CN110869492A - 用于毛囊干细胞增殖的方法 - Google Patents

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R.曼钱达
W.麦克莱恩
M.S.哈里森
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Abstract

本发明涉及Sonic Hedgehog(Shh)途径活化剂和Wnt激动剂的组合物，以及使用它们来诱导毛囊干细胞自我更新、包括诱导毛囊干细胞增殖、同时在子细胞中维持分化为毛囊上皮细胞的能力的方法。

Description

用于毛囊干细胞增殖的方法
相关申请
本申请要求2018年1月23日提交的美国申请号62/620,709和2017年4月11日提交的美国申请号62/484,279的优先权，其各自的完整内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及使用一种或多种sonic hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt途径活化剂用于诱导、促进或增强毛囊中的干细胞的生长、增殖和/或再生、同时在子细胞中维持分化为毛囊的上皮细胞的能力的方法。在一个实施方案中，毛囊中的干细胞是真皮乳头中的真皮乳头干细胞。在一些实施方案中，一种或多种Wnt活化剂是一种或多种糖原合酶(GSK)抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂是一种或多种1H-吡咯-2,5-二酮化合物。
发明背景
干细胞在体内展现出惊人的产生多种细胞类型的能力。除了胚胎干细胞外，组织特异性的干细胞在发育期间以及在成年人的体内稳态和损伤修复中发挥关键作用。干细胞通过增殖而自我更新，以及通过分化而产生组织特异性的细胞类型。不同干细胞的特性随组织不同而变化，并且由其固有的遗传状态和表观遗传状态决定。但是，不同干细胞在自我更新和分化之间的平衡都受到严格控制。失控的自我更新可能导致干细胞的过度生长，并可能导致肿瘤形成，而失控的分化可能耗尽干细胞库，从而导致维持组织体内稳态的能力受损。因而，干细胞持续地感知它们的环境并适当地以增殖、分化或细胞凋亡做出应答。通过控制干细胞增殖和分化的时机和程度来驱动再生将是合乎需要的。用随时间被清除的小分子来控制增殖，将允许控制干细胞增殖和分化的时机和程度。值得注意的是，来自不同组织的组织干细胞共享有限数目的调节其自我更新和分化的信号传导途径，但是以非常依赖于环境的方式。这些途径中的一些是Wnt和GSK3途径。
脱发，例如秃头症，是由身体生发周期的中断引起的病症。脱发可以发生在身体的任何地方，但最通常影响头皮。平均而言，头皮具有100,000根毛发，其通过生长、静息、脱落和再生期循环。尽管不是威胁生命的病况，并且主要是‘美容’问题，但脱发影响生活质量。在图像取向的社会中，脱发对个体的情绪状态具有重大影响。脱发可以与人的遗传学相关，尽管许多医学和行为状况可中断生长周期并引起脱发。
没有用于脱发的治愈疗法。当前的治疗涉及局部药物，诸如抗高血压血管扩张药米诺地尔或免疫抑制类固醇乳膏。皮质类固醇疗法也可以通过注射施用。还使用口服处方药剂，诸如非那雄胺、抗雄激素和抗真菌药剂。然而，治疗可以伴随有药剂的不良反应，并且如果中止治疗，患者可以复发。脱发也可以通过皮肤镜和假发进行美容治疗，但这些美容解决方案也无法提供治愈。
因此，仍然长期需要可以保持/促进毛囊中的细胞抵抗脱发的功能的新化合物。
发明概述
本发明提供了使用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂来诱导毛囊中的干细胞的自我更新的方法。本发明还提供了一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的药物组合物。这些组合物可用于例如治疗与脱发相关的疾病，诸如秃头症。
在一个方面，本发明提供了扩增毛囊的干细胞的群体的方法，所述方法包括使所述干细胞与一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂接触。
在另一个方面，本发明提供了促进毛囊上皮细胞的生成的方法，所述方法包括用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂处理毛囊的干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞是真皮乳头干细胞。在另一个实施方案中，所述干细胞是毛囊干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括角质形成细胞、黑色素细胞、真皮乳头细胞、隆突细胞或其组合。在一些实施方案中，所述干细胞在受试者中。在本文所述方法的一些实施方案中，在毛囊中的Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、CD133、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和/或碱性磷酸酶的表达增加。
在另一个方面，本发明提供了治疗具有与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病或处于发展与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂。在一些实施方案中，所述疾病选自静止期脱发、生长期脱发、雄激素性脱发、斑秃、头癣、毛发扁平苔藓、瘢痕性脱发、盘状红斑狼疮、秃发性毛囊炎、解剖性头皮蜂窝组织炎、前额纤维化脱发、中央离心瘢痕性脱发、拔毛癖、拉扯性脱发和少毛症。
在另一个方面，本发明提供了治疗具有秃头症或处于发展秃头症的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂。
在一些实施方案中，与未施用一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的受试者相比，施用一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的受试者具有改善的毛发生长、改善的头发密度和/或改善的毛囊的再生循环。
在又另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含：药学上可接受的载体和(i)Wnt激动剂或其药学上可接受的盐和(ii) Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约5倍至约1000倍。在某些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约10倍至约100倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约20倍至约50倍。在某些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约5倍至约1000倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约10倍至约100倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约20倍至约50倍。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothened激动剂。在其他实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothened纤毛累积增强剂。在本文公开的方法和组合物的某些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自表1或表2。在本文公开的方法和组合物的进一步实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂选自表3。在本文公开的方法和组合物的某些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂。在本文公开的方法和组合物的进一步实施方案中，所述GSK3-α抑制剂选自表5。在本文公开的方法和组合物的又进一步实施方案中，所述GSK3-β抑制剂选自表4。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种Wnt激动剂是式(I)的化合物，
Figure 857235DEST_PATH_IMAGE001
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R1a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 712059DEST_PATH_IMAGE002
Figure 491796DEST_PATH_IMAGE003
Figure 824688DEST_PATH_IMAGE004
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自-CORX1、-SO2RX1、杂芳基和-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-CONHC1-C4烷基、-COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，式I的化合物具有以下特征中的一种或多种：
a) 条件是所述化合物不是
Figure 639060DEST_PATH_IMAGE005
Figure 897741DEST_PATH_IMAGE006
b) 条件是当Ar是
Figure 164774DEST_PATH_IMAGE007
Figure 363675DEST_PATH_IMAGE008
时，则RX1既不是
Figure 970236DEST_PATH_IMAGE009
也不是
Figure 963600DEST_PATH_IMAGE010
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种Wnt激动剂是式Ia的化合物：
Figure 717930DEST_PATH_IMAGE011
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 392625DEST_PATH_IMAGE012
Figure 916010DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 345854DEST_PATH_IMAGE014
Figure 525163DEST_PATH_IMAGE015
和
Figure 800286DEST_PATH_IMAGE016
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、 -[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、-C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种Wnt激动剂是式Ib的化合物：
Figure 443757DEST_PATH_IMAGE017
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；且条件是当Q1是CH且Q3是C时，Q2不是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 215142DEST_PATH_IMAGE018
Figure 944063DEST_PATH_IMAGE019
Figure 22878DEST_PATH_IMAGE020
Figure 458538DEST_PATH_IMAGE021
和
Figure 230185DEST_PATH_IMAGE022
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
每个Q6独立地选自CRQ6和N；其中RQ6是氢、卤素、-CN、低级烷基或取代的烷基；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，
其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：
氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂选自表6。在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 μM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。在一些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。在一些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。在一些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
将在下文中部分地了解和在下文中部分地指出其他目的和特征。
附图简述
图1A-图1D显示Shh和Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。图1A：在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的集落。图1B：用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)处理的DP细胞显示比图1A略微更大和更丰富的集落。图1C：用Wnt活化剂(CHIR99021 4 µM)处理的DP细胞显示比图1A更丰富的集落。图1D：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(CHIR99021 4 µM)的组合显示许多大的DP集落。培养8天。比例尺1000 µm。
图2A-图2D显示，Shh途径活化与多种Wnt活化分子促进DP(真皮乳头)生长和毛发生长诱导。图2A：在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的集落。图2B：用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)处理的DP细胞显示比图2A略微更大和更丰富的集落。图2C：用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)处理的DP细胞显示比图2A更丰富的集落。图2D：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合显示许多大的DP集落。培养10天。所有图的比例均相同；参见图2D中的比例尺，200 µm。
图3A-图3F显示多种Shh分子与Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。图3A：用单独的嘌吗啡胺(1 µM)处理的DP细胞形成集落。图3D：与用单独的嘌吗啡胺处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7, 10 nM)和嘌吗啡胺(1 µM)处理的DP细胞形成更多的集落，并且更大。图3B：用单独的SAG (3 nM)处理的DP细胞形成集落。图3E：与用单独的SAG处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7, 10 nM)和SAG (3 nM)处理的DP细胞形成更多更大的集落。图3C：用单独的SAG HCl (500 nM)处理的DP细胞形成集落。图3F：与用单独的SAG HCl处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7, 10 nM)和SAG HCl (500 nM)处理的DP细胞形成更多更大的集落。比例尺1000 µm。
图4A-图4D显示Shh和Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。图4A：在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的碱性磷酸酶(Alp)集落。图4B：用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺1 μM)处理的DP细胞显示很少的Alp集落。图4C：用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)处理的毛囊显示小Alp集落。图4D：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合显示大和许多的Alp集落。碱性磷酸酶是DP细胞的标志物，并且用于显示具有毛发诱导能力的DP细胞。培养10天。比例尺，0.5 mm。
图5A-图5D显示Shh和Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。图5A：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合生成表达DP标志物波形蛋白的集落。图5B：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合生成表达毛发诱导的DP标志物多功能蛋白聚糖的集落。EdU表明集落在这些条件下正在活跃地分裂。图5C：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合生成表达DP和干细胞标志物Sox2的集落。图5D：Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合生成表达毛发诱导的DP标志物CD133的集落。培养10天。比例尺50 µm。
图6A-图6B显示Shh和Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。图6A：对照处理的毛囊显示在毛囊的基部处的碱性磷酸酶(Alp)。图6B：用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)和Shh途径(嘌吗啡胺 1μM)活化剂处理的毛囊显示较大的DP。碱性磷酸酶是DP细胞的标志物，并且用于显示具有毛发诱导能力的DP细胞。培养7天。比例尺，1 mm。
定义
在本申请中，使用“或”意味着“和/或”，除非另有规定。如在本申请中使用的，术语“约”和“近似”等同地使用。在本申请中使用的任何数字，不论有没有约/近似，都意在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任一个方向(大于或更小)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100%的情况除外)。
“累加效应”是指这样的效应，其中组合使用的两种或更多种物质或作用产生总作用，其与单独作用的算术总和相同。
“施用”是指将物质引入受试者中。在某些实施方案中，施用是皮内、局部、经皮或经口注射。在某些实施方案中，施用是直接施用至头皮。在某些实施方案中，通过植入递送系统直接施用至皮肤。在某些实施方案中，“造成……被施用”是指在已经施用了第一组分之后施用第二组分(例如，在不同时间和/或由不同的操作者)。
“抗体”是指具有免疫原结合能力的免疫球蛋白多肽或其片段。
如本文所用，“激动剂”是分别造成靶基因、蛋白或途径的表达或活性的增加的试剂。因此，激动剂可以以某种方式结合并活化它的相应受体，这直接地或间接地给靶基因或蛋白带来该生理学影响。激动剂还可以通过调节途径组分的活性(例如，通过抑制途径的负调节剂的活性)而增加途径的活性。因此，“Wnt激动剂”可以定义为增加Wnt途径的活性的试剂，其可以通过细胞中增加的TCF/LEF介导的转录来测量。因此，“Wnt激动剂”可以是结合并活化卷曲受体家族成员的真正Wnt激动剂，包括任意的和所有的Wnt家族蛋白、细胞内β-连环蛋白降解的抑制剂和TCF/LEF的活化剂。
“拮抗剂”是指结合受体或蛋白并又减少或消除其他分子的结合的试剂。
“反义”是指与核酸序列的编码链或mRNA互补的核酸序列，不论长度。可以将反义RNA引入单个细胞、组织或类器官。反义核酸可以含有经修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他经修饰的主链，或者可以含有非天然的核苷间键。
如本文所用的“生物相容性基质”是对于向人施用以释放治疗剂而言可接受的聚合物载体。生物相容性基质可以是生物相容性凝胶或泡沫。
本文中结合特定细胞类型使用的“细胞密度”是在代表性显微术样品中单位面积上的该细胞类型的平均数量。所述细胞类型可以包括、但不限于毛囊干细胞、真皮乳头干细胞、角质形成细胞、黑色素细胞和隆突细胞。可以用给定器官或组织(包括、但不限于毛囊)中的给定细胞类型来评估所述细胞密度。
“互补核酸序列”是指能够与包含互补核苷酸碱基对的另一个核酸序列杂交的核酸序列。“杂交”是指在合适的严谨性条件下在互补的核苷酸碱基之间配对以形成双链分子(例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对)(参见，例如，Wahl, G. M. 和S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399;Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507)。
本文中结合特定细胞类型使用的“横截面细胞密度”是在代表性显微术样品中穿过组织的单位横截面面积上该细胞类型的平均数量。给定组织的横截面也可以用于确定给定平面中的细胞数。通常，将如下测量横截面细胞密度：分析给定组织的整体制备物，并在沿着上皮部分切取的横截面中在给定距离上计数给定特定细胞类型的数量，如在代表性显微术样品中描述的。
“减少(Decreasing)”或“减少(Decreases)”是指减少至少5％，例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%，例如与参照水平相比。
“减少”还指减少至少1倍，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多，例如与参照水平相比。
“真皮乳头毛囊培养测定法”或“ DP毛囊培养测定法”是指当在测定结束测量时使用完整的毛囊来定量真皮乳头(DP)细胞的数目或毛囊内的DP区域的大小的方法。DP细胞是表达碱性磷酸酶(AP)和/或多功能蛋白聚糖和/或波形蛋白和/或Sox2和/或CD133的细胞。简言之，使用显微解剖从样本移取完整的毛囊。将各毛发修剪至靠近毛囊顶端，并且约3-5个毛囊分布在孔中。将具有生长因子和/或小分子的培养基添加至孔中，并将毛囊在37℃下孵育。监测生长一个或多个期望的时间段。可以在一个或多个期望的时间段时拍摄EVOS®透射光图像。可以处理毛囊，用于碱性磷酸酶染色、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色和/或检测标志物诸如波形蛋白、Sox2、多功能蛋白聚糖、CD133等的免疫荧光。可以分析DP标志物阳性的毛囊染色的总区域，并且可以随时间监测毛干生长。方案的细节提供于本发明的实施例部分中。
“真皮乳头干细胞”或“ DP干细胞”或“ DP细胞”是指毛囊的真皮乳头中具有自我更新的能力的细胞。
如本文所用的“分化阶段”是其中存在有效干性驱动剂浓度的时间持续期间。
“有效浓度”可以是对干性驱动剂而言的“有效干性驱动剂浓度”，“有效Shh浓度”可以是对Shh途径活化剂而言的“有效Shh浓度”，或“有效Wnt激动剂浓度”可以是对Wnt激动剂而言的“有效Wnt激动剂浓度”。
“有效Shh浓度”是，与在使用真皮乳头细胞的干细胞增殖测定结束时测量的在不存在Shh途径活化剂且所有其他组分以相同浓度存在的情况下真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或细胞培养物中的DP细胞的数目的相应增加相比，在使用真皮乳头的干细胞增殖测定结束时测量的Shh途径活化剂当与干性驱动剂组合时产生真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或细胞培养物中的DP细胞的数目的>50%增加的最小浓度。“有效体外Shh途径活化浓度”是指体外的“有效Shh途径活化浓度”。
“有效Wnt激动剂浓度”是，与在使用真皮乳头的干细胞增殖测定结束时测量的在不存在Wnt途径活化剂且所有其他组分以相同浓度存在的情况下真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或细胞培养物中的DP细胞的数目的相应增加相比，在使用真皮乳头的干细胞增殖测定结束时测量的Wnt途径活化剂产生真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或细胞培养物中的DP细胞的数目的>50%增加的最小浓度。“有效体外Wnt激动剂浓度”是指体外的“有效Wnt激动剂浓度”。
如本文所用的“有效释放速率”(质量/时间)是有效浓度(质量/体积) * 30 uL/1小时。
“有效干性驱动剂浓度”是，与未使用干性驱动剂进行的且所有其他组分以相同浓度存在的干细胞增殖测定中的给定细胞类型的细胞的数目相比，干性驱动剂在干细胞增殖测定中诱导给定细胞类型的细胞的数目的至少50%增加的最小浓度。在某些情况下，“有效干性驱动剂浓度”可以是“有效Wnt激动剂浓度”。
“消除”是指降低到不可检测的水平。
“移入”或“移植物植入”是指通过与组织的现有细胞接触而将干或祖细胞掺入体内目标组织的过程。“上皮祖细胞”是指具有变成局限于产生上皮细胞的细胞谱系的潜力的多潜能细胞。
“上皮干细胞”是指具有变成定型为多个细胞谱系(包括产生上皮细胞的细胞谱系)的潜力的多潜能细胞。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。该部分优选地含有参照核酸分子或多肽的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
“GSK3抑制剂”是抑制GSK3、GSK-3α和/或GSK-3β的活性的组合物。
如本文可互换使用的“GSK3beta”、“GSK3β”和“GSK3B”是糖原合酶激酶3β的首字母简略词。
“GSK3β抑制剂”是抑制GSK3β的活性的组合物。
“毛囊干细胞”是指不同于真皮乳头的毛囊的区域中的多能细胞，其具有自我更新和分化成多种细胞谱系的能力。
“杂交”是指在合适的严谨性条件下在互补的核苷酸碱基之间配对以形成双链分子(例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对) (参见，例如，Wahl, G. M. 和S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399;Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507)。
“抑制剂”是指分别造成靶基因或蛋白的表达或活性的减少的试剂。“拮抗剂”可以是抑制剂，但更具体地是结合受体并进而减少或消除其他分子的结合的试剂。
如本文所用的“抑制性核酸”是双链RNA、RNA干扰、miRNA、siRNA、shRNA或反义RNA或其部分或其模拟物，其当施用于哺乳动物细胞时导致靶基因的表达的下降。通常，核酸抑制剂包含靶核酸分子的至少一部分或其直系同源物，或包含靶核酸分子的互补链的至少一部分。通常，使靶基因的表达减少10%、25%、50%、75%或甚至90-100%。
“增加”还意指增加至少1倍，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多，例如，与参比标准的水平相比。
“增加”是指增加至少5%，例如，5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%或更多，例如与参照水平相比。
“皮内施用”是指将药剂、药物组合物或化合物施用至表皮正下方的真皮中。
“分离的”是指与在其天然状态下发现的通常伴随它的组分不同程度地分离的物质。“分离”是指与原始来源或环境分离的程度。
如本文所用的“谱系示踪”是使用能够对在报告物诱导时表达靶基因的任何细胞进行命运追踪的小鼠系。实例包括Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、CD133、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和/或碱性磷酸酶。
“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括、但不限于人、小鼠、大鼠、绵羊、猴、山羊、兔、仓鼠、马、奶牛或猪。
如本文所用的“平均释放时间”是在释放测定中一半试剂从载体释放到磷酸盐缓冲盐水中的时间。
如本文所用的“天然形态”是指，组织构造在很大程度上反映了健康组织中的构造。
如本文所用的“非人哺乳动物”是指非人类的任何哺乳动物。
如在本文的有关上下文中使用的，术语细胞的“数量”可以是0、1或更多个细胞。
“类器官”或“上皮类器官”是指与器官或器官的一部分类似并且具有与该特定器官相关的细胞类型的细胞簇或聚集体。
细胞的“群体”是指大于1的任何细胞数量，但优选至少1x103个细胞、至少1x104个细胞、至少1x105个细胞、至少1x106个细胞、至少1x107个细胞、至少1x108个细胞、至少1x109个细胞或至少1x1010个细胞。
如本文所用的“祖细胞”是指这样的细胞：其像干细胞一样，具有分化成特定细胞类型的趋势，但是已经比干细胞更专一，并被驱使分化成它的“靶”细胞。
“参照”是指标准或对照条件(例如，未用测试试剂或测试试剂的组合处理)。
如本文所用的“释放测定”是这样的试验：其中测量试剂从生物相容的基质穿过透析膜释放到盐水环境中的速率。可以如下进行一种示例性的释放测定：将30微升组合物放入具有适当截留值的盐水透析袋内的1 ml磷酸盐缓冲盐水中，并将该透析袋置于37℃的10mL磷酸盐缓冲盐水内。可以基于试剂大小来选择透析膜大小以允许待评估的试剂离开所述膜。对于小分子释放，可以使用3.5-5 kDa的截留值。组合物的释放速率可以随时间而变化，并且可以以1小时增量进行测量。
如本文所用的“代表性显微术样品”描述了在细胞培养系统、提取的组织的一部分、或整个提取的器官内的足够数目的视野，其使被测量的平均特征大小或数目可以合理地被认为代表测量全部相关视野时的平均特征大小或数目。代表性显微术样品可以包括在视野内的测量值，其可以测量为每给定距离的细胞数。代表性显微术样品可以用于评估形态学，诸如细胞-细胞接触、毛囊结构和细胞组分(例如，束、突触)。
如本文对于化合物所用的“ SAG”意指鉴定为CAS 912545-86-9的化合物结构。
如本文对于化合物所用的“ SAG HCl”意指鉴定为作为盐酸盐的CAS 912545-86-9的化合物结构。
术语“样品”是指得到的、提供的和/或进行分析的体积或质量。在某些实施方案中，样品是或包含组织样品、细胞样品、流体样品等。在某些实施方案中，样品取自(或是)受试者(例如，人或动物受试者)。在某些实施方案中，组织样品是或包含脑、毛发(包括根)、口腔拭子、血液、唾液、精液、肌肉，或来自与这些中的任何一种相关的任何内脏器官或癌细胞、癌变前细胞或肿瘤细胞。流体可以是、但不限于尿、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身体组织可以包括、但不限于脑、皮肤、肌肉、子宫内膜、子宫和宫颈组织，或与这些中的任何一种相关的癌细胞、癌变前细胞或肿瘤细胞。在一个实施方案中，身体组织是脑组织或脑肿瘤或癌症。本领域普通技术人员会明白，在某些实施方案中，“样品”是“原生样品”，因为其从来源(例如，受试者)获得；在某些实施方案中，“样品”是处理原生样品的结果，例如以除去某些潜在污染性组分和/或分离或纯化某些目标组分。
“自我更新”是指干细胞分裂以产生一个(不对称分裂)或两个(对称分裂)子代细胞的过程，所述子代细胞具有与亲代细胞无差别的发育潜能。自我更新涉及增殖和未分化状态的维持。
“siRNA”是指双链RNA。最佳地，siRNA是18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的长度，并且在其3'末端具有2个碱基的突出端。可以将这些dsRNA引入单个细胞或培养系统中。这样的siRNA用于下调mRNA水平或启动子活性。
“Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂”或“ Sonic Hedgehog (Shh)活化剂”是指活化Sonic Hedgehog信号传导途径的化合物或因子。Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂可以是SMO激动剂、Ptch1抑制剂、SUFU抑制剂、GLI1转录的活化剂或使得Sonic Hedgehog途径或其相互作用(例如， VEGF、FLk1、MEK、ERK、Notch/Hes、NANOG、SOX2、MYC、MYCN)增加的其他组分。
“干细胞”是指具有自我更新并分化成多个细胞谱系的能力的多潜能细胞。“毛囊的干细胞”是指毛囊的真皮乳头中发现的干细胞(“真皮乳头干细胞”、“DP干细胞”或“ DP细胞”)和毛囊的另一区域发现的干细胞(“毛囊干细胞”)两者。
如本文所用的“干细胞分化测定法”是测定干细胞的分化能力的测定法。
如本文所用的“干细胞测定”是这样的测定：其中针对一系列标准来测试细胞或细胞群体，以确定该细胞或细胞群体是否是干细胞或富集干细胞或干细胞标志物。在干细胞测定中，测试细胞/细胞群体的干细胞特征诸如干细胞标志物的表达，并进一步任选地测试干细胞功能，包括自我更新和分化的能力。
如本文所用的“干细胞增殖剂”是诱导具有自我更新和分化能力的细胞群体的增加的化合物或因子。
如本文所用的“干细胞增殖测定法”是测定药剂诱导从起始细胞群体诱导干细胞的产生的能力的测定法。使用真皮乳头的干细胞增殖测定法是指与在测定开始时相应的真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或DP细胞的数目相比，在测定结束时的真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或DP细胞的数目的增加。DP细胞是指表达碱性磷酸酶(AP)和/或多功能蛋白聚糖和/或波形蛋白和/或Sox2和/或CD133的细胞。简言之，使用显微解剖从样本移取完整的毛囊。将毛囊的细胞用细胞解离酶处理并过滤以获得单细胞悬浮液。然后将单一细胞悬浮于具有生长因子的培养基中，以给定细胞密度铺板于孔中，并在37℃下孵育。监测生长一个或多个期望的时间段。可以拍摄EVOS®透射光图像。可以收集球状体用于免疫印迹、qPCR、流式细胞术，和/或应用于玻璃底皿用于碱性磷酸酶染色、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色和/或检测标志物诸如波形蛋白、Sox2、多功能蛋白聚糖、CD133等的免疫荧光。方案的细节提供于本发明的实施例部分中。
