JP4565112B2 - 毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤 - Google Patents
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Description
組織において発現していることが知られている。マウス及びヒトにおいては、FGFは22種
類の異なる遺伝子によってコードされる(非特許文献1)。特に、FGF-1、FGF-2、FGF-5
、FGF-7、FGF-10、FGF-13及びFGF-22は、皮膚細胞及び毛包細胞において発現し、毛髪成
長及び皮膚再生を制御していることが報告されている(非特許文献2〜17参照)。
ている。しかしながら、非特許文献13に開示されているように、FGF-5遺伝子産物は、
毛包細胞を退行期に誘導する機能を有することが知られている。よって、特許文献1に開示されているFGF-5を用いて、毛髪の成長を促進したり、禿頭症を治療するといったこと
は現実的ではない。なお、特許文献1の明細書を詳細に検討しても、FGF-5が毛髪の成長
を促進するといった作用があることを何ら実証していない。
要な役割を担っていることが示唆される。しかしながら、毛包の成長を促進する作用、それに伴う毛髪成長促進作用及び発毛促進作用に対して、FGF群がどのように関与するのか
といった知見は依然として不明のままである。
伝子を特定するために、FGFファミリーに属する22遺伝子全ての発現を、毛成長周期の各
ステージ(休止期、成長期及び退行期)で網羅的に検索したところ、これまで皮膚でその機能の知られていなかったFGF-18遺伝子の発現レベルが高いことを発見した。また、本発明者等は、FGF-18に関する詳細な機能解析を行ったところ、FGF-18には毛包成長の司令塔と考えられる毛乳頭細胞の増殖を促進する機能があることを見出した。そして、本発明者らは、このような新規な知見に基づいて、FGF-18が毛成長を促進することを推定し、それを実験的に確認することによって、本発明を完成するに至った。
(1) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはFGF-18の全長又は部分ペプチドをコード
するcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長促進剤。
(2) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはFGF-18の全長又は部分ペプチドをコード
するcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する発毛促進剤。
(3) FGF-18の全長又は部分ペプチド若しくはFGF-18の全長又は部分ペプチドをコード
するcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する脱毛症治療剤。
上記(1)〜(3)の剤は、他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むも
のであっても良い。
ーに属するFGF-18以外の因子、トランスフォーミング増殖因子-α、トランスフォーミン
グ増殖因子-β、トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリーに属する因子、インシュリン様増殖因子-I及びインシュリン様増殖因子-IIを挙げることができる。上記(1)〜(3)の剤は、これら他のタンパク質増殖因子のうち一種を含むものであっても良いが、
複数種を含むものであっても良い。またこれらに限定されるものではない。
できるがこれらに限定されるものではない。上記(1)〜(3)の剤は、これら毛髪成長促進剤のうち一種を含むものであっても良いが、複数種を含むものであっても良い。
(4) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又は実
験動物におけるFGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF-18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を毛髪成長剤の候補とする、スクリーニング方法。
(5) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又は実
験動物におけるFGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF-18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を発毛促進剤の候補とする、スクリーニング方法。
(6) 被検物質を動物培養細胞又は実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又は実
