KR20000020800A - 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐혼합 스폰지를 이용한 인공진피 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인공진피 및 생인공진피에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상처 치유에 유용하게 사용될 수 있는 중화 키토산 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 포함하여 이루어진 인공진피 및 생인공진피에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 상처 주변의 섬유아세포 및 혈관세포의 이동 및 성장에 적합한 환경을 조성시켜 상처 치유를 개선하는 효과가 우수하여 상처 치유제로 활용할 수 있는 인공진피 구조물이 제공되며, 여기에 인체 섬유아세포를 로딩하여 화상과 같이 상처 부위가 커서 상처 주변의 세포 이동이 어려운 경우에 사용 가능한 생인공진피를 얻을 수 있다.

Description

중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 이용한 인공진피
본 발명은 인공진피 및 생인공진피에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상처 치유에 유용하게 사용될 수 있는 중화 키토산 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 포함하여 이루어진 인공진피 및 생인공진피에 관한 것이다.
상처 치유를 돕기 위한 일반적인 드레싱은 많이 개발되어 활용되고 있으나, 대부분이 감염 및 탈수 방지 목적의 드레싱에 불과하였다. 최근 미국, 유럽, 일본 등에서는 여러 생물 공학 관련 회사(예를 들어, 샌디에고의 Advanced Tissue Science, 보스톤의 Biosurface Technology, Organogenesis, Life Cell 등)에서는 인체 섬유아세포 및 표피세포를 초기화 배양(primary culture)하고, 이를 수화된 콜라겐에 3차원적인 배양(3-D culture, raft culture)하여 생인공진피로 개발하여 화상환자 및 성형환자에서 임상응용하여 상당히 좋은 상처 치유 촉진 및 상흔 감소의 효과를 얻었다. 그러나, 이 기술의 문제점을 동물 콜라겐을 이용하므로 아주 고가[생인공피부의 경우 10 X 10cm에 2000$; 콜라겐 스폰지(Terudermis; Terumo 일본 제품)는 약 40 만원]로 시판되고 있고, 또한, 수화된 콜라겐 겔을 이용하므로 경도(rigidity)가 부족하여 이식 조직(graft)으로 이용하는 데는 제한이 있다. 따라서, 생체 콜라겐을 대체할 수 있으며, 구조물로서의 특성을 만족시킬 수 있는 생체적합성 생분해성 중합체의 개발이 요구된다.
한편, 일본 및 다른 여러나라에서 게의 껍질에서 유래한 키틴을 산성화시켜 얻은 키토산(생체내에서 서서히 분해됨)을 생분해성 중합체로서 약물 송달계에 활용하고 있다. 키틴 자체는 직조로 개발하여 상처의 드레싱으로 사용하는 방법이 사용되고 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술이 가지는 한계를 극복하여, 생체 적합성이 탁월하고, 생분해가 가능하면서도, 가격이 저렴하고, 경도가 향상되어 취급이 용이한 상처 치유용 인공진피와, 여기에 상처 치유를 촉진시켜줄 bFGF, 파이브로넥틴(fibronectin)을 첨가한 인공진피 및 여기에 인체 섬유아세포를 로딩하여, 상처부위가 큰 경우에 적용할 수 있도록한 생인공진피를 제공하는 데 있다.
도 1은 키토산과 콜라겐 스폰지 인공진피들의 광학현미경 사진이다. (확대 X 200)
도 2는 인체 섬유아세포가 부착된 키토산 스폰지 생인공진피들의 광학현미경사진이다. (확대 X 200)
도 3은 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 함유된, 혹은 함유되지 않은 중화 키토산 스폰지 인공진피에서 인체섬유아세포가 부착된 광학현미경 사진이다. (확대 X 200)
도 4는 중화 키토산(A)과 중화 키토산/콜라겐(B) 혼합 스폰지 인공진피에서 4주동안in vitro배양된 인체 진피 섬유아 세포의 조직학적 절편사진이다. (확대 X 200)
도 5는 인체진피섬유아 세포가 부착된 중화 키토산(A)과 중화 키토산/타입- Ip콜라겐 혼합 스폰지(B)의 4주동안의 조직배양후의 바이멘틴에 대한 면역화학적인 염색사진이다. (확대 X 200)
도 6은 BALB/c 쥐의 완전 탈-피부조직 상처부위에 대한 인공진피의 이식을 나타낸다.
