KR20010046514A - 인간의 대식세포로부터 수상돌기 세포 추출 및 분화 유도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체외에서 인체의 대식세포로부터 강력한 세포성 백신인 수상돌기세포로 배양, 분화 및 면역세포의 분리, 냉동 장기 보관에 관한 것이다. 면역반응 조절에 중추적 역할을 하는 수상돌기 세포는 종양 치료 뿐만 아니라 T 세포 반응이 문제가 되는 알레르기성 질환, 자가면역질환, 감염성 질환 등의 여러 질환 및 백신 개발 등에서 수상돌기 세포를 이용할 수 있어 본 발명은 생물 및 의학산업상 매우 유용한 발명인 것이다..

Description

인간의 대식세포로부터 수상돌기 세포 추출, 분화 유도 및 말초 혈액 저축은행의 설립{Differentiation of human Dendritic cells from peripheral blood monocytes and establishment of Blood Savings Bank}

본 발명은 인체의 면역기전을 활성화 시켜 질병으로부터 인체를 방어할 수 있는 수상돌기세포의 제작에 관한 것이다. 본 발명의 수상돌기 세포는 인체의 대식세포로부터 분화를 유도한다. 수상돌기 세포가 면역반응을 조절하는데 중추적인 역할을 한다는 사실을 고려한다면, 종양 치료 뿐만 아니라 T 세포 반응이 문제가 되는 알레르기성 질환, 자가면역질환, 감염성 질환 등의 여러 질환 및 백신 개발 등에서 수상돌기 세포를 이용할 수 있다.

인체의 면역체계는 다양한 질환으로부터 인체를 방어할 수 있음은 잘 알려진 사실이다. 일반적으로 면역반응의 시작은 항원제공세포(antigen presenting cells, APC)가 세포표면의 MHC 클래스 II 및 클래스 I으로 항원을 수여하여 헬퍼(CD4+) 및 세포독성(CD8+) T 림프구를 활성화시키면서 시작한다. 활성화된 CD4+ T 림프구들은 싸이토카인(cytokines)을 통해 B 림프구와 CD8+ T 림프구, 대식 세포 및 다양한 면역세포들을 활성화 시킨다(Finkelman, F. D., J. Exp. Med. 182:279(1995)). 활성화된 세포들은 각자의 기능을 최대화 하여 CD8+ T 림프구는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyt, CTL)로 분화하여 항원제공세포에 의해 제공 받았던 항원과 동일한 항원을 발현하는 모든 세포를 파괴하고 B 림프구는 항체를 대량 생산하여 항원의 중화와 제거를, 그리고 대식세포는 식세포 작용을 통해 병원균의 제거를 담당하게 된다.

수상돌기 세포(dendritic cell, DC)는 골수에서 유래하며, 림프계 뿐만 아니라 비 림프계 기관에 상주하는 세포들로 지난 십 수년간의 연구 결과 이 세포가 면역반응의 조절에서 중요한 역할을 수행함이 알려지기 시작했다(Steinman, R. M., Ann. Rev. Immunol. 9:271(1991); Schuler, G., and R. M. Steinman., J. Exp. Med. 186:1183(1997); Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245 (1998)). DC는 B 림프구나 대식세포(macrophage)와 달리 네이브(naive) T 림프구를 활성화 시키며, 적은 수로도 강력한 T 세포반응을 유발하는 가장 뛰어난 항원제공 세포로 인정 받고 있다(Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature 392:245(1998); Bieber, T., Today 18:311(1997); Sallusto, et al., J. Exp. Med. 189:611(1999)). 비록 완전하게 정의되지 않았으나 이들은 항원만을 제공하는 것이 아니라 T 림프구의 활성에 필요한 모든 보조 활성인자를 제공하고 있다(van Gool, S. W., S. Barcy, S. Devos, P. Vandenberghe, J. L. Ceuppens, K. Thielemans, and M. de Boer., Res. Immunol. 146:183.7(1994)). 골수(Reid, C. D. L., P. R. Fryer, C. Clifford, A. Kirk, J. Tikerpae, and S. C. Knight., Blood 76:1139(1990); Siena, S., M. Di Nicola, M. Bregni, R. Mortarini, A. Anichini, L. Lombardi, F. Ravagnani, G. Parmiani, and A. M. Gianni., Exp. Heamatol . 23:1463(1995); Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa., J. Immunol. 156:2918(1996); Galy, A., F. Morel, B. Hill, and B. P. Chen., J. Immunother. 21:132(1998)) 또는 제대혈(cord blood)(Bykovskaja, S. N., et al., J. Leuk. Biol . 63:620(1998))에서 분리한 CD34 양성 조혈세포, 말초 혈액의 대식 세포 (Chapuis, F., M. Rosenzwajg, M. Yagello, M. Ekman, P. Biberfeld, and J. C. Gluckman., Eur. J. Immunol. 27:431(1997); Goxe, B., N. Latour, J. Bartholeyns, J. L. Romet-Lemonne, and M. Chokri., Res. Immunol . 149:643 (1998)), 구동화(mobilized)된 CD34음성세포(Choi, D., et al., Cancer Res . 4: 2709(1998)나 호중구(Oehler, L., et al., J. Exp. Med. 187:1019(1998))등으로부터 수상돌기 세포로의 분화를 유도할 수 있으나, 편의성과 수량의 문제를 해결하기 위해 말초 혈액(peripheral blood)의 대식세포에서 수상돌기 세포의 분화를 유도한 후(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996)) 이들을 이용하고자 한다. 이들 배양된 수상돌기 세포들은 체내에 존재하는 수상돌기 세포와 동일한 혹은 유사한 특성(조직으로의 이동, 항원 제공 능력, 보조활성인자 발현 등)을 보유함으로써, 이들 세포의 임상 적용에 용이할 것으로 본다.