験動物におけるFGF-18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF-18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を脱毛症治療剤の候補とする、スクリーニング方法。
行期は20〜21日目の期間である。また、脱毛後、21〜22日目に休止期に入ることが知られている。成長期においては、新しい毛の成長(伸長)が活発化するとともに、皮膚内では毛包の成長が活発化して、その底部が皮膚の下部近傍に到達する。一方、休止期において
は、毛包は皮膚の浅いところに小さい状態で存在する。また、成長期と休止期とでは皮膚の厚さも全く異なる。さらに成長期の初期にはメラニン色素が合成され、皮膚が青 くな
っているのを視認することができる。したがって、皮膚の外側から青い色を見て毛包の成長周期の進行を評価することもできる。また、成長期に皮膚を切開して裏側から見ると、メラニン色素を多量に含んだ毛包が高い密度で並ぶこととなるため、皮膚の裏側が黒なっているのを視認することができる。これに対して休止期においては、皮膚の裏側は白いままであることを視認することができる。例えば、マウスの実験系では、生後7〜8週齢のマウスの背中の毛は全て休止期にあり、また、生えている毛を抜くことにより、同調して成長期が開始する。
本発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤に含まれるFGF-18は、例えば配列番号2に示すアミノ酸配列からなるヒト由来のFGF-18を使用することができる。また、使用可能なFGF-18としては、ヒト由来に限定されず、例えば、他の哺乳動物由来のFGF-18を使用することができる。他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ニワトリ、七面鳥、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギ等を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、配列番号1に示すヒト由来FGF-18の塩基配列に基づいて作製したプローブを定法に従って用いれば、ヒトを除く他の哺乳動物からFGF-18をコードする遺伝子を単離することができる。
されたとしても、毛包の成長促進作用を欠損することなく本願におけるFGF-18として使用することができる。
できる。なお、配列番号3、4及び5に示すアミノ酸配列においても、上記の範囲に相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、本発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤の有効成分として使用することができる。さらに、FGF-18の部分断片としては、FGF-18の本発明における活性を発揮するために必要なものなら、1
〜207番目のアミノ酸配列のうちいずれの部分からなる長さ3-50アミノ酸程度のペプチド
であっても良い。ただし、この数値範囲を超えるアミノ酸からなるペプチドであっても、
本発明におけるFGF-18の部分断片に含まれる。
鞘細胞との複合培養系を用いて調べることで確認することができる。また、休止期にある実験動物に対してFGF-18の全長及び部分ペプチドを皮下投与し、毛包の成長を観察することによって、FGF-18の全長及び部分ペプチドによる毛包成長促進作用を確認することができる。
上記「1.FGF-18」で説明したFGF-18全長ポリペプチド及び/又は部分ポリペプチドは
、例えば、皮膚適用向けに適合化された溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー又はエアゾールといった形態で製剤化され、毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤として提供される。
進効果を増加又は増強させる増殖因子としては特に限定されず、表皮増殖因子(EGF)、
血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α)、トランス
フォーミング増殖因子-β(TGF-β)、インシュリン様増殖因子(IGF)及び血管内皮細胞増殖因子の群を挙げることができる(フアン・ブラント及びクラウスナー,バイオテクノロジー,第6巻,第25-30頁,1988年)。
、hTGF-β及びこれらの製造方法については、米国特許第4,774,228号、米国特許第4,774,322号、DNAの第7巻,第1-8頁(1988年)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリーの第262巻,第12127-12131頁(1987年)に記載されており、参照することができる。
欧州特許出願公開第264,074号、欧州特許出願公開第219,814号に記載されており、参照することができる。IGF-II、hIGF-II及び及びこれらの製造方法については、欧州特許出願
公開第280,460号に記載されており、参照することができる。
