JP2942817B2

JP2942817B2 - Ｆｇｆ−５類似体タンパク質およびそれを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JP2942817B2
Application number: JP9083302A
Authority: JP
Inventors: 亨今村; 修一岡; 和夫小沢; チエリ佐藤; 誓吾鈴木
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-17
Publication date: 1999-08-30
Anticipated expiration: 2017-03-17
Also published as: JPH09316096A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、線維芽成長因子−
５ [Fibroblast Growth Factor-5 (FGF-5)] タンパク質
をコードする遺伝子の代替的スプライスによって生じる
ｍＲＮＡがコードするＦＧＦ−５類似体タンパク質、な
らびにこれを有効成分とする医薬組成物、詳しくは頭髪
や体毛の発毛または育毛調節、脳神経系の栄養または機
能調節、および線維芽細胞等の増殖調節に有効な医薬組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、頭髪や体毛の発毛促進または抑
制、育毛に有効な成分のほとんどは、合成化合物または
植物や微生物など天然物中に存在する物質から動物実験
などによってこれらの活性を有するものをスクリーニン
グして取得されたものであった。しかしながら、これら
を有効成分とする発毛促進剤、発毛抑制剤、育毛剤は、
毛根部分の栄養環境が重要とする考え方から、局所の血
液循環や毛根の環境条件を改善または阻害することを企
図して主に開発されたものであり、動物の毛の産生メカ
ニズムの原理に着目したものではなかった。

【０００３】一方、線維芽成長因子−５ [Fibroblast G
rowth Factor-5 (FGF-5)] は、その生理的機能として、
まず線維芽細胞増殖促進活性および変異活性が知られて
いる。ＦＧＦ−５は、その遺伝子を恒常的発現プロモー
ターの調節下においてNIH3T3線維芽細胞に導入すること
により、その細胞をトランスフォームさせ、細胞増殖能
を変化させることが知られている。また、このトランス
フォームした細胞はＦＧＦ−５を培養上清中に分泌する
が、この培養上清は、他の線維芽細胞BALB／c3T3の増殖
活性を著しく促進する。また、大腸菌にＦＧＦ−５遺伝
子発現プラスミドを導入し発現させたＦＧＦ−５ポリペ
プチドも、同様にBALB／c3T3の増殖活性を著しく促進す
る。

【０００４】ＦＧＦ−５はまた、神経栄養因子としての
活性も知られており、骨格筋細胞で発現している。この
骨格筋細胞抽出物に含まれるＦＧＦ−５、また大腸菌に
ＦＧＦ−５遺伝子発現プラスミドを導入し発現させたＦ
ＧＦ−５はいずれも、培養運動神経の生存を著しく促進
することが知られている。この事実は、ＦＧＦ−５は運
動神経細胞の栄養因子であるとを強く示唆する。さら
に、ＦＧＦ−５はマウスおよびラットの脳においても発
現が認められており、脳神経初代培養細胞の実験から、
脳におけるコリン作動性およびセロトニン作動性神経細
胞の栄養因子として作用すると考えられている。