면역세포의 자극을 위해 림프조직으로 항원을 보유한 채로 이동하기 전에 비림프성 조직에 존재하고 있는 수상돌기 세포는 먼저 활성화되고 분화되는 과정이 필요하다. 최근의 연구들에 의하면, 체내 수상돌기 세포가 성숙 단계에 따라 형태적, 기능적 변화를 보인다(Morse, M. A., H. K. Lyerly, E. Gilboa, E. Thomas, and S. K. Nair., Cancer Res . 58:2965(1998); Labeur, M. S., B. Roters, B. Pers, A. Mehring, T. A. Luger, T. Schwarz, and S. Grabbe., J. Immunol. 162:1681999)). 미성숙 수상돌기 세포들은 항원을 흡수(endocytosis)하고 처리 (processing)하는데 있어서는 효과적이지만 MHC 분자에 의한 항원 제공 능력은 낮은 것으로 보고되고있다(Labeur, M. S., B. Roters, B. Pers, A. Mehring, T. A. Luger, T. Schwarz, and S. Grabbe., J. Immunol . 162:168(1999)). 반면에 성숙 수상돌기 세포의 경우 흡수, 처리 능력이 약하지만 MHC 분자와 보조 활성인자를 미성숙 수상돌기 세포에 비해 세포 표면에 높게 발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수상돌기 세포의 분화를 적절히 체외에서 조절하여 종양 면역에 최적의 조건을 구하는 것이 중요하다.

비록, 많은 연구 결과들이 수상돌기 세포의 순수분리 및 배양에 초점을 맞추고 있으나(Landry, D., M. Lafontaine, M. Cossette, H. Barthelemy, and C. Chartrand., Immunol . 65:135(1988); Freudenthal, P. S., and R. M. Steinman., Proc. Natl. Acad. Sic . USA 87:7698(1990); Thomas, R., L. S. Davis, and P. E. Lipsky., J. Immunol . 150:821(1993); Thirdborough, S. M., N. J. M. London, R. F. L. James, and P. R. F. Bell., Transplant Immunol. 1:143(1993); Beaulieu, S., D. Landry, D. Bergeron, E. A. Cohen, and S. Montplaisir., J. Immunol . Methods 180:225(1995)). 말초 혈액에서 획득되어지는 수상돌기세포의 수는 극히 낮으며, 효과를 입증하기 위한 백서에서의 동물실험의 경우나 차후의 임상 적용에 이용하기에는 이들의 수가 지나치게 적어 순수 분리한 세포의 효용성에 의문이 제기된다. 또한 이들 순수 분리한 세포들이 비록 형태적으로나 수상돌기 세포의 기준을 만족시킨다 하여도, 이들이 각 연구진의 의도대로 기능적인 특성을 보유하는 지는 별개의 문제이다. 따라서 본 발명자들은 수상돌기 세포의 순수 분리 보다는 대식세포와 같이 말초 혈액에서 대다수(majority)를 점유하는 수상돌기 세포의 전구체(precursor)로서 기능을 하는 백혈구로부터 수상돌기 세포의 분화를 유도하고자 한다. 기존의 방식은 말초혈액으로부터 단핵구를 파이콜-하이페크(Ficoll-Hypaque)에 의해 분리한 다음, 플라스틱 부착성이나 CD14-MACS를 이용하여 대식세포를 분리하는데 비해, 본 발명은 파이콜-하이페크 으로 분리한 단핵구를 퍼콜 그래디언트 (Percoll gradient)로 세포의 크기에 따라 분리하는 방식을 이용한다. 이를 위해 밀도 1.050 및 1.061 g/ml의 퍼콜용액을 준비한 후 단핵구 세포 부유액을 퍼콜용액 상에서 분리한다. 이렇게 분리된 세포는 대식세포의 순도가 70%이상이고 숫자도 5 x 10exp7 개 이상을 확보할 수 있다. 다시 이들을 부착성 특성으로 분리하면 순수도 95%까지 도달할 수 있다.

