL21-/- CD3 - - - - 1.30 0.62 0.35
CD20 - - - - 1.17 0.54 0.13
CD14 - - - - 1.05 0.64 0.31
實例6 NK細胞的細胞毒性功能
藉由螢光細胞毒性測定評估了NK細胞對腫瘤靶細胞系的細胞毒性。將NK細胞與用鈣黃綠素AM染色的K-562細胞以10:1、3:1、1:1及0.5:1的比率在光保護下共培養了4小時。向靶細胞中添加了含有10%的FBS或2%的特裡同（triton）X100的RPMI1640，以提供自發及最大的釋放。對於鈣黃綠素釋放測定，回收NK細胞與靶細胞孵育後的上清液，且使用斯必克特拉麥克斯（SpectraMax）M2酶標儀（分子裝置公司（Molecular devices），加利福尼亞州聖何塞（San Jose, CA））評估了其螢光。使用式[（測試釋放-自發釋放）/（最大釋放-自發釋放）] × 100計算了特異性溶胞百分比（percent specific lysis）。
使用標準K-562細胞系（其為NK敏感靶）測試了藉由原始方法及再刺激方法培養的NK細胞的細胞毒性。在利用及不利用IL-21的條件下來自原始方法的擴增的細胞即使在低E:T比率（1:1及0.5:1）下亦會對K-562表現出強的細胞毒活性（圖6至圖7）。但是，藉由再刺激方法而得到的NK細胞的細胞毒活性在利用及不利用IL-21處理的不同條件下顯示出不同的水準。對於原始方法及再刺激方法二者而言，藉由IL-21處理而得到的NK細胞皆表現出較其他條件更強的細胞毒活性（圖8至圖11）。
但對於原始條件及再刺激條件二者而言，藉由未經IL-21處理條件而得到的NK細胞的細胞毒活性在0.05:1至3:1的E:T比率下降低。此外，相較於IL-21處理條件而言，在10:1的E:T比率下，顯示出更低的細胞毒性水準。
利用IL-21處理擴增的NK細胞顯示出對K-562細胞系的高度有效的細胞毒性，在藉由原始方法及再刺激方法生產的兩種NK細胞中具有相似的細胞毒性（圖6至圖11）。圖6展示出利用IL-21擴增（IL-21+）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖7展示出不利用IL-21擴增（IL-21-）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖8展示出利用IL-21擴增且利用IL-21再刺激（IL-21+/+）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖9展示出利用IL-21擴增而不利用IL-21再刺激（IL-21+/-）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖10展示出不利用IL-21擴增而利用IL-21再刺激（IL-21-/+）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖11展示出不利用IL-21擴增且不利用IL-21再刺激（IL-21-/-）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。圖12A展示出NK細胞的激活受體的表型比較。圖12B展示出NK細胞的抑制性及趨化因子受體的表型比較。 表面標記表達
NK細胞功能藉由在其表面上表達的激活受體與抑制受體之間的平衡來精細調節。為在表型上表徵激活[CD16、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D、2B4（CD244）、NKG2C、CRACC]或抑制性NK受體[NKG2A、KIR:CD158a（KIR2DL1）、CD158b（KIR2DL2/L3）、CD158e（KIR3DL1）]的表達水準，在擴增前（第0天；D0）以及在藉由利用IL-21處理的原始（舊的（Old））過程及再刺激過程擴增17至18天後，在閘控CD56+ NK細胞上分析了趨化因子受體（CXCR3、CXCR4）或黏附分子（CD62L）。表面受體表達水準被計算為樣品中NK細胞的受體陽性子集的百分比。用每一標記的螢光染料標記抗體對原始過程及再刺激過程的每一階段處的NK細胞進行染色，且然後藉由使用流式細胞術進行分析。
表面受體表達水準分析了在針對4種不同供體的類型1實驗中，已經藉由利用IL-21處理的原始過程及再刺激過程培養的起始階段及最終階段（D0、D17及D32）的細胞。表面受體表達水準被計算為樣品中NK細胞的受體陽性子集的百分比。
在激活受體中，CD16、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D及CRACC的表達水準在藉由原始過程（舊的）生產的NK細胞擴增期間增加，且與藉由再刺激過程（新的（New））擴增的NK細胞相似，而NKG2C及2B4的表達水準在藉由兩種方法培養擴增後沒有改變（圖6）。抑制性受體CD158a及CD158e的表達在藉由兩種過程（舊的及新的）培養時保持基本不變，而NKG2A及CD158b的比例顯著增加（圖12A至圖12B）。分析的所有抑制性受體表達水準在藉由兩種方法生產的NK細胞上是相似的。亦評價了趨化因子受體（例如CXCR3及CXCR4）的表達。
