CN1324254A - 应用中和脱乙酰壳多糖海绵或中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的皮肤支架 - Google Patents

应用中和脱乙酰壳多糖海绵或中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的皮肤支架 Download PDF

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Abstract

公开了一种皮肤支架,该皮肤支架包含中和脱乙酰壳多糖海绵、中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵、或者含有脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵,所述皮肤支架因构成适合环绕创伤的成纤维细胞和血管细胞迁移和增殖的微环境而具有优异的创伤愈合效果,它特别适用作创伤愈合敷料;还公开了包含所述皮肤支架和人成纤维细胞的人造真皮,它尤其适用于治愈宽创伤部位(例如烧伤)。

Description

应用中和脱乙酰壳多糖海绵或中和脱乙酰 壳多糖/胶原混合海绵的皮肤支架
本发明涉及一种皮肤支架和应用该支架的生物人造真皮。更具体地说，本发明涉及皮肤支架和生物人造真皮，它们包含中和脱乙酰壳多糖海绵、中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵、或者含有脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵，它们特别适用于创伤愈合疗法。
迄今开发并方便地应用了用于创伤愈合的各种常规敷料，但在大多数情况下，它们只是被用来防止感染或脱水。
最近，开发了无细胞的人造皮肤或基于细胞的生物人造皮肤并通过很多生物技术公司上市了。就无细胞的人造皮肤来说，例如，现在可商购的有：结合到聚硅氧烷薄膜上的无细胞胶原-糖胺聚糖基质(INTEGRAftTM,Interga LifeSciences Co.)和纤维状变性胶原的脱氢热交联的(dehydrorothermally cross-linked)复合物(TerudermisTM,Terumo Co.)。但是，这样的产品因掺有生物材料(例如胶原)而很贵，所以，难于在宽创伤部位(例如烧伤)临床试用。
就基于细胞的生物人造皮肤来说，Advanced Tissue Sciences,Inc.(La Jolla,California)开发了一种皮肤替代品，它包含一薄层生物可降解的网状框架，其上接种了人皮肤成纤维细胞，可用于治疗糖尿病性足溃疡(Dermagraft-TCTM)。此外，还开发了用于部分-厚度(partial-thickness)创伤的表皮细胞片(ActicelTM,BiosurfaceTechnology,Inc.)，位于胶原糖胺聚糖基质上的培养的角质形成细胞和成纤维细胞的复合移植片(ApligraftTM,Organogenesis,Inc.)以及来自人尸体皮肤的皮肤替代品(AllodermTM,Lifecell)。
基于细胞的生物人造皮肤是这样制备的：原代培养人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞，接着在水合胶原中立体培养(3-D培养，筏培养(raft culture))所述培养的细胞。它们在临床试验中对烧伤患者或整形外科患者具有良好的创伤愈合和疤痕减少效果。但是，它们仍存在问题：它们因掺有胶原而太昂贵(例如，Dermagraft-TC:2,000$/l0×10cm,Terudermis:1,500$)，并且由于水合胶原凝胶的低刚性而使它们作为移植物的应用受限制。因此，仍很需要开发具有良好的生物相容性和生物降解性的聚合物，它们能成功地替代胶原，还适用作支架。
脱乙酰壳多糖是阳离子型多糖，它包含葡糖胺和N-乙酰葡糖胺残基与1,4-β-键。脱乙酰壳多糖可通过来自蟹或其它源的壳多糖的脱乙酰作用制备。壳多糖在体内缓慢地降解，所以，壳多糖及其降解产物都是天然的、安全的物质。在药物领域，脱乙酰壳多糖已被用作药物的缓释载体[Hou等，化学与药物通报(Chem Pharm Bull),1985；33(9):3986～3992]。壳多糖就这样被织成织物而用作创伤愈合的敷料。然而，从未报导中和脱乙酰壳多糖被用作皮肤支架。
因此，为解决现有技术中涉及的上述问题，本发明的一个目的是提供一种用于创伤愈合、具有优异的生物相容性和生物降解性的新型皮肤支架，它不但是低成本的，而且还由于改良的刚性而便于操作，所述皮肤支架进一步包含促进创伤愈合的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、纤连蛋白等。