如本文所用的“干细胞标志物”可以定义为在干细胞中特异性地表达的基因产物(例如蛋白、RNA等)。一种类型的干细胞标志物是直接地和特异性地支持干细胞特性的维持的基因产物。实例包括Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、CD133、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和/或碱性磷酸酶。使用在文献中描述的测定，可以鉴别另外的干细胞标志物。为了确定基因对干细胞特性的维持而言是否是必要的，可以使用功能获得和功能缺失研究。在功能获得研究中，特定基因产物(干细胞标志物)的过表达将有助于维持干细胞特性。而在功能缺失研究中，干细胞标志物的除去将造成干细胞特性的丧失或诱导干细胞的分化。另一种类型的干细胞标志物是仅在干细胞中表达但不一定具有维持干细胞特性的特定功能的基因。通过用测定(诸如微阵列和qPCR)对比分选的干细胞和非干细胞的基因表达概况，可以鉴别这类标志物。这类干细胞标志物可以在文献中找到(例如Liu Q. 等人, Int J Biochem Cell Biol. 2015 60:99-111. www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750)。潜在的干细胞标志物包括Ccdc121、Gdf10、Opcm1、Phex等。使用测定诸如qPCR、免疫组织化学、蛋白质印迹和RNA杂交，可以测量在给定的细胞或细胞群体中的干细胞标志物(诸如CD133或Sox2)的表达。使用可以指示给定干细胞标志物的表达的转基因细胞表达报告物(例如多功能蛋白聚糖-GFP、CD133-GFP或Sox2-GFP)，也可以测量干细胞标志物的表达。然后可以使用流式细胞计量术分析来测量报告物表达的活性。还可以使用荧光显微术直接使报告物的表达可视化。使用用于全基因表达概况分析的微阵列分析，可以进一步确定干细胞标志物的表达。可以将给定的细胞群体或纯化的细胞群体的基因表达概况与干细胞的基因表达概况对比以确定两个细胞群体之间的相似性。通过集落形成测定或球形成测定、自我更新测定和分化测定，可以测量干细胞功能。在集落(或球)形成测定中，当在适当的培养基中培养时，所述干细胞应当能够在细胞培养表面(例如细胞培养皿)上形成集落或嵌入细胞培养基质(例如Matrigel)中，或能够在悬浮培养时形成球。在集落/球形成测定中，将单个干细胞以低细胞密度接种在适当的培养基中，并允许其增殖给定的时间段(7-10天)。然后对形成的集落进行计数，并针对干细胞标志物表达进行评分，作为原始细胞的干性的指标。任选地，随后挑选所形成的集落并传代以测试其自我更新和分化潜力。在自我更新测定中，当在适当的培养基中培养时，所述细胞应当在至少一次(例如1、2、3、4、5、10、20次等)细胞分裂期间维持干细胞标志物(例如CD133)表达。在干细胞分化测定中，当在适当的分化培养基中培养时，所述细胞应当能够产生毛细胞，其可以通过毛细胞标志物表达来鉴别，所述标志物表达通过qPCR、免疫染色、蛋白质印迹、RNA杂交或流式细胞计量术来测量。
如本文所用的“干性驱动剂”是在保持自我更新的潜力和分化成给定细胞类型的细胞(例如毛囊上皮细胞)的潜力的同时诱导给定细胞类型的细胞的增殖、上调细胞中的基因或生物标志物、或维持细胞中的基因或生物标志物表达的组合物。通常，干性驱动剂上调出生后干细胞的至少一种生物标志物。干性驱动剂包括、但不限于Wnt激动剂和GSK3抑制剂。
“受试者”包括人类和哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在许多实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是灵长类动物，特别是人类。在某些实施方案中，受试者是家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛和猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和驯化的动物，特别是宠物诸如狗和猫。在某些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试哺乳动物将是例如啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪诸如近交猪等。
“协同作用”或“协同效应”是大于分别做出的每项效果的总和的效果，即大于累加效应。
如本文所用的“TGFβ抑制剂”是减少TGFβ的活性的组合物。
如本文所用的“BMP抑制剂”是减少BMP的活性的组合物。
如本文所用的“Notch活化剂”是增加Notch途径活性的组合物。
如本文所用的“mTOR”抑制剂是降低雷帕霉素(mTOR)活性的机制靶标的组合物。
“组织”是来自相同来源的类似细胞的集合体，所述细胞一起执行特定功能。
在本文中与细胞群体关联使用的“处理”是指向该群体递送物质以产生结果。在体外群体的情况下，可以将所述物质直接地(或甚至间接地)递送给该群体。在体内群体的情况下，可以通过施用将所述物质递送给宿主受试者。
如本文所用的“Wnt活化”是Wnt信号传导途径的活化。
如本文所用的“ Wnt激动剂”是活化Wnt信号传导途径的任何化合物、蛋白、肽或药剂。
如本文所用的术语“烷基”是指直链或支链饱和烃。例如，烷基可以具有1至8个碳原子(即(C1-C8)烷基)或1至6个碳原子(即(C1-C6)烷基)或1至4个碳原子。
如本文所用的术语“烯基”是指具有2至约15个碳原子的直链或支链烃基，其包括一个或多个双键并且可包括二价基团。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基及更高级的同系物和异构体。
如本文所用的术语“炔基”是指具有2至约15个碳原子的直链或支链烃基，其包括一个或多个三键并且可以包括二价基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基及更高级的同系物和异构体。
如本文所用的术语“卤素”或“卤素”是指氟基、氯基、溴基和碘基。
如本文所用的术语“芳基”是指单个全碳芳环或多个稠合全碳环系，其中至少一个环是芳族的。例如，芳基可以具有6至20个碳原子、6至14个碳原子、或6至12个碳原子。芳基包括苯基。芳基还包括具有约9至20个碳原子的多个稠合环系(例如，包含2、3或4个环的环系)，其中至少一个环是芳族的并且其中其他环可以是芳族的或非芳族的(即，碳环)。这种多个稠合环系可任选在所述多个稠合环系的任何碳环部分上被一个或多个(例如1、2或3个)氧代基取代。当价键要求允许时，所述多个稠合环系的环可以经由稠合、螺环和桥接键彼此连接。应当理解，如上面所定义的多稠合环系的连接点可位于环系的任何位置，包括所述环的芳族或碳环部分。
如本文所用的术语“杂芳基”是指在环中具有至少一个非碳的原子的单个芳环，其中该原子选自氧、氮和硫；该术语还包括具有至少一个这种芳环的多稠合环系，下面将进一步描述该多稠合环系。因此，该术语包括环中具有约1至6个碳原子以及约1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的单一芳环。硫原子和氮原子也可以以氧化形式存在，条件是环为芳族的。该术语还包括多稠合环系(例如，包含2、3或4个环的环系)，其中如上所定义的杂芳基可以与一个或多个选自以下的环稠合以形成所述多稠合环系：杂芳基(以形成例如萘啶基，诸如1,8-萘啶基)、杂环(以形成例如1,2,3,4-四氢萘啶基，诸如1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶基)、碳环(以形成例如5,6,7,8-四氢喹啉基)和芳基(以形成例如吲唑基)。因而，杂芳基(单芳环或多稠合环系)在杂芳环内具有约1-20个碳原子和约1-6个杂原子。这种多稠合环系可任选在该稠环的碳环或杂环部分上被一或多个(如1、2、3或4个)氧代基取代。当价键要求允许时，所述多个稠合环系的环可以经由稠合、螺环和桥接键彼此连接。应当理解，该多稠合环系的各环可以相对于彼此以任何顺序连接。还应理解，多稠合环系(如上文对杂芳基所定义的)的连接点可位于该多稠合环系的任何位置(包括该多稠合环系的杂芳基、杂环、芳基或碳环部分)，以及位于该多稠合环系的任何合适的原子(包括碳原子和杂原子(例如氮))上。
如本文所用的术语“环烷基”是指具有约3至约8个环成员的饱和或部分饱和的环结构，其仅具有碳原子作为环原子并且可包括二价基团。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯、环戊烯基、环己烯基。
术语“杂环基”或“杂环的”是指含有碳和选自氧、磷、氮或硫的杂原子的单环或多环的3至24元环，并且其中不存在环碳或杂原子之间共享的离域π电子(芳香性)。杂环基环包括但不限于氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、吡喃基、噻喃基、四氢吡喃基、二氧杂环戊烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S-二氧化物、哌嗪基、氮杂䓬基、氧杂䓬基、二氮杂䓬基、托烷(tropanyl)和高托烷基(homotropanyl)。杂环基或杂环烷基环也可以是稠合或桥连的，例如，可以是双环的环。
除非另有指明，“或”的使用意指“和/或”。如在本申请中使用的，术语“约”和“近似”等同地使用。在本申请中使用的任何数字，不论有没有约/近似，都意在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任一个方向(大于或更小)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100%的情况除外)。
短语“药学上可接受的”在本文中用于是指这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括、但不限于已经被美国食品和药品管理局批准为可接受用于用在人类或家养动物中的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂、或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括、但不限于：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡类、动物和植物脂肪、石蜡、有机硅、皂粘土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和在药物制剂中采用的任意其他相容的物质。
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物学有效性和性能(其不是在生物学上或其他方面不希望的)的那些盐，并且其用无机酸和有机酸形成，所述无机酸是例如、但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸是例如、但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷- 1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羟乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物学有效性和性能(其不是在生物学上或其他方面不希望的)的那些盐。通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备这些盐。源自无机碱的盐包括、但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。例如，无机盐包括、但不限于铵、钠、钾、钙和镁盐。源自有机碱的盐包括、但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，被取代的胺(包括天然存在的被取代的胺)，环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基还原葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。在某些实施方案中使用的实例有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括: (1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可以以适合于期望的递送途径(例如，经鼓膜注射、经鼓膜管芯针和导管和可注射蓄池)的任何方式配制本文描述的化合物或组合物。通常，制剂包括所有生理学上可接受的组合物，包括其衍生物或前药、溶剂合物、立体异构体、外消旋体或互变异构体以及任何生理上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
发明详述
本发明的实例实施方案的描述如下。
本发明涉及扩增毛囊的干细胞的群体的方法，所述方法包括使干细胞与一种或多种干细胞增殖剂接触，其中所述一种或多种干细胞增殖剂是一种或多种Sonic Hedgehog途径(Shh)活化剂和一种或多种Wnt激动剂。
在另一个方面，本发明涉及促进毛囊上皮细胞的生成的方法，所述方法包括用一种或多种Sonic Hedgehog途径(Shh)活化剂和一种或多种Wnt激动剂处理毛囊的干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞是真皮乳头干细胞。在另一个实施方案中，所述干细胞是毛囊干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括角质形成细胞、黑色素细胞、真皮乳头细胞、隆突细胞或其组合。在一些实施方案中，所述干细胞在受试者中。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了通过活化Shh途径和Wnt途径来诱导毛囊中的干细胞的群体的自我更新的方法。优选地，所述途径用小分子或蛋白活化。例如，化合物，当体外应用于毛囊中的真皮乳头(DP)干细胞时，在使用真皮乳头细胞的干细胞增殖测定中诱导DP干细胞以高程度且以高纯度增殖，并且还在DP毛囊培养测定中允许毛囊内的DP细胞的数目和/或DP面积的增加。在一个此实施方案中，一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂通过产生可以分裂并维持使高比例的所得细胞分化为毛囊的细胞的能力的干细胞来诱导和维持干细胞特性。进一步，增殖中的干细胞表达干细胞标志物，其可以包括Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、CD133、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和/或碱性磷酸酶中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了治疗具有与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病或处于发展与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog途径(Shh)活化剂和一种或多种Wnt激动剂。在一些实施方案中，所述疾病选自静止期脱发、生长期脱发、雄激素性脱发、斑秃、头癣、毛发扁平苔藓、瘢痕性脱发、盘状红斑狼疮、秃发性毛囊炎、解剖性头皮蜂窝组织炎、前额纤维化脱发、中央离心瘢痕性脱发、拔毛癖、拉扯性脱发和少毛症。
在另一个方面，本发明提供了治疗具有秃头症或处于发展秃头症的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog途径(Shh)活化剂和一种或多种Wnt激动剂。
在又另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含：药学上可接受的载体和(i)Wnt激动剂或其药学上可接受的盐和(ii) Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约5倍至约1000倍。在某些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约10倍至约100倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约20倍至约50倍。在某些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约5倍至约1000倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约10倍至约100倍。在一些实施方案中，所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约20倍至约50倍。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothened激动剂。在其他实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothened纤毛累积增强剂。在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自SAG、氧甾酮、嘌吗啡胺类似物、GSA-10类似物、虎杖苷、糖皮质激素、hedgehog多肽、肌醇衍生物、甾酮、过氧化物氧化还原酶2、RACK1、Dhh和Ihh。在一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自表1。在一些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自表2。在某些实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺(CAS 483367-10-8)。在本文公开的方法和组合物的进一步实施方案中，所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
表1. 用于本发明的组合物和方法中的示例性Shh途径活化剂
化合物家族 化合物名称或公司 化合物CAS编号 参考文献
SAG (HH-Ag)家族
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.1 364590-52-3 Journal of biology (2002) 1 (2): 10
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.2 364590-54-5 Cell Chemical Biology (2017) 24(3): 252-280
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.2 (反式) 612542-13-9 Journal of biology (2002) 1 (2): 10
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.3 (SAG-1.3) 364590-63-6
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.3 (反式)– SAG(3nM) 912545-86-9 Stem Cells Int. (2012) 140427; Nat. Chem. Biol.(2009) 5(3):154-156; PNAS (2002) 99(22): 14071-14076
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.3 (顺式) 1401532-80-6
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.4
Figure 180824DEST_PATH_IMAGE023
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.5 612542-14-0
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.6 Journal of Neurochemistry (2009) 108(6): 1539-1549
SAG(HH-Ag) HH-Ag 1.8 869497-97-2 Journal of Investigative Dermatology (2005) 125(4): 638-646
SAG(HH-Ag) CUR-0236715 946048-09-5
SAG(HH-Ag) Curis (反式) 612542-12-8 US 6,683,108 B1
SAG(HH-Ag) Curis / Wyeth 946047-96-7 WO 2008057468 A1
SAG(HH-Ag) Curis / Wyeth 946047-93-4 WO 2008057468 A1
SAG(HH-Ag) 化合物35 (顺式/反式) 566172-68-7 PLoS Biol (2016) 14(2): e1002375
SAG(HH-Ag) 化合物35 (反式) 1186398-30-0 PLoS Biol (2016) 14(2): e1002375
SAG(HH-Ag) 化合物36 946002-48-8 PLoS Biol (2016) 14(2): e1002375
甾醇 US 2008/013319
甾醇 化合物35 (0.54−0.65 µM) 27241-03-8 ACS Med. Chem. Lett. (2012) 3(10): 828−833
甾醇 Oxy34 24339-14-8 Journal of Cellular Biochemistry (2011) 112(6): 1673-1684
甾醇 Oxy49 (3 µM) 1059591-82-0 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2012) 22(18):5893–5897; ACS Med. Chem. Lett. 2012, 3, 828−833
甾醇 20(S)-羟化胆固醇 516-72-3 Biomaterials (2014) 35(26): 7336-7345
甾醇 哈西奈德 3093-35-4 PLoS One (2015) 10(12): e0144550; PNAS (2010) 107(20):9323-9328
甾醇 氯倍他索 25122-41-2 PLoS One (2015) 10(12): e0144550; PNAS (2010) 107(20):9323-9328
甾醇 氟替卡松 90566-53-3 PLoS One (2015) 10(12): e0144550; PNAS (2010) 107(20):9323-9328
甾醇 氟轻松 356-12-7 PNAS (2010) 107(20): 9323-9328
甾醇 醋酸曲安奈德 76-25-5 ChemMedChem (2014) 9(1): 27-37
嘌吗啡胺类似物
嘌吗啡胺 嘌吗啡胺 483367-10-8 Biomaterials (2014) 35(26): 7336-7345; Chem. Biol. (2004)11(9): 1229-1238; JACS (2002) 124(49): 14520-14521
嘌吗啡胺 化合物40 841221-62-3 ChemMedChem (2014) 9(1): 27-37; Cells Tissues Organs (2012)197(2):89–102
嘌吗啡胺 化合物38 1394159-22-8 ChemMedChem (2014) 9(1): 27-37; Cells Tissues Organs (2012)197(2):89–102
嘌吗啡胺 96547 (#70) 1160569-67-4 Molecules and Cells (2008), 26(4): 380-386
GSA-10类似物
GSA-10 GSA-10 300833-95-8 European Journal of Medicinal Chemistry (2016) 121: 747-757; Molecular Pharmacology (2013) 84(2): 303
GSA-10 化合物11 353777-56-7 European Journal of Medicinal Chemistry (2016) 121: 747-757
GSA-10 化合物20 1990524-02-1 European Journal of Medicinal Chemistry (2016) 121: 747-757
GSA-10 化合物35 331963-09-8 European Journal of Medicinal Chemistry (2016) 121: 747-757
GSA-10 化合物12 300837-51-8 European Journal of Medicinal Chemistry (2016) 121: 747-757
虎杖苷
虎杖苷 虎杖苷，白藜芦醇的葡糖苷 65914-17-2 Food and Chemical Toxicology (2016), 96: 215-225
PI4P
PI4P 磷脂酰肌醇4-磷酸酯(PI4P) Cell Chemical Biology (2017) 24(3): 252-280; PLoS Biol(2016) 14(2): e1002375
专利
受让人 CAS编号或Shh途径活化剂
SAG(HH-Ag) CUR-0201365 946047-59-2 US2010/038833
SAG(HH-Ag) CUR-0236715 946048-09-5 US2010/038833
SAG(HH-Ag) CUR-0201784 946047-85-4 US2010/038833
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag WO 2001/074344 A2
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag WO 2008/057468 A1
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag WO 2008/057469 A1
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag WO 2008/057497 A2
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag US 2002/0198236 A1
SAG(HH-Ag) Curis HH-Ag US 2003/0139457 A1
SAG(HH-Ag) Aderans ResearchInstitute HH-Ag WO 2010/148094 A1
SAG(HH-Ag) Aderans ResearchInstitute HH-Ag US 2012/0095445
GSA-10 Centre National de laRecherche Scientifique GSA-10类似物 US 8957091 B2
GSA-10 Centre National de laRecherche Scientifique GSA-10类似物 US 2012/0121693 A1
GSA-10 Centre National de laRecherche Scientifique GSA-10类似物 US 2013/0236912 A1
GSA-10 Centre National de laRecherche Scientifique GSA-10类似物 WO 2012/066479 A1
甾醇 THE REGENTS OF THEUNIVERSITY OFCALIFORNIA 氧甾酮 US 9526737 B2
甾醇 THE REGENTS OF THEUNIVERSITY OFCALIFORNIA 氧甾酮 WO 2008/115469 A2
甾醇 THE REGENTS OF THEUNIVERSITY OFCALIFORNIA 氧甾酮 WO 2009/073186 A1
甾醇 THE REGENTS OF THEUNIVERSITY OFCALIFORNIA 氧甾酮 WO 2014/179756 A1
甾醇 Fate Therapeutics 氧甾酮 WO 2012/024581 A2
甾醇 Fate Therapeutics 氧甾酮 WO 2012/024583 A2
甾醇 Fate Therapeutics 氧甾酮 WO 2012/024584 A2
甾醇 Duke 糖皮质激素 WO 2011/109711 A1
肽 Elizabeth Wang Hedge Hog多肽 US 2002/0151460 A1
肽 Ontogeny Hedge Hog多肽 WO 99/20298 A1
肽 Strasspharma Hedge Hog多肽 WO 2014/085523 A1
嘌吗啡胺 Scripps and IRM 嘌吗啡胺 US 2004/0157864 A1
嘌吗啡胺 Biomatcell 嘌吗啡胺 WO 2012/115575 A1
HH-Ag HH-Ag US 2005/0070578 A1
PI4P Barbara Brooke Jennings 肌醇衍生物 US 2009/0214474 A1
甾醇 甾醇 WO 00/41545 A2
蛋白
蛋白 过氧化物氧化还原酶2 Oncotarget (2016) 7(52): 86816-86828
蛋白 RACK1 Journal of Biological Chemistry (2012) 287(11): 7845-7858
蛋白 Desert Hedgehog (Dhh) Journal of Biology (2002). Agonizing Hedgehog. 1(2): 7
蛋白 Indian Hedgehog (Ihh) Journal of Biology (2002). Agonizing Hedgehog. 1(2): 7
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种SAG化合物是式II的化合物：
Figure 1012DEST_PATH_IMAGE024
其中R独立地是一个或多个-H、卤素、-C1-C10烷基、-C3-C10环烷基、-OC1-C10烷基、-CN、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基；其中所述取代可以是一个或多个-H、卤素、-OH、-OC1-C6烷基、-C1-C6烷基、-CN、NH2、-NHSO2-C1-C6烷基、-NHCO-C1-C6烷基、-SO2-C1-C6烷基、-CONH2、-CONH-C1-C6烷基、COOH、-COO-C1-C6烷基；
其中R1独立地是一个或多个-H、卤素、-C1-C3烷基、-OH、-O-C1-C3烷基。
表2. 用于本发明的组合物和方法中的示例性Shh途径活化剂
Shh途径活化剂 CAS编号
嘌吗啡胺 483367-10-8
化合物35 27241-03-8
HH-Ag 1.1 364590-52-3
HH-Ag 1.2 364590-54-5
HH-Ag 1.2 (反式) 612542-13-9
HH-Ag 1.3 (SAG-1.3) 364590-63-6
HH-Ag 1.3 (反式) - SAG 912545-86-9
HH-Ag 1.3 (顺式) 1401532-80-6
HH-Ag 1.5 612542-14-0
CUR-0236715 946048-09-5
哈西奈德 3093-35-4
氯倍他索 25122-41-2
氟替卡松 90566-53-3
化合物36 946002-48-8
化合物35 331963-09-8
化合物12 300837-51-8
化合物20 1990524-02-1
用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的Wnt激动剂(Wnt活化剂)的类别包括但不限于表3的列A中列出的那些。用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的特定Wnt激动剂包括但不限于表3的列B中列出的那些。在表3、列B中列出的所有试剂被理解为包括其衍生物或其药学上可接受的盐。在表3、列A中列出的所有类别被理解为包括构成该类别的药剂及其衍生物或其药学上可接受的盐。
表3. 用于本发明的组合物和方法中的示例性Wnt激动剂(Wnt活化剂)
Figure 353496DEST_PATH_IMAGE025
Figure 296044DEST_PATH_IMAGE026
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt活化剂或激动剂是一种或多种GSK抑制剂。在某些实施方案中，所述GSK抑制剂是GSK3-β抑制剂。用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的GSK3-β抑制剂的类别包括但不限于表4的列A中列出的那些。用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的特定GSK3-β抑制剂包括但不限于表4的列B中列出的那些。在表4、列B中列出的所有试剂被理解为包括其衍生物或其药学上可接受的盐。在表4、列A中列出的所有类别被理解为包括构成该类别的药剂及其衍生物或其药学上可接受的盐。
表4. 用于本发明的组合物和方法中的示例性GSK3-β抑制剂
Figure 671662DEST_PATH_IMAGE028
Figure 92279DEST_PATH_IMAGE029
Figure 564849DEST_PATH_IMAGE030
Figure 114517DEST_PATH_IMAGE031
Figure 39747DEST_PATH_IMAGE032
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，所述一种或多种Wnt活化剂或激动剂是一种或多种GSK抑制剂。在某些实施方案中，所述GSK抑制剂是GSK3-α抑制剂。用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的GSK3-α抑制剂的类别包括但不限于表5的列A中列出的那些。用于本文公开的组合物和方法的各个实施方案中的特定GSK3-α抑制剂包括但不限于表5的列B中列出的那些。在表5、列B中列出的所有试剂被理解为包括其衍生物或其药学上可接受的盐。在表5、列A中列出的所有类别被理解为包括构成该类别的药剂及其衍生物或其药学上可接受的盐。
表5. 用于本发明的组合物和方法中的示例性GSK3-α抑制剂
Figure 264055DEST_PATH_IMAGE033
在本文所述的方法和组合物的某些实施方案中，所述GSK3抑制剂选自丙戊酸钠盐、CT20026、CHIR99021 (CT99021)、CHIR98014 (CT98014)、CHIR98023 (CT98023)、CHIR98024 (CT98024)、TCS 2002、化合物39、化合物29、化合物33、TCS 21311、LY2090314、603281-31-8、化合物34、化合物14d、化合物15b、化合物20x、AZD-1080、Kenpaullone、Cazpaullone、GSK-3抑制剂XXII、化合物4a、化合物4t、化合物4z、吡咯并吡啶9、化合物14、化合物23、化合物14、化合物18和化合物19。
