CN107090433A - 用于肿瘤治疗的t细胞培养方法 - Google Patents

用于肿瘤治疗的t细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，为解决现有技术不能大量体外获得T细胞的问题，其包括下列步骤：1）分离单核细胞：2）单核细胞洗涤：3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK‑AEC‑IL2的淋巴细胞无血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养；4）Day 1‑14扩增：T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋培养，最后扩增到1‑3×109以上即可；Day12无菌检测：5）Day14 收获。具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。

Description

用于肿瘤治疗的T细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，特别是涉及一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法。
背景技术
癌症是目前困扰人类的最为重大的疾病之一，无论发病率还是死亡率均呈持续上升趋势。我国具有13.7亿的庞大人口，据统计显示，2015年我国约有4292,000例癌症新发病例，其中2814,000例死亡，癌症治疗问题亟待解决；肿瘤临床治疗基本以手术、放疗和化疗为主，但手术和放疗虽然在控制肿瘤的局部病灶方面有很好的疗效，但在预防肿瘤的复发和转移方面显得无能为力，而肿瘤的免疫学治疗可以弥补传统治疗手段的这一不足，给癌症治疗带来新的曙光。
肿瘤免疫学治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而达到控制和杀死癌细胞的目的。目前，肿瘤免疫学治疗已成为继手术治疗，放、化疗之后的第四种癌症治疗模式，正逐渐为人们所接受。这些方法可以清除、杀死少量的术后残留或扩散的癌细胞，提高、巩固癌症治疗的效果，减少癌症的复发。
T 细胞由多能造血干细胞发育分化而来。体内存在能特异性识别 各种抗原的T细胞库。淋巴样前体细胞进入胸腺之初尚未表达T细胞表面标志，但表达末端脱氧核苷转移酶后，即称为前胸腺细胞。它们在胸腺微环境中胸腺基质细胞（TSC)及其所分泌细胞因子和胸腺激素作用下，逐渐分化为成熟的T 细胞。在该过程中，T 细胞受体（TCR）逐渐成熟，表达不同分化抗原(如CD4和CD8等)，并获得MHC限制性识别能力。血液中的T细胞约占淋巴细胞总数的75%，是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类细胞。按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。它的正常功能对人类抵御疾病非常重要，参与细胞免疫，如排斥异体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。
细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells,Tc），具有杀伤靶细胞的功能；消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞。
CD8+ T细胞杀伤靶细胞主要有两种途径：即细胞裂解性杀伤和诱导细胞凋亡。前者指T细胞分泌诸如穿孔素一类的介质损伤靶细胞膜；后者指T细胞通过表面FasL与靶细胞表面的Fas结合，或者通过释放粒酶B至靶细胞后诱导靶细胞凋亡。
人体可天然产生T细胞，但数量较少。随着科技的进步，无血清培养技术的发展，体外培育T细胞，再将大量细胞注入患者体内，以增强免疫系统成为一种可能。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，其可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
为实现上述目的，本发明用于肿瘤治疗的T细胞培养方法包括下列步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容，混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养。
4）Day 1-14扩增：T细胞前期扩增：细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化、数量变化、培养基颜色变化；一般情况下此时细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入因子的无血清培养基以满足细胞生长的需要。
T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋培养，最后扩增到1-3×109以上即可。
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测。
5）Day14 收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（2）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中；依此操作，将离心管并为两个，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（3）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液，吸取细胞样本于离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂细胞检测合格即为成品。具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。
作为优化 ，所述细胞检验有：细胞数量与活性检测、细胞无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞表型检测。
作为优化，细胞数量与活性检测是：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
细胞无菌检测是：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
支原体检测是：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测。
内毒素检测是：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，执行内毒素标准≤0.25EU，操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；‚鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；ƒ放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
细胞表型检测是：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3+CD8+所占的比例≧90%为合格。
作为优化，培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测。
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
细胞无菌检测：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
作为优化，在1）分离单核细胞步骤前先进行如下准备步骤：分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出。废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量（mL）=80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