CXCR3+ NK細胞的頻率在藉由兩種方法（舊的及新的）進行的NK細胞擴增期間顯著增加且具有相似的表達水準，而CXCR4 + NK細胞的頻率在藉由兩種方法培養擴增後降低，其中在藉由新方法生產的NK細胞上，降低略多（圖12A至圖12B）。在藉由兩種方法擴增的NK細胞上，CD62L的表達水準皆略有增加。
如藉由該些結果所證明的，儘管一組細胞經歷了再擴增程序，但IL21+及IL21+/+擴增的細胞的性質是相似的。 實例7：IL-21濃度
對於各種IL-21濃度，將分離的CD56+細胞重懸於在類型1實驗設計（僅IL21+，不執行再刺激）的具有10、30、50及100奈克/毫升IL-21的RPMI培養基中含有10%的FBS、500國際單位/毫升的IL-2、20微克/毫升慶大黴素的初始NK細胞培養基中。 實例8：IL-21濃度
在類型1實驗中，以不同比率的飼養細胞以1:10:10（CD56+細胞:LCL:KL-1）及1:20:20、1:30:30（僅IL21+細胞，不執行再刺激）來執行。 實例9
此非限制性實例示出IL-21藉由冷凍-解凍來增強CD56+及CD3-/CD56+ NK細胞的擴增。（ 1 ） CD56+ 自然殺手細胞（ NK 細胞） -1 的製備
首先，使用聚蔗糖密度梯度（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度方法）分離了血液PBMC。根據以下1-1或1-2進一步處理了PBMC。1-1. CD56+ 細胞分離
藉由添加MACS緩衝液（1x PBS + 0.5% HSA）懸浮PBMC，且添加了CD56微珠（美天旎生物技術公司）以獲得1至20微升/1.0×107 PBMC，並在2℃至8℃下孵育了5至30分鐘。孵育後，添加了MACS緩衝液並混合，且將混合物離心分離（600xg）以使細胞沈澱。離心分離後，移除了上清液，且添加了MACS緩衝液以使細胞重懸，且將細胞添加至與管柱耦合的MACS分離器中。使MACS緩衝液通過所述管柱以移除非特異性結合。將管柱自MACS分離器中分離，並轉移至15毫升錐形管中，且添加了MACS緩衝液以分離附著至管柱的CD56+細胞。1-2. CD3-/CD56+ 細胞分離
CD3-/CD56+細胞分離如下。藉由添加MACS緩衝液（1x PBS + 0.5% HSA）懸浮PBMC，且添加了CD3微珠（美天旎生物技術公司）以獲得1至20微升/1.0×107 PBMC，並在2℃至8℃下孵育了5至30分鐘。孵育後，添加了MACS緩衝液並混合，且將混合物離心分離（600xg）以使細胞沈澱。離心分離後，移除了上清液，且添加了MACS緩衝液以使細胞重懸，且將細胞添加至與管柱耦合的MACS分離器中。使MACS緩衝液通過所述管柱以回收CD3-細胞。
向回收的CD3-細胞中添加了MACS緩衝液（1x PBS + 0.5%的HSA），以使CD3-細胞重懸，且添加了CD56微珠（美天旎生物技術公司），以獲得1至20微升/1.0×107 個CD3-細胞，且在2℃至8℃下孵育了5至30分鐘。孵育後，添加了MACS緩衝液並混合，且將混合物離心分離（600xg）以使細胞沈澱。離心分離後，移除了上清液，且添加了MACS緩衝液以使細胞重懸，且將細胞添加至與管柱耦合的MACS分離器中。使MACS緩衝液通過所述管柱以移除非特異性結合。將管柱自MACS分離器中分離，並轉移至15毫升錐形管中，且添加了MACS緩衝液以分離附著至管柱的CD3-/CD56+細胞。1-3. 初次培養
將來自1-1及1-2的分離的CD56 +細胞或CD3- / CD56 +細胞分別在孵育器中在37℃、5%的CO2 下在具有10%的FBS的RPMI-1640培養基中與飼養細胞（尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞）共培養，所述飼養細胞是藉由利用濃度分別為500國際單位/毫升及50奈克/毫升的IL-2及IL-21且在IL-2及IL-21存在的情況下用100戈瑞照射預先製備的。
在第6天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個/毫升接種在350毫升標準袋中，並再培養4天，且在第10天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升接種在1升袋中，並再培養4天。此時，孵育期間的比率（CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞）:（尤爾卡特細胞）:（EBV-LCL細胞）為1:30:30。1-4. 冷凍及解凍後的二次培養
在培養1（1至3）的第14天，根據培養排程將培養的細胞懸浮在含有90%的FBS及10%的DMSO的溶液中，在-192℃或低於-192℃下冷凍儲存，並在37℃恆溫水浴中解凍。
然後，分別以500國際單位/毫升及50奈克/毫升的濃度向IL-2及IL-21中添加了含有10%的FBS的RPMI-1640，以及被100戈瑞輻照的飼養細胞（尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞）。在放入培養基中後，將其在37℃、5%的CO2孵育器中共培養。