수상돌기 세포로의 분화에 있어 기존의 방식은 GM-CSF와 IL-4의 혼합 배양액 또는 GM-CSF, IL-4 및 TNF-α의 혼합 배양액을 사용하는 대 비해 본 발명자들은 GM-CSF와 IL-4의 배양액으로 6일간 배양한 후 동일 배지에 Monocyte-conditioned medium(MCM) 또는 CD40L를 첨가한 배양액으로 3일간 추가 배양하는 방식을 택한다.

본 발명자들은 기존의 방식에서 벗어나 보다 저렴하고 효과적인 방식으로 수상돌기세포의 제작과 분화를 유도하는 세포분리법 및 배양법을 발명하였다. 구체적으로 기존의 방식보다 높은 순수도의 대식세포로부터 출발하여 발명의 최종산물인 수상돌기세포의 분화와 기능획득에 가장 효과적인 방식을 개발하였다. 말초 혈액으로부터 면역세포와 조혈모세포의 순수 추출 및 혈액저축은행(Blood Savings Bank)에 효과적으로 고밀도의 말초혈액세포, 조혈모세포 등을 장기간 안정하게 저장하는 방식을 확보하고 있다.

도 1은 대식세포의 형질을 분석한 결과를 나타내는 그림이고,

도 2는 대식세포로부터 분화 유도하여 제조한 수상돌기세포의 표현 형질 변화를 보여주는 그림이고,

도 3은 배양한 본 발명 수상돌기세포의 형태를 현미경(100배율)에서 관찰한 그림이고,

도 4는 배양한 본 발명 수상돌기세포들의 항원 제공능력을 MLR로 항원제공세포들의 능력을 분석한 결과를 나타내는 그림이고,

도 5는 본 발명 수상돌기세포와 대식세포의 동결보존 후 MLR로 항원제공세포들의 항원 제공능력을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

본 발명은 수상돌기세포의 대량 제작에 관한 것으로, 대식세포의 분리, 수상돌기세포로의 분화, 형질 분석, 기능 분석 등으로 구성된다. 본 발명은 종양면역유도 방법에 있어서 종래의 것보다는 개선된 하기와 같은 특징이 있다.

(1) 대식세포의 순수도 :

본 발명의 대식세포는 기존의 대식세포 분리 방식과는 다른 방법을 사용하며, 보다 높은 순수도를 획득할 수 있다. 기존의 방식 대부분은 순도 70-80%로 다른 면역세포에 의해 상당히 오염되어 있으나 본 발명의 방식으로 이를 상당 부분 축소, 제거할 수 있다.

(2) 수상돌기세포 분화 :

본 발명에서는 수상돌기세포의 제작에 있어 기존의 방식과는 다른 방법을 채택하고 있다. 분화한 수상돌기 세포를 MCM(monocyte-conditioned medium) 또는 CD40 리간드로 최적 분화(또는 성숙)를 완성할 수 있다. 기존의 방식에 비해 수상돌기세포의 성숙 정도 및 활성의 증가가 가능하다.

이러한 방식으로 기존의 방식에 의해 제작된 수상돌기세포들 보다 기능이 증가된 세포를 제공할 수 있다.