【０００５】このようにＦＧＦ−５は神経栄養因子とし
ての活性が知られてきており、その活性制御因子が注目
されるが、解明には至っていない。また、ＦＧＦ−５タ
ンパク質の生成については、ＦＧＦ−５タンパク質をコ
ードする遺伝子が、ｍＲＮＡとして転写され、スプライ
シングを経て成熟型ｍＲＮＡになる際に、エクソン１と
エクソン２、エクソン３が順次連結されてこれらが連続
した構造となることが知られている。すなわち、その翻
訳フレームは、エクソン１の中の翻訳開始コドンＡＴＧ
（メチオニンをコード）から始まり、エクソン２を経
て、エクソン３の中で終了コドンが出現するまで連続
し、結果としてヒトでは２６８アミノ酸からなるタンパ
ク質、マウスでは２６４アミノ酸からなるタンパク質を
作りだす [Zhan, X.ら、Mol. Cell. Biol., Vol.8, pp.
3487-3495(1988) ; Haub, O. ら、Proc. Natl. Acad.Sc
i., USA, Vol.87, pp.8022-8026 (1990)]。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、毛の
産生メカニズムに直接作用した発毛または育毛調節、脳
神経系の栄養または機能の調節、線維芽細胞の増殖調節
等、ＦＧＦ−５の生理的機能の制御、およびＦＧＦ−５
の他のＦＧＦファミリータンパク質およびその遺伝子産
物の種々の生理的機能の制御に有効な医薬組成物を提供
することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来知られていた
以外にもう一種ＦＧＦ−５のｍＲＮＡがあることに着目
し、これがコードするタンパク質がＦＧＦ−５の生理的
機能を制御するものであること、さらに、毛の産生メカ
ニズムの根本に作用して発毛または育毛を調節する作
用、脳神経系の栄養または機能を調節する作用を有する
ことを見出し、これを有効成分とする医薬組成物として
本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、成熟型ｍＲＮＡを産
する過程で起こるスプライシングの中でこれまで知られ
ていなかったもの（これを「ＦＧＦ−５遺伝子転写後代
替的スプライス」と称する）によって定義されるタンパ
ク質およびこれを有効成分とする医薬組成物に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の新規ＦＧＦ−５タンパク
質（以後、ＦＧＦ−５類似体タンパク質と称する）は、
ＦＧＦ−５タンパク質をコードする遺伝子がスプライシ
ングの際にエクソン１とエクソン３が直接結合して形成
された成熟型ｍＲＮＡをコードするものである。

【００１０】ＦＧＦ−５類似体タンパク質は、これまで
知られていたＦＧＦ−５タンパク質とはエクソン１のア
ミノ酸配列（ヒトでは１１８番目まで、マウスでは１１
６番目まで）と同一であるものの、エクソン３とつなが
ることによってフレームがずれ、ヒトでは１１９番目以
降、マウスでは１１７番目以降のアミノ酸配列がＦＧＦ
−５タンパク質のアミノ配列とは異なり、ヒトでは１２
３番目、マウスでは１２１番目のアミノ酸をコードした
直後に終了コドンが出現する。よって、ＦＧＦ−５類似
体タンパク質は、ＦＧＦ−５タンパク質の部分構造をそ
の分子内に有しながら、新規のペプチドが連結した構造
を有する。

【００１１】本発明のＦＧＦ−５類似体タンパク質は、
具体的には、ヒトでは実質的に配列番号１記載のアミノ
酸配列を有するタンパク質、マウスでは実質的に配列番
号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、前
者は配列番号３、後者は配列番号４に示されるＤＮＡ配
列によりそれぞれコードされる（図１および２）。ここ
で、「実質的に」とは、その機能を発揮する限りにおい
て、そのアミノ酸配列の一部に、付加、欠失、置換、修
飾があってもよい。

【００１２】本発明にいうＦＧＦ−５類似体タンパク質
は、配列表に記載されたｃＤＮＡが一次的に規定するタ
ンパク質に加えて、細胞から分泌される際にそのアミノ
末端に存するシグナルペプチドと呼ばれる分泌の為のペ
プチド配列が切断された形のタンパク質を含む。すなわ
ち、組み換え体その他の形で本発明の医薬組成物の有効
成分として含有させるＦＧＦ−５類似体タンパク質は、
初めからシグナルペプチドを欠損する形で製造してもそ
の有用性には変化がない。

【００１３】以下、本発明のＦＧＦ−５類似体タンパク
質の調製方法を具体的に述べる。まず、動物脳組織より
抽出したＲＮＡを、ランダムヘキサオリゴヌクレオチド
をプライマーとして逆転写し、これをＰＣＲ反応によっ
て増幅する。その際プライマーとしてはＦＧＦ−５のオ
ープンリーディングフレームを増幅することができるオ
リゴヌクレオチドを用いると、既知のＦＧＦ−５タンパ
ク質に相当する大きさのＤＮＡフラグメントとともに、
本発明のＦＧＦ−５タンパク質類似体に相当する大きさ
のＤＮＡフラグメントを生じる。前者と後者をゲル電気
泳動によって分離後、ゲルから切り出し、クローニング
ベクターのマルチクローニングサイトに組み込むこと
で、プラスミドが得られる。

