KR20210067776A - 냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법 - Google Patents

냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자연살해세포의 대량생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 대량생산방법은 냉동보존(Cryopreservation) 과정을 거치더라도 임상에 적용할 만큼 충분한 수로 자연살해세포를 생산할 수 있으므로, 자연살해세포를 이용한 암의 예방 및 치료, 특히 동종 치료의 효과를 증진시키기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법{Mass Manufacturing Method for Natural Killer Cells comprising Freezing and Thawing Process}
본 발명은 냉동 및 해동 과정을 포함하는 자연살해세포의 대량생산방법에 관한 것이다.
인체는 면역 반응에 의해 병원체로부터 보호되고 있고, 면역 시스템은 많은 면역관련 세포와 사이토카인 등에 의해 구성되어 있다. 이러한 면역시스템에서 중요한 역할을 하는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 림프구를 구성하는 세포로는 대표적으로 선천성 면역계와 후천성 면역계가 있다.
자연살해세포(Natural Killer Cell, NK cell)는 대표적인 선천면역세포 중 하나로, 비특이적으로 암을 살상할 수 있고 바이러스, 박테리아 등을 인식하여 이들을 살상하며, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) 등의 효소나 Fas-FasL 상호작용으로 병원체를 살상하는 세포로 알려져 있다. 암환자의 경우, 이러한 자연살해세포(NK cell)의 암세포 살상능의 감소가 폐암(Carrega P, et al., Cancer, 2008: 112: 863-875), 간암(Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013-1020), 유방암(Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119-124), 자궁암(Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 1999: 79: 244-250), 혈액암(Tajima F., et al, Lekemia 1996: 10: 478-482) 등의 질환의 발생과 깊은 연관이 있는 것으로 보고되고 있으며, 암의 치료를 위해서는 암 환자 자연살해세포의 암세포 살상능 및 활성 증가가 필수적이라 할 것이다.
이러한 암세포 살상의 효과를 얻기 위해서는 순도가 높은 다량의 자연살해세포가 요구되나, 암 환자의 혈액을 대량으로 확보하는 것이 쉽지 않으며 혈액 내에서 자연살해세포가 차지하는 비율도 약 5~20% 정도에 불과하여 이를 면역치료제로 사용하기 어렵다.
이에, 자연살해세포만을 효과적으로 확장 및 증식시키는 것이 중요하나, 기존의 자연살해세포 증식 방법은 고가의 다양한 사이토카인을 고농도로 이용하여야 하는 바, 경제적으로 안정된 일부 환자에게만 해당 치료가 가능한 문제가 있고, 또한 자연살해세포 외의 다른 종류(예: T 세포, B 세포 등)의 면역세포가 함께 존재하여, T 세포가 포함되어 동종에 투여될 경우 GVHD(Graft versus host disease)를 일으킬 수 있고, B 세포가 포함되어 혈액형 부적합의 동종에 투여될 경우 일과성림프구증후군(Passenger B-lymphocyte syndrome)을 일으킬 수 있는 등, 항암 효과를 극대화하지 못하는 문제가 있다.
국내공개특허 제10-2013-0086820호
본 발명자들은 생산인력, 시설 및 장비 등을 종합적으로 고려할 때, 냉동보존(Cryopreservation) 과정을 통하여 자연살해세포를 대량생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, CD56+ 세포를 사이토카인 존재 하에서 방사선 조사된 영양세포와 함께 공배양하는 경우 냉동 및 해동 과정 후에도 세포배양이 원활하게 이루어짐을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 자연살해세포(Natural killer cell)의 대량생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 생산인력, 시설 및 장비 등을 종합적으로 고려할 때, 냉동보존(Cryopreservation) 과정을 통하여 자연살해세포를 대량생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, CD56+ 세포를 사이토카인 존재 하에서 방사선 조사된 영양세포와 함께 공배양하는 경우 냉동 및 해동 과정 후에도 세포배양이 원활하게 이루어짐을 규명하였다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 다음 단계를 포함하는 자연살해세포(Natural killer cell)의 대량생산방법에 관한 것이다:
CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 영양세포(Feeder cell) 및 제1 사이토카인(Cytokine)과 공배양하는 제1 배양단계;
냉동하는 단계;
해동하는 단계; 및
영양세포를 첨가하여 공배양하는 제2 배양 단계.