在解凍及培養後的第6天，將細胞接種至350毫升袋中（在1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升下，並再培養4天，且在第10天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升接種至1升標準袋中，並進一步培養4天。
為維持細胞在培養物中的生長直至解凍後的第14天，將細胞與被100戈瑞輻照的飼養細胞（尤爾卡特細胞及EBV-LCL細胞）在濃度分別為500國際單位/毫升及50奈克/毫升的IL-2及IL-21存在的情況下共培養。將細胞在含有10%添加的FBS的RPMI-1640培養基中，在37℃、5%的CO2 的孵育器中培養。
在解凍後第20天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升接種至1升袋中，隨後再培養4天，且在解凍後培養的第24天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升接種至1升袋中，並進一步培養4天。
最後，在解凍後培養的第28天，將細胞以1.0×105 至2.0×106 個細胞/毫升接種至1升袋中，隨後再培養3至6天。此時，（CD56+細胞或CD3-/CD56+細胞）:（尤爾卡特細胞）:（EBV-LCL細胞）以1:30:30的比率來進行培養。（ 2 ） CD56+ 自然殺手細胞 -2 的製備
除了在1-4中添加細胞因子的步驟之外，以與（1）相同的方式製備了自然殺手細胞。（ 3 ）比較例 . 不包括細胞因子處理步驟的自然殺手細胞的製備
除了在1-3及1-4中添加細胞因子（IL-21）的步驟之外，以與（1）相同的方式製備了自然殺手細胞。（ 4 ） NK 細胞增殖能力的確認
量測了藉由（1）至（3）的方法培養的NK細胞的增殖能力。自圖13A中可以看出，當細胞因子在初次培養期間未被處理（IL-21-/-）；參見上面的（3））時，發現在冷凍及解凍過程後沒有製造足夠數目的NK細胞用於臨床應用（圖13A）。另一方面，當用細胞因子處理細胞（IL-21 +/+；參見上面的（1））時，即使在冷凍及解凍過程之後，仍會製造足夠數目的NK細胞用於臨床應用，且該些結果不僅是在冷凍及解凍過程之後處理細胞因子時。在其中細胞在冷凍及解凍後未用細胞因子處理（IL-21+/-；參見上面的（2））的情況下，在冷凍及解凍後，NK細胞及用細胞因子處理的細胞會擴增（圖13B）。 實例10
各種擴增以及冷凍及再冷凍過程的一些實施例的進一步結果示於圖14A及圖14B中。圖14A示出所得PDL（群體倍增水準），並繪示擴增期間的不同時段的一些實施例。圖14B繪示所述實例的所得擴增倍數。
此實例分析NK細胞在冷凍至少一次後是否可被刺激或擴增多次，以及NK細胞的增殖是否可停止及重新開始，而非簡單地保持。首先將NK細胞培養了14天。在前六天時段（第0至6天）期間，以3天的間隔用IL-21（50奈克/毫升）及飼養細胞將NK細胞處理了兩次。
在此前14天擴增後，將細胞冷凍了90天，然後解凍以再培養14天。在此第二擴增期間的前六天時段（第0至6天）期間，以3天的間隔用IL-21（50奈克/毫升）及飼養細胞將NK細胞又處理了兩次。
藉由在此第二擴增期間的前6天時段（第0至6天）期間，以3天的間隔用IL-21（50奈克/毫升）及飼養細胞將其再刺激第三次，最終將細胞再培養了18天。
針對培養的46天監測了NK細胞的擴增。如圖14A及圖14B所示，當用飼養細胞及IL-21處理兩次或更多次時，即使在細胞冷凍後，NK細胞在每次刺激後皆表現出顯著的擴增。 術語
示例性實施例的前述說明已被提出僅用於說明及闡述的目的，且不旨在為窮舉的或將本發明限制於所揭露的精確形式。根據上述教示內容，許多修改及變化是可能的。設想到，可進行以上所揭露的實施例的特定特徵及態樣的各種組合或子組合，且所述各種組合及子組合仍落入本發明中的一或多者內。此外，本文結合實施例揭露的任何特定特徵、態樣、方法、性質、特性、品質、屬性、元件等可用於本文闡述的所有其他實施例中。因此，應理解所揭露的實施例的各種特徵及態樣可相互組合或替代，以形成所揭露的發明的各種模式。因此，本文揭露的本發明的範圍旨在不應被上述特別揭露的實施例所限制。此外，儘管本發明易於進行各種修改及替代形式，但其具體實例已經在圖式中示出並在本文中詳細闡述。然而，應理解本發明並非旨在被限制於所揭露的特定形式或方法，而是相反地，本發明將涵蓋落入所述各種實施例及隨附申請專利範圍的精神及範圍內的所有修改形式、等效形式及替代形式。本文揭露的任何方法不需要以所述的順序執行。本文揭露的方法包括由從業者採取的某些動作；然而，所述方法亦可包括所述動作的任何第三方指令，而無論是明示的還是暗示的。本文揭露的範圍亦囊括任何及所有重疊、子範圍及其組合。
選擇及闡述所述實施例以解釋本發明的原理及其實際應用，以激活熟習此項技術者利用本發明及各種實施例以及適合於設想的特定用途的各種修改。替代實施例將對熟習此項技術者變得顯而易見，其中本發明由所附申請專利範圍而非前述說明及其中闡述的示例性實施例來界定。
除非另外特別闡明，或者在所使用的上下文中以其他方式理解，否則，例如「可（can、could、might或may）」等條件語言一般旨在傳達某些實施例包括，而其他實施例不包括某些特徵、元件及/或步驟。因此，此種條件語言一般並不旨在暗指一或多個實施例以任何方式需要特徵、元件及/或步驟。