作为优化，在1）分离单核细胞步骤前先进行如下生产准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证。通过验证后，才可以投入使用。
2）CD3单克隆抗体用生理盐水稀释至2-10μg/mL，用10mL移液管吸取12.5mL加入到175 cm2透气盖细胞培养瓶内，轻晃包被液使其充分润湿瓶底，将细胞培养瓶放平，于室温放置4h或于4℃冰箱过夜。完成后，倒掉包被液，并用生理盐水晃洗细胞培养瓶2-3次，加入少量保护液后置于4℃冰箱备用。
3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌。水浴锅打开设置工作温度为56℃。
4）将淋巴细胞分离液以及淋巴细胞无血清培养基置于冰箱外部恢复室温。
作为优化，所述1）分离单核细胞中：所述离心管是50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL是离心管中分别加入15mLFicoLL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的移液管是25mL移液管，用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中是每管加入30mL血液，离心是7升4降2000rpm离心20min；将血浆层尽量吸弃干净的移液管是10mL移液管。
作为优化，所述2）单核细胞洗涤步骤中：将上述收集好的细胞稀释液进行离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容是用生理盐水定容到45mL；混合均匀，离心是混合均匀，1200rpm离心8min；离心前吸取样本是离心前吸取约0.5mL样本。
3）单核细胞培养步骤中：加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基是加入含BK-AEC-IL2浓度为100-1000 IU/mL淋巴细胞无血清培养基，使细胞的接种浓度为1-2×106/ml。
作为优化，Day 1-14扩增：T细胞前期扩增中：细胞形态变化是体积、形状变化，数量变化是集落变化。
Day12无菌检测中：用注射器抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
作为优化，Day14 收获：（1）步骤中：离心管是250mL离心管，离心是2000rpm离心5min；（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；将离心管并为两个是将四个离心管并为两个，离心是2000rpm离心5min；（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，合并细胞悬液，共100mL；吸取细胞样本于离心管中是吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，用生理盐水将细胞悬液定容是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，离心2000rpm离心5min；（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白，使终浓度为1%；取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将细胞悬液转入100mL细胞转移袋中。
采用上述技术方案后，本发明用于肿瘤治疗的T细胞培养方法具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。
具体实施方式
本发明用于肿瘤治疗的T细胞培养方法包括下列步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容，混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养。
4）Day 1-14扩增：T细胞前期扩增：细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化、数量变化、培养基颜色变化；一般情况下此时细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入因子的无血清培养基以满足细胞生长的需要。
T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋培养，最后扩增到1-3×109以上即可。
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测。
5）Day14 收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（2）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中；依此操作，将离心管并为两个，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（3）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液，吸取细胞样本于离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂细胞检测合格即为成品。具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。
具体是：所述细胞检验有：细胞数量与活性检测、细胞无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞表型检测。
具体是：细胞数量与活性检测是：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
细胞无菌检测是：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
支原体检测是：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测。
内毒素检测是：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，执行内毒素标准≤0.25EU，操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；‚鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；ƒ放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
细胞表型检测是：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3+CD8+所占的比例≧90%为合格。
具体是：培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测。
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
细胞无菌检测：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
具体是：在1）分离单核细胞步骤前先进行如下准备步骤：分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出。废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量（mL）=80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
具体是：在1）分离单核细胞步骤前先进行如下生产准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证。通过验证后，才可以投入使用。