본 발명을 각 단계별로 구체적으로 설명하도록 한다.
제1 배양 단계
본 명세서에서 용어 "CD56+ 세포"는 "CD56+ NK 세포" 또는 "CD56 자연살해세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있고, "CD3-/CD56+ 세포"는 "CD3-/CD56+ NK 세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포는 필요에 따라, 세포 표면의 CD56 당단백질이 발현되는 세포, 및 CD56 당단백질이 발현되는 동시에 CD3 당단백질이 비발현되는 세포를 포함할 수 있다. 같은 면역세포라도 세포 표면에 붙어있는 CD 종류와 발현율에 차이가 있어 그 기능이 달라질 수 있다.
상기 CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포는 하기의 단계를 통하여 수득될 수 있다.
혈액 시료로부터 말초혈액단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 분리하는 제1 분리 단계; 및
CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 분리하는 제2 분리 단계.
본 명세서에서 "혈액 시료"는 말초혈액(peripheral blood) 전혈(whole blood)이나, 말초혈액으로부터 백혈구성분채집술(Leukapheresis)을 이용하여 분리한 백혈구(Leukocytes)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 말초혈액은 정상인, 암의 위험성을 갖는 환자 또는 암 환자로부터 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "백혈구성분채집술(Leukapheresis)"은 채혈한 혈액에서 백혈구(Leukocytes)를 선택적으로 제거(분리)한 후 다시 환자에게 수혈하는 것으로, 상기 방법에 의해 분리된 백혈구의 경우, 피콜-하이팩 밀도 구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method) 등과 같은 별도의 방법 없이 본 발명에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "말초혈액단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell)"는 "PBMC", "단핵세포(Mononuclear cell)" 또는 "단핵구"와 동일한 의미로 사용될 수 있고, 이는 항암면역치료를 위하여 통상적으로 사용되는 말초혈액(Peripheral Blood)으로부터 분리된 단핵세포(Mononuclear Cell)를 의미한다. 말초혈액단핵세포는 채혈한 사람의 혈액을 피콜-하이팩 밀도 구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method) 등과 같은 공지의 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
상기 말초혈액단핵세포는 반드시 자가 유래일 필요는 없으며, 동종 유래의 말초혈액단핵세포도 본 발명에 따른 항암면역치료를 위한 고순도 자연살해세포의 생산을 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 말초혈액단핵세포는 반드시 정상인 유래일 필요는 없으며, 암 환자의 말초혈액단핵세포도 본 발명에 따른 항암면역치료를 위한 고순도 자연살해세포의 생산을 위해 사용될 수 있다.
상기 제2 분리 단계는 CD56 마이크로비즈(CD56 microbeads) 및/또는 CD3 마이크로비즈(CD3 microbeads)를 사용하여 분리하는 방법, 또는 CliniMACSs, Flow Cytometry Cell Sorter 등의 장비를 사용하여 분리하는 방법 등을 통해 수행될 수 있다.
상기 CD56 마이크로비즈 및/또는 CD3 마이크로비즈를 사용하여 분리하는 방법은 예를 들어, PBMC에 CD56 마이크로비즈를 첨가한 후 비특이적 결합(Non-specific binding)을 제거함으로써 수행되거나, PBMC에 CD3 마이크로비즈를 첨가하여 특이적 결합을 제거한 후, 다시 CD56 마이크로비즈를 첨가하여 비특이적 결합을 제거함으로써 수행될 수 있다.
상기 CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포의 분리를 통하여 T 세포 등을 효과적으로 제거할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "영양세포(Feeder cell)"는 분열 증식하지 못하나 대사활성이 있어, 여러 가지 대사물질을 생산함으로써 목적 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다.