用語「包括」、「包含」、「具有」等是同義的，且以開放式的方式包含性地使用，並且不排除額外的元件、特徵、行動、操作等。此外，用語「或」是以其包含性意義（而非其排他性意義）使用，因此當用於例如連接一列表元件時，用語「或」意指所述列表中的元件中的一個、一些或所有者。
本文揭露的範圍亦囊括任何及所有重疊、子範圍及其組合。例如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」、「位於...之間」等語言包括所列舉的數字。
本文使用的以例如「近似」、「約」及「實質上」等用語開頭的數字包括所列舉的數字（例如，約10% = 10%），且亦表示接近所述量的量，所述量仍然執行期望的功能或達成期望的結果。例如，用語「近似」、「約」及「實質上」可意指在小於所述量的10%以內、小於5%以內、小於1%以內、小於0.1%以內及小於0.01%以內的量。
本文使用的用語「一般」表示主要包括或傾向於特定值、量或特性的值、量或特性。作為實例，在某些實施例中，用語「大體上一致」是指偏離完全一致小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於1%、小於0.1%及小於0.01%的值、量或特性。
本文揭露的範圍亦囊括任何及所有重疊、子範圍及其組合。例如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」、「位於...之間」等語言包括所列舉的數字。以例如「約」或「近似」等用語開頭的數字包括所列舉的數字。例如，「約5.0公分」包括「5.0公分」。
已經結合示意圖闡述了一些實施例。然而，應理解，示意圖未必按比例繪製。距離僅是說明性的，並不必與所示裝置的實際尺寸及佈局有精確的關係。
為了本揭露的目的，本文闡述某些態樣、優點及新穎特徵。應理解，根據任何特定實施例，未必可達成所有此種優點。因此，例如，熟習此項技術者將認識到，本揭露可以達成本文所教示的一個優點或一組優點而不必達成本文可能教示或建議的其他優點的方式來實施或施行。
此外，儘管本文已經闡述了說明性實施例，但熟習此項技術者基於本揭露將會理解具有等效元件、修改、省略、組合（例如，跨越各實施例的態樣的組合）、改編及/或變更的任何及所有實施例的範圍。申請專利範圍中的限制將基於申請專利範圍中所採用的語言被廣義地解釋，且不限於在本說明書中或者在申請案檢控期間闡述的實例，所述實例將被解釋為非排他性的。此外，所揭露的過程及方法的動作可以任何方式（包括藉由對動作進行重新排序及/或插入額外動作及/或刪除動作）進行修改。因此，本說明書及實例旨在僅被視為說明性的，真實的範圍及精神由申請專利範圍及其等效形式的全部範圍來指示。
無
各種實施例被繪示於附圖中用於說明性目的，且不應以任何方式被解釋為限制實施例的範圍。此外，所揭露的不同實施例的各種特徵可加以組合以形成額外的實施例，所述額外的實施例是本揭露的一部分。
圖1繪示用於在IL21處理（冷凍前及任選的冷凍後）後擴增細胞的再擴增實驗設計及實施例。
圖2A及圖2B繪示具有及不具有IL21（圖2A）供體1、（圖2B）供體2的細胞擴增之間的群體倍增水準（Population Doubling Level，PDL）比較。
圖3A及圖3B繪示具有及不具有IL21（圖3A）供體1、（圖3B）供體2的細胞擴增之間的擴增倍數比較。
圖4A及圖4B繪示具有及不具有IL21（圖4A）供體1、（圖4B）供體2的細胞再刺激方法之間的群體倍增水準（PDL）比較。
圖5A及圖5B繪示具有及不具有IL21（圖5A）供體1、（圖5B）供體2的細胞再刺激方法之間的擴增倍數比較。
圖6繪示利用IL-21（IL-21+）擴增的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖7繪示不利用IL-21（IL-21-）擴增的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖8繪示利用IL-21擴增且利用IL-21再刺激（IL-21+/+）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖9繪示利用IL-21擴增而不利用IL-21再刺激（IL-21+/-）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖10繪示不利用IL-21擴增而利用IL-21再刺激（IL-21-/+）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖11繪示不利用IL-21擴增且不利用IL-21再刺激（IL-21-/-）的NK細胞對K562細胞的細胞毒活性。
圖12A繪示自然殺手細胞的激活受體的表型比較。
圖12B繪示自然殺手細胞的抑制性及趨化因子受體的表型比較。
圖13A示出利用IL-21擴增且利用IL-21再擴增（IL-21+/+）的自然殺手細胞及不利用IL-21擴增且不利用IL-21再擴增（IL-21-/-）的自然殺手細胞的群體倍增水準（PDL）的曲線圖。
圖13B示出利用IL-21擴增且利用IL-21再擴增（IL-21+/+）的自然殺手細胞及利用IL-21擴增而不利用IL-21再擴增（IL-21+/-）的自然殺手細胞的群體倍增水準（PDL）的曲線圖。
圖14A示出利用IL-21（第一刺激）擴增並再擴增至少兩次（第二刺激及第三刺激）的自然殺手細胞的群體倍增水準（PDL）的曲線圖。