有する発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。すなわち、本発明に係る毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤は、上記発現ベクターを用いた遺伝子治療に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞において発現を実現するためのプロモーターなどの配列を備えるが、特に限定されるものではない。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが利用可能であるが、これらに限定されない。
組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス(無毒化されたもの)を患者に感染させる。患者体内ではFGF-18の全長ポリペプチド及び/又は部分ポリペプチドが産生
され、毛包の成長を促進することができる。
変異TR4をコードするDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクシ
ョン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチ
ン法、リポソーム法が好ましい。
出し体外でDNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボがある(日経サイエ
ンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48(1994)、実験医学増刊,12(15)(1994))。
FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを用いて、再生された皮膚組織における毛髪のイ
ンビトロ再生系を構築することができる。ここで、皮膚組織とは、分離した皮膚幹細胞を培養することによって得られる、皮膚の各種の細胞からなる組織を意味する。皮膚の各種の細胞とは、特に限定されないが、皮膚表皮の上皮細胞、皮膚上皮基底層の細胞、毛胞を構成する各種細胞、真皮の細胞及び脂肪細胞等を意味する。皮膚組織を再生する際に使用される細胞は、異種細胞、同種他家細胞及び同種自家細胞のいずれであっても良い。
それぞれに対応するリガンド増殖因子を培地中に加えることにより、異なった分化方向を有する細胞を選択的に増幅することができる。異なった分化方向を有する細胞を選択的に増幅した後、皮膚組織を作製することができる。
ドを適当な時期に添加することによって、再生した皮膚組織において毛包の成長を促進することができ、当該皮膚組織における毛髪の成長或いは発毛を促進することができる。さらに、皮膚組織の作製方法において、培地中にFGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを適
当な時期に添加することによって、皮膚細胞の増殖を促進することができ、皮膚組織全体の体積の増大を図ることができる。
FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを用いて、毛包を成長させる培養法を構築するこ
とができる。毛包は、例えば、引き抜いた毛髪から調製された成長期ヒト毛包を使用することができる。毛包は、許容される洗浄用溶液、緩衝液又は培地で洗浄される。許容される洗浄用溶液としては、特に限定されず、蒸留水、生理塩水等を使用することができ、許容される緩衝液としては、特に限定されず、リン酸緩衝液、リン酸緩衝塩水(PBS)、リ
ン酸緩衝塩水グルコース、トリスHCl等を使用することができる。培地としては、特に限
定されず、イーグル最小必須培地、イーグル基本培地及びダルベツコ修正イーグル培地等を使用することができるが、ダルベツコ修正イーグル培地が好ましい。洗浄された毛包は約1〜約10毛包/ウェルで細胞培養プレートにおかれる。
補充された培地で培養される。選択される培地はダルベツコ修正イーグル培地が好ましい。毛包は、約5%のCO2及び約95%空気雰囲気下において37℃で約1〜約5日間培養される。このとき、FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドを、例えば約0.01〜約1.0μgFGF/ml/日で添加される。また、ヘパリンは各ウェルに約3:1=ヘパリン:FGFで加えられる。ヒト血
清アルブミン(HSA)は、すべてのウェルに約10:1=HSA:FGFで加えられる。細胞刺激は最終24時間のインキユベ−トにおいて、3H-チミジン約5μCi、約0.14μg/ウェルの添加後、冷チミジン約14.2μg/ウェルの添加により、FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドの作
用を調べることができる。
本発明に係るスクリーニング方法は、FGF-18による毛包の成長促進作用を介して、毛髪成長促進、発毛促進或いは脱毛症治療といった機能を有する物質をスクリーニンする方法である。
物内におけるFGF-18遺伝子のmRNA量を定量的逆転写PCR法やノーザンブロット法等により
解析するといった方法によりモニターすることができる。