【００１４】ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、宿
主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用する
ことができるが、例えば大腸菌由来のpBR322、pUC18 、
およびこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げること
ができる。プラスミドに組み込む方法としては、例えば
T.Maniatisら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory, p. 239 (1982) に記載の方法などが挙げ
られる。

【００１５】クローン化された遺伝子は、発現に適した
ベクター中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。ベクターとしては、上記の大
腸菌由来のプラスミド(pBR322 、pBR325、pUC12 、pUC1
3 、pET-3)、枯草菌由来のプラスミド(pUB110 、pTP5、
pC194)、酵母由来のプラスミド(pSH19、pSH15)由来のプ
ラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファー
ジやこの誘導体およびレトロウイルス、ワクシニアウイ
ルスなどの動物ウイルス、あるいは昆虫ウイルスなどが
挙げられる。

【００１６】該遺伝子はその5'末端に翻訳開始コドンと
してのATG を有し、また3'末端には翻訳終始コドンとし
てのTAA 、TGA またはTAG を有してもよい。さらに該遺
伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続す
る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子
の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであ
ればいかなるものでもよい。形質転換する宿主が大腸菌
である場合には、trpプロモーター、lac プロモータ
ー、rec A プロモーター、λPLプロモーター、lpp プロ
モーター、T7プロモーターなどが、宿主が枯草菌である
場合には、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penP
プロモーターなどが、宿主が酵母である場合には、PHO5
プロモーター、PGK プロモーター、GAP プロモーター、
ADH プロモーターなどが用いられる。また、宿主が動物
細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーターが用いられる。

【００１７】このようにして構築されたＦＧＦ−５類似
体タンパク質をコードする塩基配列を有する組み換えＤ
ＮＡを含むベクターを用いて、該ベクターを保持する形
質転換体を製造する。

【００１８】宿主としては、大腸菌 [例えばBL21, BL21
(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE]、枯草菌 (例
えばBacillus subtilis DB105)、酵母 (例えばPichia p
astoris, Saccharomyces cerevisiae)、動物細胞（例え
ばCOS cell, CHO cell, BHKcell, NIH3T3 cell, BALB/c
3T3 cell, HUVE cell, LEII cell)、昆虫細胞などが挙
げられる。

【００１９】上記の形質転換は、それぞれの宿主につい
て一般的に行われている方法で行う。または一般的でな
くとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が
大腸菌ならばカルシウム法その他の方法により作成した
コンピータント細胞に組み換えＤＮＡを含むベクターを
温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法によ
り導入する。宿主が酵母であればリチウム法その他の方
法により作成したコンピータント細胞に組み換えＤＮＡ
を含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポ
レーション法により導入する。宿主が動物細胞であれ
ば、増殖期等の細胞に組み換えＤＮＡを含むベクターを
リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレク
トロポレーション法により導入する。

【００２０】このようにして得られた形質転換体を培地
に培養することにより、ＦＧＦ−５類似体タンパク質を
産生させる。形質転換体を培養する場合、培養に使用さ
れる培地としては、それぞれの宿主について一般的に用
いられているものを用いる。または一般的でなくとも適
用可能な培地ならば良い。例としては、宿主が大腸菌な
らばＬＢ培地などを用いる。宿主が酵母であればＹＰＤ
培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Dulbecc
o's MEMに動物血清を加えたものなどを用いる。培養
は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条
件で行う。また一般的でなくとも適用可能な条件ならば
よい。例としては、宿主が大腸菌ならば約30〜37℃で、
約3 〜24時間行い、必要により通気や攪拌を加えること
ができる。宿主が酵母であれば約25〜37℃で、約12時間
〜2 週間行い、必要により通気や攪拌を加えることがで
きる。宿主が動物細胞であれば約32〜37℃で、5% CO₂、
100%湿度の条件で約24時間〜2 週間行い、必要により気
相の条件を変えたり攪拌を加えることができる。

【００２１】培養後、培養菌体あるいは細胞をホモジェ
ナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび
／または凍結融解によって菌体または細胞を破壊し、菌
体外にＦＧＦ−５類似体タンパク質を溶出させ、可溶性
の画分から該タンパク質を得ることができる。また、目
的のタンパク質が不溶性画分に含まれる場合は菌体また
は細胞を破壊後、遠心分離により不溶性画分を回収し、
塩酸グアニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性に
して回収する方法も用いうる。このほか塩酸グアニジン
などのタンパク質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体
あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のタンパク質を溶
出させる方法もある。