圖14B示出圖14A中的結果的對應擴增倍數的曲線圖。

Claims (56)

  1. 一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法，包括： 自血樣中分離CD56+細胞； 在IL-21存在的情況下將分離的所述CD56+細胞共培養第一時段； 在所述第一時段後冷凍共培養的所述CD56+細胞； 解凍冷凍的所述CD56+細胞；及 在IL-21存在的情況下將解凍的所述CD56+細胞共培養第二時段。
  2. 如請求項1所述的方法，更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。
  3. 如請求項1或2所述的方法，更包括在解凍前將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天。
  4. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中分離的所述CD56+細胞在冷凍前被共培養13天至16天。
  5. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中分離的所述CD56+細胞在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。
  6. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中解凍的所述CD56+細胞在IL-21存在的情況下與一或多種被輻照飼養細胞共培養。
  7. 如請求項5或6所述的方法，其中一或多種飼養細胞是選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。
  8. 如請求項5至7中任一項所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與所述飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
  9. 如請求項8所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:2的比率共培養。
  10. 如請求項8所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:5至1:30的比率共培養。
  11. 如請求項8所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞約1:10的比率共培養。
  12. 如請求項8所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:30的比率共培養。
  13. 如請求項8所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
  14. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間IL-21以10至100奈克/毫升的濃度添加。
  15. 如請求項1至13中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間以20至80奈克/毫升的濃度添加IL-21。
  16. 如請求項1至13中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間以30至70奈克/毫升的濃度添加IL-21。
  17. 如前述請求項中任一項中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間IL-21被添加多於一次。
  18. 一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法，包括： 自血樣中分離CD56+； 在IL-21存在的情況下，對所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養； 冷凍所述CD56+細胞； 解凍冷凍的所述CD56+細胞；及 擴增解凍的所述CD56+細胞。
  19. 如請求項18所述的方法，其中在低於-100℃的溫度下冷凍所述CD56+細胞。
  20. 如請求項18或19所述的方法，更包括將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天且少於10年的時段。
  21. 如請求項18至20中任一項所述的方法，其中所述CD56+細胞在冷凍前被共培養13天至16天。
  22. 如請求項18至21中任一項所述的方法，其中一或多種飼養細胞是選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。
  23. 如請求項18至22中任一項所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
  24. 如請求項18至23中任一項所述的方法，其中IL-21以10至100奈克/毫升的濃度添加。
  25. 如請求項18至24中任一項所述的方法，其中IL-21被添加多於一次。