이와 함께 본 발명자들은 정상인으로부터 건강할 때 말초혈액세포 또는 말초조혈모세포를 채집하여 액체 질소에 보관하였다가 면역세포이식이 필요한 질병이 발병했을 때 이를 사용하여 자가혈액세포 이식을 시행한다. 노년기의 인체의 면역력은 청,장년기의 그것에 비해 상당한 정도로 약화(또는 결핍)되어 있어 암, 세균성 질환, 혈액장애 등과 같은 질환에 상대적으로 감수성이 높으며, 그 근본적인 이유는 골수에서 면역세포의 생산능력 저하, 면역세포들의 분열능 저하 등과 같은 복합적인 요인이 작용한다. 이들 세포들은 정상인이 건강을 유지하고있는 상태에서 채집하여 혈액저축은행(Blood Savings Bank)에 장기간 냉동 보관하다가, 노년기의 본인이 질환을 앓게되는 경우 자가 혈액 이식 또는 수혈(autologous transplantation or transfusion)의 과정을 통해 면역력을 회복할 수 있는 근거를 마련한다. 조혈모세포 이식은 1970년대 후반 만성 골수성 백혈병에서의 첫 성공 이후, 1990년대에 이르러서는 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 유방암, 소세포성폐암, 난소암, 신경모 세포암 등의 암이나 혈액질환을 가진 환자들의 일부에서 효과가 인정되며 경우에 따라서는 최선의 치료방법으로 간주되고 있다(Goldman, J. M., D. Catovsky, J. Hows, A. S. Spiers, and D. A. Galton., Br Med J 1:1310(1979); Kessinger, A., and J. O. Armitage., Int. J. Cell. Cloning 10 (Suppl. 1):127(1992)). 비록 자가 대식세포를 채집한 직후 이들을 자극하여 항종양 면역을 유도하려는 시도가 있으나(Lesimple, T., A. Moisna, and L. Toujas., Res. Immunol .149:663(1998)), 건강할 때 채집한 자가혈액(또는 면역세포)을 면역결핍증후가 나타나는 시기에 이식하는 방식은 아직 전세계적으로 시행된 바 없다.

면역세포의 자가수혈(이식) 일차적인 대상은 유전적으로 암 발생률이 높은 가계 구성원으로 하지만, 그렇지 않는 일반인의 경우에도 동일하게 적용한다. 건강한 사람의 경우 조혈 성장인자인 과립구 집락 촉진인자 (G-CSF)를 단독으로 사용하는 경우 G-CSF를 5-10 (g/kg/day씩 투여하면, 대개 4-6일째에 전형적으로 말초혈액의 조혈모세포수가 최고치에 도달하여 CFU-GM이 20-50배, CD34양성세포가 10-30배 증가한다.

말초조혈모세포는 성분 채집술을 통하여 의하여 비교적 용이하게 수집할 수 있다. 국내에서 흔히 이용되는 기종으로 Fenwal CS-3000(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL), COBE Spectra(COBE Laboratories, Lakewood, CO), Haemonetics Model V50(Haemonetics Corporation, Braintree, MA) 등이 있는데, 세 기기 모두 채집효율이 우수하나, 다만 자동화 정도와 채집된 백혈구 성분에 차이가 있는 것으로 보고되고 있다.

최근에는 총혈액량의 3-5배 이상 또는 15L 이상을 처리하는 대용량백혈구성분채집을 통하여 1-3회의 적은 횟수의 성분채집을 통하여 이식에 필요한 충분한 양의 조혈모세포를 얻을 수 있다. 그러나 골수기능이 정상인인 경우 성분채집을 더욱 용이하게 시행할 수 있으며 가동화 방법이 정립되는 경우 외래방문으로 1-2회로 충분한 조혈모세포를 얻을 수 있다.

1회의 성분채집에 걸리는 시간은 혈액 처리량과 혈류에 따라 2-4시간이 걸리는데, 성인의 경우 채집시간이 연장되더라도 말초혈액의 조혈모세포수가 감소하지 않으며 오히려 채집시간이 길수록 채집효율이 좋아졌다는 보고가 있다. 이식에 필요한 충분한 CFU-GM수는 20-50 10exp4/kg 정도로 알려졌으나 배양법(clonogenic assay)은 배양에 걸리는 시간이 2주일이나 되고 재현성이 떨어지며 표준화된 방법이 없어 객관적이지 못한 단점이 있다.

또한 가동화된 말초조혈모세포의 경우 CD34양성세포 2.5 10exp6/kg 정도이면 중성구와 혈소판의 생착이 2주 이내에 이루어진다고 보고된 바 있다.

성분 채집된 조혈모세포의 용량은 약 50-100 mL 되며 이보다 용량이 많은 경우에는 원심분리를 하여 상층액을 제거함으로써 쉽게 줄일 수 있는데 세포농도가 2-4 10exp7/mL 이상이 되지 않도록 주의하는 것이 좋으며, CD34양성세포만을 분리하면 더욱 효과적으로 용량을 줄일 수 있다.