本发明的另一个目的是提供一种生物人造真皮(其中，在皮肤支架上载有人成纤维细胞)，特别适用于宽创伤部位(例如烧伤)的治愈。
为了达到上述目的，本发明一方面提供了一种皮肤支架，它包含中和脱乙酰壳多糖海绵、中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵、或者含有脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。所述皮肤支架优选进一步包含一种或多种选自下组的物质：纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子-β。
本发明另一方面提供了一种生物人造真皮，其中，在中和脱乙酰壳多糖、中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵或者含有脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵上载有人成纤维细胞。
图1是制备的脱乙酰壳多糖和胶原海绵的光学显微镜检查照片(放大×200)；
图2是脱乙酰壳多糖海绵与培养的人成纤维细胞的光学显微镜检查照片(放大×200)；
图3是包含人成纤维细胞的中和脱乙酰壳多糖海绵[包含bFGF(50ng/ml)或不含bFGF]的光学显微镜检查照片(放大×200)；
图4示出中和脱乙酰壳多糖海绵(A)和中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵(B)与培养的人成纤维细胞在体外培养4周的横切片组织学(放大×200)；
图5示出Balb/c小鼠的全厚切除物(full-thickness excision)上的脱乙酰壳多糖海绵移植物；
图6示出了移植4周后的Balb/c小鼠的移植物位置；
图7示出了移植10天后从Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的对比物的总体组织学；
图8示出了移植10天后、从移植了中和脱乙酰壳多糖海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学；
图9示出了移植10天后、从移植了中和脱乙酰壳多糖+bFGF(50ng/ml)海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学；
图10示出了移植10天后、从移植了中和脱乙酰壳多糖+Ip型胶原海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学；以及
图11示出了用脱乙酰壳多糖衍生物处理的人皮肤成纤维细胞的存活分析结果。
下文将更具体地解释本发明。
本发明人意外地发现了，可通过用碱性溶液中和脱乙酰壳多糖溶液、接着将中和后的脱乙酰壳多糖溶液冻干而获得海绵状支架。获得的中和脱乙酰壳多糖海绵与本领域已知的胶原海绵产品相比是低成本的并且具有改良的刚性而便于操作。此外，可将它移植到创伤组织而表现出优异的创伤愈合效果，所以，它将特别适用作创伤愈合的敷料。
为了制备本发明的包含中和脱乙酰壳多糖海绵的皮肤支架，首先，将脱乙酰壳多糖溶液与碱性溶液混合而获得中和脱乙酰壳多糖溶液。按本发明，脱乙酰壳多糖溶液优选是通过将脱乙酰壳多糖以1～2w/v％的浓度溶于1％乙酸溶液而配制的。作为中和用的碱性溶液，优选应用复配缓冲剂[2.2g NaHCO3,4.77g HEPES(200mM)/100ml 0.05N NaOH]与10×不含NaHCO3的培养基(DMEM∶F12=3∶1,GibcoBRL.DMEM-Cat.No.12800-058,F12-Cat.No.21700-026)的混合溶液。在低温(具体在-70℃)下将中和后的脱乙酰壳多糖溶液冷冻一天，或者在液氮中(在大约-140℃下)冷冻，然后冻干(-42℃)而获得海绵状皮肤支架。将获得的皮肤支架灭菌后应用到创伤部位。在本发明中，优选采用γ-射线或紫外线辐射或70％乙醇浸泡的方法来灭菌。
为了增大本发明的中和脱乙酰壳多糖海绵的生物相容性，可应用中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵可这样制备：将如上述制备的中和脱乙酰壳多糖溶液与中和Ip型胶原(一种无端粒胶原)溶液(按与配制中和脱乙酰壳多糖溶液大致相同的方法配制的)混合。优选地，调节混合比使胶原与脱乙酰壳多糖的重量比基于终产品在1∶8～1∶2的范围内。不过，可以根据所需的刚性和创伤组织的组织学特性而适当地改变混合比。由于胶原在室温下容易形成凝胶，所以，胶原溶液的配制和中和优选在4℃或更低温度下进行。