상기 영양세포는 방사선 조사된 Jurkat 세포, 방사선 조사된 EBV-LCL 세포(Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line), 및/또는 PBMC, HFWT, RPMI 1866, Daudi, MM-170, TCO-2, K562 또는 K562세포를 대상으로 유전자 조작한(예를 들어, K562-mbIL-15-41BB ligand) 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "Jurkat 세포" 또는 "Jurkat 세포주"는 혈액암(immortalized acute T cell leukemia) 세포주로 University of California at San Francisco의 Dr. Arthur Weiss가 개발한 세포주이다. 다양한 케모카인 수용체가 발현하고 있으며 IL-2를 생산할 수 있는 세포로서, 이는 세포 표면에 자연 살해세포 활성억제 인자인 MHC class I을 높이 발현하기 때문에 항암면역치료를 위한 영양세포(feeder cell)의 후보로 가능성이 전혀 대두되지 못했던 세포주였다. 본 발명에 사용되는 Jurkat 세포는 ATCC로부터 입수할 수 있다(ATCC TIB-152).
본 명세서에서 용어 "EBV-LCL 세포" 또는 "EBV-LCL 세포주"는 엡스테인 바르 바이러스가 형질전환된 임파구 연속 세포주(EBV-LCL, Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line, D.M. Koelle et al., J Clin Invest, 1993: 91: 961-968)로, 시험관 내에서 사람의 B 세포에 Epstein-Barr Virus를 감염시켜서 만든 B 세포주이다. 본 발명에서 사용되는 EBV-LCL 세포는 PBMC에서 EBV를 감염시키는 과정 중에 사이클로스포린 A를 넣어주는 방법을 통하여 통상의 실험실에서 직접 제조하여 사용할 수 있다.
상기 EBV-LCL 세포는 예를 들어, 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다:
30x106의 PBMC를 배양배지 9mL에 넣고, 이를 T25 배양 플라스크에 넣은 후, EBV 상층액을 9mL 첨가한다. 50μg/mL농도의 사이클로스포린 A 80μL를 첨가한 후 37℃에서 배양한다. 배양 7일 후 상층액을 1/2 제거한 후 새로운 배양배지를 넣어주고 40μL의 사이클로스포린 A를 첨가한다. 배양 28일까지 매 7일에 한번 7일째와 같은 과정을 반복한다. 세포주는 배양 28일 후부터 사용 가능하며, 이 때부터 배양 배지에 사이클로스포린 A를 넣지 않고 배양한다.
상기 Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포는 방사선 조사를 통해 영양세포로 사용할 수 있다.
상기 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 1:0.1-5, 1:0.1-4, 1:0.1-3, 1:0.1-2, 1:0.1-1.5, 1:0.5-1.5 또는 1:0.75-1.25의 함량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 각각 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-150, 70-130, 80-120 또는 90-110Gy 방사선을 처리하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "사이토카인(Cytokine)"은 "제1 사이토카인" 및 "제2 사이토카인"을 모두 포함하는 것으로, 말초혈액단핵세포를 자연살해세포로 유도하는데 사용 가능한 면역 활성화 사이토카인을 의미한다.
상기 사이토카인은 IL(Interleukin)-2, IL-21, IL-15, Flt3-L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), SCF(Stem Cell Factor), IL-7, IL-18, IL-4, type I interferons, GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및/또는 IGF 1(Insulin-like growth factor 1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 제1 사이토카인은 IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, type I interferons, GM-CSF 및/또는 IGF 1일 수 있고, 제2 사이토카인은 IL-21일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 사이토카인은 배양 0-6일 동안 1회 이상 첨가하여 수행될 수 있다.
구체적으로는, 배양 0일 및 3일째에 1회씩 제2 사이토카인을 첨가하여 수행될 수 있다.
영양세포 및 제1 사이토카인과 공배양 시, 추가적으로 제2 사이토카인을 배양 0-6일 동안 1회 이상 첨가하여 배양하는 경우 보다 우수한 증식능 및 항암 활성을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 냉동 및 해동 과정 후에도 임상에 적용할 만큼 충분한 수로 NK 세포가 제조될 수 있다.