도 7은 인공진피 이식 4주 후의 BALB/c 쥐의 이식 부위를 나타낸다.
도 8은 이식 10일후, BALB/c 쥐의 등부위로 부터 생체 검시된 대조군의 전체적인 조직학적 도식도이다.
도 9는 이식 10일후의 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체검시한 전체적인 조직학적 도식도이다.
도 10은 이식 10일 후의 bFGF (50ng/ml)가 첨가된 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체 검시한 전체적인 조직학적 도식도이다.
도 11은 이식 10일 후의 타입-Ip 콜라겐을 첨가한 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체검시한 전체적인 조직학적 도식도이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 한 실시형태에 따르면, 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 포함하여 이루어진 인공진피가 제공된다.
본 발명의 또다른 실시 형태에 따르면, 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지에 bFGF, 파이브로넥틴을 함유한 인공 진피가 제공된다
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지에 인체 섬유아세포를 부착, 배양하여 제조되는 생인공진피가 제공된다.
본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 키토산 용액을 알칼리 용액으로 중화하고 동결 건조하여 스폰지상의 구조물을 제조할 수 있음을 발견하였다. 이러한 중화 키토산 스폰지는 종래의 콜라겐 스폰지 제품보다 가격이 훨씬 저렴하고, 경도가 향상되어 있어 취급이 용이하며, 상처 조직에 이식되어 우수한 치유 효과를 나타내므로, 상처 치유용 드레싱으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 중화 키토산 스폰지 인공진피를 제조하기 위해서는 먼저 키토산 용액을 알칼리 용액과 혼합하여 중화시킨다. 키토산 용액은 키토산을 1 % 아세트산 용액에 1-2w/v%로 용해시켜 얻은 것이 바람직하다. 중화용 알칼리 용액으로는 재조성 완충용액(2.2g NaHCO3. 4.77g HEPES(200mM)/ 100ml 0.05N NaOH) 및 NaHCO3가 제거된 10 X 배양액 (DMEM:F12=3:1, Gibco BRL. DMEM- Cat. no.12800-058, F12- Cat. no 21700-026)의 혼합용액 등을 사용할 수 있다. 중화된 키토산 용액을 저온, 특히 바람직하게는 -70℃의 초저온에서 1 일간 혹은 액체 질소(약 -140℃)에서 동결하고, 동결 건조(-42℃)하면 스폰지 상의 인공진피 구조물을 얻을 수 있다. 얻어진 인공진피는 살균하여 상처부위에 적용할 수 있다. 살균시에는 감마 광선, 자외선 조사 방법, 70 % 에틸알코홀 소독방법을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 중화 키토산 스폰지 인공진피의 세포 적합성을 높이기 위하여 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 사용할 수도 있다.
혼합 스폰지는 상기에서와 같은 방법으로 중화한 키토산 용액과 역시 같은 방법으로 중화한 콜라겐 용액을 혼합하여 동결 건조함으로써 제조할 수 있다. 키토산과 콜라겐의 혼합비는 최종산물에서 중량비로 1:8 ∼ 1:2 (콜라겐:키토산의 사용 비율 범위)가 되도록 하는 것이 바람직하지만, 원하는 경도와 상처부위의 조직 특성을 고려하여 적절히 조절할 수도 있다. 콜라겐의 경우 상온에서 겔화되기 쉬우므로 콜라겐 용액 제조 및 중화는 4℃이하의 저온에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하여 제조되는 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지 인공진피는 상처치유 효과를 높이기 위하여 파이브로넥틴(fibronectin), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), 표피세포성장인자 (epidermal growth factor), 종양세포 성장인자 베타 (transforming growth factor beta)등을 더욱 함유할 수 있다. 파이브로넥틴은 인공진피 구조물에 50 ∼ 500 ng/ml (사용량 범위), 염기성 섬유아세포 성장인자는 10 ∼ 100 ng/ml (사용량 범위) 함유되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 의한 인공진피에 인체 섬유아세포를 로딩(loading)하여 생인공진피를 제조하면 비교적 넓은 상처부위에 이식하여 상처 치유를 돕는데 유용하게 사용할 수 있다. 생인공진피는 생존 인체 섬유아세포 1-5 X 105cells/cm2을 로딩한 후 1-4주간 인체 섬유아세포의 부착, 성장에 적당한 조건하에서 배양하여 얻을 수 있다. 그러나, 응급 이식시에는 1일간 배양한 생인공 피부로 상처 부위에 이식할 수 있다.