用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー又はエアゾールといった非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
本実施例では、マウスの皮膚におけるFGFファミリーに属する遺伝子の発現プロファイ
ルを検討した。
<材料と方法>
マウスおよび皮膚サンプルの調製
毛周期の実験用として7週齢のC3H/HeN雄マウス(Tlr4+/+)25匹を日本エスエルシー株式会社から入手し、標準的な実験動物用飼料および水を任意に摂取させて飼育した。1週
間馴化させた後、マウス5匹を安楽死させ、背部毛を短く刈り、皮膚サンプルを分離し、
「0日(休止期)」サンプルとした。残りのマウス20匹については、ワックス、テープ又
は脱毛剤を用いずに、手袋を装着して指によって背部毛幹を優しく抜いて、毛周期の成長期を誘発した。そして毛包周期の時期、すなわち脱毛後8日(成長期V)、18日(成長期VI)、20日(退行期IV)及び22日(休止期)を選択し、マウスを安楽死させ、毛を短く刈り、全層皮膚サンプル(表皮、毛幹、毛包、皮脂腺、皮下脂肪、皮膚筋及び血管を含む)を脱毛した部位から採取した。全層皮膚サンプルは、後述するmRNA分離、in situハイブリ
ダイゼーション及び免疫組織染色に使用した。なお、これらの実験は基本的に同一試験計画によって3回実施して結果の再現性を確証した。
液体窒素で凍結した。また、免疫組織染色用の皮膚サンプルは、最初に10%ホルムアルデヒドで室温24時間固定し、標準的な方法によってパラフィンで包理した。
トータルRNAは、上述したように準備した皮膚サンプルからIsogen(株式会社ニッポン
ジーン)を製造業者の取扱説明書に従って使用して調製した。次に、Oligotex-dT30 Super mRNA精製キット(タカラバイオ株式会社)を用いて、トータルRNAからmRNAを精製した
。精製したmRNAサンプル(100ng)を鋳型とし、プライマとしてOligo(dT)12-18を用いたSuperScript II(Gibco BRL)によって全量20mlで逆転写反応を行った。
各FGFのmRNA量をリアルタイムPCRによって分析できるように、特異的なプライマセットを設計した(表1)。各FGFのmRNAを定量する際、コピー数対照としてcDNAフラグメント
が必要となる。このcDNAフラグメントをクローニングする際、同じプライマセットを使用した。
鋳型とした。PCR増幅には、Pfuポリメラーゼ(Stratagene社製)を製造業者の取扱説明書に従って使用した。そして、PCR増幅反応混合液の一部を2.0%アガロースゲルを用いた電気泳動に使用し、増殖産物の大きさを確証した。また、各FGFに相当するそれぞれのcDNA
をクローニングするため、PCR産物をpCR-BluntII-TOPOベクター(Invitrogen社製)に連
結してE.coliの形質転換に使用した。リコンビナントプラスミドのヌクレオチド配列はBigDyeターミネータサイクルシークエンシングキット及びABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いて確認した。
リアルタイムPCR増幅は、1:10に希釈したRT混合物2mlを鋳型として用い、Light Cycler(Roche Diagnostics社製)によって実施した。各FGFの絶対コピー数を得るため、各FGF
に対応するプラスミッドDNAをコピー数対照としてそれぞれ使用した。Light Cyclerによ
って増幅したDNAの定量には、Cyber Greenを使用した。特異性の高いプライマとともに、最適なアニーリング温度、伸長時間、および取得温度でLight Cycler反応を実施した。プライマの特異性はバックグラウンド用の配列としてマウスの全cDNAを用いて最初に確証した。プライマの特異性および反応条件はプラスミドDNAに増幅フラグメントをクローニン
グすることによって、さらに実験的に実証してこれらの配列を検証した。
よって既知サイズのDNAフラグメントが正確に増幅されていることが確証された。この実
験系によって個別遺伝子の特異的な定量が保証される。mRNAの評価では、Light Cyclerによる同一実験に標的cDNA配列を有するDNAの連続希釈サンプルを含め、これらの測定から
個別サンプルと関連するmRNAの絶対コピー数を算出した。またハウスキーピング遺伝子のコピー数を同じ方法で評価してこれらの量が予測範囲内であることを確認した(例えば、b-アクチンmRNAコピー数は8日目のサンプルが2×106コピー/ng mRNAであることが測定さ
れた)。
FGF及びFGFRファミリメンバの発現プロファイル
毛周期の指示時期における各FGFおよびFGFRのmRNA発現量をそれぞれ図1A、図1B及び図2に示した。さらにすべてのmRNAの中で最も高い発現量およびその毛周期での時期を表2にまとめて示す。
であることが判明した。この群では、FGF-5及びFGF-22のmRNA量が毛周期全体を通して同