상기 제1 사이토카인은 50-1,000, 50-900, 50-800, 50-700, 50-600, 50-550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550 또는 450-550 IU/mL, 제2 사이토카인은 10-1,000, 10-500, 10-100, 20-100, 30-100, 40-100, 50-100 또는 10-50ng/mL의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 종래의 자연살해세포 증식 방법은 고농도의 다양한 사이토카인을 필요로 하였으나, 본 발명에 따른 자연살해세포 증식 방법은 고순도의 CD56+ 세포(CD3-/CD56+ 세포 포함)에 2 종의 영양세포를 사용하므로, 사이토카인을 낮은 농도로 사용하더라도 고수율 및 고순도의 자연살해세포를 증식할 수 있다.
상기 공배양은 말초혈액단핵세포와 영양세포(예를 들면, Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포)를 1:1-100, 1:1-90, 1:1-80, 1:1-70, 1:10-65, 1:20-65, 1:30-65, 1:40-65, 1:50-65 또는 1:55-65의 혼합비로 포함하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공배양은 배지에서 수행될 수 있으며, 이때 사용 가능한 배지는 말초혈액단핵세포의 자연살해세포로의 유도 및 증식에 사용하고 있는 통상의 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 배지로는 예를 들어, RPMI-1640, DMEM, x-vivo 10, x-vivo 20 또는 cellgro SCGM 배지 등을 사용할 수 있다. 그 외 온도 등의 배양 조건은 통상의 말초혈액단핵세포의 배양 조건을 따를 수 있다.
상기 제1 배양 단계는 0-45, 0-42, 0-40, 0-35, 0-30, 0-20, 0-19, 0-18, 0-17, 0-16, 0-15 또는 0-14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
냉동하는 단계
상기 제1 배양 단계에서 배양되어 제조된 세포는 회수 후 FBS, DMSO가 포함된 배지에 부유시킨 후, 동결 보관할 수 있다. 예를 들어 90% FBS, 10% DMSO가 포함된 배지에 부유시켜 동결 보관할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 동결 보관은 구체적으로, 제조된 세포를 이소프로필 알코올이 담겨있는 냉동보관용 용기에 담아서 초저온 냉장고에서 하룻밤 지난 후 -192℃이하의 온도로 옮겨서 보관하는 것일 수 있다. 바람직하게는 제조된 세포를 자동온도냉각기(CRF; controlled rate freezer)를 이용하여 온도를 떨어뜨린 후 액체질소 하에 보관할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
해동하는 단계
상기 냉동하는 단계에서 동결 보관된 세포를 해동시킬 수 있다. 예를 들어 동결 보관된 세포를 37℃ 항온수조를 이용하여 해동할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 배양 단계
본 단계는 상기 영양세포를 1회 이상 처리하여 수행될 수 있다.
구체적으로는, 배양 14일 주기로 영양세포를 1회 이상 처리하여 수행될 수 있다.
영양세포를 배양 14일 주기로 1회 이상 첨가하여 배양하는 경우 보다 우수한 증식능 및 항암 활성을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 세포의 성장을 지속시켜 냉동 및 해동 과정 후에도 임상에 적용할 만큼 충분한 수로 NK 세포가 제조될 수 있다.
본 단계는 사이토카인을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 단계는 제1 사이토카인을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 단계는 배양 0-6일 동안 제2 사이토카인을 1회 이상 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 단계 및 상술한 본 발명의 단계 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 자연살해세포의 대량생산방법은 하기의 단계를 반복하는 것일 수 있다.
냉동하는 단계;
해동하는 단계; 및
영양세포를 첨가하여 공배양하는 제2 배양 단계.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 방법을 이용하는 경우 냉동 및 해동 과정 후에도 세포배양이 원활하게 이루어짐을 확인하였는 바, 상기 단계를 반복함으로써 자연살해세포를 대량생산할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 자연살해세포의 대량생산방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 대량생산방법은 냉동보존(Cryopreservation) 과정을 거치더라도 임상에 적용할 만큼 충분한 수로 자연살해세포를 생산할 수 있으므로, 자연살해세포를 이용한 암의 예방 및 치료, 특히 동종 치료의 효과를 증진시키기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 NK 세포의 증식능을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. CD56+ 자연살해세포(NK cell)의 제조-1
먼저, 피콜-하이팩 밀도 구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method)을 이용하여 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후 세포를 계수하였다.