본 발명에 따른 중화 키토산 스폰지 또는 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지 스폰지 인공진피 구조물은 원형, 직사각형 등 어떠한 3차원 형상을 가져도 무방하며, 크기도 적용부위에 따라 적절히 조절될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위하여 제공되는 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 인공진피의 제조
(1) 키토산 스폰지 인공진피의 제조
정량한 키토산 (Fluka, medium 분자량; ~ 400,000)을 2w/v%의 용액이 되도록 1v/v% 아세트산용액에 용해하였다. 이 용액을 실온에서 한 시간 동안 휘저어 섞은 다음, 청정환경에서 용액 안의 공기방울을 제거하기 위하여 실온에서 밤샘 방치하였다. 20ml의 용액을 지름 100mm의 플라스틱 배양접시에 넣어(지름 10cm의 원형 스폰지 제조) -70℃의 초저온 상태에서 밤샘 방치하였다. 이 냉동용액은 키토산 스폰지 인공진피를 얻기 위하여 48시간동안 냉동 건조하였다. 얻어진 키토산 스폰지 인공진피는 인산완충용액으로 3 회 세척하였다. 이 스폰지에 대하여 동일한 조건에서 냉동, 건조과정을 반복한 후, 감마 광선 조사(20 kGy/5hr, -광선원; Co60) 방법으로 살균하였다. 수용액상에서의 분해를 방지하기 위하여 30cm의 거리에서 인공진피의 표면에 1시간 동안 30W의 자외선을 조사하였다. 이렇게 하여 두께 약 3-4 mm의 스폰지형 인공진피를 얻었다. 얻어진 인공진피는 부드럽고 유연한 성질을 가지며 키토산 섬유질로 이루어져 다공성을 보인다. 도 1(A)는 위상차 광학 현미경하에서의 반투명성의 키토산 인공진피를 보여준다.
(2) 중화 키토산 스폰지 인공진피의 제조
중화 키토산 스폰지를 제조하기 위해서, 아세트산에 용해된 2w/v% 키토산 용액, 재조성 완충용액(2.2g NaHCO3. 4.77g HEPES(200mM)/ 100ml 0.05N NaOH), NaHCO3가 제거된 10 X 배양액 (DMEM:F12=3:1, Gibco BRL. DMEM- Cat. no.12800-058, F12- Cat. no 21700-026)을 8:1:1 비율로 혼합하여 키토산 용액을 중화시켰다. 중화 키토산 용액은 상기 (1)의 키토산 스폰지 인공진피 제조방법과 동일한 과정을 거쳐 인공진피로 제조하였다. 도 1B는 위상차 광학현미경하에서의 반투명성의 중화 키토산 인공진피를 보여준다.
(3) 중화 키토산/콜라겐 스폰지 인공진피의 제조
중화된 콜라겐을 제조하기 위하여, 타입-Ip 콜라겐(3 mg/ml in pH 3.0; Cell matris, Gelatin Corp., Osaka, Japan., 돼지 콜라겐을 펩신처리하여 telomeric portion을 제거한 것)용액, 재조성 완충용액, NaHCO3가 제거된 10 X 배양액을 8:1:1 비율로 혼합하여 중화하였다. 콜라겐의 용액의 중화 및 취급은 겔화를 방지하기 위하여 4℃ 이하의 온도에서 수행하였다. 얻어진 중화 콜라겐 용액과 상기 (2)의 방법으로 얻은 중화 키토산 용액을 1:1(v/v)의 비율이 되도록 혼합하여 키토산/콜라겐 스폰지 제조액으로 사용하였다(최종농도; 키토산: 8 mg/ml, 콜라겐: 1.2 mg/ml). 이러한 키토산/콜라겐 혼합용액은 상기 (1), (2)에서와 동일한 과정을 거쳐 인공진피로 제조하였다. 도 1C는 위상차 광학현미경하에서의 반투명성의 중화 키토산/콜라겐 인공진피를 보여준다. 도 1D는 타입-Ip 콜라겐 스폰지를 나타낸다.