様な変化を示し、成長期VIにおける発現量が最も高かった(18日目;図1A)。FGF-7及び-10(又は、それぞれ角化細胞増殖因子(KGF)-1及びKGF-2)のmRNA量は、成長期Vで最も
高かった(8日目;図1A)。FGF-1のmRNA(又は酸性FGF)量は比較的一定しており、休止
期で最大量を示した(0日目;図1A)。これらFGFの最大発現量はFGF-7及び-18などで1×104コピー/ng mRNAである。このmRNA発現量は豊富な構造タンパク質の1つであるβ-アクチン(成長期Vで5.6×105コピー/ng mRNA;表2)の約60分の1だった。
、-2、-5、-7、-10、-13及び-22に加えて、FGF-18 mRNAも高い量で発現しており、FGF-18
mRNA量が休止期にピークを示す(0日目及び22日目;図1A)ことが明らかになった。また、図1Aからは、FGF-18発現量が、十分研究されているFGF-2(又は塩基性FGF)及び他のFGFよりもほとんどの時期で高いことが明らかとなった。FGF-3、-6、-9、-11、-20及び-21
のmRNAも中程度発現された(図1B)が、FGF-4、-8、-14、-15及び-23のmRNA発現は毛周期のどの時期でもほとんどあるいは全く検出されなかった(<100コピー/ng mRNA;表2)。
い発現が成長期VI〜退行期(18日目及び20日目)に現れ、後者では成長期VI(18日目;図2)で最高だった。FGFR-2のmRNA発現量は、上皮細胞に特異的であるIIIbサブクラスも含
めてFGFR-1又は3のmRNAよりも少なく(図2)、FGFR-4のmRNA発現量は4種類の受容体の中
で最も低かった(図2)。
実施例1において、皮膚におけるFGF-18の発現が新規に明らかになったため、本実施例では、in situハイブリダイゼーションを用いてそのmRNAの分布を測定した。
<材料と方法>
in situハイブリダイゼーション
in situハイブリダイゼーション実験は、OCTで包理した凍結組織切片およびジゴキシゲニン標識リボプローブを用いて基本的に既に報告されている方法(Komminoth P: Digoxygenin as an alternative probe labeling for in situ hybriodization. Diag Mol Pathol 1:142-150, 1992参照)に従って実施した。
(Roche Applied Science社製)の存在下で、それぞれSP6及びT7のRNAポリメラーゼを使
用して合成した。ハイブリダイゼーション処理中はあらゆる手段を講じてRNA変性を避け
た。凍結組織は、クライオスタット(Microm社製、モデルHM500OM)を用いて10mmに切り
、直ちにMASでコートしたスライドグラス(松浪硝子株式会社製)にのせ、50℃で1時間乾燥させてから、乾燥剤とともに−80℃で保存した。ハイブリダイゼーション前に切片は4
%パラホルムアルデヒドを含むPBSで室温10分間固定してからPBSで5分間洗浄した。そし
て切片にプロテイナーゼK(2×TE中に0.01mg/ml)を37℃で5分間浸透させ、PBSですすい
でから再度4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで5分間固定し、PBSで5分間洗浄した。固
定した切片は0.1%DEPCを含むPBSで15分間2回浸漬し、PBSですすいだ。
加えた熱変性(70℃で10分間)プローブを用いて、45℃で16〜18時間実施した。ハイブリダイゼーション後、スライドを2×SSCを用いて45℃ですすぎ、そして2×SSCによって45℃で30分間2回洗浄し、さらに0.2×SSCによって45℃で20分間2回洗浄した。結合したリボプローブをアルカリホスファターゼと結合させた抗ジゴキシゲニン抗体(1:500、Roche Applied Science社製)を用いて検出した。可視化するため、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-1-リン酸(NBT/BCIP)を用いた比色反応を、BMパ
ープル(Roche Applied Science社製)を使用してシグナルが認められるまで暗所におい
て室温で行った。具体的には、脱毛後8日(成長期V)の切片サンプルについては24時間の比色反応、18日(成長期VI)の切片サンプルについては48時間の比色反応、20日(退行期IV)の切片サンプルについては24時間の比色反応、及び0日(休止期)の切片サンプルに
ついては96時間の比色反応を行った。
in situハイブリダイゼーションの結果を図3に示す。図3中、A及びBはアンチセンス
リボプローブを用いた結果を示し、C及びDはセンスプローブを用いた結果を示す。図3中のバーは100μmを意味する。図3に示すように、成長期における毛包では、FGF-18 mRNA
は実質的に毛包の内毛根鞘細胞のみで発現されることを認めた(図3A、B;紫色のシグナ
ル)。一方、センスプローブはシグナルを生じなかった(図3C、D)。
た。なお、休止期においては、β-アクチンmRNAでさえ非常に微弱にしか検出できないこ
とから、成長期と比較して休止期のin situハイブリダイゼーションは非常に困難であっ