2）CD3单克隆抗体用生理盐水稀释至2-10μg/mL，用10mL移液管吸取12.5mL加入到175 cm2透气盖细胞培养瓶内，轻晃包被液使其充分润湿瓶底，将细胞培养瓶放平，于室温放置4h或于4℃冰箱过夜。完成后，倒掉包被液，并用生理盐水晃洗细胞培养瓶2-3次，加入少量保护液后置于4℃冰箱备用。
3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌。水浴锅打开设置工作温度为56℃。
4）将淋巴细胞分离液以及淋巴细胞无血清培养基置于冰箱外部恢复室温。
具体是：所述1）分离单核细胞中：所述离心管是50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL是离心管中分别加入15mLFicoLL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的移液管是25mL移液管，用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中是每管加入30mL血液，离心是7升4降2000rpm离心20min；将血浆层尽量吸弃干净的移液管是10mL移液管。
具体是：所述2）单核细胞洗涤步骤中：将上述收集好的细胞稀释液进行离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容是用生理盐水定容到45mL；混合均匀，离心是混合均匀，1200rpm离心8min；离心前吸取样本是离心前吸取约0.5mL样本。
3）单核细胞培养步骤中：加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基是加入含BK-AEC-IL2浓度为100-1000 IU/mL淋巴细胞无血清培养基，使细胞的接种浓度为1-2×106/ml。
具体是：Day 1-14扩增：T细胞前期扩增中：细胞形态变化是体积、形状变化，数量变化是集落变化；Day12无菌检测中：用注射器抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
具体是：Day14 收获：（1）步骤中：离心管是250mL离心管，离心是2000rpm离心5min；（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；将离心管并为两个是将四个离心管并为两个，离心是2000rpm离心5min；（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，合并细胞悬液，共100mL；吸取细胞样本于离心管中是吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，用生理盐水将细胞悬液定容是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，离心2000rpm离心5min；（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白使终浓度为1%；取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将细胞悬液转入100mL细胞转移袋中。具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。更具体做如下进一步说明。
一、主要仪器、试剂与耗材。
1主要仪器。
生物安全柜(ThermoFisher 1374 ) CO2培养箱(ThermoFisher 150i )。
离心机(ThermoFisher ST40R ) 生化培养箱（一恒 LRH-150F）。
倒置显微镜（Nikon TS100-F） 高压锅（松下 MLS-3781L-PC）。
烘箱（博讯 GZX-9070MBE） 超纯水仪（ThermoFisher EDI 15）。
冰箱（海尔 SCD-648WDBE） 封管热合器（SureseaL SE70011C）。
水浴锅。
2主要试剂：人淋巴细胞分离液，注射用生理盐水， 淋巴细胞无血清培养基（Corning88-581-CM），CD3McAb ，BK-AEC-IL2，人血白蛋白，赤藓红染色剂，鲎试剂检测试剂盒，
支原体检测试剂盒，硫乙醇酸盐流体培养基，大豆酪蛋白流体培养基，PE-CD8，PerCP-CD3。
3耗材：5mL注射器、50mL注射器、T175细胞培养瓶（透气盖）、50mL离心管、250mL离心管、10mL移液管、25mL移液管、肝素抗凝管、细胞转移袋、细胞培养袋、100μm细胞筛网、灭菌进口1000μL枪头、封口膜。
二.操作内容：1.生产前准备： 1.1、对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证。通过验证后，才可以投入使用。
1.2、CD3单克隆抗体用生理盐水稀释至2-10μg/mL，用10mL移液管吸取12.5mL加入到175 cm2细胞培养瓶（透气盖）内，轻晃包被液使其充分润湿瓶底，将细胞培养瓶放平，于室温放置4h或于4℃冰箱过夜。完成后，倒掉包被液，并用生理盐水晃洗细胞培养瓶2-3次，加入少量保护液后置于4℃冰箱备用。
1.3、洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌。水浴锅打开设置工作温度为56℃。
1.4、将淋巴细胞分离液以及淋巴细胞无血清培养基置于冰箱外部恢复室温。
2.人外周血单核细胞分离：2.1分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜。物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出。废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置。操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方。
2.2全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量（mL）=80/淋巴细胞绝对值。将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀。开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
2.3分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的50mL离心管的个数，离心管中分别加入15mLFicoLL；用25mL移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，每管加入30mL血液，旋紧盖子，2000rpm离心20min（升7降4）。注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面。
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层。用10mL移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干50mL离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀。
2.4单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，1600rpm离心10min，弃上清；用生理盐水定容到45mL，混合均匀，1200rpm离心8min；重复洗涤细胞1次，离心前吸取约0.5mL样本，赤藓红染色计数。最后收集得到的沉淀即为单核细胞。
3.单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入淋巴细胞无血清培养基（含BK-AEC-IL2浓度为100-1000 IU/mL），使细胞的接种浓度为1-2×106/ml，重悬。将CD3单抗包被好的细胞培养瓶（透气盖）中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养。