(4) 파이브로넥틴과 염기성 섬유아세포 성장인자가 함유된 인공진피의 제조
(1), (2), (3)의 방법으로 제조한 키토산-, 중화 키토산-, 중화 키토산/콜라겐- 혼합 스폰지 제조용액에, 각각 인산완충용액에 희석된 파이브로넥틴(100ng/ml) 또는 염기성 섬유아세포 성장인자(50 ng/ml)를 첨가하였다. 이 경우 최종 스폰지 구조물에서 파이브로넥틴은 0.67ng/8mm(지름) 스폰지, 염기성 섬유아세포 성장인자는 0.33ng/8mm(지름) 스폰지의 농도로 함유된다. 각 혼합용액을 사용하여 상기 (1), (2), (3)에서와 동일한 과정을 거쳐 인공진피로 제조하였다. 다만, 멸균은 감마 광선 조사 (5 kGy/5hr, -광선원; Co60) 방법으로 실시하였다.
실시예 2 : 생인공진피의 제조
(1) 인체 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)의 일차 순수배양
인체 진피 섬유아세포는 포경수술후의 신생아 피부로부터 순수 분리하였다. 표피와 진피는 0.25% 트립신/0.02% EDTA 용액으로 37℃에서 1시간 방치하여 분리하였다. 진피는 잘게 절편하여 37℃에서 1시간 0.35% 콜라겐 분해효소 B용액으로 소화 분해하였다. 얻어진 세포들은 여러 번 세척하여 콜라겐 분해효소를 제거하고 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum)이 함유된 DMEM 배양액에 부유시켰다. 섬유아세포들은 일정습도와 5% CO2, 37℃가 유지되는 항온 배양기내, 조직배양 플라스크에서 배양하였다. 이러한 세포들은 혼잡도가 80-90%에 도달하였을 때, 0.1 % 트립신 용액을 사용하여 계대 배양하며, 계대 배양시 부유된 세포의 수는 1 X 106cell/100mm 배양접시가 기준이 된다. 세포들은 냉동저장액 (DMEM 50%, 우태아혈청 40%, DMSO 10%)에 보관되며, 인공진피에 부착시킬 때는 해동한 뒤 재배양하여 사용한다. 세포를 해동하여 생인공진피를 제조하기 위하여 냉동저장된 세포를 인산완충용액으로 희석하여 원심분리과정을 3회 반복 수행하여 냉동저장액을 세척한 다음 배양액에 부유하여 재배양에 사용하였다. 도 2.(A)는 일차 순수배양된 인체 진피 섬유아세포를 나타낸다.
(2) 인공진피에 대한 인체 진피 섬유아세포의 부착
스폰지 인공진피는 지름 8mm 및 100mm의 크기로 무균후드에서 천공하여 배양접시(24 well, 지름 150 mm)에 각각 놓았다. 지름 8mm 원형 생인공진피 제조에는 1 X105개의 생존 세포(트립판블루 용액으로 판정)를 최소 부피의 DMEM배양액으로 희석하여 스폰지 인공진피 조각 위에 부착시켰다. 5% CO2와 37℃상태에서 4시간 방치한 후에 50㎕의 DMEM 배양액을 가한 후, 24시간 후에 1ml의 배지를 각의 웰에 첨가하여 배양하였다. 이러한 생인공진피는 일정한 혼잡도를 이루기 위하여 4주 동안 같은 조건에서 유지하였다(즉 모든 생인공진피에 부착 형성된 세포와 조직 매트릭스는 위상차 광학현미경으로 판단한다). 배양액은 일주일에 세 번씩 교환하였다. 배양 결과 인체 섬유아세포가 부착된, 중화 키토산 스폰지 인공진피, 파이브로넥틴이 첨가된 중화 키토산 스폰지 인공진피, 파이브로넥틴이 첨가된 중화 키토산/타입-Ip 콜라겐 혼합 스폰지 인공진피의 모양을 도 2의 B 내지 D에 각각 나타내었다.