  26. 一種增加自然殺手細胞的細胞毒性的方法，包括： 提供所述自然殺手細胞； 冷凍所述自然殺手細胞； 解凍冷凍的所述自然殺手細胞；及 在IL-21存在的情況下，對解凍的所述自然殺手細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
  27. 如請求項26所述的方法，更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述自然殺手細胞。
  28. 如請求項26或27所述的方法，更包括在解凍前將冷凍的所述自然殺手細胞儲存多於一天。
  29. 如請求項26至28中任一項所述的方法，其中一或多種飼養細胞是選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。
  30. 如請求項26至29中任一項所述的方法，其中解凍的所述自然殺手細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
  31. 如請求項26至30中任一項所述的方法，其中IL-21以10至100奈克/毫升的濃度添加。
  32. 如請求項26至31中任一項所述的方法，其中IL-21被添加多於一次。
  33. 一種處理受試者的方法，包括： 自所述受試者收集CD56+細胞； 在IL-21存在的情況下，對所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養； 將共培養的所述CD56+細胞冷凍至少一天； 解凍冷凍的所述CD56+細胞； 擴增解凍的所述CD56+細胞；以及 向所述受試者施用擴增的所述CD56+細胞，其中來自第二擴增的所述細胞的細胞毒性是冷凍前共培養的所述CD56+細胞的細胞毒性的至少80%。
  34. 如請求項33所述的方法，更包括在低於-100℃的溫度下儲存冷凍的所述CD56+細胞。
  35. 如請求項33或34所述的方法，更包括在解凍前將冷凍的所述CD56+細胞儲存多於一天。
  36. 如請求項33至35中任一項所述的方法，其中分離的所述CD56+細胞在冷凍前被共培養13天至16天。
  37. 如請求項33至36中任一項所述的方法，其中擴增解凍的所述CD56+細胞包括在IL-21存在的情況下對解凍的所述CD56+與一或多種被輻照飼養細胞進行共培養。
  38. 如請求項33至37中任一項所述的方法，其中一或多種飼養細胞是選自由被輻照尤爾卡特細胞、被輻照艾巴氏病毒轉化的淋巴細胞連續系（EBV-LCL）細胞、K562細胞及外周血單核細胞組成的群組中的一或多者。
  39. 如請求項33至38中任一項所述的方法，其中所述CD56+細胞以CD56+細胞與飼養細胞的約1:1至100的比率共培養。
  40. 如請求項33至39中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間IL-21以10至100奈克/毫升的濃度添加。
  41. 如請求項33至40中任一項所述的方法，其中在所述第一時段及/或所述第二時段期間IL-21被添加多於一次。
  42. 一種組成物，包含： 有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞，其中所述CD56+細胞是藉由以下方式來製備： 自血樣中分離外周血單核細胞（PBMC）； 自所述外周血單核細胞中分離CD56+細胞； 在一或多種細胞因子存在的情況下，對所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養； 冷凍所述CD56+細胞； 解凍冷凍的所述CD56+細胞；及 在一或多種細胞因子存在的情況下，對解凍的所述CD56+細胞與一或多種飼養細胞進行共培養。
  43. 一種細胞組成物，包含： 有效量的源自患者外周血單核細胞（PBMC）的CD56+細胞； IL-2；及 IL-21。
  44. 一種組成物，包含： 源自外周血單核細胞（PBMC）的第一群CD56+細胞； 冰；及 IL-2 IL-21， 其中，當解凍時，所述CD56+細胞具有第二群CD56+細胞的至少80%的細胞毒性，其中所述第二群CD56+細胞尚未冷凍。
  45. 一種在培養物中擴增自然殺手細胞的方法，包括： 提供外周血單核細胞； 在IL-21存在的情況下將所述外周血單核細胞共培養第一時段； 在所述第一時段後冷凍共培養的所述外周血單核細胞； 解凍冷凍的所述外周血單核細胞；及 在IL-21存在的情況下將解凍的所述外周血單核細胞共培養第二時段。
  46. 如請求項45所述的方法，其中外周血單核細胞與飼養細胞的比率為1:0.5:0.5。
  47. 如請求項2至17中任一項所述的方法，但依附於請求項45，而非請求項1。
  48. 如請求項33所述的方法，更包括在準備注射的溶液中冷凍。
  49. 如請求項33或34所述的方法，其中所述細胞毒性是將非冷凍擴增（利用及不利用IL-21）與冷凍但在第一步驟上與IL-21+共培養的擴增進行比較，其中所述冷凍擴增的平均細胞毒性是所述非冷凍的97.7%。
  50. 如請求項33或34所述的方法，其中所述細胞毒性是將非冷凍擴增（利用及不利用IL-21）與冷凍但在第一步驟上不與IL-21+共培養的擴增進行比較，其中所述冷凍擴增的平均細胞毒性是所述非冷凍擴增的81.4%。
