CN108990962A - 一种细胞保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞保护剂，该细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。本发明还提供了上述细胞保护剂的制备方法和应用。本发明将细胞保护剂与血液按照一定的比例混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响血液中淋巴细胞的活性。为血液样本的保存和运输提供了方便。

Description

一种细胞保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种保护血液中T淋巴细胞活性的细胞保护剂及其制备方法和应用。
技术背景
目前，市面上加入静脉血中的抗凝剂一般为复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素。为了保证淋巴细胞的活力，加入复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素的抗凝血必须在6小时之内使用。抗凝血的保存时间如果超过10小时，其中的淋巴细胞会部分或者全部死亡，无法进行后续的实验或检测。所以需要开发一种新的细胞保护剂，在血液离体后，保护血液中的淋巴细胞的活力，以为血液的保存及运输提供方便。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种保护血液中T淋巴细胞活性的细胞保护剂及其制备方法和应用。
为了达成上述的目的，本发明提供了一种新的细胞保护剂。该保护剂包括缓冲液、盐类、糖类、氨基酸等。其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，盐类为氯化钠，糖类为葡萄糖和蔗糖，氨基酸为丙氨酰谷氨酰胺。将该保护剂与全血以一定的比例混合后，在5～25℃条件下，全血样本可以保存或运输48小时而不影响淋巴细胞的活性。
本发明采用以下技术方案：
一种细胞保护剂，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
如上所述的细胞保护剂，优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～20g/L的葡萄糖，终浓度为10～20g/L的蔗糖，终浓度为1～10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
如上所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为20g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为5g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
如上所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂的pH值为7.1-7.5。
一种上述细胞保护剂的制备方法，包括以下步骤：
用超纯水配制上述终浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在该三羟甲基氨基甲烷缓冲液中分别加入上述终浓度的氯化钠、葡萄糖、蔗糖、丙氨酰谷氨酰胺，然后用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5，得到所述细胞保护剂。
一种上述细胞保护剂在用于保护血液样本中T淋巴细胞活性中的应用。
如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:10-1:100。
如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:100。
如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存温度为5～25℃。
如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存和运输时间长达48小时。
本发明具有与以下有益效果：
本发明配制的细胞保护剂易于保存且具有较长的货架期，配制好的细胞保护剂在室温下可以保存1年。
本发明配制的细胞保护剂与血液样本混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响血液中淋巴细胞的活性，温度范围较宽，保存时间较长，为血液样本的运输提供了方便。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定的，不能以此限定本发明的保护范围。
以下所用的市售试剂盒为市售的γ-干扰素检测试剂盒，该试剂盒的校准品需经过γ-IFN国际标准品校准。
以下试剂或材料，除非特殊说明，均为市售。
实施例1
1.细胞保护剂的配制
用超纯水分别配制10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L和100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述4种缓冲液中分别加入9g/L的氯化钠，20g/L的葡萄糖，10g/L的蔗糖，10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。得到细胞保护剂1-4号。
2.实验设计
2.1采用肝素锂抗凝管采集5例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成5份，上述4种细胞保护剂分别与每份血以1:50的体积比例混合，预留一份血不加入保护剂，作为对照组。
2.2将5份血液在室温下放置或者运输48小时后，分别取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素，可于Sigma公司购买)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.3分别将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。
2.4按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤如下：
2.4.1标准曲线：使用校准品稀释液将γ-干扰素校准品(经国际标准品校准正)稀释成国际标准浓度为4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.5IU/mL、0.25IU/mL共6个稀释浓度。各取100μL，按顺序加入板孔中，平行做两孔。
2.4.2加样：每孔加入50μl IGRA稀释液，再加入50μL待检血浆样品，4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.5IU/mL、0.25IU/mL校准品各2孔，100μl/孔，轻微震荡混匀。
2.4.3温育：在37℃的温箱中温育1小时。
2.4.4洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复3次。
2.4.5加二抗：每孔加入50μl IGRA生物素抗体(主要成分为生物素标记的抗人γ-干扰素单克隆抗体，可使用市售相关材料及生物学常用的稀释液，将其稀释到标准曲线最高浓度点OD值不低于1.5)。
2.4.6温育：在37℃的温箱中温育30分钟。
2.4.7洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复3次。
2.4.8加酶：每孔加入100μl稀释后的IGRA酶复合物(主要成分为亲和素标记的辣根过氧化物酶，可使用市售相关材料及生物学常用的稀释液，将其稀释到标准曲线最高浓度点OD值不低于1.5)。
2.4.9温育：在37℃的温箱中避光温育30分钟。
2.4.10洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复5次。
2.4.11显色：显色剂临用前配制，取等体积的显色剂A液(其为酶联检测的商业化试剂，主要成分为过氧化氢)与显色剂B液(其为酶联检测的商业化试剂，主要成分为四甲基联苯胺盐酸)于15ml试管中混合混匀，然后迅速向每孔加入100μl。
2.4.12温育：在37℃的温箱中避光温育15分钟。
2.4.13终止：按显色的顺序和速度，向每孔中加入50μl的终止液(主要成分为稀释后的硫酸，一般浓度不超过10wt％)。
2.4.14测定：终止液加入后5分钟内用酶标仪读取450nm(以630nm为参比)处的OD值。
3.实验结果
检测结果如表1所示。
表1 1-4号保护剂
由上述表1的结果可知，当三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为20mmol/L时，保护剂效果最好，不加保护剂时，血样检测的浓度值会降低。这说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有一定的保护作用；不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。
实施例2
1.细胞保护剂的配制