た。そこで、本実施例では、0日(休止期)の切片サンプルに対するin situハイブリダイゼーションの比色反応を96時間といった長時間で行うことで、休止期のin situハイブリ
ダイゼーションを可能ならしめた。
本実施例では、FGF-18の皮膚における機能を評価するため、ヒト毛包外根鞘(ORS)細
胞、毛乳頭(HFDP)細胞、皮膚線維芽細胞(HDF細胞)及び表皮角化細胞(HEK細胞)ついて、FGF-18による細胞分裂促進効果を調べた。
DNA合成アッセイ
培養した最初のヒト皮膚線維芽細胞(新生児包皮由来;東洋紡績株式会社製)は、HDF
生育培地(生育補助成分を加えたFBM(線維芽細胞基礎培地);東洋紡績株式会社製)で
継代培養して2継代以内に[3H]-チミジン取り込みアッセイに使用した。
ゲンコートプレート(Sumilon社製)に、密度が1×104細胞/ウェルで48ウェル(HDF細胞
)又は1×104細胞/ウェルで24ウェル(HFDP細胞)に分注してHDF培地で37℃に維持した。次の日にHDF生育培地を、0.5%チャコール吸着子ウシ血清を含むFBMで置き換え、細胞を48時間(HDF細胞)又は96時間(HFDP細胞)培養してから所定の濃度のFGFで刺激した。FGF
を加えてから18時間後(HDF細胞)又は8時間後(HFDP細胞)に[3H]-チミジン(1mCi/ウェル;Moravek Biochemicals社製)を培地に加え、細胞をさらに8時間(HDF細胞)又は18時間(HFDP細胞)培養した。そして細胞を採取して、取り込まれた放射能量を計測した。
]-チミジン(1mCi/0.5ml;Moravek Biochemicals社製)を培地に加え、細胞をさらに8時間(HEK細胞)又は18時間(ORS細胞)培養した。そして細胞を採取して、取り込まれた放射能量を計測した。
DNA合成アッセイの結果を図4に示す。図4中、AはHFDP細胞(図中ではDPCと表記)を
用いたアッセイの結果を示し、BはORS細胞(図中ではORSCと表記)を用いたアッセイの結果を示し、CはHDF細胞(図中ではDFと表記)を用いたアッセイの結果を示し、DはHEK細胞(図中ではEKと表記)を用いたアッセイの結果を示している。図4から判るように、比較的高い濃度(100及び1000ng/ml)のFGF-18によって、HFDP細胞、HDF細胞及びHEK細胞においてDNA合成が誘導されていた(それぞれ図4A、4C及び4D)。このことは、HEK細胞でDNA
合成を刺激する(図4D)がHFDP細胞(図4A)及びHDF細胞(図4C)では非常に刺激が弱い
ことが十分特徴付けられている角化細胞マイトジェンであるFGF-7(KGF)と相違している。
あることが実証された。さらに、この結果から、FGF-18の全長及び/又は部分ペプチドは
、皮膚細胞の増殖、すなわち皮膚全体の体積の増大に促進的に作用することが実証された。
本実施例では、毛包に対するFGF-18のin vivoでの影響の特徴を調べるため、FGF-18の
投与による影響を毛周期の休止期にあるC3H/HeNマウスで試験した。
<材料と方法>
FGF-18活性のin vivo分析
FGF-18の毛包に対するin vivoでの影響の特徴を調べるため、毛成長が休止期のマウス
に組換えFGF-18を投与した。基本的な手順はMcElweeらによって開発された方法に従って
、in vivoにおけるマクロファージ刺激性タンパク質の活性を実証した(McElwee KJ, Huth A, Kissling S, Hoffman R; Macrophage-stimulating protein promotes hair growth ex vivo and induces anagen from telogen stage hair follicles in vivo. J Invest Dermatol 123:34-40, 2004参照)。
包装容量)のセファロース4Bビーズ及び7.5mlのC3H/HeN血清と37℃で2時間混合してビー
ズに組換えFGF-18を吸着させた。また、組換えFGF-18を加えずに同一処理して得られたビーズを対照ビーズとした。50日齢のC3H/HeN雌マウス5匹に麻酔をかけ、背部毛をトリマによって優しく短く刈った。そしてFGF-18吸着ビーズ懸濁液を背部皮膚に皮下注射した(150ml/マウス、すなわち、マウス1匹あたり1μgのFGF-18)。マウスは飼料および水を任意
に摂取できるようにして飼育した。21日後にマウスに麻酔をかけて安楽死させた。背部皮膚を全層で切除し、内部表面を写真撮影してから皮膚をパラフィンで包理した。包理した皮膚サンプルはミクロトームで4μm厚の切片にしてヘマトキシリンで染色して顕微鏡で観察した。
結果を図5に示す。図5中、AはFGF-18吸着ビーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚
内部表面を撮影した写真であり、Bは写真A内の囲み枠を拡大した写真であり、CはFGF-18
吸着ビーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚切片を撮影した写真であり、Dは対照ビ
ーズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚内部表面を撮影した写真であり、Eは対照ビー
ズ懸濁液を投与したマウスにおける皮膚切片を撮影した写真である。なお、図5に示した写真C及びE内のバーはそれぞれ100μmを示している。
わたる成長が示された(図5の写真A及びB)。図5の写真A及びBは代表的な結果を示しているが、図5の写真A及びBにおいて黒色のスポットは成長期毛包を示している。さらに、図5の写真Cに示すように、皮膚切片の組織学的検査によってもマウスの成長期毛包における広範囲にわたる成長を確認することができた。なお、5匹のマウスのうち1匹はFGF-18吸着ビーズ懸濁液の投与によっても、試験期間中に明白な変化を示さなかった。
沈着は認められなかった。図5の写真Dに示すように、内部表面の検査からは、白色によって示されるように成長期毛包はほとんど又は全く示されなかった。図5の写真Eに示すよ
うに、このことは組織学的検査により確認することができた。
成長を促進できることがin vivoにおいて実証された。
正常な皮膚と全く同じように非常に厚くなっていた。この結果から、FGF-18の全長及び/
又は部分ペプチドは、皮膚細胞の増殖、すなわち皮膚全体の体積の増大に対しても、促進的に作用することが実証された。
Claims (15)
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドを有効成分として含有する毛髪成長促進剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項1記載の毛髪成長促進剤。
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドを有効成分として含有する発毛促進剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項3記載の発毛促進剤。
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドを有効成分として含有する脱毛症治療剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項5記載の脱毛症治療剤。
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドをコードするcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長促進剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項7記載の毛髪成長促進剤。
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドをコードするcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する発毛促進剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項9記載の発毛促進剤。
- FGF−18の全長又は配列番号2に示されるアミノ酸配列における55〜177番目の領域を含むFGF−18の部分ペプチドをコードするcDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する脱毛症治療剤。
- 他のタンパク質増殖因子及び/又は毛髪成長促進剤を更に含むことを特徴とする請求項11記載の脱毛症治療剤。
- 被検物質を動物培養細胞又はヒト以外の実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又はヒト以外の実験動物におけるFGF−18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF−18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を毛髪成長剤の候補とする、スクリーニング方法。
- 被検物質を動物培養細胞又はヒト以外の実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又はヒト以外の実験動物におけるFGF−18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF−18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を発毛促進剤の候補とする、スクリーニング方法。
- 被検物質を動物培養細胞又はヒト以外の実験動物に接触させる工程と、動物培養細胞又はヒト以外の実験動物におけるFGF−18遺伝子の発現をモニターする工程とを含み、FGF−18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を脱毛症治療剤の候補とする、スクリーニング方法。
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