为了增大中和脱乙酰壳多糖海绵的延性，可制备含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。更具体地说，可将脱乙酰壳多糖纤维按任何常规方法织成织物。在织成的脱乙酰壳多糖织物上浇中和脱乙酰壳多糖溶液，再按上述方法制备包含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖海绵。然后，为了增大人成纤维细胞的附着力，用中和Ip型胶原溶液涂布制备的海绵而获得含脱乙酰壳多糖织物的脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。
中和脱乙酰壳多糖海绵、中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵或含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵可进一步包含纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子-β等。在本发明中，所述海绵优选包含50～500ng/ml的纤连蛋白或者10～100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
此外，通过将人成纤维细胞接种到所述海绵上制备的生物人造真皮适用于通过移植到较宽创伤部位而治愈创伤。可这样制备生物人造真皮：将1～5×105个细胞/cm2接种到所述海绵上，接着在适合人成纤维细胞的附着和增殖的条件下培养。然而，就急症来说，允许移植包含只培养了一天的人成纤维细胞的生物人造真皮。
在所述中和脱乙酰壳多糖海绵或中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中，允许任意形状(例如圆形、方形等)，还可以根据应用部位适当地改变它的尺寸和厚度，尤其可将它模制成各种形状，例如鼻、耳等。
                            实施例
从如下实施例将能更好地理解本发明。但是，本领域技术人员应容易懂得：描述的具体材料和结果仅仅是阐述而不是想限制、也不应当被认为是限制后文的权利要求书中更充分地描述的本发明。实施例1：皮肤支架的制备(1)包含脱乙酰壳多糖海绵的皮肤支架的制备
将称量的量的脱乙酰壳多糖(Fluka，平均MW；～400,000)溶于1v/v％乙酸而给出2w/v％溶液。在室温下将该溶液搅拌1小时，然后，在室温下保温一夜而在无尘气氛中除去溶液中残存的气泡。将20ml该溶液加到直径为100mm的塑料培养皿中(为了制备直径为100mm的圆形海绵)，在-70℃下放置一夜。将冷冻的溶液在冷冻干燥仪中冻干48小时而获得脱乙酰壳多糖海绵。用磷酸盐缓冲盐水将该海绵洗涤三次。接着，再次在上述相同的条件下冷冻获得的脱乙酰壳多糖海绵并冻干，然后，通过γ-射线辐射(20Kgy/5hrs,γ-射线源；Co60)灭菌。用30W紫外灯在30cm处照射所述海绵的每一表面达1小时而使该海绵不溶于水。于是，获得厚度为3.0～4.0mm的海绵状皮肤支架。
获得的脱乙酰壳多糖海绵光滑、柔软，包含多孔的脱乙酰壳多糖纤维。图1示出了相差光学显微镜下拍摄的半透明脱乙酰壳多糖海绵(A)。(2)包含中和脱乙酰壳多糖海绵的皮肤支架的制备
为了制备中和脱乙酰壳多糖海绵，以8∶1∶1的比率混合2w/v％溶于乙酸的脱乙酰壳多糖溶液、复配缓冲剂[2.2g NaHCO3,4.77gHEPES(200mM)/100ml 0.05N NaOH]和10×不含NaHCO3的培养基(DMEM∶F12=3∶1,Gibco BRL.DMEM-Cat.No.12800-058,F12-Cat.No.21700-026)而获得中和脱乙酰壳多糖溶液。应用该中和脱乙酰壳多糖溶液，按实施例1(1)的相同方法制备了中和脱乙酰壳多糖海绵。图1示出了相差光学显微镜下拍摄的半透明中和脱乙酰壳多糖海绵(B)。(3)包含中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的皮肤支架的制备
为了制备中和胶原溶液，以8∶1∶1的比率混合Ip型胶原(3mg/ml,pH为3.0；Cell matrices,Gelatin Corp.,Osaka,Japan，通过用胃蛋白酶处理使之不含端粒部分的猪胶原)溶液、复配缓冲剂和10×不含NaHCO3的培养基，然后，将混合溶液中和。在4℃或更低温度下进行胶原溶液的中和与处理。以1∶1(v/v)的比率混合获得的中和胶原溶液与实施例1(2)中制备的中和脱乙酰壳多糖溶液而获得用于制备脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵(最终浓度为：8mg/ml的脱乙酰壳多糖，1.2mg/ml的胶原)的溶液。应用该脱乙酰壳多糖/胶原混合溶液，按与实施例1(1)和(2)大致相同的方法制备了皮肤支架。图1示出了相差光学显微镜下拍摄的半透明中和脱乙酰壳多糖/胶原海绵(C)和Ip型胶原海绵(D)。(4)包含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的制备