적정농도의 세포수가 되도록 자가혈장(20%)와 배양액(RPMI-1640)으로 조절하면서 냉동보존제인 DMSO(dimethyl surfoxide, Sigma)를 최종농도 10%가 되도록 섞는다. 냉동 보존제와 섞인 조혈모세포는 controlled rate refrigerate에 의해 냉동되며 이를 각각 알루미늄 용기에 넣어 -160℃ 이하의 액체질소가스에 넣어 보관한다. 이렇게 보관된 조혈모세포는 현재 7년까지 보관된 조혈모세포로 이식에 성공한 사례가 보고되고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명은 이에 제한적인 것은 아니다. 또한, 본 발명의 기술적 요지 및 권리범위 내에서 얼마든지 당업자간에 변형실시 또는 균등적 실시가 가능하다는 것은 당업자간에 명백히 이해될 것이고, 그 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

실시예 1 : 대식세포의 분리

본 발명은 대식세포의 대량 순수분리 방법에 대해 기술하였다. 본 발명은 다양한 인체 질환의 치료에 이용될 수 있는 세포성 백신인 수상돌기세포의 제작 방식을 제공하고 있다. 본 발명에서 사용하는 대식세포는 말초혈액에서 추출하였고, 이를 파이콜-하이페크(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 및 퍼콜(Pharmacia)로 연속 분리한 후 부착성 형질을 이용하여 분리한 것이다. 그러나, 본 발명에서 이용하는 방식은 골수, 림프절등의 다른 조직에서 획득한 대식세포 또는 골수, 제대혈, 말초혈액과 같은 다른 조직에서 획득한 조혈 모세포에도 적용할 수 있다.

혈액으로부터 수상돌기세포의 제작을 시작할 때는 생존률을 증가 시키기 위해 다음의 방식을 적용하였다. 혈액을 헤파린(100 U/ml) (또는 다른 항응고제)을 함유하는 용액(주로 RPMI-1640, Irvine Scientific, Santa Ana, CA)에 1:1로 희석한 후 파이콜-하이페크 용액 위에 얹은 다음 이들을 2000 RPM (약 900g force)로 상온에서 20분간 원심 분리하였다. 단핵구는 파이콜-하이페크와 혈액 희석액의 중간층에서 획득하며 적혈구, 다핵구 및 혈소판의 오염을 최소화할 수 있다.

퍼콜그래디언트에 의한 세포 분리를 위해 퍼콜 원액을 10X PBS와 9:1의 비율로 섞어서 삼투압을 보정하였다. 분리된 단핵구는 1.050g/ml 및 1.061g/ml의 밀도에서 대식세포의 집적이 이뤄진다는 보고(Wierenga, E. A., M. Snoek, C. de Groot, I. Chretien, J. D. Bos, H. M. Jansen, and M. L. Kapsenberg., J. Immunol. 144:4651(1990))에 따라 이들 밀도의 퍼콜그래디언트를 이용하여 대식세포를 분리하였다. 이들 그래디언트는 반복 실험을 통해 각각30%와 50% 퍼콜 혼합액에 해당함을 알 수 있었다. 15 ml 원심분리관(TPP, Switzerland)에 퍼콜 1.061, 1.050 두 층을 형성하고 단핵구를 배양액과 함께 퍼콜 위에 주입한 다음 1000 g에서 10분간 상온 원심 분리하고 난 뒤 1.050-1,061의 층 사이에 밀집한 대식세포를 수집하였다.

분리된 세포의 순수도는 항 사람의 제 백혈구군에 대한 백서에서 유래하였고 형광색소로 표지된 단일클론항체 (CD3, CD19, CD14; Becton Dickinson)로 염색한 뒤 이를 유세포 분석기(Becton Dickinson)로 분석하였다.

사용한 배양용기는 조직 배양용 플레이트(TPP, Switzerland)를 이용하였으나, 페트리디시, 플라스크, 또는 roller bottles 등의 다른 세포 배양 용기를 이용할 수 있다.

일반적으로 배양용기(culture dish, 직경 100 mm)에 분주한 세포의 수는 ml 당 5X10exp5개로 하였다.

각 배양단계에 이용하는 배양액은 수상돌기세포의 생존과 증식을 유지할 수 있어야 하며, 이를 위해 성장인자의 첨가가 필수적이다. 일반적으로 사용하는 배양액은 10% 우혈청(Life Technologies, Grand Island, NY)을 첨가한 RPMI-1640이나 사람을 포함하는 다른 종의 혈청을 이용할 수 있으며, 2mM 글루타민, 필수 아미노산, 비타민을 함유하는 다른 합성 배양액을 사용할 수 있다. 배양 중 세균에 의한 오염을 최소화 하기 위해 100 U/ml 페니실린, 100 g/ml 스트렙토마이신을 사용히였으나 40 g/ml 젠타미이신(Life Technologies)의 사용도 가능하다. 배양액에 의해 제공되는 양분의 지속적인 공급을 위해 주기적으로 성장인자를 첨가한 배양액의 교환을 권장한다. 도 1은 대식세포의 형질을 분석한 것이다. 파이콜-하이패크로 분리한 단핵구(mononuclear cells)를 퍼콜 농도 그래디언트(Percoll density gradient)로 추가 분리한 대식세포와 이를 다시 플라스틱 부착성을 이용하여 분리한 대식세포를 단일클론 항체로 염색한 후 순수도를 유세포 분석기로 측정한 대표적인 결과이다.