在本文所述的方法和组合物的某些实施方案中，所述GSK3抑制剂选自丙戊酸钠盐、CHIR99021 (CT99021)、CHIR98014 (CT98014)、CHIR98023 (CT98023)、CHIR98024(CT98024)、化合物39、化合物29、LY2090314、603281-31-8、化合物34、化合物14d、化合物15b、化合物20x、AZD-1080、Cazpaullone、GSK-3抑制剂XXII、化合物4t、化合物4z、吡咯并吡啶9、化合物14、化合物23、化合物14、化合物18和化合物19。
在本文所述的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂是式(I)的化合物，
Figure 263235DEST_PATH_IMAGE034
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中Q1、Q2、Q3、R1、R2、R3、Ar、-Z-W-X-Y-和m是如上文针对式(I)所定义。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，式I的化合物具有以下特征中的一种或多种：
a) 条件是所述化合物不是
Figure 547586DEST_PATH_IMAGE035
Figure 960113DEST_PATH_IMAGE036
b) 条件是当Ar是
Figure 925795DEST_PATH_IMAGE037
且
Figure 107377DEST_PATH_IMAGE038
是
Figure 297050DEST_PATH_IMAGE039
或
Figure 134556DEST_PATH_IMAGE040
时，则RX1既不是
Figure 700667DEST_PATH_IMAGE041
又不是
Figure 2335DEST_PATH_IMAGE042
；
在某些实施方案中，本发明提供了用于本文公开的方法中且未在WO 2003/076442(PCT/US03/05050)(其通过引用并入本文)中公开的式(I)的化合物。
在式(I)的某些实施方案中，RX是-CORX1或-SO2RX1。
在式(I)的某些实施方案中，RX选自
Figure 799128DEST_PATH_IMAGE043
Figure 186247DEST_PATH_IMAGE044
Figure 556048DEST_PATH_IMAGE045
。
在某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个作为卤素的取代基取代。在某些实施方案中，RX1是氘代的杂环基。在某些实施方案中，所述杂环基是单环的或双环的。在某些实施方案中，所述杂环基含有一至三个氮(即1、2或3个氮)和/或一至三个氧(即1、2或3个氧)。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮和/或一个氧。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮。在某些实施方案中，所述杂环基含有两个氮。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮和一个氧。
在某些实施方案中，RX1是哌啶或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷，其两者任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-(CH2)p-NH2；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是哌啶，其任选地被1至2个卤代取代基取代。在某些实施方案中，RX1是哌啶，其任选地被-(CH2)p-OH取代。
在式(I)的某些实施方案中，所述杂环基任选地被C1-C4烷基、-(CH2)p-OH或-(CH2)p-NH2取代；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被C1-C4烷基取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)p-OH取代的杂环基；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被-CH2-OH取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)p-NH2取代的杂环基；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被-CH2-NH2取代的杂环基。
在式(I)的某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被-[C(RX1a)2]p-CN取代。在某些实施方案中，RX1是用-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基或-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被-CONHC1-C4烷基、-COH、-CO2H或-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基取代。
在式(I)的某些实施方案中，每个RX1a独立地选自氢和卤素。在某些实施方案中，两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在式(I)的某些实施方案中，RX是杂芳基。在某些实施方案中，所述杂芳基是单环的或双环的。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一至三个氮(即1、2或3个氮)和/或一至三个氧(即1、2或3个氧)。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮和/或一个氧。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮。在某些实施方案中，所述杂芳基含有两个氮。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮和一个氧。在某些实施方案中，RX是
Figure 384327DEST_PATH_IMAGE046
。
在式(I)的某些实施方案中，RX是-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)。在某些实施方案中，所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上被1至2个卤素取代。在某些实施方案中，所述C3-C8环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，RX是-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)，其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上任选地被1至2个卤素取代，且其中C3-C8环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，RX是
Figure 181382DEST_PATH_IMAGE047
。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂是具有式(Ia)的化合物，
Figure 790217DEST_PATH_IMAGE048
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中Q1、Q2、Q3、R1、R2、R3、Ar、-Z-W-X-Y-和m是如上文针对式(Ia)所定义。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂是具有式(Ib)的化合物，
Figure 901393DEST_PATH_IMAGE049
及其药学上可接受的盐和互变异构体，其中Q1、Q2、Q3、R1、R2、R3、Ar、-Z-W-X-Y-和m是如上文针对式(Ib)所定义。
在某些实施方案中，Q1是CH；Q2是N；且Q3是C。在某些实施方案中，Q1是N；Q2是C；且Q3是N。在某些实施方案中，Q1是CH；Q2是C；且Q3是N。在某些实施方案中，Q1是N；Q2是N；且Q3是C。
在某些实施方案中，
Figure 912074DEST_PATH_IMAGE050
选自
Figure 880030DEST_PATH_IMAGE051
和
Figure 913845DEST_PATH_IMAGE052
。
在某些实施方案中，R1是氢或卤素。在某些实施方案中，R1是C1-C4烷基，其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代。在某些实施方案中，R1是C1-C4炔基、-CN、-OH或-S(O)2NH2。在某些实施方案中，R1是-NH2或-NHC(O)R1a，其中R1a是C1-C4烷基。在某些实施方案中，R1是C1-C4烯基。在某些实施方案中，R1是-O-C1-C4烷基。
在某些实施方案中，R2是氢或卤素。在某些实施方案中，R2是C1-C4烷基，其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代。在某些实施方案中，R2是C1-C4炔基、-CN、-OH或-S(O)2NH2。在某些实施方案中，R2是-NH2或-NHC(O)R2a，其中R2a是C1-C4烷基。在某些实施方案中，R2是-S(O)2NH2。
在某些实施方案中，R2是C1-C4烯基。在某些实施方案中，R2是-O-C1-C4烷基。在某些实施方案中，R2是-NH2、-NH(C1-C4烷基)或-N(C1-C4alkyl)2。
在某些实施方案中，R2选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基。在某些实施方案中，R2选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-NH2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基。在某些实施方案中，R2不是氢。
在某些实施方案中，R3是氢或卤素。在某些实施方案中，R3是C1-C4烷基，其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代。在某些实施方案中，R3是C1-C4炔基、-CN、-OH或-S(O)2NH2。在某些实施方案中，R3是-NH2或-NHC(O)R3a，其中R3a是C1-C4烷基。在某些实施方案中，R3是C1-C4烯基。在某些实施方案中，R3是-O-C1-C4烷基。
在某些实施方案中，Ar是
Figure 625449DEST_PATH_IMAGE053
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 490637DEST_PATH_IMAGE054
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 89150DEST_PATH_IMAGE055
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 672578DEST_PATH_IMAGE056
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 922294DEST_PATH_IMAGE057
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 907568DEST_PATH_IMAGE058
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 155009DEST_PATH_IMAGE059
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 225734DEST_PATH_IMAGE060
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 279140DEST_PATH_IMAGE061
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 56603DEST_PATH_IMAGE062
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 537263DEST_PATH_IMAGE063
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 829704DEST_PATH_IMAGE064
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 624485DEST_PATH_IMAGE065
。在某些实施方案中，Ar是
Figure 318772DEST_PATH_IMAGE066
。
在式(Ia)的某些实施方案中，Ar是
Figure 970333DEST_PATH_IMAGE067
。在式(Ia)的某些实施方案中，Ar是
Figure 451867DEST_PATH_IMAGE068
。在式(Ia)的某些实施方案中，Ar是
Figure 847077DEST_PATH_IMAGE069
或
Figure 395870DEST_PATH_IMAGE070
，其中Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基。
在式(Ib)的某些实施方案中，Ar是
Figure 421595DEST_PATH_IMAGE071
。在式(Ib)的某些实施方案中，Ar是
Figure 688628DEST_PATH_IMAGE072
。在式(Ib)的某些实施方案中，Ar是
Figure 887528DEST_PATH_IMAGE073
或
Figure 228511DEST_PATH_IMAGE074
，其中Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基。在式(Ib)的某些实施方案中，Ar是
Figure 487454DEST_PATH_IMAGE075
、
Figure 241783DEST_PATH_IMAGE076
，其中Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基。在式(Ib)的某些实施方案中，Ar是
Figure 978795DEST_PATH_IMAGE077
，其中每个Q6独立地选自CRQ6和N；其中RQ6是氢、卤素、-CN、低级烷基或取代的烷基。
在某些实施方案中，-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-。在某些实施方案中，-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。在某些实施方案中，-Z-W-X-Y-是-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。
在某些实施方案中，每个RZ独立地选自氢和卤素。在某些实施方案中，两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，两个RZ基团一起形成氧代。在某些实施方案中，RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在某些实施方案中，每个RW独立地选自氢和卤素。在某些实施方案中，两个RW基团一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，两个RW基团一起形成氧代。在某些实施方案中，RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在某些实施方案中，每个RY独立地选自氢和卤素。在某些实施方案中，两个RY基团一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，两个RY基团一起形成氧代。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX是H。在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX是RX1，其为C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-CONHC1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX是-CORX1或-SO2RX1。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX选自
Figure 439863DEST_PATH_IMAGE078
Figure 869707DEST_PATH_IMAGE079
。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX是-(C1-C4亚烷基)-RX1，其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代。在某些实施方案中，所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上被1至4个卤素取代。在某些实施方案中，所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上被1或2个卤素取代。在某些实施方案中，RX是-(C1-C4亚烷基)-RX1，其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1或2个卤素取代，且其中RX1是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在某些实施方案中，RX是
Figure 845754DEST_PATH_IMAGE080
。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX1是C3-C8环烷基。在某些实施方案中，RX1是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个作为卤素的取代基取代。在某些实施方案中，RX1是氘代的杂环基。在某些实施方案中，所述杂环基是单环的或双环的。在某些实施方案中，所述杂环基含有一至三个氮(即1、2或3个氮)和/或一至三个氧(即1、2或3个氧)。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮和/或一个氧。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮。在某些实施方案中，所述杂环基含有两个氮。在某些实施方案中，所述杂环基含有一个氮和一个氧。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基是任选地被C1-C4烷基、-(CH2)p-OH或-(CH2)p-NH2取代的杂环基；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被C1-C4烷基取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)p-OH取代的杂环基；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)-OH取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)p-NH2取代的杂环基；其中p是1、2或3。在某些实施方案中，RX1是被-(CH2)-NH2取代的杂环基。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被-[C(RX1a)2]p-CN取代。在某些实施方案中，RX1是用-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基或-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2取代的杂环基。在某些实施方案中，RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被-CONHC1-C4烷基、-COH、-CO2H或-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基取代。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，每个RX1a独立地选自氢和卤素。在某些实施方案中，两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX1是杂芳基。在某些实施方案中，所述杂芳基是单环的或双环的。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一至三个氮(即1、2或3个氮)和/或一至三个氧(即1、2或3个氧)。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮和/或一个氧。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮。在某些实施方案中，所述杂芳基含有两个氮。在某些实施方案中，所述杂芳基含有一个氮和一个氧。在某些实施方案中，RX1是
Figure 822675DEST_PATH_IMAGE081
。
在式(Ia)和(Ib)的某些实施方案中，RX是–CON(RX2)2。在某些实施方案中，RX is –CON(RX2)2，其中RX2是氢或甲基。在某些实施方案中，RX is –CONH2。在某些实施方案中，RX is–CON(RX2)2，其中RX2是C1-C4烷基。在某些实施方案中，RX是–CON(RX2)2，其中RX2是甲基。
在某些实施方案中，m是0。在某些实施方案中，m是1。在某些实施方案中，m是2。
在本文公开的化合物的一种变型中，Ar是
Figure 466146DEST_PATH_IMAGE082
且Q1是CH；Q2是N；Q3是C；Q4是C；且Q5是C。
在本文公开的化合物的一种变型中，Ar是
Figure 801312DEST_PATH_IMAGE083
且Q1是CH；Q2是N；Q3是C；Q4是C；且Q5是C。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂具有下式：
Figure 467917DEST_PATH_IMAGE084
其具有以下特征中的一种、两种、三种或更多种：
a) Ar是
Figure 546731DEST_PATH_IMAGE085
；
b) Q1是CH；Q2是N；且Q3是C；
c) R2是氢或卤素；
d) -Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-；
e) RX是-CORX1。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂具有下式：
Figure 982392DEST_PATH_IMAGE086
其具有以下特征中的一种、两种、三种或更多种：
a) Ar是
Figure 488459DEST_PATH_IMAGE087
；
b) Q1是CH；Q2是N；且Q3是C；
c) R2是C1-C4烷基，其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；
d) -Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-；
e) RX是-CORX1。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，一种或多种GSK抑制剂具有下式：
Figure 704677DEST_PATH_IMAGE088
其具有以下特征中的一种、两种、三种或更多种：
a) Ar是
Figure 587183DEST_PATH_IMAGE089
；
b) Q1是CH；Q2是N；且Q3是C；
c) R2是C1-C4炔基、-CN、-OH、-S(O)2NH2、-NH2或-NHC(O)R2a；
d) -Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-；
e) RX是-CORX1。
用于本发明的方法中的GSK抑制剂的非限制性实例呈现于表6中。
表6. 用于本发明的组合物和方法中的示例性化合物
Figure 877350DEST_PATH_IMAGE090
Figure 819898DEST_PATH_IMAGE091
Figure 257832DEST_PATH_IMAGE092
Figure 114668DEST_PATH_IMAGE093
Figure 587237DEST_PATH_IMAGE094
Figure 372791DEST_PATH_IMAGE095
本发明还提供了以下化合物及其药学上可接受的盐，其用于本文公开的方法和组合物中。
Figure 298021DEST_PATH_IMAGE096
除非另有说明，否则本文描绘的结构也意在包括仅在存在一个或多个同位素富集原子方面不同的化合物。例如，具有本结构、不同的是用氘或氚置换氢原子、或者用13C或14C置换碳原子、或者用15N置换氮原子、或者用17O或18O置换氧原子的化合物，均在本发明的范围内。这样的同位素标记的化合物可用作研究或诊断工具。在某些实施方案中，氘化可用于减缓代谢，且因此潜在地改善化合物半衰期。化合物中的任何或所有氢都可以用氘置换。
在某些实施方案中，所述GSK抑制剂是化合物I-7 [3-(2-(4,4-二氟哌啶-1-羰基)-9-氟-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮䓬[6,7,1-hi]吲哚-7-基)-4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮]。
在某些实施方案中，所述Wnt信号传导途径靶标(例如，用于抑制)选自AES (TLE/groucho)、腺瘤性结肠息肉病(APC)、ARHU、ARHV、AXIN1、AXIN2、β-联蛋白、BMP4、BTRC (b-TrCP)、CCND1、CCND2、CCND3、CD44、CDX1、CLD N l (密蛋白-1)、COL1A1、CTBP1、CTBP2、CTNNBI、CTNNB1P1 (ICAT)、DKK l、DKK2、DKK3、DKK4、Dsh、DVL2、EGR1、EFNBl (肝配蛋白Bl)、ENPP2 (自趋化素)、EP300、FBXW1B、FGF4、FO SL l (Fra-1)、FRATl、FRAT2、FRZB (FRP-3)、FST (卵泡抑素)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、GAS(胃泌素)、GIPC2、GIPC3、GJAl (连接蛋白43)、GSK3A、糖原合酶激酶-3B (GSK-313)、ICAM1、ID2、ID3、JUN、LEFI、LRP5、LRP6、MFRP、MMP7、MMP26、MSX1、MSX2、MYC、N K D l、NKD2、NOS2A(iNOS)、PITX2、PLAUR (uPAR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A (PP2A)、PPN、PPP2R5D (B56PP2A)、PTGS2 (Cox-2)、RET、SFRP1 (分泌的Frizzled相关蛋白-1，包括SFRP1抑制剂)、SFRP2 (FRP-2)、SFRP4 (FRP-4)、SFRP5、SMOH、SOX17、T (brachyury)、TCF、VANGL1、VEGF、WIF1、WISP1、WISP2、WISP3、Wnt蛋白、Wnt受体及其任何类似物或同源物。
除了其他方面，本文呈现的方法可用于制备药物制剂，用于预防和/或治疗与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病，诸如非瘢痕性脱发(例如，静止期脱发、生长期脱发、雄激素性脱发和斑秃)、瘢痕性脱发(例如，头癣、毛发扁平苔藓、瘢痕性脱发、盘状红斑狼疮、秃发性毛囊炎、解剖性头皮蜂窝组织炎、前额纤维化脱发和中央离心瘢痕性脱发)、拔毛癖、拉扯性脱发和少毛症。
当用本发明的Shh途径活化剂和Wnt激动剂处理毛囊中的干细胞时，无论该群体是在体内还是在体外，经处理的细胞都表现出干细胞样行为，因为经处理的细胞具有增殖和分化(更具体地，分化成毛囊上皮细胞)的能力。优选地，所述Shh途径活化剂和Wnt激动剂诱导和维持细胞以产生子代干细胞，所述干细胞可以分裂许多代并保持具有高比例的所得细胞分化为毛囊上皮细胞的能力。在某些实施方案中，增殖中的干细胞表达干细胞标志物，其可以包括Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、多功能蛋白聚糖、碱性磷酸酶(AP)、波形蛋白、CD133、CD200、ID2、DKK3、WIF1、FZD1、FZD2、PHLDA1、卵泡抑素和/或DIO2。AP活性已被用作检测DP(真皮乳头)的存在的标志物，并被视为头发诱导性的指标。Handjiski等人(Br J Dermatol (1994) 131(3): 303-310)显示小鼠的毛发DP在整个毛发周期中表现强烈且持久的AP活性。CD133 (prominin1)是已知的造血iPSC标志物。CD133在早期生长期小鼠皮肤的DP细胞中表达。CD133表达与毛发诱导特性相关(Yang和Cotsarelis. J DermatolSci (2010) 57(1): 2-11)。波形蛋白是存在于DP和真皮成纤维细胞中的间充质标志物(Rendl等人 PLOS Biol (2005) 3(11): e331)。多功能蛋白聚糖在生长期的毛囊中的DP细胞中表达。多功能蛋白聚糖表达与毛发诱导特性相关(Yang and Cotsarelis. J DermatolSci (2010) 57(1): 2-11)。Sox2是干细胞的常见标志物。在毛发重构测定中，表达Sox2的细胞是锥子/auchene囊的形成所需的(Driskell等人 Development (2009) 136(16):2815-2823)。
在某些实施方案中，本发明的方法可以用于在显著的毛囊细胞形成之前维持或甚至瞬时增加预先存在的毛囊中的干细胞的干性(即自我更新)。在一些实施方案中，毛囊中预先存在的干细胞包括角质形成细胞、黑色素细胞、真皮乳头细胞和/或隆突细胞。可以使用在代表性显微术样品上的免疫染色形态学分析(包括细胞计数)和谱系示踪来确认这些细胞类型中的一种或多种的扩增。
有利的是，本发明的方法在不使用遗传操作的情况下实现了这些目标。种系操纵不是治疗上合乎需要的治疗毛损失的方案。一般而言，所述疗法优选地包括在不伴随基因治疗的情况下施用小分子、肽、抗体或其他非核酸分子或核酸递送载体。在某些实施方案中，所述疗法包括施用小有机分子。优选地，通过使用施用(例如皮内、经皮、局部或经口)的(非基因)治疗剂来实现毛维持或恢复。
除了扩增毛囊的干细胞之外，本发明的方法还具有在子细胞中维持分化成毛囊上皮细胞的谱系的能力。在体内群体中，通过受试者的毛密度、毛生长或毛囊通过再生循环的改善可以间接地观察到这种能力的保持。在体外群体中，这种能力的保持可以通过DP细胞数量相对于起始群体的增加而直接观察到，或通过测量DP干细胞标志物中的一种或多种的活性而间接观察到。
在某些实施方案中，所述干细胞群体是体内受试者的，且该方法是脱发的治疗(例如，其中从扩增的干细胞群体生成毛囊上皮细胞导致脱发的部分或全部恢复)。
在某些实施方案中，本发明涉及促进真皮乳头细胞的生成的方法，所述方法包括：施用本发明的组合物以扩增真皮乳头细胞的群体。在某些实施方案中，所述化合物可以在哺乳动物中再生毛发。在某些实施方案中，所述真皮乳头细胞群体是体内受试者的。在某些实施方案中，所述真皮乳头细胞群体是体内受试者的，其用于治疗秃头症。在某些实施方案中，本发明提供了使用本发明的组合物在体内初始群体中增殖真皮乳头细胞、产生真皮乳头细胞的扩增群体来生成真皮乳头细胞的方法。
在某些实施方案中，通过进行一次或多次注射入真皮(例如，皮内施用)来实施施用步骤。在一些实施方案中，所述施用是局部的并且针对表现出脱发的皮肤区域。在一些实施方案中，所述施用是经口的。在一些实施方案中，所述施用是经皮的并且针对表现出脱发的皮肤区域。
在一些实施方案中，所述皮肤在施用疗法之前是粗糙或受伤的。在一些实施方案中，在应用疗法之前，将一根或多根针应用于皮肤。
在某些实施方案中，所述施用步骤包括以持续方式施用一种或多种Shh途径活化剂、一种或多种Wnt激动剂或一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的组合。
在一些实施方案中，所述干细胞是DP干细胞。在某些实施方案中，所述干细胞是毛囊干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括角质形成细胞、黑色素细胞、真皮乳头细胞和/或隆突细胞。
在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的毛囊上皮细胞执行高通量筛选。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的毛囊上皮细胞关于对毛囊上皮细胞的毒性筛选分子。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的毛囊上皮细胞关于改善毛囊上皮细胞(例如，暴露于所述分子的毛囊上皮细胞)的存活的能力筛选分子。
在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的扩增的干细胞群体执行高通量筛选。在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的干细胞关于对干细胞和/或它们的后代的毒性筛选分子。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的干细胞关于改善干细胞和/或它们的后代的存活的能力筛选分子。
在另一个方面，本发明涉及一种产生毛囊上皮细胞的方法，所述方法包括：增殖毛囊(例如，体外、离体或体内样品/受试者的初始干细胞群体)中的干细胞，产生扩增的毛囊的干细胞群体(例如，使得扩增的群体是初始干细胞群体的至少1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍)；和促进从所述扩增的毛囊干细胞群体产生毛囊上皮细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种产生毛囊上皮细胞的方法，所述方法包括将本文提供的化合物或组合物施用于受试者的一个或多个毛囊中的细胞群体，由此促进毛囊上皮细胞的产生。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含：药学上可接受的载体，和(i)Wnt激动剂，或其药学上可接受的盐，和(ii) Sonic Hedgehog (Shh)活化剂，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂包含GSK3-α抑制剂。在其他实施方案中，所述Wnt激动剂包含GSK3-β抑制剂。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothened激动剂。在某些实施方案中，所述Shh途径活化剂包含Smoothen纤毛累积增强剂。在一些实施方案中，所述组合物适合于施用于皮肤。