  51. 如請求項33或34所述的方法，其中，在冷凍之前及之後兩種情況下皆添加IL-21，且其中平均細胞毒性是非冷凍擴增的114%。
  52. 一種組成物，包含： IL-2； 5%至10%的二甲基亞碸； 90%至95%的胎牛血清；及 任選為CD56+細胞的自然殺手細胞。
  53. 如請求項52所述的組成物，其中所述組成物是冷凍固體。
  54. 如請求項52所述的組成物，其中所述自然殺手細胞是所述組成物的細胞群的至少90%。
  55. 一種組成物，包含： IL-2； 5%至10%的二甲基亞碸； 80%至95%的哈特曼溶液； 1%至10%的人血清白蛋白；及 自然殺手細胞。
  56. 如請求項52至55中任一項所述的組成物，更包含冷凍存溶液。
TW109141339A 2019-11-29 2020-11-25 在培養物中擴增自然殺手細胞的方法、增加自然殺手細胞的細胞毒性之方法、處理受試者的方法、其組成物及其細胞組成物 TW202128988A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0157727 2019-11-29
KR1020190157727A KR20210067776A (ko) 2019-11-29 2019-11-29 냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법
US202063062694P 2020-08-07 2020-08-07
US63/062,694 2020-08-07
PCT/US2020/061984 WO2021108389A1 (en) 2019-11-29 2020-11-24 Method of producing natural killer cells and compositions thereof
WOPCT/US20/061984 2020-11-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202128988A true TW202128988A (zh) 2021-08-01

Family

ID=76129661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109141339A TW202128988A (zh) 2019-11-29 2020-11-25 在培養物中擴增自然殺手細胞的方法、增加自然殺手細胞的細胞毒性之方法、處理受試者的方法、其組成物及其細胞組成物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230002731A1 (zh)
EP (1) EP4048296A4 (zh)
JP (1) JP2023505102A (zh)
KR (1) KR20220119611A (zh)
CN (1) CN114929249A (zh)
TW (1) TW202128988A (zh)
WO (1) WO2021108389A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102623244B1 (ko) 2016-12-21 2024-01-09 주식회사 엔케이맥스 면역 세포 및 포나티닙을 포함하는 약학 조성물 및 방법
CN113403273B (zh) * 2021-06-25 2023-04-25 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种扩增脐带血来源的nk细胞的培养方法
WO2024015822A1 (en) * 2022-07-12 2024-01-18 Nkmax Co., Ltd. Method of treating parkinson's disease with expanded natural killer cells
WO2024036005A1 (en) * 2022-08-10 2024-02-15 Nkmax Co., Ltd. Method of treating alzheimer's disease with expanded natural killer cells

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI439275B (zh) * 2010-12-31 2014-06-01 Glory Biomedical Co Ltd 一種人類自然殺手細胞之體外增殖方法
KR20120093002A (ko) * 2011-02-14 2012-08-22 (주)에이티젠 Ｎｋ 세포의 활성 측정을 이용한 암 진단 방법 및 진단 키트
NO2794859T3 (zh) * 2011-12-22 2018-02-17
CN104321425B (zh) * 2012-05-07 2018-08-10 株式会社Nkmax 用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法
US9546203B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