为了增大中和脱乙酰壳多糖海绵的延性，如下述那样制备了包含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。
首先，按任何常规方法将脱乙酰壳多糖纤维织成织物。在编织的脱乙酰壳多糖织物上浇实施例1(2)中制备的中和脱乙酰壳多糖溶液，再按与实施例1(1)大致相同的方法制备含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖海绵。然后，为了增大人成纤维细胞的附着力，用实施例1(3)中制备的Ip型胶原溶液涂布制备的海绵而获得含脱乙酰壳多糖织物的脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵。
本实施例的包含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵具有改良的延性，所以可被方便地操作和贮存。(5)包含纤连蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的皮肤支架的制备
往用来制备实施例1(1)～(3)制备的脱乙酰壳多糖海绵、中和脱乙酰壳多糖海绵和中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的溶液中分别以5、50和500ng/ml的浓度添加纤连蛋白或碱性成纤维细胞生长因子。在上述情况下，最终海绵分别包含0.67ng/8mm-直径海绵的纤连蛋白和0.33ng/8mm-直径海绵的碱性成纤维细胞生长因子。
应用所述混合溶液按与实施例1(1)～(3)大致相同的方法制备了皮肤支架，不同的是通过γ-射线辐射(5Kgy/5hrs,γ-射线源；Co60)进行灭菌。实施例2：生物人造真皮的制备(1)人皮肤成纤维细胞的原代纯培养物
从无菌包皮环切术后获得的新生儿包皮分离人皮肤成纤维细胞(HDFs)。通过在37℃下0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA溶液中保温一小时将真皮与表皮分离。将真皮绞碎，在37℃下用0.35％胶原酶B溶液消化一小时。将获得的细胞洗涤数次而除去胶原酶，然后，将细胞悬浮于补加了10％胎牛血清的DMEM培养基中。在37℃、5％CO2、加湿的培养箱中，将成纤维细胞置于组织培养瓶中培养。在达到80～90％铺满后，应用0.1％胰蛋白酶溶液将细胞传代培养。传代培养物中悬浮细胞的标准数量是1×106个细胞/100mm皿。将细胞贮存在冷藏溶液(DMEM50％，胎牛血清40％，DMSO10％)中。在接种到皮肤支架的制备之前，将细胞融化并且再培养。要制备生物人造真皮，用磷酸盐缓冲盐水稀释冷藏的细胞并离心三次。然后，洗涤细胞，悬浮于培养基中并且再培养。图2示出了原代纯培养的人皮肤成纤维细胞(A)。(2)人皮肤成纤维细胞附着到皮肤支架上
在层流罩超静台中，将所述海绵冲出直径为8mm和100mm的孔，置于培养皿(24孔，直径为150mm)中。要制备直径为8mm的圆形海绵，用最少体积的DMEM培养基稀释1×105个活细胞(通过锥虫蓝溶液检测)，浇到海绵上。然后，在37℃、5％CO2气氛中静置4小时，再添加50μl DMEM培养基。添加后24小时，往每个孔中添加1ml上述培养基而培养细胞。将人造真皮在与上述相同的条件下保持4周而达到恒定铺满。在相差光学显微镜下观察粘附在海绵上的全部细胞和形成的组织基质。一周替换培养基三次。
图2分别示出了包含人成纤维细胞的中和脱乙酰壳多糖海绵(B)、包含纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖海绵(C)和包含纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖/Ip型胶原混合海绵(D)。(3)中和脱乙酰壳多糖海绵与中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中人皮肤成纤维细胞生存和生长的评估(体外)
用活体染色剂锥虫蓝估测，从培养皿酶促解离后细胞的存活率约为95～100％。以1×105个细胞/海绵(直径为8mm)的接种浓度将这些细胞接种入脱乙酰壳多糖海绵与中和脱乙酰壳多糖海绵中。在脱乙酰壳多糖海绵与中和脱乙酰壳多糖海绵上接种1周后，对这些海绵进行胰蛋白酶消化，在光学显微镜下计数活的、移动的细胞。下表1示出了接种1周后脱乙酰壳多糖海绵中的活成纤维细胞数。
表1接种1周后脱乙酰壳多糖海绵中的成纤维细胞数
脱乙酰壳多糖海绵 中和脱乙酰壳多糖海绵
     对比物     6.0±2.0     42.7±10.6
    +纤连蛋白(100ng/ml)     22.7±3.4     93.3±6.2