(3) 생인공진피의 세포학/생화학적 분석
인체섬유아세포가 1주 배양된 생인공진피들을 배양접시로부터 분리하여 인산완충용액으로 세 번 세척한 후, 10분동안 0.25 % 트립신 용액에 노출하여 인공진피로부터 세포를 분리하였다. 생인공진피는 페트리접시에서 진동 과정을 거쳐 DMEM 배양액으로 세척 후, 부유액을 10 % 우태아 혈청이 함유된 플라스틱 시험관 튜브에 넣어 5분 동안 원심 분리하였다. 1 ml의 DMEM배양액을 세포침전물에 가하여 부유시킨 후 100㎕의 분주액을 트립판블루 용액으로 염색하여 광학 현미경하에서 생존 세포수를 확인하였다. 실험결과, 세포부착 1주후 산성 키토산 스폰지에 비하여 중화키토산 스폰지에서 부착된 생존 세포수가 약 7배가량 증가하였으며 중화키토산에 파이브로넥틴(100ng/ml)을 첨가 하였을 경우 중화키토산을 기준으로 약 2.2배 증가하였고, 염기성 섬유아세포 성장인자(50ng/ml)를 첨가한 경우 약 7.3배 증가하였고, 타입-Ip 콜라겐을 첨가하였을 경우 약 7.8배 증가효과가 나타났다 (표 1).
세포부착 1주 후의 여러 키토산 스폰지 인공진피에서의 진피 섬유아세포 생존 세포수 (1X 104세포)
키토산 스폰지 인공진피 중화 키토산 스폰지 인공진피 기존 수화 콜라겐 사용한 경우
무 처 리 6.0 + 2.0 42.7 + 0.6
파이브로넥틴100ng/ml 첨가 22.7 + 3.4 93.3 + 6.2
염기성 섬유아세포 성장인자50ng/ml 첨가 68.4 + 16.1 312.9 + 63.0
타입-Ip 콜라겐1.2 mg/ml 첨가 - 332.0 + 44.0
상기 표 1에서, 실험 데이터는 표준편차 통계방법으로 나타낸다. - 표시는 미실험을 나타낸다.(실험횟수 = 4)
4주 배양시, 염기성 섬유아세포 성장인자를 함유한 중화 키토산에서 배양된 진피 섬유아세포는 염기성 섬유아세포 성장인자를 함유하지 않은 중화 키토산에서 배양된 세포보다 세포의 크기와 생존 수에서 월등한 효과를 나타내었다(도 3).
도 3에서 A는 배양된 인체진피 섬유아세포, B는 중화 키토산 스폰지, C는 염기성 섬유아세포 성장인자를 함유하지 않은 중화키토산 스폰지에 부착된 인체진피 섬유아세포, D는 염기성 섬유아세포 성장인자가 함유된 중화 키토산 스폰지에 부착된 인체진피 섬유아세포의 사진으로, 화살표는 중화 키토산 스폰지의 섬유에 부착된 건강한 섬유아세포를 가리킨다.
중화 키토산과 중화 키토산/콜라겐 스폰지 인공진피의 조각을 10 % 포르말린/인산완충용액에 넣어 고정시킨 후 에탄올로 탈수하고, 자일렌으로 세척 과정을 거쳐 파라핀으로 밤샘 고정하였다. 고정된 조직들은 회전 미세절삭기를 이용하여 4 um의 두께로 절단한 뒤 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 중화 키토산 섬유는 생인공진피의 절삭과정에 영향을 미쳐 조직 절편을 만드는 동안 쉽게 부서지며 특히, 초기에 배양된 키토산 스폰지 생인공진피에서 이러한 현상은 두드러진다. 그러나 배양 4주후의 생인공진피들은 구조적인 강도가 훨씬 강하지며 절편화 과정에서도 쉽게 부서지지 않았다(도 4: 확대 X 200)
도 4의 A(중화 키토산)에서, 인공진피조직은 구조적인 강도가 약하고 쉽게 부서진다. 인체 진피 세포층이 조직 절편화 과정에서 파괴되어 거의 세포가 보이지 않는다. 화살표의 머리부위는 키토산 섬유를 가리킨다.