1-1. CD56+ 세포 분리
상기 계수된 PBMC에 MACS 버퍼(1x PBS+0.5% HSA)를 첨가하여 세포를 부유하고, PBMC 1.0x107 세포 당 1-20μL가 되도록 CD56 마이크로비즈(microbeads)(Miltenyi Biotec)를 첨가 후, 5-30분 동안 2-8℃로 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, MACS 버퍼를 넣어 섞어준 다음 원심분리(600xg)하여 세포를 침전시켰다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 MACS 버퍼를 넣어 세포를 부유하고, MACS 분리기(separator)에 결합된 컬럼에 넣었다. MACS 버퍼를 컬럼에 통과시켜 비특이적 결합(Non-specific binding)을 제거하였다. MACS 분리기에서 컬럼을 분리하여 15 mL 코니칼 튜브(conical tube)로 옮긴 후, MACS 버퍼를 추가하여 컬럼에 붙어있는 CD56+ 세포를 분리하였다.
1-2. CD3-/CD56+ 세포 분리
별도로, 상기 계수된 PBMC에 MACS 버퍼(1x PBS+0.5% HSA)를 첨가하여 세포를 부유하고, PBMC 1.0x107 세포 당 1-20μL가 되도록 CD3 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 첨가 후, 5-30분 동안 2-8℃로 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, MACS 버퍼를 넣어 섞어준 다음 원심분리(600xg)하여 세포를 침전시켰다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 MACS 버퍼를 넣어 세포를 부유하고, MACS 분리기에 결합된 컬럼에 넣었다. MACS 버퍼를 컬럼에 통과시켜 CD3- 세포를 회수하였다.
회수된 CD3- 세포에 MACS 버퍼(1x PBS+0.5% HSA)를 첨가하여 세포를 부유하고, CD3- 세포 1.0x107 세포 당 1-20μL가 되도록 CD56 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 첨가 후, 5-30분 동안 2-8℃로 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, MACS 버퍼를 넣어 섞어준 다음 원심분리(600xg)하여 세포를 침전시켰다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 MACS 버퍼를 넣어 세포를 부유하고, MACS 분리기에 결합된 컬럼에 넣었다. MACS 버퍼를 컬럼에 통과시켜 비특이적 결합을 제거하였다. MACS 분리기에서 컬럼을 분리하여 15mL 코니칼 튜브로 옮긴 후, MACS 버퍼를 추가하여 컬럼에 붙어있는 CD3-/CD56+ 세포를 분리하였다.
1-3. 1차 배양
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 분리된 CD56+ 세포 또는 CD3-/CD56+ 세포를 미리 준비된 100Gy 방사선 조사된 영양세포(Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포)와 함께 IL-2 및 IL-21이 각각 500IU/mL 및 50ng/mL의 농도로 첨가된 FBS 10%를 함유하는 RPMI-1640 배지에 넣은 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 공배양하였다.
배양 6일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 350mL 백(bag)에 접종하여 4일 동안 추가 배양하고, 배양 10일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 1L 백에 접종 후 4일 동안 추가 배양하였다. 이때, (CD56+ 세포 또는 CD3-/CD56+ 세포):(Jurkat 세포):(EBV-LCL 세포)는 1:30:30의 비율로 배양하였다.
1-4. 냉동 및 해동 후 2차 배양
배양 14일차에, 배양된 세포를 90% FBS, 10% DMSO가 포함된 용액에 부유시켜 -192℃ 이하에서 냉동보관 시키고, 배양일정에 맞추어 37℃ 항온수조에서 해동하였다.
그 다음, 100Gy 방사선 조사된 영양세포(Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포)와 함께 IL-2 및 IL-21이 각각 500IU/mL 및 50ng/mL의 농도로 첨가된 FBS 10%를 함유하는 RPMI-1640 배지에 넣은 후 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 공배양하였다.