    +bFGF(50ng/ml)     68.4±16.1     312.9±63.0
    +Ip型胶原(1.5mg/ml)     -     332.0±44.0
*上述试验数据是通过SEM(±)获得的(-表示未检测到；n=4)
与第一个接种浓度相比，脱乙酰壳多糖海绵中生长的活细胞数减少约40％，但中和脱乙酰壳多糖海绵中增加约427％。在纤连蛋白(100ng/ml)混合的脱乙酰壳多糖海绵与中和脱乙酰壳多糖海绵上存活力的估测中，分别与脱乙酰壳多糖海绵和中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比，活细胞显著增加约5.5倍和2倍。在bFGF(50ng/ml)混合的脱乙酰壳多糖海绵与中和脱乙酰壳多糖海绵中生长的细胞数与脱乙酰壳多糖海绵和中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比显著增加约17倍和9倍；而且，在Ip型胶原(1.5mg/ml)混合的中和脱乙酰壳多糖海绵中生长的细胞数与中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比增加约9倍。(4)生物人造真皮的细胞学/生物化学分析
从培养皿中移出与人皮肤成纤维细胞培养1周的生物人造真皮，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将所述真皮暴露于0.25％胰蛋白酶溶液中达10分钟而从生物人造真皮中分离成纤维细胞。在培养皿中搅拌真皮，再用DMEM培养基洗涤而获得一悬浮液。将形成的悬浮液加入盛有10％胎牛血清的塑料试管中，离心5分钟。往细胞离心片中添加1ml DMEM培养基而获得一悬浮液。用锥虫蓝溶液将100ml形成的悬浮液染色，在光学显微镜下计数活细胞。结果示于下表2中。
表2细胞在海绵上粘附一周后脱乙酰壳多糖海绵中存活的人皮肤成纤维细胞数(1×104个细胞)
中和脱乙酰壳多糖海绵 中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵(1.2mg/ml的Ip型胶原)
         对比物     8.5±1.2     41.5±1.9
     +bFGF     5ng/ml     18.0±1.4     37.0±2.1
    50ng/ml     33.5±2.1     88.0±2.7
    500ng/ml     24.0±3.4     98.0±3.5
    +纤连蛋白     5ng/ml     16.0±2.2     44.3±1.2
    50ng/ml     23.5±0.9     58.3±2.7
    500ng/ml     20.0±1.7     58.0±3.2
*上述试验数据是通过SEM(±)获得的(n=4)
如上表2中所示，将细胞接种在海绵上一周后，中和脱乙酰壳多糖/Ip型胶原混合海绵中的活细胞数与中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比增加了5倍。包含5、50和500ng/ml的bFGF的中和脱乙酰壳多糖海绵中活细胞数与不含bFGF的中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比分别增加了2倍、4倍和3倍。包含5、50和500ng/ml的纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖海绵中活细胞数与不含纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖海绵中的相比分别增加了2倍、4倍和3倍。
另外，包含5、50和500ng/ml的bFGF的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中活细胞数与不含bFGF的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中的相比分别增加了4.5倍、10倍和11.5倍。包含5、50和500ng/ml的纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中活细胞数与不含纤连蛋白的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵中的相比分别增加了5倍、7倍和7倍。
图3示出了培养的人成纤维细胞(A)、中和脱乙酰壳多糖海绵(B)、不含bFGF的中和脱乙酰壳多糖海绵与培养的人成纤维细胞(C)以及含bFGF的中和脱乙酰壳多糖海绵与培养的人成纤维细胞(D)。箭头指向脱乙酰壳多糖-基质纤维中的健康成纤维细胞。