실시예2: 대식세포로부터 수상돌기 세포로의 분화

본 발명은 다량의 수상돌기세포의 회수를 가능하게 하는 방법을 제공한다. 또한 전체 배양기간을 9일간으로 단축하는 특징을 갖는다. 본 발명은 제작된 수상돌기 세포를 장기 보관할 수 있는 방식을 제공한다. 또한 다양한 질병의 예방과 치료에 이용할 수 있는 적절한 수의 세포성 백신의 제작을 용이하게 할 것이다.

본 발명은 Chapius등에 의한 수상돌기세포의 성숙 방식(Chapuis, F., M. Rosenzwajg, M. Yagello, M. Ekman, P. Biberfeld, and J. C. Gluckman., Eur. J. Immunol. 27:431.13(1997))을 다음과 같은 방식으로 변형하였다. 제작되는 수상돌기세포의 수적 증가를 위해 GM-CSF, IL-4과 MCM 또는 CD40 리간드를 이용하였으며, 이외에도 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), M-CSF(monocyte-macrophage colony-stimulating factor), 인터루킨 1, 인터루킨 3, 인터루킨 6, TNF(tumor necrosis factor)와 같은 다른 성장인자를 사용할 수 있다. 이들 인자는 세포 성장과 분화에 최적 농도를 결정한 후 첨가되었다.

사용되는 성장인자의 양은 공급자의 활성 정의에 따라 다르지만 GM-CSF (6000 U/ml)(Pharmingen, San Diego, CA), IL-4(200 U/ml)( Pharmingen)를 사용하였다.

CD40 리간드(Caux, C., C. Massacrier, B. Vanbervliet, B. Dubios, C. van Kooten, I. Durand, and J. Banchereau., J. Exp. Med. 180:1263(1994); Canque, B., S. Camus, M. Yagello, and J. C. Gluckman., J. Leukoc. Biol. 64:235(1998)) 또는 MCM(Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl, D. Niederwieser, and G. chuler., J. Immunol. Methods 196:137(1996))의 첨가가 수상돌기 세포의 기능적 성숙(분화)을 촉진한다고 알려져 있으므로, 본 발명은 MCM( 대식세포 배양 상층액; monocyte-conditioned medium) 또는 CD40 리간드(연세대학교 이태호교수)에 의한 수상돌기세포 분화 유도의 방식을 이용하였다. 다만 대식세포 배양 상층액(MCM)은 기존의 방식과는 다르게 다음과 같은 변화를 주었다. 대식세포(5 x 10exp7 cells/100 mm dish/10 ml)를 24시간 1g/ml의 LPS(Sigma, St. Louis, MO)로 자극한 다음 그 상층액 만을 수집, 고속 원심 분리하고, 0.2 μM filter로 세포 잔해를 제거한 용액을 일컫는다.

특정항원의 면역효과를 극대화할 수 있는 것을 어주번트(adjuvant)라 하며,대표적으로 alum이 있다. 최근에, 추가적인 어주번트 없이 수상돌기세포를 항원과 함께 체내로 투여해도 최대의 면역효과를 확인할 수 있음이 보고 되었다. 이러한 이유로 수상돌기세포를 생체내 어주번트(nature's adjuvant)라 칭하기도 한다. 따라서 본 발명은 수상돌기세포가 보유하는 고유한 항원제공 능력을 임상과 치료에 이용 가능한 충분한 수의 수상돌기세포의 제작을 용이하게 한다. 특히 체외에서 대량의 수상돌기 세포를 제작할 수 있으므로 종양, 자가면역질환, 알레르기성 질환, 감염성 질환의 치료와 예방 백신의 전달 등에 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 형질적으로 제작된 수상돌기세포는 백서에서 제작된 항 사람 단일클론 항체 CD1a(Pharmingen), CD11c(Pharmingen), CD14(Becton Dickinson), CD15(Becton Dickinson), CD40(Pharmingen), CD54, CD80(Serotec, Oxford, England), CD83(Pharmingen), CD86(serotec) 및 HLA-DR(Becton Dickinson)로 염색하면 CD1a, CD11c, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR을 발현하며, CD14를 발현하지 않는 안정한 형질을 갖는 세포군으로 정의한다.