某些实施方案涉及药物组合物，其包含：药学上可接受的载体，和(i) Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii) Sonic Hedgehog活化剂、Smoothened激动剂、Smoothened纤毛累积增强剂，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述组合物适合于施用于皮肤。
在本文所述的方法和组合物的一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12。
在某些实施方案中，所述Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺(Purmorphamine)、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂的浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至1000 mM、约1 µM至100 mM、约10µM至10 mM、约1 µM至10 µM、约10 µM至100 µM、约100 µM至1000 µM、约1 mM至10 mM或约10mM至100 mM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在进一步实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在又进一步实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂的浓度为约0.01 nM至1000 µM、约0.1 nM至1000 µM、约1 nM至100 µM、约10 nM至10 µM、约1 nM至10 nM、约10nM至100 nM、约100 nM至1000 nM、约1 µM至10 µM或约10 µM至100 µM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是CHIR99021，其浓度为约1 µM至1000 mM、约10 µM至100 mM、约100 µM至100mM、约1 mM至10 mM或约10 mM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是CHIR99021，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是CHIR99021，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是CHIR99021，其浓度为约1 nM至1000 µM、约10 nM至100 µM、约100 nM至100 µM、约100 nM至1 µM、约1 µM至10 µM或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 µM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是LY2090314，其浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至10 mM、约1 µM至1mM、约10 µM、约20 µM、约30 µM、约40 µM或约50 µM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是LY2090314，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是LY2090314，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是LY2090314，其浓度为约0.01 nM至1000 µM、约0.1 nM至10 µM、约1 nM至1 µM、约1 nM至100 nM、约1 nM至50 nM或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是AZD1080，其浓度为约0.1 µM至1000 mM、约1 µM至1000 mM、约10 µM至100mM、约100 µM至10 mM、约1 mM至10 mM或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是AZD1080，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是AZD1080，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是AZD1080，其浓度为约1 nM至1000 µM、约10 nM至1000 µM、约100 nM至100 µM、约1 µM至10 µM或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 µM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是GSK3抑制剂XXII，其浓度为约0.1 µM至1000 mM、约1 µM至100 mM、约10 µM至10 mM、约100 µM至10 mM、约100 µM至1 mM或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是GSK3抑制剂XXII，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是GSK3抑制剂XXII，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂是GSK3抑制剂XXII，其浓度为约0.1 nM至1000 µM、约1 nM至100 µM、约10 nM至10 µM、约100 nM至1 µM或约0.5 µM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-6，其浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至10 mM、约1 µM至1 mM、约10 µM至1 mM、约125 µM、约250 µM、约500 µM或约750 µM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-6，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-6，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度为约50至2000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-6，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-6，其浓度为约0.01 nM至1000 µM、约0.1 nM至10 µM、约1 nM至1 µM、约10 nM至100 nM、约25 nM、约25 nM或约75 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-7，其浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至10 mM、约1 µM至1 mM、约10 µM、约20 µM、约30 µM、约40 µM或约50 µM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-7，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-7，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-7，其浓度为约0.01 nM至1000 µM、约0.1 nM至10 µM、约1 nM至1 µM、约1 nM至100 nM、约5 nM、约10 nM或约20 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-12，其浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至10 mM、约1 µM至1 mM、约10 µM至1 mM、约125 µM、约250 µM、约500 µM或约750 µM。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-12，其相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.01至1,000,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约0.1至100,000倍，或相对于相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约1至10,000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至5000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约50至2000倍，或相对于其有效干性驱动剂浓度的浓度比为约100至1000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-12，其相对于其有效干性驱动剂浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Wnt激动剂是化合物I-12，其浓度为约0.01 nM至1000 µM、约0.1 nM至10 µM、约1nM至1 µM、约10 nM至100 nM、约25 nM、约50 nM或约75 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Sonic Hedgehog (Shh)活化剂的浓度为约0.01 µM至1000 mM、约0.1 µM至1000 mM、约1 µM至100 mM、约0.1 µM至1 µM、约1 µM至10 µM、约10 µM至100 µM、约100 µM至1 mM、约1 mM至10 mM或约100 mM至1000 mM或约10 mM至100 mM或约100 mM至1000 mM。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂的浓度为约0.01 nM至1000 µM，或约0.1 nM至1000 µM，约1 nM至100 µM，约10 nM至10 µM，约1 nM至10 nM，约10nM至100 nM，约100 nM至1000 nM，约1 µM至10 µM，约10 µM至100 µM，或约100 µM至1000 µM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG (CAS912545-86-9)，其浓度为约0.01 µM至1000 mM，约0.1 µM至10 mM，约1 µM至1 mM，约10 µM至100 µM，约10 µM，约20 µM，约25 µM，约50 µM。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG (CAS 912545-86-9)，其相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG (CAS 912545-86-9)，其相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG (CAS 912545-86-9)，其浓度为约0.001 nM至1000 µM，约0.01 nM至10 µM，约0.1 nM至1 µM，约1 nM至100 nM, 1 nM至10 nM，约1 nM，约2 nM，约3 nM，约4 nM，约5 nM，约6 nM，约7 nM，约9 nM，或约10 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇，其浓度为约0.01 µM至1000 mM，约0.1 µM至100 mM，约1 µM至10 mM，约10 µM至1mM，约125 µM，约250 µM，约500 µM，或约1000 µM。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇，其相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇，其相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇，其浓度为约0.01 nM至1000 µM，约0.1 nM至100 µM，约1 nM至10 µM，约10 nM至1 µM，约25 nM，约50 nM，约100 nM，约200 nM，或约500 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG HCl(CAS 912545-86-9)，其浓度为约1 µM至1000 mM，或约10 µM至1000 mM，或约100 µM至10mM，或约1 mM。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG HCl，其相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG HCl，其相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG HCl，其浓度为约1nM至1000 µM，约10 nM至100 µM，约100 nM至10 µM，约125 nM，约250 nM，或约500 nM，或约750 nM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Shh途径活化剂是嘌吗啡胺，其浓度为约1 µM至1000 mM，或约10 µM至1000 mM，或约100 µM至10 mM，或约2 mM。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是嘌吗啡胺，其相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是嘌吗啡胺，其相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，所述Shh途径活化剂是嘌吗啡胺，其浓度为约1 nM至1000 µM，约10 nM至100 µM，约100 nM至10 µM，约1 µM至10 µM，约1 µM，约2 µM，约3 µM，约4 µM，约5µM，或约6 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 μM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 µM至约100 μM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100nM至约10 µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至10 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，与其组合的SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 µM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100mM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100mM。在某些实施方案中，AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100µM至约10 mM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文所述的组合物和方法的某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，与其组合的嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，与其组合的SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，与其组合的20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。在某些实施方案中，化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，与其组合的SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方案中，所述Shh途径活化剂是SAG (CAS912545-86-9)或SAG-HCl，其与选自SFRP1抑制剂(例如，WAY-316606)、SFRP2抑制剂、SFRP3抑制剂、SFRP4抑制剂、SFRP5抑制剂、环孢菌素或其类似物(例如，环孢菌素A(CsA)、PSC833(戊司泊达))、DKK1抑制剂(例如，WAY-262611)和WIF1抑制剂中的一种或多种的Wnt激动剂组合。在一些实施方案中，SAG的浓度为约1 µM至1000 mM，或约10 µM至1000 mM，或约100 µM至10 mM，或约1 mM。在一些实施方案中，SAG HCl相对于其有效Shh浓度的浓度比为约0.1至1,000,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1至100,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约10至10,000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约100至1000倍，或相对于其有效Shh浓度的浓度比为约1000倍。在一些实施方案中，SAG HCl相对于其有效Shh浓度为约1倍、3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、5000倍。在一些实施方案中，SAG HCl的浓度为约1 nM至1000 µM，约10 nM至100 µM，约100 nM至10 µM，约125 nM，约250nM，或约500 nM，或约750 nM。
毛囊生长
毛囊通过由胚胎发育期间的上皮和潜在的间充质之间的相互分子相互作用导致的复杂的形态发生过程而发育。每个毛囊都通过再生循环。毛发周期由生长(生长期)、退化(退化期)和静息(静止期)的阶段组成。在退化期中，毛囊干细胞维持在隆突中。然后，当提供适当的分子信号时，静息毛囊重新进入生长期(再生)。在晚期静止期至早期生长期的转变期间，来自真皮乳头(DP)的信号刺激毛胚和静止的隆突干细胞变得活化。在生长期中，隆突中的干细胞产生毛胚，然后新毛囊的基质中的瞬时扩增细胞迅速增殖以形成新的发丝。退化期后，毛囊经历凋亡。发丝保留在静止期毛囊中，以变为棒状毛发，其后来在外源性期间脱落。这些再生周期在生物体的整个生命周期中重复继续。
Hedgehog途径
进化保守的Hedgehog (Hh)途径对于正常的胚胎发育至关重要，并且在成年组织维持、更新和再生中发挥关键的作用。分泌的Hh蛋白以浓度和时间依赖性的方式起作用，以引发范围为存活和增殖至细胞命运指定和分化的一系列细胞应答。适当水平的Hh信号传导需要调节的Hh配体的产生、加工、分泌和运输-在哺乳动物中，这包括Sonic (Shh)、Indian(Ihh)和Desert (Dhh)。所有Hh配体均被合成为前体蛋白，其经历在羧基末端的自动催化切割和伴随的胆固醇修饰以及在氨基末端的棕榈酰化，产生分泌的双重脂化的蛋白。Hh配体通过Dispatched和Scube2的组合作用从细胞表面释放，且随后通过与细胞表面蛋白LRP2和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC1-6)的Glypican家族相互作用而在多个细胞中运输。Hh蛋白通过与经典受体Patched (PTCH1)和共受体GAS1、CDON和BOC结合而起始信号传导。Hh与PTCH1的结合导致GPCR样蛋白Smoothened (SMO)的抑制，其导致SMO在纤毛中累积及其其胞质尾部的磷酸化。SMO介导下游信号转导，其包括从驱动蛋白家族蛋白Kif7和关键的细胞内Hh途径调节剂SUFU解离GLI蛋白(Hh途径的转录效应子)。GLI蛋白也通过纤毛运输，并且在Hh信号传导不存在的情况下被SUFU和Kif7掩蔽，允许PKA、GSK3β和CK1对GLI的磷酸化，且然后加工成转录阻遏物(通过羧基末端的切割)或靶向用于降解(由E3泛素连接酶β-TrCP介导)。响应于Hh信号传导的活化，GLI蛋白被差异化磷酸化并加工成诱导Hh靶基因的表达的转录活化剂，其中许多是该途径的组分(例如PTCH1和GLI1)。反馈机制包括诱导干扰Hh配体功能的Hh途径拮抗剂(PTCH1、PTCH2和Hhip1)，以及由E3泛素连接酶衔接蛋白SPOP介导的GLI蛋白降解。除了在正常胚胎发育和成体组织内稳态期间的重要作用以外，异常的Hh信号传导负责起始越来越多的癌症，包括经典的基底细胞癌、成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤；更近来，过度活跃的Hh信号传导已牵涉于胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌中。
制备化合物的方法
本文所述的化合物可以由市售的起始材料制备或使用已知的有机、无机和/或酶促方法合成。
本发明的化合物可以以有机合成领域的技术人员众所周知的多种方式制备。通过实例的方式，本发明的化合物可以使用以下描述的方法连同合成有机化学领域中已知的合成方法或如本领域技术人员所理解的其上的变型来合成。这些方法包括但不限于以下描述的那些方法。
主题化合物的代表性合成显示于方案1中。
方案1. 式(I)的说明性化合物的一般合成
Figure 522329DEST_PATH_IMAGE097
在方案1中，化合物I-11是这样的实施方案；其中Q1是CH；Q2是N；且Q3是C；R2是溴；Ar是
Figure 787089DEST_PATH_IMAGE098
；且-Z-W-X-Y-是
Figure 71439DEST_PATH_IMAGE099
。式1的化合物和烯丙基醛是市售的起始材料。或者，可以使用市售的起始材料和/或通过常规合成方法制备的起始材料，经由各种不同的合成途径来合成式1的化合物和烯丙基醛。
继续参考方案1，在合适的溶剂诸如乙腈中，在例如约40℃至100℃的温度下，化合物1和烯丙基醛在缩合反应中反应以形成化合物2。在合适的溶剂诸如甲醇中，在例如0℃至室温的范围内的温度下，化合物2与氨反应以形成化合物3。化合物3可用于待下文讨论的偶联反应中。
继续参考方案1，可以在碱诸如碱金属氢化物、诸如氢化钠存在的情况下，从化合物4与烷基卤的烷基化反应制备化合物5。可以在合适的溶剂诸如二甲基甲酰胺(DMF)中在例如0℃至室温的范围内的温度下运行该反应。
化合物6可以从化合物5的还原制备。合适的还原剂包括硼烷吡啶络合物。可以在合适的溶剂诸如乙酸中在例如0℃至室温的范围内的温度下运行该反应。
化合物7可以从化合物6的反应制备。在酸诸如硫酸和乙酸存在的情况下用甲醛进行该反应。
化合物8可以从化合物7的氨基的保护制备。合适的试剂包括BOC酸酐。可以在合适的溶剂诸如四氢呋喃(THF)中在例如0℃至室温的范围内的温度下运行该反应。
核心1可以从化合物8的脱氢制备。合适的试剂包括DDQ (2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌)。可以在合适的溶剂诸如四氢呋喃(THF)中在例如0℃至室温的范围内的温度下运行该反应。
可以通过氨基的脱保护和然后与酰基卤反应而从核心1制备化合物10。如果保护基为BOC，则可以在酸性条件下进行氨基的脱保护。然后与酰基卤的反应可以产生化合物10。可以在合适的溶剂诸如二甲基甲酰胺(DMF)中在例如0℃至室温的范围内的温度下运行该反应。
可以通过酰化反应诸如Friedel Crafts酰化反应从化合物10制备化合物11。在该反应中，在合适的溶剂诸如二氯甲烷中在例如30℃至100℃的范围内的温度下，酰基卤与化合物10反应。然后使产物与醇和碱反应以形成酯，如化合物11中。
化合物11和化合物3反应以形成1H-吡咯-2,5-二酮化合物。反应在惰性有机溶剂诸如二甲基甲酰胺、四氢呋喃等中且在碱诸如叔丁醇钾存在的情况下实施。
合成方案
合成方案1
Figure 483966DEST_PATH_IMAGE100
合成方案2
Figure 246386DEST_PATH_IMAGE101
合成方案3
Figure 365652DEST_PATH_IMAGE102
合成方案4
Figure 820904DEST_PATH_IMAGE103
合成方案5
Figure 720727DEST_PATH_IMAGE104
合成方案6
Figure 723055DEST_PATH_IMAGE105
合成方案7
Figure 759144DEST_PATH_IMAGE106
合成方案8
Figure 385298DEST_PATH_IMAGE107
合成方案9
Figure 710100DEST_PATH_IMAGE108
合成方案10
Figure 814322DEST_PATH_IMAGE109
合成方案11
Figure 970497DEST_PATH_IMAGE110
合成方案12
Figure 705235DEST_PATH_IMAGE111
实验程序：
中间体2的合成.
Figure 314071DEST_PATH_IMAGE112
向中间体 1 (20 g, 213 mmol)在MeCN (540 mL)中的溶液中添加(E)-4-氧代-丁烯酸乙酯(28.6 g, 223 mmol)。将该反应混合物加热至80℃并搅拌6小时。在减压下浓缩反应混合物，通过快速柱色谱(用1:0至200:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化残余物，以得到作为棕色固体的粗制中间体2 (25 g)。
中间体3的合成.
Figure 487563DEST_PATH_IMAGE113
向粗制中间体2 (25 g)在MeOH (100 mL)中的溶液中添加NH3/MeOH (6 M, 100 mL)。将该混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入EtOAc (500 mL)中，然后过滤。将滤饼真空干燥以得到作为棕色固体的中间体3(13g，两个步骤为35%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 8.30 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.60 (s br,1H), 7.54 (d, J=5.2Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.19-7.23 (m, 1H), 7.06 (s br, 1H),6.89-6.93 (m, 1H), 3.80 (s, 2H)。
中间体5的合成.
Figure 435928DEST_PATH_IMAGE114
在0℃下向中间体4 (100 g, 0.51 mol)在DMF (1000 mL)中的溶液中添加NaH (60%,61 g, 1.53 mol)。将该混合物在室温下搅拌20分钟。在0℃下将2-氯乙胺盐酸盐(89.2 g,0.77 mol)分批添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (600 mL × 3)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到作为黄色油的中间体5(110 g, 90 %)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.74-7.75 (d, 1H, J=1.2 Hz), 7.21-7.29 (m, 2H), 7.13-7.14 (d, 1H. J=3.2Hz), 6.44-6.45 (d, 1H, J=2.8Hz), 4.14-4.17 (t, 2H, J=6 Hz), 3.08-3.11(t, 2H, J=6 Hz)。
中间体6的合成.
Figure 403884DEST_PATH_IMAGE115
在N2下在室温下向中间体5 (150 g, 0.63 mol)在AcOH (720 mL)中的溶液中添加硼烷-吡啶络合物(9.3 M, 135.5 mL, 1.26 mol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。将该混合物用NaOH水溶液调节至pH = 9-10，用EtOAc (800 mL × 3)萃取。真空浓缩合并的有机相以得到粗制化合物。将水(720 mL)添加至该粗制化合物，然后缓慢添加浓HCl (240 mL)。将该混合物在室温下搅拌30分钟，用NaOH水溶液调节至pH = 10-11，用EtOAc(800 mL×3)萃取，浓缩以得到粗制化合物。在室温下向该粗制化合物在甲基叔丁基醚(500 mL)中的溶液中添加AcOH (28 mL)。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后过滤，将滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，干燥，以得到作为白色固体的中间体6(120g，63.5%)。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 7.14 (s, 1H), 7.09-7.12 (d, 1H, J=8.4 Hz), 6.43-6.45 (d, 1H, J=8.4 Hz), 3.33-3.37 (t, 2H, J=8.4 Hz), 3.06-3.09(t, 2H, J=6.6 Hz), 2.87-2.92 (t, 2H, J=8.4 Hz), 2.76-2.79 (t, 2H, J=6.6 Hz)。
中间体7的合成.
Figure 500016DEST_PATH_IMAGE116
在室温下向H2SO4 (12.6 mL)在AcOH (80 mL)和HCHO(37%水溶液，660mL)中的溶液中分批添加中间体6 (100 g, 0.33 mol)。将该混合物在50℃下搅拌20分钟。然后将该混合物用NaOH水溶液调节至pH = 9-10，用EtOAc (800 mL × 3)萃取，浓缩以得到作为黄色固体的粗制中间体7 (100 g)，将其直接用于下一步而无需纯化。
中间体8的合成.
Figure 382259DEST_PATH_IMAGE117
在室温下向中间体7(100g，粗品)和K2CO3水溶液(300 mL, 1 M)在THF (700 mL)中的混合物添加(Boc)2O (94.4 g)。将该混合物在室温下搅拌过夜。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后添加H2O，用EtOAc (500 mL ×3)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用50:1至5:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体8(75g, 两个步骤为64.6%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.11 (bs, 1H), 6.99 (bs, 1H), 4.30-4.37 (m, 2H), 3.68 (m, 2H), 3.36-3.40 (m, 2H), 2.96-3.01 (m, 4H), 1.41 (s,9H)。
核心1的合成.
Figure 513026DEST_PATH_IMAGE118
在N2下在0℃下向中间体8 (49 g, 0.14 mol)在THF (490 mL)中的溶液中添加DDQ(37.9 g, 0.17 mol)在THF (490 mL)中的溶液。将该混合物在0℃下搅拌15分钟。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入Na2CO3水溶液中并用EtOAc (400 mL ×2)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用50:1至10:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的核心1 (24 g, 49%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.63 (bs, 1H), 7.04-7.15 (m, 2H),6.46-6.47 (d, 1H, J=3.2 Hz), 4.76-4.83 (m, 2H), 4.25 (m, 2H), 3.92 (m, 2H),1.42-1.45 (m, 9H)。
中间体10的合成
Figure 651883DEST_PATH_IMAGE119
在室温下向核心1 (10 g, 28.5 mmol)在二氯甲烷(100 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(7 M, 50 mL)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。真空浓缩溶剂以得到白色固体。
在低于5℃下向该白色固体和1-哌啶酰氯(4.6 g, 31.3mmol)在DMF (100 mL)中的溶液中添加Et3N (8.6 g, 85.5 mmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EA (200 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用20:1至1:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体10 (7.5 g, 72.8%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.86 (d, J=1.6Hz, 1H), 7.26 (s, 1H),7.02 (t, J=1.6Hz, 1H), 6.47 (d, J=3.2Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.22-4.20 (t, J =4.8Hz, 2H), 3.98-4.00 (t, J = 4.8Hz, 2H), 3.18-3.19 (m, 4H), 1.58-1.40 (m,6H)。
中间体11的合成.