用超纯水配制20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述缓冲液中加入9g/L的氯化钠，10g/L的蔗糖，10g/L的丙氨酰谷氨酰胺，再分别加入10g/L、20g/L、30g/L、40g/L的葡萄糖，用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。得到保护剂5-8号。
2.实验设计
2.1采用肝素锂抗凝管采集5例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成5份，上述4种细胞保护剂分别与每份血以1:50的体积比例混合，预留一份血不加入保护剂，作为对照组。
2.2将5份血液在室温下放置或者运输48小时后，分别取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.3分别将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。
2.4按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤同实施例1中的2.4.1～2.4.14。
3.实验结果
检测结果如表2所示。
表2 5-8号保护剂
由上述表2的结果可知，当葡萄糖的浓度为20g/L时，保护剂效果最好，不加保护剂时，血样检测的浓度值会降低。这说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有一定的保护作用；不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。
实施例3
1.细胞保护剂的配制
用超纯水配制20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述缓冲液中加入9g/L的氯化钠，20g/L的葡萄糖，10g/L的蔗糖，再分别加入1g/L、5g/L、10g/L的丙氨酰谷氨酰胺，用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。得到保护剂9-11号。
2.实验设计
2.1采用肝素锂抗凝管采集5例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成4份，上述3种保护剂分别与每份血以1:50的体积比例混合，预留一份血不加入保护剂，作为对照组。
2.2将5份血液在室温下放置或者运输48小时后，取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.3将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。
2.4按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤同实施例1中的2.4.1～2.4.14。
3.实验结果
检测结果如表3所示。
表3 9-11号保护剂
由上述表3的结果可知，当葡萄糖的浓度为5g/L时，保护剂效果最好，不加保护剂时，血样检测的浓度值会降低。这说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有一定的保护作用；不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。
实施例4
1.细胞保护剂的配制
用超纯水配制20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述缓冲液中加入9g/L的氯化钠，20g/L的葡萄糖，10g/L的蔗糖，5g/L的丙氨酰谷氨酰胺，用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。
实验设计
2.1采用肝素锂抗凝管采集5例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成4份，上述保护剂分别与每份血以1:50，1:100，1:200的体积比例混合，预留一份血不加入保护剂，作为对照组。
2.2将上述血液在室温下放置或者运输48小时后，分别取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.3分别将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。
2.4按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤同实施例1中的2.4.1～2.4.14。
3.实验结果
检测结果如表4所示。
表4保护剂与血样的体积混合比例
由上述表4的结果可知，当保护剂：血样为1:100的体积比例时，保护剂保护效果最好，不加保护剂时，血样检测的浓度值会降低。说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有一定的保护作用。不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。
实施例5
1.细胞保护剂的配制
用超纯水配制20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述缓冲液中加入9g/L的氯化钠，20g/L的葡萄糖，10g/L的蔗糖，5g/L的丙氨酰谷氨酰胺，用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。
2.实验设计
2.1采用肝素锂抗凝管采集10例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成3份，上述保护剂分别与每份血以1:100的体积比例混合，预留两份血不加入保护剂，作为对照组。
2.2将上述预留的两份血液，其中一份不运输，直接将血液加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.3将加入保护剂的血液和另一份不加保护剂的血液在室温下放置或者运输48小时后，取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入阳性刺激剂，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。
2.4分别将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。
2.5按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤同实施例1中的2.4.1～2.4.14。
3.实验结果
检测结果如表5所示。
表5血样检测结果
由上述表5的结果可知，不加保护剂运输48h后，与当天刺激的结果相比较，血样检测的浓度值下降幅度较大；加入保护剂运输48h后，与当天刺激的结果相比较，浓度值下降幅度较小。这说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有较好的保护作用；不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
2.如权利要求1所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～20g/L的葡萄糖，终浓度为10～20g/L的蔗糖，终浓度为1～10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
3.如权利要求2所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为20g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为5g/L的丙氨酰谷氨酰胺。
4.如权利要求3所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂的pH值为7.1-7.5。
5.一种权利要求1-4任一项所述的细胞保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用超纯水配制上述终浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在该三羟甲基氨基甲烷缓冲液中分别加入上述终浓度的氯化钠、葡萄糖、蔗糖、丙氨酰谷氨酰胺，然后用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5，得到所述细胞保护剂。
6.一种权利要求1-4任一项所述的细胞保护剂在用于保护血液样本中T淋巴细胞活性中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:10-1:100。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:100。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存温度为5～25℃。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存和运输时间长达48小时。
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