Day 1-14 细胞培养：T细胞前期扩增；细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化（体积、形状等）、数量（集落）变化、培养基颜色变化等；一般情况下此时细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入因子的无血清培养基以满足细胞生长的需要。
T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时可以用细胞培养袋培养，最后扩增到1-3×109以上即可。
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测。将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本，做微生物检测。
Day14 收获：1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干250mL离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
2）用25mL×3次生理盐水（已加入适量人血白蛋白）洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；依此操作，将四个离心管并为两个，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
3）用50mL×2次生理盐水（已加入适量人血白蛋白）洗离心管，合并细胞悬液，共100mL，吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，2000rpm离心5min，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块。
4）加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白（终浓度为1%）；取出约1.5mL细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过100μm的细胞筛后，通过60mL注射器连接100mL细胞转移袋，将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂检测。
4.细胞检验：4.1细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%。
4.2细胞无菌检测：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
除此之外，还需要对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次血平板检测。用这两种方法可以监控细胞有无细菌污染，并方便排查原因。
4.3支原体检测：支原体个体小，较一般细菌更难检测，本公司用支原体检测试剂盒进行检测。方法是将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用于支原体检测。
4.4内毒素检测：本公司用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测。内毒素标准≤0.25EU。操作如下：1）准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用。
2）鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水。
3）放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格。
4.5细胞表型检测：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3+CD8+所占的比例≧90%。
采用上述技术方案后，本发明用于肿瘤治疗的T细胞培养方法具有可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T细胞（≧90%），从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优点。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，其特征在于包括下列步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面；
将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀；
2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容，混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞；
3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO2培养；
4）Day 1-14扩增：
T细胞前期扩增：细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化、数量变化、培养基颜色变化；一般情况下此时细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入因子的无血清培养基以满足细胞生长的需要；
T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋培养，最后扩增到1-3×109以上即可；
Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测；
5）Day14 收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（2）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中；依此操作，将离心管并为两个，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（3）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液，吸取细胞样本于离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；
（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂细胞检测合格即为成品。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于所述细胞检验有：细胞数量与活性检测、细胞无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞表型检测。
3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于细胞数量与活性检测是：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%；
细胞无菌检测是：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性；
支原体检测是：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测；
内毒素检测是：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，执行内毒素标准≤0.25EU，操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；‚鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL 2λ的标准品，阴性对照组加入0.1 mLBET水；ƒ放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格；