Figure 172994DEST_PATH_IMAGE120
在N2下在0℃下向中间体10 (10 g, 27.6 mmol)在二氯甲烷(100 mL)中的溶液中添加(COCl)2 (8.8 g, 69 mmol)。将该混合物在40℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后在N2下在-60℃下添加NaOMe (3.7 g, 69 mmol)在MeOH (10 mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌1小时。添加水，用二氯甲烷(100 mL×3)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用5:1至1:2的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体11 (6 g, 48.5%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 8.70 (d, J = 1.6Hz, 1H), 8.29 (s,1H), 7.41 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 4.41-4.39 (m, 2H), 4.01-3.98 (m, 2H), 3.95(s, 3H), 3.15-3.01 (m, 4H), 1.60-1.40 (m, 6H)。
核心2的合成.
Figure 422710DEST_PATH_IMAGE121
在0-10℃下向中间体11 (10 g, 22.3 mmol)和中间体3 (3.9 g, 22.3 mmol)在DMF(180 mL)中的溶液中添加t-BuOK (6.4 g, 19.0 mmol)在THF (100 mL)中的溶液。将该混合物在0-10℃下搅拌15分钟。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用10:5:1至1:1:1的石油醚/EtOAc/THF洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的核心2 (6.5 g, 50.7%)。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.91(s, 1H), 7.65-7.68 (d, J = 6.8Hz, 1H), 7.59-7.61 (d, J = 6.8Hz, 1H), 7.19-7.23 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.55-6.58 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.08(s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.50-4.62 (m, 2H), 3.82-3.86 (m, 2H), 2.94-3.06 (m,4H), 1.40-1.60 (m, 6H)。
LC/MS M+1=573.1。
中间体12的合成.
Figure 407983DEST_PATH_IMAGE122
在N2下在室温下向核心1 (10 g, 28.5 mmol)在DMF (200 mL)中的溶液中添加CuI(5.4 g, 28.5 mmol)和2,2-二氟-2-(氟磺酰基)乙酸甲酯(19.2 g, 100 mmol)。将该混合物在80℃下搅拌2.5小时。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。将该混合物冷却至室温，并过滤。向滤液中添加水并用EtOAc (100 mL ×4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用20:1至5:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体12 (5.5 g, 56.7%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.81 (s, 1H), 7.13-7.28 (m, 2H), 6.62(s, 1H), 4.92-4.84 (m, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.98-3.97 (m, 2H), 1.40 (s, 9H)。
中间体13的合成.
Figure 655425DEST_PATH_IMAGE123
在N2下向中间体12 (5.0 g, 14.7 mmol)在二氯甲烷(75 mL)中的溶液中添加(COCl)2(4.6 g, 36.7 mmol)。将该混合物在40℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后在N2下在-60℃下添加NaOMe (1.98 g, 36.7 mmol)在MeOH (10 mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌1小时。添加水，用二氯甲烷(100 mL ×3)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用10:1至5:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体13 (3.8g, 60.7%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 8.64 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.40-7.31(m, 1H), 4.98-4.88 (m, 2H), 4.51-4.50 (m, 2H), 4.04-4.01 (m, 2H), 3.96 (s,3H), 1.40 (s, 9H)。
中间体14的合成.
Figure 726149DEST_PATH_IMAGE124
在0-10℃下向中间体13 (5.5 g, 12.9 mmol)和中间体3 (2.25 g, 12.9 mmol)在DMF(110 mL)中的溶液中添加tBuOK (3.6 g, 32.2 mmol)在THF (10 mL)中的溶液。将该混合物在0-10℃下搅拌15分钟。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用100:1至30:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的中间体14 (3.5 g, 58.3%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 8.16 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.96 (s,1H), 7.35 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.12-7.08 (m, 2H)), 6.40-6.38 (m, 2H, 4.89-4.77 (m, 2H), 4.50 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 1.48-1.37 (m, 9H)。
化合物I-1的合成.
Figure 779556DEST_PATH_IMAGE125
在室温下向中间体14 (5 g, 9.1 mmol)在二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(50 mL, 7M)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。真空浓缩溶剂以得到白色固体。
在室温下向该白色固体和1-哌啶酰氯(1.8 g, 12.3mmol)在DMF (40 mL)中的溶液中添加Et3N (2.49 g, 24.6 mmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用20:1至10:1的二氯甲烷/THF洗脱)纯化该残余物以得到作为红色固体的化合物I-1 (3.0 g, 70%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.30 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.93(s, 1H), 7.64-7.60 (m, 2H), 7.19 (s, 1H), 6.56 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 4.77-4.69 (m, 2H), 4.68-4.60 (m, 2H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.10-2.90 (m, 4H), 1.55-1.35 (m, 6H)。
LC/MS M+1 563.1。
化合物I-2的合成.
Figure 557019DEST_PATH_IMAGE126
在室温下向核心2 (5 g, 8.7 mmol)在N-甲基-2-吡咯烷酮(50 mL)中的溶液中添加CuCN (2.5 g, 28 mol)。在N2下在150℃下搅拌该混合物6小时。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用1:0至50:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的化合物I-2 (2.2 g, 49%)。
1H NMR (DMSO-d 6): δ (ppm) 11.30 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.97 (s, 1H),7.66-7.68 (d, 1H，J = 9.2 Hz), 7.54-7.56 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.29 (s, 1H),7.19-7.23 (t, J = 8 Hz, 1H), 6.53-6.57 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.44 (s, 1H),4.68 (S, 4H), 4.60-4.63 (m, 4H), 3.84-3.88 (m, 2H), 2.96-3.05 (m, 4H), 1.43-1.47 (m, 6H)。
LC/MS M+1 520.1。
中间体15的合成.
Figure 37679DEST_PATH_IMAGE127
向核心1 (50 g, 0.14 mol)在1,4-二氧杂环己烷(500 mL)中的溶液中添加NaI (42.7g, 0.28 mol)和CuI (2.7g)以及2-二甲基氨基乙胺(2.5g)。在N2下于140℃下搅拌该混合物过夜。将混合物过滤，用二氯甲烷洗涤滤饼。真空浓缩合并的有机相。将残余物用甲基叔丁基醚洗涤以得到作为黄色固体的中间体15 (50 g, 88.0%)。
中间体16的合成.
Figure 330120DEST_PATH_IMAGE128
在室温下向中间体15 (10 g, 25.1mmol)在Et3N (120 mL)和THF(60mL)中的溶液，然后在N2下添加Pd(PPh3)2Cl2 (1.2g, 2.4mmol)和CuI (1.2g, 2.4mmol)。然后逐滴添加乙炔基三甲基硅烷(4.75g, 48.4mmol)。在60℃下搅拌该混合物过夜。真空浓缩该混合物以移除Et3N。然后将该混合物倒入冰水中，用CH2Cl2 (300 mL ×2)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用100:1至50:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体16 (6 g, 64.8 %)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.63-7.67 (m, 1H), 7.04-7.41 (m, 2H),6.46-6.49 (m, 1H), 4.77-4.84 (m, 2H), 4.23-4.29 (m, 2H), 3.90-3.97 (m, 2H),1.43 (s, 9H), 0.26 (s, 9H)。
中间体17的合成.
Figure 623436DEST_PATH_IMAGE129
在N2下在0℃下向中间体16 (10 g, 27 mmol)在二氯甲烷(110 mL)中的溶液中添加(COCl)2 (8.5 g, 67.4 mmol)。将该混合物在40℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。然后在N2下在-60℃下添加NaOMe (3.64 g, 67.4 mmol)在MeOH (10 mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌1小时。添加水，用二氯甲烷(100 mL ×3)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用100:1至5:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体17 (7 g, 56.7%)。
中间体18的合成.
Figure 317722DEST_PATH_IMAGE130
在0-10℃下向中间体17 (8 g, 17.6 mmol)和中间体3 (3.1 g, 17.6 mmol)在DMF(80 mL)中的溶液中添加tBuOK (4.9 g, 44 mmol)在THF (30 mL)中的溶液。将该混合物在0-10℃下搅拌15分钟。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用100:1至50:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的中间体18 (5 g, 49%)。
中间体19的合成.
Figure 969284DEST_PATH_IMAGE131
在室温下向中间体18 (5 g, 8.6 mmol)在二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(50 mL, 7M)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。真空浓缩溶剂以得到白色固体。
在室温下向该白色固体和1-哌啶酰氯(1.4 g, 9.5mmol)在DMF (50 mL)中的溶液中添加Et3N (2.6 g, 25.8 mmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到粗制中间体19 (5.2 g)，将其直接用于下一步而无需纯化。
化合物I-3的合成.
Figure 952283DEST_PATH_IMAGE132
向粗制中间体19 (5.2 g)在DMF(100mL)中的溶液中添加K2CO3 (2 g)。将该混合物加热至50℃并搅拌1小时。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用100:1至30:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为红色固体的化合物I-3(3g，两个步骤为18.6%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.26 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.92(s, 1H), 7.65-7.59 (m, 2H), 7.20 (t, 1H, J = 8Hz), 6.97 (s, 1H), 6.58-6.55(t, J = 6.8Hz, 1H), 6.18 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.50-4.60 (m, 2H), 3.80-3.90(m, 2H), 3.75 (s, 1H), 2.95-3.05 (m, 4H), 1.46-1.35 (m, 6H)。
LC/MS M+1 519.2。
化合物I-10的合成
Figure 347492DEST_PATH_IMAGE133
在N2下在室温下向核心2 (5 g, 8.8 mmol)在二氧杂环己烷(50 mL)中的溶液中添加乙酰胺(3.1 g, 53.3 mmol)、CuI (1.1 g, 5.8 mmol)、K3PO3 (5.5 g, 26.4 mmol)。将该混合物在室温下搅拌20分钟。在N2下添加N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(1.56 g, 17.8 mmol)，然后将该混合物在115℃下搅拌5小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc/THF (3/1, 100 mL ×4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用200:1至50:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为红色固体的化合物I-10 (3 g, 62%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.21 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.58-7.64 (m, 2H), 7.17-7.21 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.00(s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.56-6.58 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 4.60 (s, 2H), 4.40-4.50(m, 2H), 3.80-3.88 (m, 2H) , 2.88-3.12 (m, 4H), 1.85 (s, 3H) , 1.15-1.20 (m,6H)。
LC/MS M+1 552.2。
化合物I-4的合成.
Figure 896285DEST_PATH_IMAGE134
在室温下向化合物I-10 (3 g, 5.4 mmol)在EtOH (10 mL)中添加HCl (28 mL, 6 N)。将该混合物在80℃下搅拌3小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用二氯甲烷(100 mL ×2)萃取，然后用Na2CO3水溶液将水相调节至pH =9-10，用二氯甲烷(100 mL ×6)萃取，真空浓缩。将残余物用甲基叔丁基醚洗涤，过滤。将滤饼真空干燥以得到作为红色固体的化合物I-4 (2.1 g, 75 %)。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 11.19 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.84(s, 1H), 7.62 (bs, 2H), 7.18-7.22 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 6.57-6.61 (t, 1H, J =6.8 Hz), 6.24 (s, 1H), 5.27 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.36-4.39 (m, 2H), 4.14-4.17 (m, 2H), 3.75-3.78 (m, 2H), 2.88-3.05 (m, 4H), 1.44-1.48 (m, 6H)。
MS/LC M+1 511.1。
中间体22的合成.
Figure 922010DEST_PATH_IMAGE135
在室温下向中间体21 (100 g, 0.59 mol)在干燥甲苯(890 mL)中的溶液中添加n-BuOH (131.6 g, 1.78 mol)和TsOH (10 g)。将该混合物在120℃下搅拌过夜，并用Dean-stark装置除去水。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。将该混合物真空浓缩以得到粗制中间体22。通过快速柱色谱(用100:1至20:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该粗制中间体22以得到作为黄色油的中间体22 (120 g, 67.8%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.89-7.92 (dd, 1H, J=4.8Hz, 8.8 Hz),7.51-7.54 (dd, 1H, J=2.8Hz, 9.6Hz), 7.09-7.14 (m, 1H), 6.04 (s, 1H), 3.50-3.56 (m, 4H), 1.55-1.62 (m, 4H), 1.33-1.42 (m, 4H), 0.83-0.93 (m, 6H)。
中间体23的合成.
Figure 189044DEST_PATH_IMAGE136
在-40℃下向中间体22 (50 g, 0.17 mol)在干燥THF (1500 mL)中的溶液中逐滴添加乙烯基溴化镁溶液(1 M, 668.8 mL, 668.8 mmol)。将该混合物在-40℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入NH4Cl水溶液中，用EtOAc (300mL ×3)萃取，将有机相浓缩以得到粗制化合物。通过快速柱色谱(用100:1至20:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该粗制化合物以得到作为黄色油的化合物(24 g)。在室温下向该化合物(24 g)在THF (100 mL)中的溶液中逐滴添加HCl (0.5 N, 80 mL)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC (石油醚/EtOAc=5/1)显示反应完成。将该混合物用NaOH水溶液调节至pH=10，用EtOAc (300 mL ×3)萃取，真空浓缩以得到作为黄色固体的中间体23 (16 g, 58.8%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 10.06 (s, 1H), 7.62 (dd, 1H, J=2Hz,9.2Hz), 7.38-7.41 (m, 2H), 6.60(t, 1H, J=2.4Hz)。
中间体24的合成.
Figure 122365DEST_PATH_IMAGE137
在N2下在室温下向中间体23 (140 g, 0.86 mol)在MeOH (2100 mL)中的溶液中添加2-氨基乙醇(78 g, 1.3 mol)和Pd/C (14 g)。在N2下在室温下搅拌该混合物2小时。然后在H2下在室温下将该混合物搅拌过夜。将混合物过滤、浓缩以得到作为黄色油的中间体24(200g，粗品)，将其直接用于下一步而无需纯化。
中间体25的合成.
Figure 728926DEST_PATH_IMAGE138
在室温下向中间体24(90g，粗品)和K2CO3 (467 mL, 1 M)在THF (1300 mL)中的混合物中添加Boc2O (141 g)。将该混合物在室温下搅拌过夜。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后添加H2O，用EtOAc (500 mL ×3)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用10:1至1:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色油的中间体25(66.6g，两个步骤为56%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 10.17 (s, 1H), 7.23-7.26 (m, 2H),6.78-6.82 (dd, 1H, J = 9.2 Hz, J=2 Hz), 6.48-6.50 (t, 1H, J=2.4Hz), 4.67 (s,2H), 3.66-3.71 (m, 2H), 3.25-35 (m, 2H), 1.40 (s, 9H)。
中间体26的合成.
Figure 987869DEST_PATH_IMAGE139
在N2下在0℃下向中间体25 (50 g, 0.26 mol)在THF (1000 mL)中的溶液中添加Et3N(79 g, 0.79 mol)和Ms2O (55 g, 0.32 mol)。将该混合物在0℃下搅拌2小时。TLC (石油醚/EtOAc=3/1)显示反应完成。然后将其倒入冰水中并用EtOAc (400 mL × 2)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到作为黄色油的中间体26(50 g,79%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 10.08 (bs, 1H), 7.24-7.29 (m, 2H),6.81-6.84 (m, 1H), 6.49-6.50 (d, 1H, J=2.4Hz), 4.67 (s, 2H), 4.28-4.31 (m,2H), 3.48-3.52 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 1.51 (s, 9H)。
中间体27的合成.
Figure 476620DEST_PATH_IMAGE140
在0℃下向中间体26 (65 g, 0.19 mol)在DMF (722 mL)中的溶液中添加NaH (60%,11.5 g, 0.29 mol)。在N2下在0℃下搅拌该混合物1小时。TLC (石油醚/EtOAc=3/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (500 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用50:1至10:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为黄色固体的中间体27 (26 g, 53.2%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.14-7.16 (d, 1H, J=8Hz), 7.07 (s,1H), 6.72-6.83 (m, 1H), 6.48-6.49 (d, 1H, J=2.8Hz), 4.84 4.76 (s, 2H), 4.24-4.25 (m, 2H), 3.94 (m, 2H), 1.45-1.48 (m, 9H)。
中间体28的合成.
Figure 915429DEST_PATH_IMAGE141
在N2下在0℃下向中间体27 (27.5 g, 95.0 mmol)在二氯甲烷(900 mL)中的溶液中添加(COCl)2 (18 g, 142 mmol)。将该混合物在0℃下搅拌2小时。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后在N2下在-60℃下添加NaOMe (13.4 g, 247 mmol)在MeOH (40.8 mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌1小时。添加水，用二氯甲烷(200 mL ×3)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用20:1至1:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到中间体28 (20 g, 56%)的白色固体。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 8.37 (s, 1H), 8.02-8.04 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.84-6.91 (m, 1H), 4.80-4.90 (m, 2H), 4.44 (bs, 2H), 3.91-3.98 (m,5H), 1.41-1.46 (m, 9H)。
中间体29的合成.
Figure 438814DEST_PATH_IMAGE142
在0-10℃下向中间体28 (10 g, 26.5 mmol)和中间体3 (4.6 g, 26.5 mmol)在DMF(120 mL)中的溶液中添加tBuOK (7.4 g, 66.2 mmol)在THF (100 mL)中的溶液。将该混合物在0-10℃下搅拌15分钟。TLC (石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用20:1至1:1的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为红色固体的中间体29 (7 g, 52.5%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.07 (s, 1H), 8.02-8.01 (d, 1H, J=4Hz), 8.96 (s, 1H), 7.61-7.63 (t, 1H, J=8.8Hz), 7.45 (s, 1H), 7.17 (s, 1H),6.57-6.64 (m, 1H), 6.47-6.49 (d, 1H, J=8Hz), 5.77-5.80 (d, 1H J =8.4Hz), 4.734.78 (2H), 4.52 (bs, 2H), 3.96 (bs, 2H), 1.25-1.44 (m, 9H)。
核心3的合成.
Figure 603079DEST_PATH_IMAGE143
在室温下向中间体29 (5 g, 9.9 mmol)在二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(50 mL, 7M)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。真空浓缩溶剂。将残余物用甲基叔丁基醚洗涤，过滤。将滤饼真空干燥以得到作为橙色固体的核心3 (4 g, 91.9%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.59 (s, 1H), 10.46 (bs, 2H), 8.49(s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.08-8.12 (m, 2H, J=14Hz), 7.88-7.92 (t, 1H, J=8.0Hz),7.25-7.29 (t, 1H, J=6.8Hz), 7.04-7.07 (m, 1H), 6.22-6.25 (m, 1H), 4.76 (bs,2H), 4.62 (bs, 2H), 3.68 (bs, 2H)。
中间体31的合成.
Figure 782388DEST_PATH_IMAGE144
在室温下向中间体30 (20 g, 94 mmol)在二氧杂环己烷(100 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(100 mL, 7M)。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(石油醚/EtOAc=3/1)显示反应完成。将该混合物倒至甲基叔丁基醚(300 mL)上，并过滤。将滤饼真空干燥以得到作为白色固体的中间体31盐酸盐(8 g, 57%)。
中间体32的合成.
Figure 323091DEST_PATH_IMAGE145
在室温下向中间体31盐酸盐(7 g, 47 mmol)在二氯甲烷(180 mL)中的溶液中添加Et3N (14.2 g, 141 mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃ ~10℃下将三光气(5.6 g, 19 mmol)在二氯甲烷(20 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物用NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将该粗制产物真空蒸馏以得到作为无色油的中间体32 (2.5 g, 30.5%)。
化合物I-5的合成.
Figure 700982DEST_PATH_IMAGE146
在室温下向核心3 (5 g, 11.45 mmol)在DMF(70 mL)中的溶液中添加Et3N (3.5 g,34.35 mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃~10℃下将中间体32 (3.6 g,20.5 mmol)在DMF(5 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。将该混合物倒入冰水中并用甲基叔丁基醚萃取以移除杂质，然后用EtOAc (100 mL×5)萃取。将合并的EtOAc相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到作为橙色固体的粗制化合物I-5(4.5g，粗品)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.3 (s, 1H), 9.58 (s, 1H), 8.05(s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.65 (d, 1H, J=8.8Hz ), 7.60 (d, 1H, J=6.8Hz ), 7.21(t, 1H, J=8Hz), 6.78 (d, 1H, J=9.6Hz), 6.58 (t, 1H, J=6.8Hz), 5.62 (d, 1H, J=2Hz), 4.64 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.21-3.37 (m, 2H), 2.73-2.76(m, 2H), 1.75-1.76 (m, 2H), 1.33-1.47 (m, 3H)。
化合物I-6的合成.
Figure 239411DEST_PATH_IMAGE147
在低于5℃下向粗制中间体33(4.5 g)在THF(100 mL)中的溶液分批添加NaBH4 (0.16g, 4.2 mmol)。添加后，将该反应混合物在低于5℃下搅拌0.5小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用200:1至30:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的化合物I-6(3g，两个步骤为48%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.92(s, 1H), 7.64-7.66 (d, 1H, J=8.8Hz ), 7.59-7.61 (d, 1H, J=6.4Hz ), 7.18-7.22(t, 1H J=8Hz), 6.78-6.80 (d, 1H, J=9.6Hz), 6.56-6.59 (t, 1H J=6.8Hz), 5.62-5.65 (d,d, 1H J=2Hz J=10Hz), 4.63 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.45-4.47 (t, 2H, J=5.2Hz), 3.85 (s, 2H), 3.40-3.43 (d, 2H J=12.4Hz), 3.23-3.26 (t, 2H, J=4.8Hz),2.58-2.65 (t, 2H, J=12Hz), 1.55-1.58 (d, 2H J=12.8Hz), 1.47-1.48 (d, 1H J=6.4Hz), 1.05-1.13 (m, 2H)。
LC/MS M+1 543.1。
中间体35的合成.
Figure 702753DEST_PATH_IMAGE148
在室温下向中间体34盐酸盐(8.6 g, 55.0 mmol)在二氯甲烷(240 mL)中的溶液中添加Et3N (16.7g, 165.0mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃ ~10℃下将三光气(6.5g, 22.0 mmol)在二氯甲烷(20 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物用NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将该粗制产物真空蒸馏以得到作为无色油的中间体35 (4.2 g, 42%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 3.80-3.85 (bs, 2H), 3.71-3.75 (bs,2H), 2.01-2.11 (m, 4H)。
化合物I-7的合成.
Figure 47147DEST_PATH_IMAGE149
在室温下向核心3 (3 g, 6.8 mmol)在DMF(40 mL)中的溶液中添加Et3N (2.1 g,20.6 mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃ ~10℃下将中间体35 (1.4 g,7.5 mmol)在DMF(5 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。将该混合物倒入冰水中并用甲基叔丁基醚萃取以移除杂质，过滤。将滤饼用水(100 mL × 3)洗涤，用二氯甲烷(200 mL)溶解，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到作为橙色固体的化合物I-7 (2.2 g, 58%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.91(s, 1H), 7.62-7.66 (m, 2H), 7.19-7.23 (t, 1H, J=8Hz), 6.84-6.86 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.58-6.61 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.63-5.66 (d, 1H, J=8.0Hz), 4.70 (s, 2H),4.58 (bs, 2H), 3.90 (bs, 2H), 3.15 (bs, 4H), 1.93-1.96 (m, 4H)。
LC/MS M+1 549.1。
中间体37的合成.