도 4의 B(중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지)에서, 인공진피조직은 A의 조직보다 훨씬 구조적인 강도가 강하며, 아마도 세포로부터 분비된 매트릭스 단백질과 콜라겐 섬유에 기인한것으로 보이며, 이런 이식조직은 절편화 과정에서도 구조적인 강도는 유지되었다. 화살표는 인체진피 섬유아세포와 매트릭스 조직을 가리킨다.
인체진피섬유아 세포가 부착된 중화 키토산과 중화 키토산/타입-Ip 콜라겐 혼합 스폰지를 4주 동안의 조직배양 한 후 생인공진피에 생성된 바이멘틴(vimentin; 인체 섬유아세포의 세포골격 구조물)을 바이멘틴에 대한 단일항체 (Zymed)와 퍼록시데이즈가 결합된 항 마우스 이차 면역글로블린(Zymed)을 이용한 면역염색 방법으로 확인하였다. 발색은 퍼록시데이즈 기질 키트(kit)를 사용하였다. (도 5).
도 5의 A(중화키토산 스폰지)에서, 소수의 인체 진피섬유아세포가 확인되며 화살표의 머리부위는 섬유아세포를 가리킨다.
도 6의 B(중화 키토산/타입-Ip 콜라겐 혼합 스폰지)에서, 다량의 섬유아세포가 부착된다. 화살표는 인체진피섬유아세포와 매트릭스의 조직을 가리킨다.
실시예 3: Balb/c 쥐에 대한 생체적용을 위한 이식실험
(1) 인공진피의 이식
Balb/c 쥐는 무균실에서 사육하였다. 수술과 이식과정은 무균 후드에서 실행하며 마취는 3 ml/Kg의 농도의 에퀴테신(Equithesin)을 복강내 주사하여 수행하였다. 쥐의 등부위를 제모제를 바르고 면도를 한후 포비딘과 70% 아이소프로필알코올로 소독하였다. 지름 8mm의 부검 천공기를 사용하여 상처를 형성하였다. 이러한 상처부위는 실험동물의 체면적의 약 5%에 해당한다. 상처부위와 같은 크기로 제조된 합성 및 생인공진피는 상처부위에 이식한 후, 소독된 거즈로 도포하였다. 감염을 방지하기 위하여 엠피실린과 스트렙토 마이신의 항생제를 식수에 첨가하였다. 실험동물의 이식부위의 강도와 치유과정은 매일 검사하며 10일과 4주 후에 치사하였다. 각각의 실험동물의 이식부위는 사진기록을 남기고 얻어진 부검조직은 조직검사에 사용하였다.
도 6.은 쥐의 완전 탈-피부 조직 상처부위에 이식 부착된 스폰지를 나타낸다. 도 6에서 A의 오른쪽(R)은 상처부위(대조군), 왼쪽(L)은 중화 키토산 스폰지; B의 오른쪽은 타입-Ip 중화 콜라겐 스폰지, 왼쪽은 중화 키토산 + 타입-Ip 콜라겐 스폰지; C의 오른쪽은 타입-Ip 중화 콜라겐 + 파이브로넥틴 스폰지, 왼쪽은 키토산 + 타입-Ip 콜라겐 + 파이브로넥틴 스폰지를 각각 나타낸다. 이러한 인공진피 스폰지들은 상처부위에 강하게 흡착되며 분비된 퇴적물은 보이지 않았다.
도 7은 이식 4주후, 인공진피가 이식된 BALB/c 쥐의 이식부위를 나타낸다. 도 7에서 A의 오른쪽(R)은 대조군, 왼쪽(L)은 중화 키토산 스폰지; B의 오른쪽은 타입-Ip 중화 콜라겐 스폰지, 왼쪽은 중화 키토산 + 타입-Ip 콜라겐 혼합 스폰지를 각각 나타낸다. 대조군에서는 상흔이 남아 있으나 다른 이식 부위는 정상적으로 치유됨을 확인할 수 있었다.