【００２２】上記上澄み液からＦＧＦ−５類似体タンパ
ク質を精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み
合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾
過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気
泳動などがある。さらに、多くのＦＧＦ−５類似体タン
パク質については、ヘパリンセファロースを担体とした
アフィニティークロマトグラフィー法が適用できる。

【００２３】このようにして得られた標品はＦＧＦ−５
類似体タンパク質の活性が損なわれない限りにおいて透
析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さ
らに、担体として血清アルブミンなどを添加して保存す
ることは、標品の容器への吸着を防ぐのに有効である。

【００２４】また、精製過程、または保存過程での微量
の還元剤の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適であ
る。還元剤としては、β−メルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、グルタチンなどが用いられる。

【００２５】本発明のＦＧＦ−５類似体タンパク質は、
毛の産生メカニズムを調節する作用、具体的には頭髪な
どの発毛を促進または抑制する作用、毛の成長を促進ま
たは抑制する作用を有する。また、本発明のＦＧＦ−５
類似体タンパク質は、脳神経系の栄養または機能を調節
する機能を有する。

【００２６】さらに、本発明のＦＧＦ−５類似体タンパ
ク質は、上記作用のほかＦＧＦ−５の生理的機能を調節
する作用を有する。ＦＧＦ−５の生理的機能とは、具体
的には、線維芽細胞、血管内皮細胞、筋芽細胞、軟骨細
胞、骨芽細胞、グリア細胞の増殖や分化を促進または抑
制すること、またはこれらの細胞の機能を調節すること
をいう。

【００２７】ＦＧＦ−５の類似体タンパク質の有する上
記機能により、該タンパク質は、各種疾病、具体的に
は、線維芽細胞腫、血管腫、骨芽腫、神経細胞死、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、神経芽腫、健忘症、痴
呆症、心筋梗塞の予防・治療に有用である。

【００２８】上記のようにして得られたＦＧＦ−５類似
体タンパク質は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担
体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液
剤、ローション剤、エアゾール剤、注射剤、散剤、顆粒
剤、錠剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤などの医薬組
成物とする。医薬組成物中、有効成分であるＦＧＦ−５
類似体タンパク質の含有量は、0.0000000001〜1.0 重量
％程度とすればよい。

【００２９】該医薬組成物は、発毛剤、育毛剤、脳神経
系栄養剤・機能抑制剤、学習効果調節剤等として、例え
ばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳
動物に対して非経口的にまたは経口的に安全に投与する
ことができる。本医薬組成物の投与量は、剤形、投与ル
ート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含
む哺乳動物に投与する場合、当該ＦＧＦ−５類似体タン
パク質を、0.0001〜1000mgを1 日に数回適用することが
例示される。

【００３０】微生物の寄託本発明の配列番号４のＤＮＡ配列を有するマウスＦＧＦ
−５類似体タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ
プラスミドを含む大腸菌ＭＦＧＦ５Ｓ／ＰＢＳ／ＸＬ１
株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FE
RM BP-5472にて、平成8 年 3月12日に寄託されている。

【００３１】

【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではな
い。

【００３２】〔実施例１〕ヒトＦＧＦ−５類似体（ヒ
トＦＧＦ−５Ｓ）をコードするｃＤＮＡの取得ヒトＲＮＡ、例えばClonetech 社、Catalog number 640
202-1 Human Brain Whole RNA を用いる。このヒトＲＮ
Ａ 1μg に120ng のrandom hexanucleotide DNA を加
え、50mM Tris-HCl, pH8.3, 40mM KCl, 6mM MgCl₂, 1mM
DTT, 0.4mM dNTPs, 40 unit RN asinの緩衝液中、200u
nit M-HLV 逆転写酵素によりcDNA混合物を得た。