Figure 545124DEST_PATH_IMAGE150
在室温下向中间体36盐酸盐(15 g, 100 mmol)在二氯甲烷(430 mL)中的溶液中添加Et3N (30.6g, 300 mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃ ~10℃下将三光气(11.9 g, 40 mmol)在二氯甲烷(20 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物用NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将该粗制产物真空蒸馏以得到作为无色油的中间体37 (9.2 g, 52%)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 4.40 (s, 2H), 3.90-3.94 (d, 2H, J=13.2Hz), 3.41-3.44 (d, 1H, J=13.2Hz), 3.23-3.36 (d, 1H, J=12.8Hz), 1.90-2.04(m, 2H), 1.80-1.86 (m, 2H)。
化合物I-8的合成
Figure 988875DEST_PATH_IMAGE151
在室温下向核心3 (3 g, 6.8 mmol)在DMF(40 mL)中的溶液中添加Et3N (2.1 g,20.6 mmol)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。然后在0℃ ~10℃下将中间体37 (1.3g,7.5 mmol)在DMF(5 mL)中的溶液中添加至该混合物。将该混合物在室温下搅拌2小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=10/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL ×4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用200:1至50:1的二氯甲烷/MeOH洗脱)纯化该残余物以得到作为橙色固体的化合物I-8 (2.3g, 62%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.92(s, 1H), 7.60-7.66 (m, 2H), 7.20-7.24 (t, 1H, J=7.6Hz), 6.80-6.82 (d, 1H, J=9.2Hz), 6.57-6.59 (t, 1H J=6.8Hz), 5.64-5.67 (d, 1H J=10Hz), 4.60 (s, 2H),4.54 (bs, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.84 (bs, 2H), 3.20-3.24 (d, 2H J=12.8Hz), 3.01-3.04 (d, 2H, J=12Hz), 1.74 (s, 4H)。
LC/MS M+1 541.1。
中间体39的合成.
Figure 205093DEST_PATH_IMAGE152
向中间体38 (20 g, 113 mmol)在MeOH (100 mL)中的溶液中添加HCl/MeOH (4 M,100 mL)，然后室温下搅拌过夜。真空浓缩该混合物。向滤液中添加水(500 mL)，然后用EtOAc (200 mL ×4)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩以得到作为棕色固体的粗制中间体39 (21 g)，将其直接用于下一步而无需纯化。
中间体40的合成.
Figure 87598DEST_PATH_IMAGE153
向粗制中间体39 (21 g)在MeOH (100 mL)中的溶液中添加NH3/MeOH (6 M, 100 mL)。将该混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入EtOAc (500 mL)中，然后过滤。将滤饼真空干燥以得到作为米白色固体的中间体40(8 g，两个步骤为40%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 7.86 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.80 (s br,1H), 7.72 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.62-7.66 (m, 1H), 7.37-7.41 (m, 1H), 7.22 (s br,1H), 3.88 (s, 2H)。
中间体41的合成.
Figure 876301DEST_PATH_IMAGE154
在0-10℃下向中间体28 (10 g, 26.5 mmol)和中间体40 (4.6 g, 26.5 mmol)在DMF(120 mL)中的溶液中添加tBuOK (7.4 g, 66.2 mmol)在THF (100 mL)中的溶液。将该混合物在0-10℃下搅拌15分钟。TLC(石油醚/EtOAc=1/1)显示反应完成。然后将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱(用10:5至1:2的石油醚/EtOAc洗脱)纯化该残余物以得到作为红色固体的中间体41 (5 g, 37.5%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.07 (s, 1H), 8.02-8.01 (d, 1H, J=4Hz), 8.96 (s, 1H), 7.61-7.63 (t, 1H, J=8.8Hz), 7.45(s, 1H), 7.17 (s, 1H),6.57-6.64 (m, 1H), 6.47-6.49 (d, 1H, J=8Hz), 5.77-5.80 (d, 1H, J=8.4Hz),4.73-4.78 (d, 2H), 4.52 (bs, 2H), 3.96 (bs, 2H), 1.25-1.44 (m, 9H)。
中间体42的合成.
Figure 553270DEST_PATH_IMAGE155
在室温下向中间体41 (5 g, 9.9 mmol)在二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(50 mL, 7M)。将该混合物在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。浓缩溶剂以得到作为橙色固体的中间体42 (4 g, 92%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.59 (s, 1H), 10.46 (s, 1H), 8.49(s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.08-8.12 (m, 2H, J=14Hz), 7.88-7.92 (t, 1H, J=8.4Hz),7.25-7.29 (t, 1H, J=13.6Hz), 7.04-7.07 (t, 1H, J=10 Hz), 6.22-6.25 (m, 1H),4.76 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.45 (s, 2H), 3.68 (s, 2H)。
化合物I-9的合成.
Figure 928887DEST_PATH_IMAGE156
在室温下向中间体42 (2 g, 4.9 mmol)和1-哌啶酰氯(1.1 g, 7.4 mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加Et3N (1.5 g, 14.9 mmol)。将该混合物在室温下搅拌30分钟。TLC(二氯甲烷/MeOH=15/1)显示反应完成。将该混合物倒入冰水中并用EtOAc (100 mL × 4)萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物用甲基叔丁基醚洗涤，过滤。将滤饼真空干燥以得到作为橙色固体的化合物I-9 (1.1 g, 43.1%)。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.48 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.83-7.86 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.68-7.76 (m, 1H), 7.35-7.39 (t, 1H, J=7.6 Hz), 6.89-6.92 (m, 1H), 6.04-6.07 (m, 1H), 4.66 (s, 2H), 4.57-4.65 (bs, 2H), 3.83-3.90(m, 2H), 3.01-3.05 (m, 4H), 1.46-1.49 (m, 6H)。
LC/MS M+514.1。
化合物I-12的合成.
可使用3,3-二氟哌啶作为起始材料，以与化合物I-7类似的方式合成化合物I-12。
1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.93(s, 1H), 7.58-7.66 (m, 2H), 7.18-7.23 (t, 1H, J=8Hz), 6.81-6.79 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.58-6.61 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.65-5.67 (d, 1H, J=8.0Hz), 4.66 (s, 2H),4.56 (bs, 2H), 3.88 (bs, 2H), 3.31-3.64 (bs, 2H), 3.07 (bs, 2H), 1.96-2.01(bs, 2H), 1.69 (bs, 2H)。
LC/MS M+1 549.1。
化合物I-13的合成.
化合物I-13如合成方案9中所示。
Figure 615083DEST_PATH_IMAGE157
中间体44的合成的方式类似于中间体47，产率为43.1 %。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.47 (9H, s), 1.91-1.94 (2H, m), 3.37-3.56(4H, m), 4.40-4.70 (1H, m), 4.71-4.74 (1H, m)。
中间体45的合成：
Figure 822074DEST_PATH_IMAGE158
中间体45的合成的方式类似于中间体48，粗品。
化合物I-13的合成：
Figure 873206DEST_PATH_IMAGE159
化合物I-13的合成方式类似于化合物I-19，两个步骤的产率为20.7 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.45-1.48 (1H, d, J = 9.2 Hz), 1.54-1.56(1H, d, J = 9.2 Hz), 2.71-2.73 (1H, d, J = 9.2 Hz), 2.88-2.90 (1H, d, J = 8.4Hz), 2.97-2.99 (1H, d, J = 9.6 Hz), 3.35-3.37 (1H, d, J = 8.0 Hz), 3.49 (1H,s), 3.75-3.76 (1H, m), 3.90-3.92 (1H, m), 4.04 (1H, s), 4.46-4.50 (1H, m),4.58-4.74 (3H, m), 5.60-5.62 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.60-6.63 (1H, m), 6.78-6.80 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.20-7.24 (1H, m), 7.63-7.66 (2H, m), 7.90 (1H, s),8.06 (1H, s)。
LCMS纯度为> 95%, Rt = 2.55 min; MS计算值：525.5；MS实测值：526.2 [M+1]+。
化合物I-14的合成.
化合物I-14可以类似于化合物I-8的方式合成。
LC/MS M+1 548.2。
化合物I-15的合成.
化合物I-15可以类似于化合物I-7的方式合成。
LC/MS M+1 556.2。
化合物I-16的合成.
化合物I-16可以类似于化合物I-7的方式合成。
LC/MS M+1 556.2。
化合物I-17的合成.
化合物I-17可以类似于化合物I-7的方式合成。
LC/MS M+1 599.2。
化合物I-18的合成.
化合物I-18可以类似于化合物I-8的方式合成。
LC/MS M+1 591.2。
化合物I-19的合成.
Figure 798437DEST_PATH_IMAGE160
向中间体46 (1.0g, 4.67mmol)在DCM(25mL)中的溶液中添加Et3N (1.41g,14.0mmol)。搅拌悬浮液并在0~10℃下用DCM (5mL)中的三光气(0.55g, 1.87mmol)逐滴处理。完成添加后，将悬浮液在室温下搅拌2小时。将反应混合物倒入冰水(20 mL)中，用DCM萃取，并用NaHCO3(水溶液)、盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，以得到作为无色油的中间体47 (0.6 g, 46.5 %)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.20-1.27 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.72-1.79(3H, m), 2.84-2.90 (1H, m), 3.03-3.09 (3H, m), 4.32-4.35 (2H, m), 4.66 (1H,br s)。
化合物I-19的合成：
Figure 22745DEST_PATH_IMAGE161
向核心3 (1.0 g, 2.29 mmol)在DMF (13 mL)中的溶液中添加Et3N (0.70 g, 6.87mmol)。在0~10℃下搅拌该悬浮液并用DCM (2 mL)中的中间体47 (0.70 g, 2.52 mmol)逐滴处理。完成添加后，将悬浮液在室温下搅拌2小时。将该反应混合物倒入冰水(60 mL)中，过滤并真空浓缩以得到作为红色固体的中间体48 (1.0g，粗品)。
化合物I-19的合成
Figure 287504DEST_PATH_IMAGE162
在室温下向中间体48(1.0g，粗品)在DCM (30mL)中的溶液中添加HCl/二氧杂环己烷(10 mL，8 mol/L) ，并将混合物在室温下搅拌2小时。过滤该反应混合物，将滤饼溶解于水中，用Na2CO3(水溶液)调节至pH=8~9，并再次过滤，用水洗涤并真空浓缩以得到作为红色固体的化合物I-19(130mg，两个步骤为10.5%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.03-1.11 (2H, m), 1.13-1.62 (3H, m), 2.44-2.82 (4H, m), 3.41-3.44 (2H, m), 3.85 (2H, m), 4.54 (2H, m), 4.64 (2H, m),5.64-5.66 (1H, d, J = 9.6 Hz), 6.56-6.58 (1H, m), 6.78-6.81 (1H, m), 7.19-7.23 (1H, m), 7.60-7.66 (2H, m), 7.92 (1H, s), 8.06 (1H, s)。
LCMS纯度为>95%, Rt = 2.77 min; MS计算值：541.6; MS实测值：542.2([M+1]+。
化合物I-20的合成.
Figure 571855DEST_PATH_IMAGE163
向中间体49 (15 g, 130.2 mmol)在DCM (1.5 L)中的溶液中添加Et3N (19.8 g,195.3 mmol)和DMAP (0.8 g, 6.5 mmol)。在0~10℃下搅拌该悬浮液并用叔丁基二苯基氯硅烷(53.7 g, 195.3 mmol)逐滴处理。完成添加后，将悬浮液在室温下搅拌5小时。将反应混合物倒入冰水(500mL)中，用DCM (300 mL×2)萃取，并用盐水(300mL×2)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩以得到作为黄色油的中间体50(30g，粗品)。
中间体51的合成：
Figure 718803DEST_PATH_IMAGE164
向中间体50(30g，粗品，84.8mmol)在DCM (900mL)中的溶液中添加Et3N (25.8g,254.5mmol)。搅拌悬浮液并在0~10℃下用DCM (50mL)中的三光气(10.1g, 33.9mmol)逐滴处理。完成添加后，将悬浮液在室温下搅拌2小时。将反应混合物倒入冰水(300mL)中，用DCM萃取，并用NaHCO3(水溶液)、盐水洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，以得到作为无色油的中间体51 (3.1g, 8.8%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.05 (9H, s), 1.22-1.29 (2H, m), 1.78-1.83(3H, m), 2.84-2.90 (1H, m), 3.01-3.07 (1H, m), 3.50-3.51 (2H, d, J = 5.6 Hz),4.30-4.34 (2H, m), 7.36-7.45 (6H, m), 7.62-7.64 (4H, m)。
中间体52的合成：
Figure 183020DEST_PATH_IMAGE165
向马来酰亚胺核心(1.6 g, 3.28 mmol)在DMF (15 mL)中的溶液中添加Et3N (1.0 g,9.84 mmol)。在0~10℃下搅拌悬浮液并用DCM (5mL)中的中间体51 (1.5g, 3.60mmol)逐滴处理。完成添加后，将悬浮液在室温下搅拌2小时。将反应混合物倒入冰水(80mL)中，过滤并将滤饼用水和MTBE洗涤，真空浓缩以得到作为红色固体的中间体52(0.98g，粗品)。
化合物I-20的合成：
Figure 364603DEST_PATH_IMAGE166
在室温下向中间体52(0.98 g，粗品)在THF (20 mL)中的溶液中添加THF (10 mL)中的TBAF (0.56 g, 1.77 mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。将该反应混合物倒入冰水(40 mL)中，过滤，并将滤饼真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化以得到作为橙色固体的化合物I-20 (160 mg, 22.8 %)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.05-1.13 (2H, m), 1.48-1.58 (3H, m), 2.54-2.67 (2H, m), 3.23-3.26 (2H, m), 3.40-3.44 (2H, m), 3.87-3.90 (2H, m) 4.44-4.47 (1H, m) 4.62-4.69 (2H, m), 4.72 (2H, s), 6.31 (1H, s), 6.53-6.56 (1H,m), 7.14-7.20 (2H, m), 7.60-7.64 (2H, m), 7.92 (1H, s), 8.16 (1H, s), 11.29(1H, s)。
LCMS纯度为>95%, Rt = 2.87 min; MS计算值：592.6; MS实测值：593.2([M+1]+。
化合物I-21的合成.
Figure 819855DEST_PATH_IMAGE167
中间体53的合成的方式类似于中间体52，粗品。
化合物I-21的合成：
Figure 719678DEST_PATH_IMAGE168
化合物I-21的合成与化合物I-20相同，产率为28.6 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.08-1.13 (2H, m), 1.47-1.56 (1H, m), 1.56-1.59 (2H, m), 2.58-2.65 (2H,m), 3.23-3.26 (2H, m), 3.40-3.43 (2H, m), 3.86(2H, s), 4.45-4.61 (1H, m), 4.61(2H, s), 4.68 (2H, s), 6.44 (1H, s), 6.53-6.57 (1H, m), 7.19-7.24 (1H, m), 7.28 (1H, s), 7.54-7.56 (1H, d, J = 6.8 Hz),7.67-7.69 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.98 (1H,s), 8.08 (1H, s), 11.32 (1H, s)。
LCMS纯度为> 95%, Rt = 3.41 min; MS计算值：549.6; MS实测值：550.2[M+1]+。
化合物I-22、23、24、25、27的合成可以类似于化合物I-7的方式合成。
化合物I-26的合成。
化合物I-26可以如合成方案11中所示合成。
化合物I-28的合成。
化合物I-28可以如合成方案12中所示合成。
化合物I-29、30的合成可以类似于非氚化材料的方式通过利用适当的氚化起始材料进行合成。
施用
在某些实施方案中，药物制剂适合于将药物局部施用于发生脱发的皮肤区域。可以使用液体、凝胶或泡沫制剂。也可能局部应用活性成分或采用递送方案的组合。
注射方案包括通过渗透泵，或通过与植入的生物材料组合，和更优选地，通过注射或输注。可以辅助控制药物的释放动力学和分布的生物材料包括水凝胶材料、可降解材料。最优选地使用的一类材料包括原位胶凝材料。其他材料包括胶原或其他天然材料，包括纤维蛋白、明胶和去细胞化的组织。明胶海绵(gelfoam)也可能是合适的。
还可以通过替代方式来增强递送，所述替代方式包括、但不限于添加到递送的组合物中的试剂，诸如渗透促进剂，或者可以通过超声、电穿孔或高速喷射装置。
关于人和兽医治疗，所施用的特定试剂的量可以取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和病症的严重程度；采用的具体试剂的活性；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；采用的具体试剂的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体试剂组合或并用的药物；处方医师或兽医的判断；和医学和兽医学领域中已知的类似因素。
本文描述的试剂可以以治疗有效量施用于需要治疗的受试者。
本文所述的化合物的施用可以经由任何合适的施用途径，尤其是皮内、经口或局部施用。其他途径包括：摄取，或可替换地胃肠外地，例如静脉内地、动脉内地、腹膜内地、鞘内地、心室内地、尿道内地、胸骨内地、颅内地、肌肉内地、鼻内地、皮下地、舌下地、透皮地，或通过吸入或吹入法，或局部施用以通过皮肤吸收。这样的施用可以是单个或多个口服剂量，限定数量的滴耳剂，或快速推注，多次注射，或作为短期或长期输注。可植入装置(例如，可植入输注泵)也可以用于在一段时间内周期性地胃肠外递送等同或不同剂量的特定制剂。对于这种胃肠外施用，优选地将所述化合物配制为在水或其他合适的溶剂或溶剂混合物中的无菌溶液。所述溶液可以含有其他物质，诸如盐、糖(特别是葡萄糖或甘露醇)，以使所述溶液与血液等渗；缓冲剂，诸如乙酸、柠檬酸和/或磷酸及它们的钠盐；和防腐剂。
通过许多足以将所述化合物递送至具有毛损失的皮肤区域的方法，可以施用本文描述的化合物和组合物。
如本文用于施用本发明的组合物的“接触”是指在一些实施方案中使皮肤、在一个实施方案中头皮、眉毛等与一种或多种化合物、因子、细胞等接触。在另一个实施方案中，该术语是指将一种或多种化合物、因子、细胞等嵌入目标皮肤区域。在另一个实施方案中，该术语是指将一种或多种化合物、因子、细胞等注入目标皮肤区域。在另一个实施方案中，该术语是指本领域中已知的任何其他类型的接触。各可能性代表本发明的单独的实施方案。
在另一个实施方案中，施用一种或多种本发明的化合物的方法中的接触步骤包括使目标皮肤区域与化合物、RNA、蛋白等直接接触。在另一个实施方案中，所述接触步骤包括经由接触所述受试者的另一部位或组织间接地接触目标皮肤区域，其后，所述化合物、RNA或蛋白通过生物过程(例如，扩散、主动运输、或流体、诸如血液、淋巴液、组织液等中的循环)运输至目标皮肤区域。各可能性代表本发明的单独的实施方案。
在特定实施方案中，局部地施用本发明的化合物、组合物和制剂，这意味着，它们不是全身施用。
在某些实施方案中，将本文提供的组合物施用于有此需要的受试者一次。在某些实施方案中，将本文提供的组合物施用于有此需要的受试者超过一次。在某些实施方案中，本文提供的组合物的第一次施用之后是本文提供的组合物的第二次、第三次、第四次或第五次施用。
向有此需要的受试者施用化合物的次数取决于医学专业人员的判断、所述障碍、所述障碍的严重程度和受试者对制剂的应答。在某些实施方案中，将本文中公开的化合物向具有轻度急性病症的有此需要的受试者施用一次。在某些实施方案中，将本文中公开的化合物向具有中度或重度急性病症的有此需要的受试者施用超过一次。在受试者的病症没有改善的情况下，根据医生的判断，可以长期施用化合物，也就是说，持续延长的时间段，包括贯穿受试者的生命持续期间，以便改善或者以其他方式控制或限制受试者的疾病或病症的征状。
在受试者的状况确实改善的情况下，根据医生的判断，可以连续地施用化合物；可替换地，可以将所施用的药物的剂量暂时减小或暂时停止一段时间(即，“休药期”)。休药期的长度在2天至1年之间变化，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天和365天。在休药期中的剂量减小可以为从10％至100％，仅举例而言，包括10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%。
一旦受试者的毛密度或毛生长已经改善，如果必要的话，可以施用维持剂量。随后，作为征状的函数，任选地将剂量或施用频率或二者减小至使改善的疾病、障碍或病症得以保留的水平。在某些实施方案中，在征状的任何复发后，受试者需要长期的间歇性治疗。
在某些实施方案中，所述药物制剂还可以含有选自Notch活化剂、HDAC抑制剂、BMP4拮抗剂、Noggin(抑制BMP4)、Sox2、维生素D(骨化三醇)、维生素B(烟酰胺)、维生素A、维生素C (pVc)、 Lgr4、p38/MAPK抑制、ROCK抑制和/或Alk4/7抑制的额外药剂。在某些实施方案中，所述药物制剂还可以含有表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或其组合。
药物组合物
本公开提供了包含本发明化合物的药物制剂。本发明化合物可以方便地配制成与生物学上可接受的介质、诸如水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)或其合适的混合物一起施用。可以根据药物化学家众所周知的程序凭经验确定所选介质中的活性成分的最佳浓度。如本文所用，“生物学上可接受的介质”包括可能适合于药物制剂的期望施用途径的任何和所有溶剂、分散介质等。这种介质用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或药剂与本发明化合物的活性不相容，考虑将其用于本发明的药物制剂中。合适的媒介物及其包含其他蛋白的制剂描述于例如the book Remington'sPharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack PublishingCompany, Easton, Pa., USA 1985)。这些媒介物包括可注射的“沉积制剂”。
本发明的药物制剂还可以包括兽医组合物，例如，本发明化合物的药物制剂，其适合于兽医用途，例如，用于治疗牲畜，诸如山羊、马、绵羊等，或家畜，例如，狗、猫、兔等，或其他动物，诸如猿、猴和黑猩猩。
本发明化合物可以配制用于以任何方便的方式施用用于人或兽药中。在某些实施方案中，药物制剂中包括的化合物本身可以是活性的，或者可以是例如在生理环境下能够转化为活性化合物的前药。
本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种上述组分。如在下面详细描述的，本发明的药物组合物可以被专门地配制成以固体或液体形式施用，包括适于下面施用的那些：(1)口服施用，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)，片剂，大丸剂，粉剂，颗粒剂，应用于舌的糊剂；(2)胃肠外施用，例如，通过皮下、肌内或静脉内注射来进行施用，例如为无菌溶液或混悬液；(3)局部施用，例如，为霜剂、膏剂，或应用于皮肤的喷雾剂；或(4)阴道内或直肠内施用，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂。然而，在某些实施方案中，本发明化合物可以简单地溶解或悬浮于无菌水中。在某些实施方案中，所述药物制剂是非热原的，即，不升高患者的体温。如本文所用的短语“治疗有效量”意味着本发明的化合物、材料或包含化合物的组合物有效地在动物中的细胞的至少亚群中产生某些期望治疗作用且由此以适用于任何药物治疗的合理的益处/风险比阻断该途径在处理的细胞中的生物学后果的量。
短语“药学上可接受的”在本文中用于是指这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料，其可用于制备本发明化合物的医药或治疗有用的组合物。每种载体在与该制剂的其他成分可相容的意义上必须是“可接受的”并且不会对患者产生损害。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)在药物制剂中采用的其他无毒相容的物质。
如上所述，本发明化合物的某些实施方案可以含有碱性官能团，诸如氨基或烷基氨基，且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在最终分离和纯化本发明的化合物期间原位制备，或者可以通过单独地使游离碱形式的纯化的本发明化合物与合适的有机酸或无机酸进行反应，并分离出由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如，Berge等人 (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.66:1-19)。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括所述化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如，来自无毒有机酸或无机酸的盐。例如，这样的常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸(salicyclic)、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸(isothionicacid)等。
在其他情况下，本发明化合物可含有一个或多个酸性官能团，且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在最终分离和纯化化合物过程中原位制备，或者可以通过单独地使游离酸形式的纯化化合物与合适的碱诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，与氨，或者与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺进行反应而制备。代表性碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见，例如，Berge等，同上)。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于所述组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括: (1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的制剂包括适用于口服、鼻、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外施用的那些。该制剂可以方便地以单位剂型的形式存在并且可以以药学领域众所周知的任何方法来制备。可以与载体材料混合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、特定的施用方式。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量一般为所述化合物产生治疗效果的量。一般而言，在100%计量方式中，该量的范围为约1%至约99%的活性成分，优选为约5%至约70%，最优选为约10%至约30%。
制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的化合物与载体和任选的一种或多种辅助成分混合的步骤。一般而言，该制剂如下进行制备：将本发明的化合物与液体载体或微粉化的固体载体或两者一起均匀、密切混合，然后，如果必要，使该产品成形。
适于经口施用的本发明的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂形式，或者为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液，或者为水包油或油包水乳液剂，或者为酏剂或糖浆剂，或者为软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶)和/或为漱口剂等，其各自包含预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的化合物还可以作为大丸剂、干药糖剂(electuary)或糊剂施用。
在用于经口施用的本发明的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣剂、粉剂、颗粒剂、含片(trouches)等)中，活性成分可以与一种或多种药学上可接受的载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任何以下物质混合在一起：(1)填充剂或膨胀剂，诸如淀粉类、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和皂土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及其混合物；(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述药物组合物还可以包含缓冲剂。使用赋形剂诸如乳糖(lactose)或乳糖类(milk sugars)以及高分子量聚乙二醇，相似类型的固体组合物也可以被用作软和硬填充的明胶胶囊剂中的填充剂。
片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分一起进行压制或模塑来进行制备。压制片可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模塑片剂可以通过在合适的机器中对用惰性稀释剂润湿的粉状化合物的混合物进行模塑来制备。本发明的药物组合物的片剂和其他固体剂型，诸如糖衣剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以任选地划有刻痕或者可以被制备成具有包衣和壳，诸如肠包衣及药物配制领域中众所周知的其他包衣。还可以使用例如用于提供所需释放谱的各种比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球将它们配制成使得其中的活性成分缓慢或受控释放。它们可以通过例如如下除菌：用截留细菌的滤器进行过滤，或者并入无菌固体组合物形式的除菌剂，其可以在临使用前被溶解于无菌水或其他一些可注射无菌介质中。这些组合物还可以任选地含有遮光剂，并且可以是仅在或者优选在胃肠道的某些部位任选以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡类。所述活性成分还可以为微囊化形式，如果适当的话，可以含有一种或多种上述赋形剂。