대식세포를 상기한 방식으로 분화를 유도한 후 이들을 2회 배지로 원심분리, 세척 하였다. 세척 후 세포를 적정농도(1 x 10exp6 cells/ml)로 보정한 다음 다양한 단일클론항체(Becton Dickinson)로 15 분간 4℃에서 염색하였다. 염색 후 세포를 2회 세척하고, 이를 1%(w/v)파라포름알데하이드(paraformaldehyde, Sigma)를 함유하는 PBS에 고정하였다.

고정된 세포는 유세포 분석기(Becton Dickinson)를 통해 형질 분석을 수행 하였다. 도 2 은 대식세포로부터 유도 분화한 수상돌기 세포의 표현 형질 변화를 보여주는 그림이다. 분리된 대식세포를 6일간 GM-CSF(600 u/ml)와 IL-4(100 u/ml)를 함유하는 배지에서 배양한 후 추가로 3일간 GM-CSF(600 u/ml)와 IL-4(100 u/ml) 및 (A) monocyte-conditioned medium(MCM) 또는 (B) GM-CSF(600 u/ml)와 IL-4(100 u/ml) 및 CD40 ligand를 함유하는 배지에서 배양하였다. 단위 시간 별로 세포를 회수하여 이를 다양한 단일클론 항체로 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다. 도3는 상기 조건에서 배양한 수상돌기 세포의 형태를 현미경(100배율)에서 관찰한 것이다.

실시예 3 : 수상돌기세포의 기능분석

기능적으로는 대식세포보다 100-1000배 이상 강력한 항원제공 능력을 보유함을 MLR로 확인 하였다. 항원제공세포로서의 수상돌기세포의 기능은 T림프구 증식 (T cell proliferation assay)에 의해 확인하였다.

첫째, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 3000Rad로 방사선 조사한 다양한 수의 수상돌기세포를 접종하고 여기에 다른 사람에게서 추출한 T 림프구 (2 x 10exp5 cells/well)을 첨가하여 37℃, 습도 95%, 5% 이산화 탄소 조건의 항온 배양기에서 5일간 배양한 다음 16시간 동안 방사선으로 표지된 티미딘(³H-thymidine, 0.5μ Ci/well, NEN, Boston, MA)로 표지하여 배양하였다. 배양 후 수상돌기세포의 자극에 의한 T 림프구의 증식 정도를 염색체 상의 티미딘 방사선 잔류량을 측정하여 결정한다. 대조군으로는 자극 받지 않은 T 림프구, PHA (10 μ/ml, Sigma)에 의해 자극 받은 T 림프구, 방사선 조사된 수상돌기세포의 3 군으로 하였다.

도4은 상기 조건에서 배양한 각 세포들의 항원 제공능력을 MLR(mixed leukocyte reaction)로 항원제공세포들의 능력을 분석한 결과이다. 고정된 수의 allogeneic 말초혈액 단핵구를 반응군(responder)로 하고 3000Rad로 조사한 자극원(stimulator)하여 5일간 배양한 다음 16 시간동안 0.5 μCi의³H-thymidine을 첨가하여 DNA 합성을 방사선 잔류량으로 측정하였다. 정사각형(?)은 대식세포에 의한 반응군의 증식을, 검정색 원형(●)은 6일간 배양한 후 3일간 추가로 MCM으로 성장한 수상돌기 세포에 의한 반응군의 증식을 그리고 개방된 원형(○)은 6일간 배양한 후 3일간 추가로 CD40 Ligand로 성장한 수상돌기 세포에 의한 반응군의 증식을 나타낸다. 도5은 수상돌기세포와 대식세포의 동결 보관 후 항원 제공능력을 mixed leukocyte reaction(MLR)로 항원제공세포들의 능력을 분석한 결과이다. 자극원으로 상기의 세포군들을 90% 우혈청과 10% DMSO(dimethyl surfoxide)를 함유하는 동결용액(freezing solution)에서 동결하여 2주일 간 보관한 후 37℃ 수조에서 해동하였다. 이들을 3000Rad에 조사한 후 고정된 수의 allogeneic 말초혈액 단핵구를 반응군(responder)으로 5일간 배양한 다음 16 시간동안 0.5 μCi의³H-thymidine을 첨가하여 DNA 합성을 방사선 잔류량으로 측정하였다. 개방된 정사각형(?)은 대식세포에 의한 반응군의 증식을, 검정색 원형(●)은 6일간 배양한 후 3일간 추가로 MCM으로 성장한 수상돌기 세포에 의한 반응군의 증식을 그리고 개방된 원형(○)은 6일간 배양한 후 3일간 추가로 CD40 Ligand로 성장한 수상돌기 세포에 의한 반응군의 증식을 나타낸다.