【００３３】続いて得られたｃＤＮＡ混合物から目的と
する遺伝子をＰＣＲ反応により増幅した。上記ｃＤＮＡ
混合物0.5 μl を、250 μM dNTPs, 75mM NH₄O₂SO₄, pH
8.5, 2.0mM MgCl₂, 0.5 μg センスプライマー（下記
Ａ），0.5 μg アンチセンスプライマー（下記Ｂ）の存
在下、0.5unit AmpliTaq (Perkin Elmer) を用いて94℃
1分、60℃2 分、72℃1 分、40サイクルの熱サイクルに
より増幅した。Ａ：5'- GA ATG AGC TTG TCC TTC CTC CTC CTC CTC TTC
TTC AGC CAC-3' Ｂ：5'- AAG TTC TGG CTG CTC CGA CTG CTT-3' この結果、ヒトＦＧＦ−５ＳをコードするｃＤＮＡが生
成した。生成したｃＤＮＡをpBlueScript ベクターにク
ローニングし、そのヌクレオチド配列を確認した（配列
番号３）。

【００３４】〔実施例２〕マウスＦＧＦ−５類似体
（マウスＦＧＦ−５Ｓ）をコードするｃＤＮＡの取得ＩＣＲマウス６週齢メス個体より脳を摘出し、これより
ＲＮＡを抽出した。このマウスＲＮＡ 1μg に120ng の
random hexanucleotide DNA を加え、50mM Tris-HCl, p
H8.3, 40mM KCl, 6mM MgCl₂, 1mM DTT, 0.4mM dNTPs, 4
0 unit RN asinの緩衝液中、200unit M-HLV 逆転写酵素
によりcDNA混合物を得た。続いて得られたｃＤＮＡ混合
物から目的とする遺伝子をＰＣＲ反応により増幅した。
上記ｃＤＮＡ混合物0.5 μl を、250 μM dNTPs, 75mM
NH₄O₂SO₄, pH8.5,2.0mM MgCl₂, 0.5 μg センスプライ
マー（下記Ｃ），0.5 μg アンチセンスプライマー（下
記Ｄ）の存在下、0.5unit AmpliTaq (Perkin Elmer) を
用いて94℃1分、60℃2 分、72℃1 分、40サイクルの熱
サイクルにより増幅した。Ｃ：5'- AAGAATGAGCCTGTCCTTGCTCTTCCTCATCTTCTGCAGCCA
CCTGATCCA -3' Ｄ：5'- AAGTTCCGGTTGCTCGGACTGCTT -3' この結果、目的とするマウスＦＧＦ−５Ｓをコードする
ｃＤＮＡを生成した。生成したｃＤＮＡをpBlueScript
ベクターにクローニングし、そのヌクレオチド配列を確
認した（配列番号４）。

【００３５】〔実施例３〕マウスＦＧＦ−５類似体の
発現と同定マウスＦＧＦ−５ＳをコードするｃＤＮＡをＴ７プロモ
ーターの下流に組み込んだベクターをテンプレートと
し、これを常法により転写、翻訳した後、翻訳産物をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離
し、ニトロセルロース膜に移した。この膜を抗ＦＧＦ−
５ウサギ抗体とインキュベートし、抗体結合分子をＨＲ
Ｐ標識抗ウサギ抗体と化学発光方法によって検出した。
その結果を図３に示す。レーン１は作成したＦＧＦ−５
Ｓタンパク質、レーン２は大腸菌で作成した全長のＦＧ
Ｆ−５である。ＦＧＦ−５ＳｃＤＮＡが確かに分子量約
14000のタンパク質分子をコードし、これがＦＧＦ−５
と共通のエピトーブを有することを確認するとともに、
タンパク質を取得した。

【００３６】〔実施例４〕 RNase Protection Assay法
によるＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）ｍＲＮＡ発現
の確認 pBluescript ベクター（プロメガ社）に挿入したマウス
ＦＧＦ−５ｃＤＮＡを標識ＲＮＡ前駆体の存在下、転写
して、ＦＧＦ−５遺伝子のエクソン１、エクソン２、エ
クソン３に相当するＦＧＦ−５ｍＲＮＡの領域にまたが
ってハイブリダイズしうる６５２ｂｐの標識リボプロー
ブを合成した。マウス中枢神経由来の細胞より全ＲＮＡ
を抽出し、上記標識リボプローブと混合し、適切な条件
下でハイブリッドを形成させた後、RNaseT1 でハイブリ
ッド非形成ＲＮＡを消化除去した。ハイブリッド形成を
したＲＮＡを電気泳動で分離し、その分子量を測定し
た。その結果、ＦＧＦ−５ｍＲＮＡの存在を示す６５２
ｂｐの反応産物とともに、ＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−
５Ｓ）ｍＲＮＡの存在を示す３２６ｂｐの反応産物と２
２２ｂｐの反応産物の存在を確認した。このことより、
ＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）ｍＲＮＡは神経細胞
に存在することが示された。