用于本发明化合物的经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，该液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，诸如例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂以外，经口组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和混悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
除了所述活性化合物以外，混悬液还可以含有混悬剂，例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯类、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂和黄蓍胶，以及它们的混合物。
用于直肠或阴道施用的本发明药物组合物的制剂可以为栓剂的形式，所述栓剂可以通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的无刺激性的赋形剂或载体混合进行制备，所述赋形剂或载体包含例如可可豆脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，并且所述栓剂在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此，将在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。
可用于阴道施用的本发明的制剂还包括含有本领域已知适当的这样的载体的阴道栓、棉塞(tampons)、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
本发明化合物的用于局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体，以及与任何防腐剂、缓冲剂或可能需要的推进剂混合。
除了本发明的活性化合物以外，膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮类、皂土类、硅酸、滑石粉和氧化锌，或它们的混合物。除了本发明化合物以外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂，诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常用推进剂，诸如氯氟烃类和挥发性的未被取代的烃类，诸如丁烷和丙烷。
经皮贴剂具有可以使本发明化合物以受控形式递送至机体的额外优点。这样的剂型可以通过将本发明的化合物溶解或分散于合适的介质中来制备。还可以用吸收促进剂来增加本发明的化合物通过皮肤的通量。可以通过提供控速膜或者将所述化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制这样的通量的速率。
可用于本发明的药物组合物中的合适的水性或非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油诸如橄揽油，以及可注射的有机酯类诸如油酸乙酯。合适的流动性可以例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持期望的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的影响。在所述组合物中包含等渗剂，诸如糖类、氯化钠等也可能是期望的。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的作用，期望减缓药物从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体混悬液来实现。药物的吸收率则取决于其溶出速率，其又可取决于晶体大小和晶形。或者，可以通过将药物溶解或混悬于油性媒介物中来延迟胃肠外施用的药物形式的吸收。
可注射的储库形式可以通过形成本发明的化合物在可生物降解的聚合物诸如聚交酯-聚乙醇酸交酯中的微囊化基质来制备。根据药物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的储库制剂也可以通过将药物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
当本发明的化合物可以作为药物被施用于人和动物时，它们可以以其本身的形式或者药物组合物的形式施用，所述组合物含有例如约0.1%至99.5%(更优选约0.5%至90%)的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
一种或多种本发明的化合物向动物饲料中的添加可以通过制备含有有效量活性化合物的适当的饲料预混合物并将预混合物并入完全日粮中来完成。
或者，可将含有活性成分的中间浓缩物或饲料添加剂共混至饲料中。可用于制备和施用这样的饲料预混合物及完全日粮的方式描述于参考书(诸如"Applied AnimalNutrition", W.H. Freedman and CO., San Francisco, U.S.A., 1969或"LivestockFeeds and Feeding" O and B books, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977)中。
具有泊洛沙姆的组合物
在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含：a)本发明的化合物和b)泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述药物组合物的pH为约5和约9之间。在某些实施方案中，所述药物组合物的pH为约5、6、7、8或9。
在某些实施方案中，在泊洛沙姆存在的情况下的化合物的溶解度是在相同pH下在泊洛沙姆不存在的情况下的化合物的溶解度的约3倍。在某些实施方案中，在泊洛沙姆存在的情况下的化合物的溶解度是在相同pH下在泊洛沙姆不存在的情况下的化合物的溶解度的约2、3、4或5倍。
在某些实施方案中，所述药物制剂还可以含有泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子型三嵌段共聚物，其由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链构成。泊洛沙姆经常被认为是“功能性赋形剂”，因为它们是必要的组分并且在制剂中发挥重要作用。
在一些实施方案中，泊洛沙姆包括泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407中的至少一种。在一些实施方案中，泊洛沙姆包括泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407中的两种或更多种的混合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种泊洛沙姆的混合物包含泊洛沙姆407和泊洛沙姆124。在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆包含泊洛沙姆188和泊洛沙姆407中的至少一种或其混合物。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407。
在一些实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的约5 wt%和约25wt%之间。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的约10 wt%和约23wt%之间。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的约15 wt%和约20wt%之间。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的约17 wt%。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的约21 wt%。
在一些实施方案中，所述泊洛沙姆可以浓度为相对于所述组合物的21wt %和40wt %之间。在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的21wt %和30wt %之间。在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的23 wt %和29wt %之间。在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的23 wt %和27wt %之间。在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆的浓度为相对于所述组合物的25 wt %。
在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为大于约10℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约11℃和约32℃之间。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约15℃和约30℃之间。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约20℃和约28℃之间。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约24℃和约26℃之间。
在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约15℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约20℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约24℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约26℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约28℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约30℃。在一些实施方案中，所述药物组合物的胶凝温度为约32℃。
实施例
材料和方法
使用真皮乳头的干细胞增殖测定法
真皮乳头(DP)增殖细胞培养测定法是指用于定量在测定结束时测量的真皮乳头(DP)球状体的数目、DP球状体的大小或细胞培养物中的DP细胞的数目的细胞培养方法。DP细胞是指表达碱性磷酸酶(AP)和/或多功能蛋白聚糖和/或波形蛋白和/或Sox2和/或CD133的细胞。
使用真皮乳头的干细胞增殖测定法的方案如下：
基础培养基：DMEM/高葡萄糖培养基和F12，其补充有N2 1X、B27 1X、硫酸链霉素(100 µg/ml)、两性霉素B(2.5 µg/ml)和1mM Hepes。
使用显微解剖从样本移取完整的毛囊。将完整的毛囊在具有1 mg/ml 1型胶原酶的TrypLE™ (Thermo Fisher Scientific)(使用0.2µm注射器过滤器除菌)中在37℃下孵育40 min。然后将处理的毛囊使用200 µl移液器尖头研磨>30X。将体积用1X PBS调节至1ml。然后将处理的毛囊通过40 µm细胞过滤器，以获得单细胞悬浮液。
将二十µl应用于细胞计数器，以测定每1 ml的细胞数。将剩余的细胞悬浮液在4℃下以1,000xg离心5分钟。
制备补充有生长因子(50 ng/ml的IGF、EGF和FGF2)的标准培养基。将细胞以120,000个细胞/ml悬浮于具有生长因子的标准培养基中，并将250 µl (30,000个细胞)应用于24-孔板(Corning Costar, 3534)的每个孔中。
每种处理条件都以2X浓度制备，其足够用于250 µl/孔，最终稀释度为500 µl中1x。对于全部，最终DMSO浓度为约0.2%。
将250 µl 2X处理培养基应用于每个孔，以具有每孔500 µl的最终培养基体积。每孔的最终处理浓度为1X。最终细胞密度是每孔30,000个细胞。
将细胞在37℃下孵育，并监测生长10天。
在培养的第0、5、7和10天拍摄EVOS®透射光图像。
在培养的第10天收集球状体用于免疫印迹、qPCR或流式细胞术。或者，可以将球状体应用至包被有聚-1-赖氨酸的玻璃底皿，用于碱性磷酸酶(AP)染色、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色和/或针对DP标志物(例如波形蛋白、Sox2、多功能蛋白聚糖、CD133)的免疫荧光，用于显微镜检查。
或者，可以使用显微镜检查评价细胞或集落以比较跨条件的DP特性。
DP毛囊培养测定法
真皮乳头(DP)毛囊培养测定法是指当在测定结束测量时使用完整的毛囊来定量真皮乳头(DP)细胞的数目或毛囊内的DP区域的大小的方法。DP细胞是表达碱性磷酸酶(AP)和/或多功能蛋白聚糖和/或波形蛋白和/或Sox2和/或CD133的细胞。
DP毛囊培养测定法的方案如下：
基础培养基：DMEM/高葡萄糖培养基和F12，其补充有N2 1X、B27 1X、硫酸链霉素(100 µg/ml)、两性霉素B(2.5 µg/ml)和1mM Hepes。
使用显微解剖从样本移取完整的毛囊。将每个毛囊修剪成靠近毛囊顶点，并转移至具有HBSS的新鲜皿。将200 µl 1X PBS应用于24-孔板的孔中。用200 µl移液器切大口径，将毛囊小心地分布于孔中，每孔3-5个毛囊。
通过移液小心地从孔除去PBS，留下完整的毛囊。将0.5 ml补充有生长因子(50ng/ml的IGF、EGF和FGF2)和期望的小分子的培养基应用于每个孔。
将毛囊在37℃下孵育，并监测生长7天。
在0 DIV和7 DIV拍摄EVOS®透射光图像。
在7 DIV处理毛囊，用于碱性磷酸酶(AP)染色、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU染色)和/或针对DP标志物(例如波形蛋白、Sox2、多功能蛋白聚糖、CD133)的免疫荧光，用于显微镜检查。
可以分析DP标志物阳性的总区域染色，并且可以随时间监测毛干生长。
实施例1
如上文在材料和方法中所述实施使用真皮乳头的干细胞增殖测定，并且通过光学显微镜分析DP集落。将图1A-图1D中显示的DP细胞培养8天。在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的集落(图1A)。与在对照条件下处理的DP细胞相比，用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)处理的DP细胞显示略微更大和更丰富的集落(图1B)。与在对照条件下处理的DP细胞相比，用Wnt活化剂(CHIR99021 4 µM)处理的DP细胞显示更丰富的集落。Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(CHIR99021 4 µM)的组合显示许多大的DP集落。因此，Shh和Wnt活化促进真皮乳头(DP)生长和毛发生长诱导。
实施例2
如上文在材料和方法中所述实施使用真皮乳头的干细胞增殖测定，并且通过光学显微镜分析DP集落。将图2A-图2D中显示的DP细胞培养10天。在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的集落(图2A)。与在对照条件下处理的DP细胞相比，用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)处理的DP细胞显示略微更大和更丰富的集落(图2B)。与在对照条件下处理的DP细胞相比，用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)处理的DP细胞显示更丰富的集落。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合处理的DP细胞显示许多大的DP集落(图2D)。因此，用多种Wnt活化分子的Shh途径活化促进DP(真皮乳头)生长和毛发生长诱导(参见实施例1和本实施例)。
实施例3
如上文在材料和方法中所述实施使用真皮乳头的干细胞增殖测定，并且通过光学显微镜分析DP集落。用单独的Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1μM)处理的DP细胞形成集落(图3A)。与用单独的嘌吗啡胺处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7 10 nM)和Shh途径活化剂(嘌吗啡胺1 µM)处理的DP细胞形成更多的集落，并且更大(图3D)。用单独的Shh途径活化剂(SAG 3 nM)处理的DP细胞形成集落(图3B)。与用单独的SAG处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7 10 nM)和Shh途径活化剂(SAG 3 nM)处理的DP细胞形成更多更大的集落(图3E)。用单独的Shh途径活化剂(SAG HCl 500 nM)处理的DP细胞形成集落(图3C)。与用单独的SAG HCl处理的集落相比，用GSK3抑制剂(化合物I-7 10 nM)和Shh途径活化剂(SAG HCl)处理的DP细胞形成更多更大的集落(图3F)。因此，多种Shh分子与Wnt活化促进DP生长和毛发生长诱导。
实施例4
如上文在材料和方法中所述实施使用真皮乳头的干细胞增殖测定，并且通过碱性磷酸酶(AP)染色分析DP集落。碱性磷酸酶是DP细胞的标志物，并且用于显示具有毛发诱导能力的DP细胞。将图4A-图4D中显示的DP细胞培养10天。在对照条件下处理的DP细胞显示小且少的碱性磷酸酶(Alp)集落(图4A)。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺1 μM)处理的DP细胞显示很少的Alp集落(图4B)。用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)处理的DP细胞显示很少的Alp集落(图4C)。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合处理的DP细胞显示大且许多的Alp集落(图4D)。因此，Shh和Wnt活化促进真皮乳头(DP)生长和毛发生长诱导。
实施例5
如上文在材料和方法中所述实施使用真皮乳头的干细胞增殖测定，并且通过针对DP细胞标志物的表达的免疫荧光和通过针对细胞分裂的EdU染色分析DP集落。将图5A-图5D中显示的DP细胞培养10天。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂的组合处理的DP细胞生成表达DP标志物波形蛋白的集落(图5A)。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合处理的DP细胞生成表达毛发诱导的DP标志物波形蛋白的集落，并且EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)染色表明集落在这些条件下活跃地分裂(图5B)。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合处理的DP细胞生成表达DP和干细胞标志物Sox2的集落(图5C)。用Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1 µM)和Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)的组合处理的DP细胞生成表达毛发诱导的DP标志物CD133的集落(图5D)。因此，Shh和Wnt活化促进真皮乳头(DP)生长和毛发生长诱导。
实施例6
如上文在材料和方法中所述实施DP毛囊细胞培养测定，并且通过碱性磷酸酶(AP)染色分析DP毛囊。碱性磷酸酶是DP细胞的标志物，并且用于显示具有毛发诱导能力的DP细胞。将图6A-图6B中显示的DP毛囊培养7天。对照处理的毛囊显示在毛囊的基部处的碱性磷酸酶(Alp)(图6A)。用Wnt活化剂(化合物I-7 10 nM)和Shh途径活化剂(嘌吗啡胺 1μM)处理的毛囊显示较大的DP(图6B)。因此，Shh和Wnt活化促进真皮乳头(DP)生长和毛发生长诱导。
实施例7
用于局部递送的制剂
表7. 示例性制剂
Figure 223471DEST_PATH_IMAGE169
。
储备溶液的制备：
组分A制备
20%泊洛沙姆407组分A媒介物储备溶液的制备。
为了制备1.5 L的蒸馏水中的20%泊洛沙姆407，将300g泊洛沙姆407溶解于1L蒸馏水中。将溶液在冷室中以300 rpm搅拌过夜。将刻度量筒和蒸馏水预冷。添加蒸馏水以得到1.5 L的最终体积，并将溶液储存在4℃。
泊洛沙姆407媒介物储备溶液：
用于TA0-TA7的媒介物PP5：
对于800 ml媒介物PP5(用于5%最终DMSO制剂的泊洛沙姆407/PEG媒介物)，将720 ml蒸馏水中的20%泊洛沙姆407、16 ml PEG和24 ml蒸馏水合并。制备1.5 ml 弹扣盖管中的1.425 ml等分试样。
用于TA8的媒介物PP1：
对于200 ml媒介物PP1(用于1%最终DMSO制剂的泊洛沙姆407/PEG媒介物)，将180 ml蒸馏水中的20%泊洛沙姆407、4 ml PEG和14 ml蒸馏水合并。制备1.5 ml 弹扣盖管中的1.485ml等分试样。
用于TA9和TA10的媒介物PP0.2：
对于200 ml媒介物PP0.2(用于0.2%最终DMSO制剂的泊洛沙姆407/PEG媒介物)，将180ml蒸馏水中的20%泊洛沙姆407、4 ml PEG和15.6 ml蒸馏水合并。制备1.5 ml 弹扣盖管中的1.497 ml等分试样。
用于TA11和TA12的Lubriderm：
制备5 ml 弹扣盖管中的2.85 ml等分试样。
药物储备物：
100 mM化合物I-7的制备。将109.7 mg化合物I-7溶解于5 ml弹扣盖管中的2 ml DMSO中。将溶液在搅拌水浴(热板设定至80℃)中加热。将溶液涡旋以完全溶解化合物I-7。
10 mM嘌吗啡胺的制备。将125 mg嘌吗啡胺溶解于50 ml锥形管中的25 ml DMSO中。使溶液避光。
50 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺混合物的制备。将274.3 mg化合物I-7溶解于10ml 10 mM嘌吗啡胺中。将溶液在搅拌水浴(热板设定至80℃)中加热，并涡旋以完全溶解。使溶液避光。
100 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺混合物的制备。将109.7 mg化合物I-7溶解于2ml 10 mM嘌吗啡胺中。将溶液在搅拌水浴(热板设定至80℃)中加热，并涡旋以完全溶解。使溶液避光。
组分B制备
对于TA0，将3.5 ml DMSO吸取至5 ml弹扣盖管中。
对于TA1，为了制备DMSO中的50mM化合物I-7，将1.75 ml 100mM化合物I-7添加至5-ml弹扣盖管中的1.75 ml DMSO中。制备100μl等分试样。
对于TA2，为了制备DMSO中的10 mM嘌吗啡胺，将3.5 ml 10mM嘌吗啡胺添加至5-ml弹扣盖管中。制备100μl等分试样。
对于TA3，为了制备DMSO中的0.2 μM化合物I-7和20 μM嘌吗啡胺，将7 μl 0.1 mM化合物I-7和7 μl 10mM嘌吗啡胺添加至5 ml弹扣盖管中的3.493 ml DMSO中。制备100μl等分试样。
对于TA4，为了制备DMSO中的2 μM化合物I-7和200 μM嘌吗啡胺，将70 μl 0.1 mM化合物I-7和70 μl 10mM嘌吗啡胺添加至5 ml弹扣盖管中的3.429 ml DMSO中。制备100μl等分试样。
对于TA5，为了制备DMSO中的20 μM化合物I-7和2 mM嘌吗啡胺，将700 μl 0.1 mM化合物I-7和700 μl 10mM嘌吗啡胺添加至5 ml弹扣盖管中的2.799 ml DMSO中。制备100μl等分试样。
对于TA6，为了制备DMSO中的200 μM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺，将7 μl 100 mM化合物I-7添加至5 ml弹扣盖管中的3.5 ml 10 mM嘌吗啡胺中。制备100μl等分试样。
对于TA7，为了制备DMSO中的50 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺，将3.5 ml的50 mM化合物I-7的混合物与10 mM嘌吗啡胺一起添加至5 ml弹扣盖管中。制备100μl等分试样。
对于TA8，为了制备DMSO中的100 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺，将1 ml的100 mM化合物I-7的混合物与10 mM嘌吗啡胺一起添加至1.5 ml弹扣盖管中。制备100μl等分试样。
对于TA9，为了制备DMSO中的10 μM化合物I-7和1 mM嘌吗啡胺，将50 μl 0.1 mM化合物I-7和50 μl 10mM嘌吗啡胺添加至1.5 ml弹扣盖管中的0.449 ml DMSO中。制备100μl等分试样。
对于TA10，为了制备DMSO中的100 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺，将0.5 ml的100mM化合物I-7的混合物与10 mM嘌吗啡胺一起添加至1.5 ml弹扣盖管中。制备100μl等分试样。
对于TA11，为了制备DMSO中的2 μM化合物I-7和200 μM嘌吗啡胺，将120 μl 0.1mM化合物I-7和120 μl 10mM嘌吗啡胺添加至15 ml锥形管中的5.879 ml DMSO中。制备200μl等分试样。
对于TA12，为了制备DMSO中的50 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺，将6ml的50 mM化合物I-7和10 mM嘌吗啡胺的混合物添加至15 ml锥形管中。制备200μl等分试样。
制剂制备
TA0
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一等分的DMSO，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的等分试样涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将等分试样短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将75 µl DMSO添加至1.425ml媒介物PP5中，并保持在冰上。应用前约5 min，将TA0置于室温。使用正排量式移液管（positive displacement pipette）分配，将200 µl应用于每只动物。
TA1
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一等分的DMSO中的50 mM化合物I-7，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的等分试样涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将等分试样短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将75 µl DMSO中的50mM化合物I-7添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将管保持在冰上(在冰上可变得混浊，但在室温下会澄清)。应用前约5 min，将TA1置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA2
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将75 µl DMSO中的10 mM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA2置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA3
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的0.2 µM化合物I-7和20 µM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将75 µl DMSO中的0.2 µM化合物I-7/20 µM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA3置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA4
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的2 µM化合物I-7/200 µM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将75 µl DMSO中的0.2 µM化合物I-7/200 µM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA4置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA5
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的20 µM化合物I-7/2 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将DMSO中的20 µM化合物I-7/2 mM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5min，将TA5置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA6
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的200 µM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将DMSO中的200 µM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5min，将TA6置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA7
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的50 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP5。将媒介物PP5保持在冰上，将DMSO中的50 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺添加至1.425 ml媒介物PP5中，并涡旋。将管保持在冰上(在冰上可变得混浊，但在室温下会澄清)。应用前约5 min，将TA7置于室温。使用正排量式移液管分配，将200µl应用于每只动物。
TA8
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的100 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP1。将媒介物PP1保持在冰上，将15 µl DMSO中的100 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺添加至1.485 ml媒介物PP1中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA8置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA9
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的10 µM化合物I-7/1 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP0.2。将媒介物PP0.2保持在冰上，将3 µl DMSO中的10 µM化合物I-7/1 mM嘌吗啡胺添加至1.497 ml媒介物PP0.2中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA9置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA10
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的100 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻(~30min)。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
从4℃移取一管媒介物PP0.2。将媒介物PP0.2保持在冰上，将3 µl DMSO中的100mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺添加至1.497 ml媒介物PP0.2中，并涡旋。将该管保持在冰上。应用前约5 min，将TA10置于室温。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA11
在应用当日准备一天的供应。从-20℃移取一管DMSO中的2 µM化合物I-7/200 µM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
将150 µl DMSO中的2 µM化合物I-7/200 µM嘌吗啡胺添加至2.85 ml Lubiderm中。将溶液涡旋。使用正排量式移液管将底部未混合的部分吸取至顶部，并将溶液涡旋并离心。重复该过程，直至混合。通过轻敲管或短暂离心来移取来自管侧的材料。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
TA12
在应用当日准备一天值(足够用于5只动物)的TA12。从-20℃移取一管DMSO中的50 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺，并使其在室温下解冻。将解冻的管涡旋以混合，并且如果存在可见沉淀，则加热(60℃)。如果必要，将该管短暂离心。
在旁边设置一管Lubriderm。
将150 µl DMSO中的50 mM化合物I-7/10 mM嘌吗啡胺添加至2.85 ml Lubiderm中。将溶液涡旋。使用正排量式移液管将底部未混合的部分吸取至顶部，并将溶液涡旋并离心。重复该过程，直至混合。通过轻敲管或短暂离心来移取来自管侧的材料。使用正排量式移液管分配，将200 µl应用于每只动物。
额外的配制方法包括但不限于：乳膏、凝胶、油、液体、喷雾剂、粉末、纳米颗粒、水凝胶、乳剂和emugel(参见以下参考文献)。
关于制剂的参考文献：
Ashni Verma, Sukhdev Singh, Rupinder Kaur, Upendra K Jain. Topical Gelsas Drug Delivery Systems: A Review. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 23(2),2013, 60, 374-382.