SG11201610699XA (en) * 2014-07-07 2017-01-27 Targazyme Inc Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use
WO2016122014A1 (ko) * 2015-01-27 2016-08-04 한국생명공학연구원 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포의 항암제로서의 용도
CN104705291A (zh) * 2015-04-03 2015-06-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法
EP3138905A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-08 Miltenyi Biotec GmbH Method for natural killer cell expansion
CN105524880A (zh) * 2016-01-27 2016-04-27 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞库的构建方法
CN107970258B (zh) * 2017-11-20 2020-11-10 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞制剂
NZ766453A (en) * 2018-02-01 2022-02-25 Nkmax Co Ltd Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021108389A1 (en) 2021-06-03
JP2023505102A (ja) 2023-02-08
US20230002731A1 (en) 2023-01-05
KR20220119611A (ko) 2022-08-30
EP4048296A1 (en) 2022-08-31
EP4048296A4 (en) 2024-01-24
CN114929249A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11766456B2 (en) Method for culturing natural killer cells using T cells
TW202128988A (zh) 在培養物中擴增自然殺手細胞的方法、增加自然殺手細胞的細胞毒性之方法、處理受試者的方法、其組成物及其細胞組成物
JP5792622B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の製造方法
KR101909879B1 (ko) 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물
JP2021104048A (ja) 正常酸素条件と交互になった低酸素条件における骨髄浸潤リンパ球の活性化
JP6073417B2 (ja) 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
US11066644B2 (en) Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer
KR101706524B1 (ko) 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법
JP5118624B2 (ja) 新規なヒトｔ細胞集団
JP2022515144A (ja) オフザシェルフのダブルネガティブｔ細胞の産生および治療的使用
WO2019152663A1 (en) Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer
RU2391401C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ
JP2002528115A (ja) ＴｃＲγδＴ細胞の生産方法
KR20210149201A (ko) 인간 조절 t 세포의 비드-무함유 생체외 확장
RU2780848C2 (ru) Способ получения природных клеток-киллеров и композиция для лечения рака
JP5602133B2 (ja) 細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトｔ細胞集団の製造方法
KR101799986B1 (ko) T 세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
KR20210067776A (ko) 냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법
Galleu et al. Umbilical Cord as a Source of Immunomodulatory Reagents