【００３７】〔実施例５〕ＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ
−５Ｓ）タンパク質の大腸菌での発現と精製融合タンパク質発現プラスミドベクターｐＭＡＬ−ｃ２
（New England Biolab社) に含まれるマルトース結合タ
ンパク質（ＭＢＰ）をコードする配列の下流にヒトＦＧ
Ｆ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）のｃＤＮＡを挿入し、発
現プラスミドｐＭＡＬ／ｈｕｍＦＧＦ５Ｓを作製した。
このプラスミドを大腸菌に導入し、液体培養を行った。
培養後期にイソプロピルガラクトピラノシド添加により
ＭＢＰ−ＦＧＦ５Ｓ融合タンパク質の発現を誘導した。
菌体を超音波で破砕して融合タンパク質を遊離させ、Am
ylose resin （New England Biolab社) のアフィニティ
ーカラムを用いて融合タンパク質を精製した。得られた
融合タンパク質を特異的タンパク質分解酵素であるＦａ
ｃｔｏｒＸａ（New England Biolab社) でＭＢＰとＦ
ＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）タンパク質とに切断し
た後、ＦＧＦ−５類似体タンパク質を分離した。この結
果、純度の高いＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）タン
パク質を大量に得ることができた。

【００３８】〔実施例６〕ＦＧＦ−５タンパク質で誘
導した細胞増殖のＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）タ
ンパク質による調節血清飢餓においた培養細胞繊維芽細胞マウス３Ｔ３細胞
の培養液中にＦＧＦ−５タンパク質を加えて培養し、培
養開始後１５時間後から１９時間後までの間に細胞が合
成したＤＮＡ合成量を測定することで細胞増殖を評価し
た。その結果、ＦＧＦ−５タンパク質の量依存的に細胞
のＤＮＡ合成量が増加し、ＦＧＦ−５タンパク質が細胞
増殖活性を有することが示された。一方、培養液中にＦ
ＧＦ−５タンパク質と共にＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−
５Ｓ）タンパク質を共存させたところ、細胞のＤＮＡ合
成量が抑制された。これは、ＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ
−５Ｓ）タンパク質が、ＦＧＦ−５タンパク質による細
胞増殖を調節する例である。

【００３９】〔実施例７〕ＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ
−５Ｓ）によるＦＧＦ−５の神経栄養活性の調節動物細胞発現用ベクターｐＭＥＸｎｅｏのクローニング
サイトにヒトＦＧＦ−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）またＦ
ＧＦ−５のｃＤＮＡを挿入して発現プラスミドｐＭＥＸ
／ＦＧＦ−５Ｓ及びｐＭＥＸ／ＦＧＦ−５を作製した。
これらの発現プラスミドを単独あるいは混合で神経分化
モデル細胞であるＰＣ１２細胞に導入し、導入細胞のア
セチルコリンエステラーゼ活性を測定した。アセチルコ
リンエステラーゼ活性はＰＣ１２細胞の神経分化の指標
であるため、この測定により、神経栄養活性を評価でき
る。実験の結果、ＦＧＦ−５単独を導入されたＰＣ１２
細胞は神経分化をしたのに対し、ＦＧＦ−５とＦＧＦ−
５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）を同時に導入されたＰＣ１２
細胞は神経分化をほとんどしなかった。これは、ＦＧＦ
−５類似体（ＦＧＦ−５Ｓ）が、ＦＧＦ−５の脳神経系
栄養活性の調節を示す例である。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１２３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu 5 10 15 Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro 20 25 30 Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Ile Gly Ser Ser Ser Arg Gln 35 40 45 Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln 65 70 75 80 Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly 85 90 95 Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser 100 105 110 His Phe Ala Asn Met Leu Ser Gln Val His Arg 115 120