해동 후 배양 6일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 350mL 백(bag)에 접종하여 4일 동안 추가 배양하고, 해동 후 배양 10일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 1L 백에 접종 후 4일 동안 추가 배양하였다.
해동 후 14일째 배양중인 세포의 성장을 지속시키기 위하여 다시 100Gy 방사선 조사된 영양세포(Jurkat 세포 및 EBV-LCL 세포)와 함께 IL-2 및 IL-21이 각각 500IU/mL 및 50ng/mL의 농도로 첨가된 FBS 10%를 함유하는 RPMI-1640 배지에 넣은 후 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 공배양하였다.
해동 후 배양 20일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 1L 백(bag)에 접종하여 4일 동안 추가 배양하고, 해동 후 배양 24일째 세포 수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 1L 백에 접종 후 4일 동안 추가 배양하였다.
마지막으로, 해동 후 배양 28일째에 세포수 1.0x105-2.0x106/mL 기준으로 1L 백에 접종 후 3-6일 동안 추가 배양하였다. 이때, (CD56+ 세포 또는 CD3-/CD56+ 세포):(Jurkat 세포):(EBV-LCL 세포)는 1:30:30의 비율로 배양하였다.
실시예 2. CD56+ 자연살해세포의 제조-2
상기 실시예 1-4에서 사이토카인을 첨가하는 단계를 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 자연살해세포를 제조하였다.
비교예. 사이토카인 처리 단계를 제외한 자연살해세포의 제조
상기 실시예 1-3 및 1-4에서 사이토카인(IL-21)을 첨가하는 단계를 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 자연살해세포를 제조하였다.
실험예. NK 세포의 증식능 확인
상기 실시예 및 비교예의 방법으로 배양된 NK 세포의 증식능을 확인하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 1차 배양 시 사이토카인을 처리하지 않은 경우(비교예) 냉동 및 해동 과정을 거치면 임상에 적용할 만큼 충분한 수의 NK 세포가 제조되지 않는 것을 알 수 있었다(도 1a). 반면, 본 발명의 방법을 사용하는 경우 냉동 및 해동 과정 후에도 임상에 적용할 만큼 충분한 수로 NK 세포가 제조되었으며, 이러한 결과는 냉동 및 해동 과정 후에 사이토카인을 처리한 경우(실시예 1)뿐만 아니라 이를 처리하지 않은 경우(실시예 2)에도 마찬가지로 나타났다(도 1b).

Claims (15)

  1. CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 영양세포(Feeder cell) 및 제1 사이토카인(Cytokine)과 공배양하는 제1 배양단계;
    냉동하는 단계;
    해동하는 단계; 및
    영양세포를 첨가하여 공배양하는 제2 배양 단계;를 포함하는 자연살해세포(Natural killer cell)의 대량생산방법으로,
    상기 제1 배양 단계는 배양 0-6일 동안 제2 사이토카인을 1회 이상 첨가하는 것인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 사이토카인은 IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, type I interferons, GM-CSF 및 IGF 1로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 사이토카인은 IL-21인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 IL-21은 10-50 ng/mL의 농도로 첨가된 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 영양세포는 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포(Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line)를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 1:0.1-5의 함량비로 포함된 것인, 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포는 각각 50-500Gy 방사선을 처리하여 수득된 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 배양 단계의 공배양은 CD56+ 세포 및 CD3-/CD56+ 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 세포와 영양세포를 1:1-100의 혼합비로 수행하는 것인, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 배양 단계는 0-17일 동안 수행되는 것인, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 배양 단계의 영양세포는 1회 이상 처리되는 것인, 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 사이토카인을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, type I interferons, GM-CSF 및 IGF 1로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인, 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 반복하는 것인, 방법:
    냉동하는 단계;
    해동하는 단계; 및
    영양세포를 첨가하여 공배양하는 제2 배양 단계.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제2 배양 단계의 영양세포는 1회 이상 처리되는 것인, 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 사이토카인을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
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