细胞表型检测是：根据每种抗体1 x 106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析， CD3+CD8+所占的比例≧90%为合格。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测；
细胞数量与活性检测：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%；
细胞无菌检测：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性。
5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于在1）分离单核细胞步骤前先进行如下准备步骤：分离前准备：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜时要从右手进入，用完后从左手出；废液缸放在左手边，一般常用的物品如枪头、移液器、移液管、剪刀、止血钳等放在右手边；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作过程中，不许左右手交叉操作，不许将手放在打开的无菌容器或培养瓶的上方；
全血检验与血样保存：根据淋巴细胞绝对值计算采血量，计算公式：采血量mL=80/淋巴细胞绝对值；将采血管用75%酒精喷洒消毒后放入生物安全柜，颠倒混匀；开启采血管，用10mL移液管将血液从采血管中转移至250mL离心管中，反复吹打混匀后取出约0.5mL血液到用于微生物检测；取1mL血液于1.5mL冻存管中，保存在-80℃冰箱，作为档案以备后续检验。
6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于在1）分离单核细胞步骤前先进行如下生产准备：1）对于生产车间，要提前进行各项洁净室验证，包括沉降菌、浮游菌和尘埃粒子的验证；通过验证后，才可以投入使用；
2）CD3单克隆抗体用生理盐水稀释至2-10μg/mL，用10mL移液管吸取12.5mL加入到175cm2透气盖细胞培养瓶内，轻晃包被液使其充分润湿瓶底，将细胞培养瓶放平，于室温放置4h或于4℃冰箱过夜；完成后，倒掉包被液，并用生理盐水晃洗细胞培养瓶2-3次，加入少量保护液后置于4℃冰箱备用；
3）洁净室通风循环系统预先运行并正常工作30min，进入洁净室打开生物安全柜紫外灯设置30 min，打开整个洁净区紫外灯进行消毒灭菌；水浴锅打开设置工作温度为56℃；
4）将淋巴细胞分离液以及淋巴细胞无血清培养基置于冰箱外部恢复室温。
7.根据权利要求1－6任一所述培养方法，其特征在于所述1）分离单核细胞中：所述离心管是50mL离心管，离心管中分别加入FicoLL是离心管中分别加入15mLFicoLL，把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中的移液管是25mL移液管，用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中是每管加入30mL血液，离心是7升4降2000rpm离心20min；将血浆层尽量吸弃干净的移液管是10mL移液管。
8.根据权利要求1－6任一所述培养方法，其特征在于所述2）单核细胞洗涤步骤中：将上述收集好的细胞稀释液进行离心是1600rpm离心10min，用生理盐水定容是用生理盐水定容到45mL；混合均匀，离心是混合均匀，1200rpm离心8min；离心前吸取样本是离心前吸取约0.5mL样本；
3）单核细胞培养步骤中：加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基是加入含BK-AEC-IL2浓度为100-1000 IU/mL淋巴细胞无血清培养基，使细胞的接种浓度为1-2×106/ml。
9.根据权利要求1－6任一所述培养方法，其特征在于Day 1-14扩增：NK细胞前期扩增中：细胞形态变化是体积、形状变化，数量变化是集落变化；Day12无菌检测中：用注射器抽取细胞样本是用2mL注射器抽取约0.5mL细胞样本。
10.根据权利要求1－6任一所述培养方法，其特征在于Day14 收获：（1）步骤中：离心管是250mL离心管，离心是2000rpm离心5min；
（2）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中是用25mL×3次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，细胞悬液并入另一离心管中，共75mL；将离心管并为两个是将四个离心管并为两个，离心是2000rpm离心5min；
（3）步骤中：用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液是用50mL×2次已加入适量人血白蛋白的生理盐水洗离心管，合并细胞悬液，共100mL；吸取细胞样本于离心管中是吸取约0.5mL细胞样本于1.5mL离心管中，用生理盐水将细胞悬液定容是用生理盐水将细胞悬液定容至250mL，离心2000rpm离心5min；
（4）步骤中：加入生理盐水混匀细胞是加入100mL生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白是加入适量人血白蛋白，使终浓度为1%；取出细胞样品是取出约1.5mL细胞样品，细胞悬液过细胞筛是细胞悬液过100μm细胞筛，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中是通过60mL注射器将细胞悬液转入100mL细胞转移袋中。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433303A (zh) * 2011-12-29 2012-05-02 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养方法
CN102876631A (zh) * 2012-10-09 2013-01-16 博雅干细胞科技有限公司 从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用
CN105462922A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种增加免疫细胞得率的方法
CN106282110A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效cik细胞制备及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433303A (zh) * 2011-12-29 2012-05-02 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养方法
CN102876631A (zh) * 2012-10-09 2013-01-16 博雅干细胞科技有限公司 从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用
CN105462922A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种增加免疫细胞得率的方法
CN106282110A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效cik细胞制备及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
鞠秀丽: "《小儿白细胞疾病》", 28 February 2009, 山东大学出版社 *

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