【００４１】配列番号：２配列の長さ：１２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Leu Ser Leu Leu Phe Leu Ile Phe Cys Ser His Leu Ile His 5 10 15 Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Thr Pro Glu Gly Gln Pro 20 25 30 Ala Pro Pro Arg Asn Pro Gly Asp Ser Ser Gly Ser Arg Gly Arg Ser 35 40 45 Ser Ala Thr Phe Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Val Ala Ala Ser 50 55 60 Pro Gly Ser Gln Gly Ser Gly Ser Glu His Ser Ser Phe Gln Trp Ser 65 70 75 80 Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly Ile Gly 85 90 95 Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser His Glu 100 105 110 Ala Ser Val Leu Ser Gln Ile Tyr Gly 115 120

【００４２】配列番号：３配列の長さ：３７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGAGCTTGT CCTTCCTCCT CCTCCTCTTC TTCAGCCACC TGATCCTCAG CGCCTGGGCT 60 CACGGGGAGA AGCGTCTCGC CCCCAAAGGG CAACCCGGAC CCGCTGCCAC TGATAGGAAC 120 CCTATAGGCT CCAGCAGCAG ACAGAGCAGC AGTAGCGCTA TGTCTTCCTC TTCTGCCTCC 180 TCCTCCCCCG CAGCTTCTCT GGGCAGCCAA GGAAGTGGCT TGGAGCAGAG CAGTTTCCAG 240 TGGAGCCCCT CGGGGCGCCG GACCGGCAGC CTCTACTGCA GAGTGGGCAT CGGTTTCCAT 300 CTGCAGATCT ACCCGGATGG CAAAGTCAAT GGATCCCACG AAGCCAATAT GTTAAGCCAA 360 GTTCACAGAT GA

【００４３】配列番号：４配列の長さ：３６６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGAGCCTGT CCTTGCTCTT CCTCATCTTC TGCAGCCACC TGATCCACAG CGCTTGGGCT 60 CACGGGGAGA AGCGTCTCAC TCCCGAAGGG CAACCCGCGC CTCCTAGGAA CCCGGGAGAC 120 TCCAGCGGCA GCCGGGGCAG AAGTAGCGCG ACGTTTTCTT CGTCTTCTGC CTCCTCACCA 180 GTCGCAGCTT CTCCGGGCAG CCAAGGAAGC GGCTCGGAAC ATAGCAGTTT CCAGTGGAGC 240 CCTTCGGGGC GCCGGACCGG CAGCCTGTAC TGCAGAGTGG GCATCGGTTT CCATCTGCAG 300 ATCTACCCGG ATGGCAAAGT CAATGGCTCC CACGAAGCCA GTGTGTTAAG CCAAATTTAC 360 GGATGA

【００４４】

【発明の効果】本発明の新規なＦＧＦ−５類似体タンパ
ク質を有効成分とした医薬組成物によれば、頭髪や体毛
の発毛または育毛の調節、脳神経系の栄養または機能調
節、線維芽細胞の増殖等のＦＧＦ−５の生理的機能を調
節することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＦＧＦ−５類似体（ヒトＦＧＦ−５Ｓ）
タンパク質のアミノ酸配列、および該タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を示す。

【図２】マウスＦＧＦ−５類似体（マウスＦＧＦ−５
Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列、および該タンパク質を
コードするＤＮＡ配列を示す。

【図３】マウスＦＧＦ−５Ｓタンパク質、およびヒト
ＦＧＦタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動写真を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者鈴木誓吾茨城県つくば市天久保２−１−１追越宿舎12号棟228号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/50 A61K 38/22 C12N 15/16 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
ＦＧＦ−５類似体タンパク質。
【請求項２】配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
ＦＧＦ−５類似体タンパク質。
【請求項３】配列番号３記載のＤＮＡ配列にコードさ
れる請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】配列番号４記載のＤＮＡ配列にコードさ
れる請求項２記載のタンパク質。
【請求項５】請求項１〜４いずれかに記載のタンパク
質を含有する医薬組成物。
【請求項６】脳神経系の栄養または機能調節のための
請求項５記載の医薬組成物。