CN107771781A - 免疫细胞高活率冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种免疫细胞高活率冻存方法，步骤如下：⑴将外周血离心800g，10min，离心采用8升4降的方式，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min，取上清作为自体血清；⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4，离心600g，40min，⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min，重复两次，生理盐水重悬计数，采用新的冻存保护剂进行冻存即可：本发明采用改进后的技术方案可以更好的保护冻存细胞，尽量减少在冻存过程中所受损伤，增加复苏后细胞的存活率达90％以上。

Description

免疫细胞高活率冻存方法

技术领域

本发明属于免疫细胞细胞实验领域，主要用于冻存分离的单个核细胞以及培养得到免疫细胞，尤其是一种免疫细胞高活率冻存方法。

背景技术

衰老是机体随着年龄增长出现生理结构的退行性改变以及机能衰退，表现出机体适应性和抵抗力减退的过程。机体衰老和免疫功能的状态呈现平行关系，即在机体衰老的过程中，免疫功能呈进行性改变，包括机体对感染的应答能力和持久免疫记忆能力，涉及免疫器官、

免疫细胞、免疫分子、免疫应答类型及水平等系列改变。

自体免疫细胞是指机体内自有而非异体引入渗与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。自体细胞免疫疗法也称为生物免疫疗法中的细胞治疗方法庄要包括三种免疫细胞的疗法一DC、CIK、DC-CIK。

免疫细胞治疗技术是采集人体免疫细胞，在多种免疫活性因子的作用下，经过体外培养，消除患者体内的免疫抑制因素，筛选并大量扩增免疫效应细胞，然后再回输到体内，杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞。免疫细胞治疗技术可打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。随着分子生物学、遗传学和病理生理学的发展，免疫细胞治疗取得了令人鼓舞的成果。它能诱发人体自身产生大量具备免疫杀伤作用的特异性细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞进行精确性、特异性、靶向性、主动式攻，杀灭体内的肿瘤细胞调节并增强患者机体的免疫功能从而提高患者的生活质量。

近年来对外周血单个核细胞(PBMC)冷冻保存的研究较少。对于细胞冻存研究的经典理论认为深低温(-196℃)能抑制细胞内酶的活性，细胞代谢十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变。但冷冻产生冰晶将造成细胞内损伤，因此，冷冻保护剂的选择成了决定冷冻效果的最关键因素。我们通过冷冻技术对PBMC冷冻保存，探讨不同冻存剂保护下外周血单个核细胞及成熟免疫细胞的存活率，和冻存前后的单个核细胞培养效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种免疫细胞高活率冻存方法，解决了冻存后的细胞存活率较低问题，冻存后的细胞不易培养，培养后细胞扩增倍数少，细胞表型低。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种免疫细胞高活率冻存方法，步骤如下：

⑴将外周血离心800g，10min，离心采用8升4降的方式，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min，离心采用8升8降的方式，取上清作为自体血清；

⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4，离心600g，40min，的方式1升0降的方式；

⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min，离心采用8升8降的方式，重复两次，生理盐水重悬计数。取一定量细胞做流式检测分析；

⑷外周血单个核细胞分为三部分，其中两部分细胞冻存，另外两部分细胞用于直接培养，分别按照NK体外扩增培养方案及DC-CIK体外扩增培养方案培养；

⑸冻存保护剂以下列体积百分比为原料进行复配：

⑹采用上述冻存保护剂对PBMC细胞进行冻存。

本发明的有益效果为：

本发明采用改进后的技术方案可以更好的保护冻存细胞，尽量减少在冻存过程中所受损伤，增加复苏后细胞的存活率达90％以上。

本发明提供的方法解决了传统方法冻存后细胞难培养，得到的效应细胞表型不高、细胞数目扩增倍数少的问题。

附图说明

图1为单个核细胞冻存前后培养NK细胞的差异(图1-A冻存前，图1-B冻存180天)；

图2为单个核细胞冻存前后培养CIK细胞的差异(图2-A冻存前图2-B冻存180天)。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种免疫细胞高活率冻存方法，步骤如下：

⑴将外周血离心800g，10min(8升4降)，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min(8升8降)，取上清作为自体血清；

⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4，(15ml ficoll，20ml液体)离心600g，40min(1升0降)；

⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min(8升8降)，重复两次，生理盐水重悬计数。取一定量细胞做流式检测分析；

⑷外周血单个核细胞分为三部分，其中两部分细胞冻存，另外两部分细胞用于直接培养，分别按照NK体外扩增培养方案及DC-CIK体外扩增培养方案培养；

⑸冻存保护剂以自体血清(10-20％)，人血白蛋白(4-8％)，培养所用培养基(44-73％)，DMSO(5-10％)，海藻糖(1-5％)，β-葡聚糖(1-5％)及羟乙基淀粉(6-8％)为原料进行复配；

⑹按照经典的冷冻技术对PBMC细胞进行冻存，改变冻存液配方，细胞复苏后状态与冻存前差异不明显，培养NK和CIK细胞得到的数目和表型也基本上与冻存前相当。

其中：图1为单个核细胞冻存前后培养NK细胞的差异(图1-A冻存前，图1-B冻存180天)；

其中：图2为单个核细胞冻存前后培养CIK细胞的差异(图2-A冻存前图2-B冻存180天)。

Claims (1)

1.一种免疫细胞高活率冻存方法，其特征在于：步骤如下：

⑴将外周血离心800g，10min，离心采用8升4降的方式，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min，离心采用8升8降的方式，取上清作为自体血清；

⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4，离心600g，40min，离心的方式1升0降的方式；

⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min，离心采用8升8降的方式，重复两次，生理盐水重悬计数；

⑷外周血单个核细胞分为三部分，其中两部分细胞冻存，另外两部分细胞用于直接培养，分别按照NK体外扩增培养方案及DC-CIK体外扩增培养方案培养；

⑸冻存保护剂以下列体积百分比为原料进行复配：

⑹采用上述冻存保护剂对PBMC细胞进行冻存。