Sonam Vats, Charu Saxena, TS Easwari, VK Shukla. Emulsion Based GelTechnique: Novel Approach for Enhancing Topical Drug Delivery of HydrophobicDrugs. International Journal for Pharmaceutical Research Scholars (2014), 3(2), 649-660.
Loveleenpreetkaur Prabhjotkaur和MU. Khan. Topical formulations and Hydro-gel: An overview. International Journal of Advances in Pharmacy, Biology andChemistry (2013), 2(1), 201-206.
Christian Wischke Eckart Rühl Andreas Lendlein. Dermal Drug Delivery byNanocarriers. Journal of Controlled Release 242 (2016) 1–2.
William Wei Lim Chin, Johannes Parmentier, Michael Widzinski, En Hui Tan,Rajeev Gokhale. A Brief Literature and Patent Review of Nanosuspensions to aFinal Drug Product. Journal of Pharmaceutical Sciences, October 2014, Vol.103(10), pp. 2980-2999。
从前面的描述显而易见，可以对本文描述的公开内容做出变化和修改，以使它适应不同的用法和条件。本文描述了用于用在本发明中的方法和材料；还可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。这样的实施方案也是在以下权利要求的范围内。在本文中对变量的任何定义中的要素的列表的列举包括该变量作为任何单个要素或列出的要素的组合(或子组合)的定义。在本文中一个实施方案的列举包括该实施方案作为任何单个实施方案或与任意其他实施方案或其部分组合。在本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用整体并入。尽管本发明已经参照其示例性实施方案进行了特定地阐明和描述，本领域技术人员将理解，可以在其中做出形式和细节的各种变化，而不脱离所附权利要求包括的主题的范围。

Claims (292)

1.扩增毛囊的干细胞的群体的方法，所述方法包括使所述干细胞与一种或多种SonicHedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂接触。
2.促进毛囊上皮细胞的生成的方法，所述方法包括用一种或多种Sonic Hedgehog(Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂处理毛囊的干细胞。
3.治疗具有与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病或处于发展与毛囊上皮细胞的不存在或缺乏相关的疾病的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂。
4.治疗具有秃头症或处于发展秃头症的风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂。
5.权利要求1或2的方法，其中所述干细胞是真皮乳头干细胞。
6.权利要求1或2的方法，其中所述干细胞是毛囊干细胞。
7.权利要求1或2的方法，其中所述干细胞包括角质形成细胞、黑色素细胞、真皮乳头细胞、隆突细胞或其组合。
8.权利要求1或2的方法，其中所述干细胞在受试者中。
9.权利要求3的方法，其中所述疾病选自静止期脱发、生长期脱发、雄激素性脱发、斑秃、头癣、毛发扁平苔藓、瘢痕性脱发、盘状红斑狼疮、秃发性毛囊炎、解剖性头皮蜂窝组织炎、前额纤维化脱发、中央离心瘢痕性脱发、拔毛癖、拉扯性脱发和少毛症。
10.权利要求3或4的方法，其中与未施用一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的受试者相比，施用一种或多种Shh途径活化剂和一种或多种Wnt激动剂的受试者具有改善的毛发生长、改善的头发密度和/或改善的毛囊的再生循环。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约5倍至约1000倍。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约10倍至约100倍。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh途径活化浓度的约20倍至约50倍。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约5倍至约1000倍。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约10倍至约100倍。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约20倍至约50倍。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述一种或多种Shh途径活化剂选自表1或表2。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自表3。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂。
21.权利要求20的方法，其中所述GSK3-α抑制剂选自表5。
22.权利要求20的方法，其中所述GSK3-β抑制剂选自表4。
23.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式I的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R1a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 229702DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 615684DEST_PATH_IMAGE004
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自-CORX1、-SO2RX1、杂芳基和-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-CONHC1-C4烷基、-COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2；
条件是所述化合物不是
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 192159DEST_PATH_IMAGE006
。
24.权利要求23的方法，其中RX是-CORX1。
25.权利要求24的方法，其中RX1是哌啶或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷，其两者任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-(CH2)p-NH2；其中p是1、2或3。
26.权利要求25的方法，其中RX1是哌啶，其任选地被1至2个卤代取代基取代。
27.权利要求26的方法，其中所述哌啶任选地被-(CH2)p-OH取代。
28.权利要求23的方法，其中RX是杂芳基。
29.权利要求28的方法，其中所述杂芳基是单环的或双环的。
30.权利要求28的方法，其中所述杂芳基含有1至3个氮。
31.权利要求23的方法，其中RX是-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)。
32.权利要求31的方法，其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上被1或2个卤素取代。
33.权利要求31的方法，其中所述C3-C8环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
34.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式Ia的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 197155DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 808265DEST_PATH_IMAGE010
和
Figure DEST_PATH_IMAGE011
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；
其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
35.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式Ib的化合物：
Figure 99569DEST_PATH_IMAGE012
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；且条件是当Q1是CH且Q3是C时，Q2不是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 678187DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
和
Figure 736142DEST_PATH_IMAGE016
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
每个Q6独立地选自CRQ6和N；其中CRQ6是氢、卤素、-CN、低级烷基或取代的烷基；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且 m是0、1或2。
36.权利要求23-34中任一项的方法，其中Q1是CH；Q2是N；且Q3是C。
37.权利要求23-35中任一项的方法，其中Q1是N；Q2是C；且Q3是N。
38.权利要求23-35中任一项的方法，其中Q1是CH；Q2是C；且Q3是N。
39.权利要求23-35中任一项的方法，其中Q1是N；Q2是N；且Q3是C。
40.权利要求23-39中任一项的方法，其中R1是氢或卤素。
41.权利要求23-40中任一项的方法，其中R2是卤素。
42.权利要求23-40中任一项的方法，其中R2选自卤素、–CF3、-CN、-C≡CH、-NH2和-NHC(O)CH3。
43.权利要求23-42中任一项的方法，其中R3是氢或卤素。
44.权利要求23和25-43中任一项的方法，其中Ar是
Figure DEST_PATH_IMAGE017
。
45.权利要求23-44中任一项的方法，其中-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-。
46.权利要求23-44中任一项的方法，其中-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。
47.权利要求45或46的方法，其中每个RZ独立地选自氢和卤素。
48.权利要求45或46的方法，其中两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基。
49.权利要求23-46中任一项的方法，其中RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基。
50.权利要求23-44中任一项的方法，其中-Z-W-X-Y-是-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。
51.权利要求23-50中任一项的方法，其中每个RW独立地选自氢和卤素。
52.权利要求23-50中任一项的方法，其中两个RW基团一起形成C3-C6环烷基。
53.权利要求23-52中任一项的方法，其中每个RY独立地选自氢和卤素。
54.权利要求23-52中任一项的方法，其中两个RY基团一起形成C3-C6环烷基。
55.权利要求34-54中任一项的方法，其中RX是RX1，其中RX1是杂芳基。
56.权利要求34-54中任一项的方法，其中RX是-CORX1。
57.权利要求34-54中任一项的方法，其中RX是-SO2RX1。
58.权利要求34-54中任一项的方法，其中RX是-(C1-C4亚烷基)-RX1。
59.权利要求56-58中任一项的方法，其中RX1是C3-C8环烷基。
60.权利要求56-58中任一项的方法，其中RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个作为卤素的取代基取代。
61.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自表6。
62.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12。
63.权利要求1-18和20中任一项的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
64.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
65.权利要求64的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
66.权利要求64的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
67.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
68.权利要求67的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
69.权利要求67的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
70.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
71.权利要求70的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
72.权利要求70的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
73.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
74.权利要求73的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
75.权利要求73的方法，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
76.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
77.权利要求76的方法，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
78.权利要求76的方法，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
79.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
80.权利要求79的方法，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
81.权利要求79的方法，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
82.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
83.权利要求82的方法，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
84.权利要求82的方法，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
85.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
86.权利要求85的方法，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
87.权利要求85的方法，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
88.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
89.权利要求88的方法，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
90.权利要求88的方法，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
91.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
92.权利要求91的方法，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 μM，且SAG的浓度为约1nM至约100 nM。
93.权利要求91的方法，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG的浓度为约1µM至约100 µM。
94.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
95.权利要求94的方法，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
96.权利要求94的方法，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
97.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
98.权利要求97的方法，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
99.权利要求97的方法，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
100.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
101.权利要求100的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
102.权利要求100的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
103.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
104.权利要求103的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
105.权利要求103的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
106.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
107.权利要求106的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
108.权利要求106的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
109.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
110.权利要求109的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且SAGHCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
111.权利要求109的方法，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAGHCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
112.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
113.权利要求112的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
114.权利要求112的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
115.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
116.权利要求115的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
117.权利要求115的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
118.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
119.权利要求118的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
120.权利要求118的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
121.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
122.权利要求121的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
123.权利要求121的方法，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
124.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
125.权利要求124的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
126.权利要求124的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
127.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
128.权利要求127的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
129.权利要求127的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
130.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
131.权利要求130的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
132.权利要求130的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
133.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
134.权利要求133的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
135.权利要求133的方法，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
136.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
137.权利要求136的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
138.权利要求136的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
139.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
140.权利要求139的方法，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
141.权利要求139的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
142.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
143.权利要求142的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
144.权利要求142的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
145.权利要求63的方法，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
146.权利要求145的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
147.权利要求145的方法，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
148.权利要求1-147中任一项的方法，其中在毛囊中的Gli1、Krt15、CD34、Lgr5、Lgr6、Lrig1、Sox2、CD133、波形蛋白、多功能蛋白聚糖和/或碱性磷酸酶的表达增加。
149.药物组合物，所述药物组合物包含：药学上可接受的载体，和(i)Wnt激动剂，或其药学上可接受的盐，和(ii) Sonic Hedgehog (Shh)途径活化剂，或其药学上可接受的盐。
150.权利要求149的药物组合物，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh活化浓度的约5倍至约1000倍。
151.权利要求149或150的药物组合物，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh活化浓度的约10倍至约100倍。
152.权利要求149-151中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Shh途径活化剂的浓度为有效体外Shh活化浓度的约20倍至约50倍。
153.权利要求149-152中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约5倍至约1000倍。
154.权利要求149-153中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约10倍至约100倍。
155.权利要求149-154中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂的浓度为有效体外Wnt激动剂浓度的约20倍至约50倍。
156.权利要求149-155中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Shh途径活化剂选自表1或表2。
157.权利要求149-156中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
158.权利要求149-157中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自表3。
159.权利要求149-158中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂。
160.权利要求159的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂选自表5。
161.权利要求159的药物组合物，其中所述GSK3-β抑制剂选自表4。
162.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式I的化合物：
Figure 952491DEST_PATH_IMAGE018
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R1a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 680275DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
和
Figure 231342DEST_PATH_IMAGE022
；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自-CORX1、-SO2RX1、杂芳基和-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、-CONHC1-C4烷基、-COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2；
条件是所述化合物不是
Figure DEST_PATH_IMAGE023
Figure 76676DEST_PATH_IMAGE024
。
163.权利要求162的药物组合物，其中RX是-CORX1。
164.权利要求163的药物组合物，其中RX1是哌啶或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷，其两者任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-(CH2)p-NH2；其中p是1、2或3。
165.权利要求164的药物组合物，其中RX1是哌啶，其任选地被1至2个卤代取代基取代。
166.权利要求165的药物组合物，其中所述哌啶任选地被-(CH2)p-OH取代。
167.权利要求162的药物组合物，其中RX是杂芳基。
168.权利要求167的药物组合物，其中所述杂芳基是单环的或双环的。
169.权利要求167的药物组合物，其中所述杂芳基含有1至3个氮。
170.权利要求162的药物组合物，其中RX是-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)。
171.权利要求170的化合物，其中所述-(C1-C4亚烷基)-(C3-C8环烷基)在C1-C4亚烷基上被1或2个卤素取代。
172.权利要求170的化合物，其中所述C3-C8环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
173.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式Ia的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure 68903DEST_PATH_IMAGE026
Figure DEST_PATH_IMAGE027
Figure 561064DEST_PATH_IMAGE028
和
Figure DEST_PATH_IMAGE029
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
174.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是式Ib的化合物：
Figure 350160DEST_PATH_IMAGE030
或其药学上可接受的盐或互变异构体，其中：
Q1是CH或N；
Q2是C或N；
Q3是C或N；
其中Q1、Q2和Q3中的至少一者是N；且条件是当Q1是CH且Q3是C时，Q2不是N；
R1选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R1a是C1-C4烷基；
R2选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NH(C1-C4烷基)、-N(C1-C4烷基)2、-NHC(O)R2a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R2a是C1-C4烷基；
R3选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基、-CN、-OH、-O-C1-C4烷基、-NH2、-NHC(O)R3a和-S(O)2NH2；其中所述烷基任选地被1至3个独立地选自卤素和–OH的取代基取代；且其中R3a是C1-C4烷基；
Ar选自
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure 218759DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE033
和
Figure 596650DEST_PATH_IMAGE034
；其中Ar任选地被氘、卤素、烷基、烷氧基和CN取代；
每个Q6独立地选自CRQ6和N；其中CRQ6是氢、卤素、-CN、低级烷基或取代的烷基；
Q7选自S、O、CH2和NRQ7；其中RQ7是氢或任选地取代的C1-C4烷基；
-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-、-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-或-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-；
每个RZ独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
每个RW独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RW基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；
或者RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基；
RX选自氢、RX1、-CORX1、-SO2RX1、-(C1-C4亚烷基)-RX1，且其中所述-(C1-C4亚烷基)-RX1在C1-C4亚烷基上任选地被1至4个卤素取代；
其中RX1是C3-C8环烷基、杂芳基或杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个独立地选自以下的取代基取代：氘、卤素、-[C(RX1a)2]p-CN、-CF3、C1-C4烷基、-(CH2)p-OH、-[C(RX1a)2]p-OH、-[C(RX1a)2]p-O-C1-C4烷基、-NHCOC1-C4烷基、CONHC1-C4烷基、COH、-CO2H、-[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4烷基、-(CH2)p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH2、-[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4烷基、-[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4烷基)2；其中p是0、1、2或3；其中每个RX1a独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RX1a基团一起形成C3-C6环烷基；
每个RY独立地选自氢、氘、卤素和C1-C4烷基，或两个RY基团一起形成C3-C6环烷基或氧代；且
m是0、1或2。
175.权利要求162-173中任一项的药物组合物，其中Q1是CH；Q2是N；且Q3是C。
176.权利要求162-174中任一项的药物组合物，其中Q1是N；Q2是C；且Q3是N。
177.权利要求162-174中任一项的药物组合物，其中Q1是CH；Q2是C；且Q3是N。
178.权利要求162-174中任一项的药物组合物，其中Q1是N；Q2是N；且Q3是C。
179.权利要求162-178中任一项的药物组合物，其中R1是氢或卤素。
180.权利要求162-179中任一项的药物组合物，其中R2是卤素。
181.权利要求162-179中任一项的药物组合物，其中R2选自卤素、–CF3、-CN、-C≡CH、-NH2和-NHC(O)CH3。
182.权利要求162-181中任一项的药物组合物，其中R3是氢或卤素。
183.权利要求162和164-182中任一项的药物组合物，其中Ar是
Figure DEST_PATH_IMAGE035
。
184.权利要求162-183中任一项的药物组合物，其中-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-。
185.权利要求162-183中任一项的药物组合物，其中-Z-W-X-Y-是-C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。
186.权利要求184或185的药物组合物，其中每个RZ独立地选自氢和卤素。
187.权利要求184或185的药物组合物，其中两个RZ基团一起形成C3-C6环烷基。
188.权利要求162-185中任一项的药物组合物，其中RZ和RW与它们所连接的碳一起形成C3-C6环烷基。
189.权利要求162-183中任一项的药物组合物，其中-Z-W-X-Y-是-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-。
190.权利要求162-189中任一项的药物组合物，其中每个RW独立地选自氢和卤素。
191.权利要求162-189中任一项的药物组合物，其中两个RW基团一起形成C3-C6环烷基。
192.权利要求162-191中任一项的药物组合物，其中每个RY独立地选自氢和卤素。
193.权利要求162-191中任一项的药物组合物，其中两个RY基团一起形成C3-C6环烷基。
194.权利要求173-193中任一项的药物组合物，其中RX是RX1，其中RX1是杂芳基。
195.权利要求173-193中任一项的药物组合物，其中RX是-CORX1。
196.权利要求173-193中任一项的药物组合物，其中RX是-SO2RX1。
197.权利要求173-193中任一项的药物组合物，其中RX是-(C1-C4亚烷基)-RX1。
198.权利要求195-197中任一项的药物组合物，其中RX1是C3-C8环烷基。
199.权利要求195-197中任一项的药物组合物，其中RX1是杂环基，其中所述杂环基任选地被1至12个作为卤素的取代基取代。
200.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自表6。
201.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12。
202.权利要求149-157和159中任一项的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080、GSK3抑制剂XXII、化合物I-6、化合物I-7和化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂选自嘌吗啡胺、SAG、20-α羟基胆固醇和SAG HCl。
203.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
204.权利要求203的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
205.权利要求203的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
206.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
207.权利要求206的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
208.权利要求206的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
209.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
210.权利要求209的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
211.权利要求209的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
212.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是CHIR99021，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
213.权利要求212的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAGHCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
214.权利要求212的药物组合物，其中CHIR99021的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAGHCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
215.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
216.权利要求215的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
217.权利要求215的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
218.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
219.权利要求218的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
220.权利要求218的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
221.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
222.权利要求221的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
223.权利要求221的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
224.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是LY2090314，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
225.权利要求224的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAGHCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
226.权利要求224的药物组合物，其中LY2090314的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAGHCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
227.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
228.权利要求227的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
229.权利要求227的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
230.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
231.权利要求230的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
232.权利要求230的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
233.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
234.权利要求233的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
235.权利要求233的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
236.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是AZD1080，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
237.权利要求236的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
238.权利要求236的药物组合物，其中AZD1080的浓度为约1 mM至约100 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
239.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
240.权利要求239的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
241.权利要求239的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
242.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
243.权利要求242的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
244.权利要求242的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
245.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
246.权利要求245的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 μM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
247.权利要求245的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
248.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是GSK3抑制剂XXII，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
249.权利要求248的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 nM至约10 µM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
250.权利要求248的药物组合物，其中GSK3抑制剂XXII的浓度为约100 µM至约10 mM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
251.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
252.权利要求251的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
253.权利要求251的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
254.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
255.权利要求254的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
256.权利要求254的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
257.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
258.权利要求257的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
259.权利要求257的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
260.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-6，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
261.权利要求260的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAGHCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
262.权利要求260的药物组合物，其中化合物I-6的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAGHCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
263.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
264.权利要求263的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
265.权利要求263的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
266.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
267.权利要求266的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
268.权利要求266的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
269.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
270.权利要求269的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
271.权利要求269的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
272.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-7，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
273.权利要求272的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 nM至约100 nM，且SAGHCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
274.权利要求272的药物组合物，其中化合物I-7的浓度为约1 µM至约100 µM，且SAGHCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
275.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是嘌吗啡胺。
276.权利要求275的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 nM至约10 µM。
277.权利要求275的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且嘌吗啡胺的浓度为约100 µM至约10 mM。
278.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG。
279.权利要求278的药物组合物，化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG的浓度为约1 nM至约100 nM。
280.权利要求278的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG的浓度为约1 µM至约100 µM。
281.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是20-α羟基胆固醇。
282.权利要求281的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 µM至约100 µM。
283.权利要求281的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且20-α羟基胆固醇的浓度为约1 mM至约100 mM。
284.权利要求202的药物组合物，其中所述一种或多种Wnt激动剂是化合物I-12，且所述一种或多种Shh途径活化剂是SAG HCl。
285.权利要求284的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 nM至约1000 nM，且SAG HCl的浓度为约10 nM至约1 µM。
286.权利要求284的药物组合物，其中化合物I-12的浓度为约10 µM至约1000 µM，且SAG HCl的浓度为约10 µM至约1 mM。
287.权利要求149的药物组合物，其中所述Shh途径活化剂包含Smoothened激动剂。
288.权利要求149的药物组合物，其中所述Shh途径活化剂包含Smoothened纤毛累积增强剂。
289.前述权利要求中任一项的方法，其中所述Shh途径活化剂是SAG (CAS 912545-86-9)或SAG-HCl，其与选自SFRP1抑制剂(例如，WAY-316606)、SFRP2抑制剂、SFRP3抑制剂、SFRP4抑制剂、SFRP5抑制剂、环孢菌素或其类似物(例如，环孢菌素A(CsA)、PSC833(戊司泊达))、DKK1抑制剂(例如，WAY-262611)和WIF1抑制剂中的一种或多种的Wnt激动剂组合。
290.前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Shh途径活化剂是SAG (CAS912545-86-9)或SAG-HCl，其与选自SFRP1抑制剂(例如，WAY-316606)、SFRP2抑制剂、SFRP3抑制剂、SFRP4抑制剂、SFRP5抑制剂、环孢菌素或其类似物(例如，环孢菌素A(CsA)、PSC833(戊司泊达))、DKK1抑制剂(例如，WAY-262611)和WIF1抑制剂中的一种或多种的Wnt激动剂组合。
291.前述权利要求中任一项的方法，其中所述皮肤在施用疗法之前是粗糙或受伤的。
292.前述权利要求中任一项的方法，其中在应用疗法之前，将一根或多根针应用于皮肤。
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