(2) 조직 시료제작 및 조직학적 분석
실험동물로부터 이식부위와 정상부위가 포함된 근육층 위의 치유조직을 얻어 이를 시료로 사용하였다. 시료는 10% 포르말린/인산완충용액으로 고정한 후 파라핀 블록으로 제작한 다음 상기와 같은 방법으로 절편화 과정을 거쳐 헤마톨실린과 에오신 용액으로 염색하여 결과를 판정하였다.
도 8은 이식 10일후, BALB/c 쥐의 등부위로 부터 생체 검시된 대조군의 전체적인 조직학적 도식도를 나타낸것이다(헤마톡실린-에오신 염색, 확대 X 100). 대조군의 경우 표피층만이 겨우 연결되어 있을 뿐 완전히 계층화된 표피층이 회복되어 있지 않으며 또한 진피층의 경우 재건되어 있지 않았으며 심한 염증반응도 나타내었다. 초기에 상처가 치유되지 않은 원인은 아마도 진피층의 결핍일 것으로 사료된다.
도 9는 이식 10일후의 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체검시한 전체적인 조직학적 도식도이다. 양쪽으로는 정상적인 피부조직을 나타내고(붉게 염색된 여러개의 모낭세포가 기준이됨) 가운데 부분의 새로이 재생된 표피와 진피조직을 나타낸다. 표피층의 경우 표피의 계층화가 이루어져 있음을 나타내며 진피층의 경우 새로이 이동되어 진피조직이 재건되었음을 나타내며 염증반응은 나타나지 않았다.
도 10은 이식 10일 후의 bFGF (50ng/ml)가 첨가된 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체 검시한 전체적인 조직학적 도식도이다. 중화키토산 인공진피의 경우와 유사하게 양쪽으로는 정상적인 피부조직을 나타내고 가운데 부위는 새로이 재건된 표피 및 진피를 나타낸다. 중화키토산 인공진피를 이식한 것과 비교하여 약간의 염증반응이 수반되기는 하지만 전체적으로는 만족할만한 상처치유효과를 나타내었다.
도 11은 이식 10일 후의 타입-Ip 콜라겐을 첨가한 중화키토산 인공진피가 이식된 부위를 생체검시한 전체적인 조직학적 도식도이다. 완전히 계층화된 표피층과 재건된 진피층을 나타내며 일부에서는 모낭세포가 새로이 형성됨을 나타내기도 하였다.
본 발명에 의하면 상처 주변의 섬유아세포 및 혈관세포의 이동 및 성장에 적합한 환경을 조성시켜 상처 치유를 개선하는 효과가 우수하여 상처 치유제로 활용할 수 있는 인공진피 구조물이 제공되며, 여기에 인체 섬유아세포를 로딩하여 화상과 같이 상처 부위가 커서 상처 주변의 세포 이동이 어려운 경우에 사용 가능한 생인공진피를 얻을 수 있다.

Claims (8)

  1. 중화 키토산 스폰지를 포함하여 이루어진 인공진피.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 중화 키토산이 키토산 용액을 알칼리 용액으로 중화한 후 동결 건조하여 제조된 것임을 특징으로 하는 인공진피.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    파이브로넥틴, 염기성 섬유아세포 성장인자 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하여 이루어진 인공진피.
  4. 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지를 포함하여 이루어진 인공진피.
  5. 상기 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지가
    a) 키토산 용액을 알칼리 용액으로 중화하는 단계,
    b) 콜라겐 용액을 알칼리 용액으로 중화하는 단계,
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 얻어진 중화 키토산 용액과 중화 콜라겐 용액을 혼합하는 단계,
    d) 상기 c) 단계에서 얻은 혼합 용액을 동결 건조하는 단계를 통하여 제조된 것임을 특징으로 하는 인공진피.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    파이브로넥틴, 염기성 섬유아세포 성장인자 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하여 이루어진 인공진피.
  7. 중화 키토산 스폰지에 인체섬유아세포가 부착되어 이루어지는 생인공진피.
  8. 중화 키토산/콜라겐 혼합 스폰지에 인체섬유아세포가 부착되어 이루어지는 생인공진피.
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