이상의 결과로 본 발명의 수상돌기 세포는 효과적인 세포성 백신제작에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 골수이식술의 발달과 세포냉동기술의 발달은 골수세포이식의 급격한 발전과 종양성 질환 뿐 아니라 체외증폭, 유전자 요법 등 그 이용분야도 점차 확대되고 있다. 일단 질병이 발생한 후 자가골수이식을 위한 말초조혈모세포를 채집하는 경우에는 암세포의 혼입의 위험도가 높아진다. 또한 어떤 질환에 이환 되었던 세포보다는, 건강할 때 이를 채혈하여 냉동 보관하였던 정상 면역세포나 조혈모세포가 준비되어 있다면 암을 치료하는 고용량 항암 화학요법과 동반된 자가골수 이식뿐 아니라 이를 체외증폭, 유전자 치료 등에 중요한 벡터로 사용할 수 있는 건강한 자가세포는 암의 치유가능성을 지금보다도 훨씬 높게 기대할 수 있는 획기적인 방법으로 생각할 수 있다.

Claims (16)

1. 사람의 말초혈액으로부터 퍼콜 그래디언트를 이용하여 분리한 대식세포를 GM-CSF(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor), IL-4(interleukin-4)를 첨가하여 배양하고 CD40리간드와 MCM을 첨가하여 성숙한 수상돌기 세포로 분화유도시킴을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
2. 제1항에 있어서, 대식세포는 CD14 항원 양성세포임을 특징으로 하는 수상돌기 세포의 분화 유도 방법.
3. 제1항에 있어서, 대식세포는 플라스틱 부착성 세포임을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
4. 제1항에 있어서, 퍼콜 그래디언트는 1.050 과 1.061 g/ml의 밀도 (또는 30% 퍼콜과 55% 퍼콜)임을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
5. 제1항에 있어서, 대식세포의 배양에 GM-CSF와 IL-4를 통시에 첨가하여 배양함을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
6. 제1항에 있어서, 대식세포의 배양에 GM-CSF를 배지에 넣고 배양한 다음 1-3일 후 IL-4를 첨가하여 배양함을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
7. 제1항, 제 5항 또는 제6항에 있어서, 배양액은 100-1000 U/ml GM-CSF 과 50-500 U/ml의 IL-4를 함유함을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
8. 플라스틱 비부착성의 미성숙 수상돌기세포를 다음 어느 한 단계로부터 선택된 단계 및 분화유도된 수상돌기세포를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 성숙한 수상돌기 세포의 분화 유도 방법.

   (a) GM-CSF와 IL-4를 함유하는 배지에서 약 6일간 배양한 다음, 2-3일간 추가로 GM-CSF, IL-4와 CD40리간드를 함유하는 배지에서 배양하는 단계

   (b) GM-CSF와 IL-4를 함유하는 배지에서 약 6일간 배양한 다음, 2-3일간 추가로 GM-CSF, IL-4와 MCM을 함유하는 배지에서 배양하는 단계
9. 제8항에 있어서, 회수되는 수상돌기 세포는 CD14-음성, CD1a-음성 및 양성, CD83-양성의 형질을 보유함을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
10. 제14항에 있어서, MCM의 사용농도는 10-50% (v/v)임을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
11. 제14항에 있어서, MCM은 플라스틱 부착성에 의해 분리한 대식세포를 24시간 LPS가 있는 조건에서 배양한 다음 수집한 상층액을 통칭함을 특징으로 하는 수상돌기세포의 분화 유도 방법.
12. 사람으로부터 혈액 또는 면역세포를 채취하여 혈액저축은행에 냉동 보관하고 면역 결핍시 이를 자가 수혈하는 것을 특징으로 하는 면역력 회복 방법.
13. 제12항에 있어서, 냉동 보관은 액체 질소용기에서 장기관 보관함을 특징으로 하는 면역력 회복 방법.
14. 제12항에 있어서, 면역 결핍은 노년기의 종양, 세균성 질환, 바이러스 감염, 혈액 장애 등과 같은 각종 질환을 포함함을 특징으로 하는 면역력 회복 방법.
15. 제12항에 있어서, 혈액은 말초혈액임을 특징으로 하는 면역력 회복 방법.
16. 제12항에 있어서, 면역세포는 분리된 단핵구와 분리된 T 림프구 또는 CD34-양성 조혈 모세포임을 특징으로 하는 면역력 회복 방법.