用10％福尔马林/磷酸盐缓冲盐水固定中和脱乙酰壳多糖或中和脱乙酰壳多糖/胶原海绵的部分并在乙醇中脱水。然后，用二甲苯洗涤，包埋入石蜡中过夜。应用轮转切片机将包埋的组织切成4μm厚的片，用苏木精-伊红对切片的组织染色。中和脱乙酰壳多糖海绵(尤其前几周成纤维细胞在脱乙酰壳多糖海绵上生长)在切片过程中轻易裂开。然而，与成纤维细胞培养4周的海绵具有改良的结构规整性，更容易切片、裂开更少(图4：放大×200)。
在图4(A)(中和脱乙酰壳多糖海绵)中，基质几乎没有结构规整性而且易碎。人成纤维细胞在切片过程中破裂，所以很少出现。箭头指示脱乙酰壳多糖纤维。
在图4(B)(中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵)中，海绵比(A)中的规整得多。这可能是从细胞和胶原纤维分泌的基质蛋白质的缘故。切片过程中海绵保持结构规整性。箭头指示人成纤维细胞和基质纤维。实施例3：体内应用生物人造真皮在Balb/c小鼠中的移植试验(1)人造真皮的移植
在无菌室内喂养Balb/c小鼠。在层流罩超静台中进行手术和移植并且通过腹膜内注射3ml/kg的equithesin进行麻醉。将脱毛剂涂到小鼠背侧，剪去毛发层，然后，用聚维酮碘和70％异丙醇对脱毛的部位消毒。应用尸检穿刺术切除皮肤全厚片。所述切除导致试验动物中大约5％总的体表面的皮肤缺损。将与切除相同尺寸的无细胞人造真皮和含细胞的人造真皮移植到创伤层，用无菌纱布敷料覆盖。为了防止感染，给小鼠提供添加了氨苄西林和链霉素的水。
对动物检查移植物的规整性和每天的愈合过程，在10天和4周后杀死动物。为动物拍照，获取组织用于如下组织分析。
图5示出了Balb/c小鼠内全厚切除物上的脱乙酰壳多糖海绵移植物。在图5(A)中，右边(R)指示没有移植物(对比)，而左边(L)则指示中和脱乙酰壳多糖海绵。在图5(B)中，R指示中和Ip型胶原海绵，而L则指示中和脱乙酰壳多糖海绵。在图5(C)中，R指示中和Ip型胶原+纤连蛋白海绵，而L则指示中和脱乙酰壳多糖+Ip型胶原+纤连蛋白海绵。这些海绵紧密地附着在创伤层上并且没有流体聚集。
图6示出了移植4周后Balb/c小鼠内的移植部位。在(A)中，R指示对比，而L则指示中和脱乙酰壳多糖海绵。在(B)中，R指示中和Ip型胶原海绵，而L则指示中和脱乙酰壳多糖+Ip型胶原海绵。可见，对比中保留疤痕，而其它移植物中创伤愈合良好。(2)组织样品的制备和组织分析
动物创伤的组织样品是通过切除具有正常小鼠皮肤的周边的、处于肉膜下面的整块移植物而获得的。用10％福尔马林/磷酸盐缓冲盐水固定样品，包埋于石蜡中。然后，按上述相同的方法将它切片，通过用苏木精-伊红染色获取结果。
图7示出了移植10天后、从Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的对比物的总体组织学(苏木精-伊红染色，放大100×)。该部位没有充分形成上皮，而且未重新形成新真皮，所以表现出严重的炎症。这种差的愈合可能是由于真皮的缺乏而引起的。
图8示出了移植10天后、从移植了中和脱乙酰壳多糖海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学。正常皮肤组织见于两侧(通过很多被染红的滤泡细胞确定的)，而新再生的表皮和真皮则见于中央。形成了多层表皮，并且皮肤细胞迁移入创伤部位而重新形成新真皮，此外，未观察到发炎。
图9示出了移植10天后、从移植了含50ng/ml的bFGF的中和脱乙酰壳多糖海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学。在与中和脱乙酰壳多糖海绵相似的模式中，正常皮肤组织见于两侧，而新再生的表皮和真皮则见于中央。与中和脱乙酰壳多糖海绵相比，伴随较少的发炎，但总体来说，获得了令人满意的愈合效果。
图10示出了移植10天后、从移植了中和脱乙酰壳多糖/Ip型胶原混合海绵的Balb/c小鼠背外侧区活组织检查的移植部位的总体组织学。见到了完整的多层表皮和重新形成的新真皮，此外，还见到了滤泡细胞。实施例4：脱乙酰壳多糖衍生物的体外细胞毒性试验
用添加了10μl的10％血清的DMEM培养基培养处于96孔板中的1×104个人皮肤成纤维细胞。然后，分别用5、50和500ng/ml的脱乙酰壳多糖低聚体，CM-壳多糖和3,6-S-壳多糖处理培养的细胞。处理后48小时，往其中添加MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑；Thiazolyl blue,Sigama产品No.M5655)，再将混合物放置4小时。除去培养基后，用磷酸盐缓冲盐水将形成的混合物洗涤2～3次，往其中添加100μl DMSO(二甲亚砜)。生色后，应用ELISA阅读器测定545nm处的吸光度。结果示于图11(直线表示对比)和下表3中。
表3用脱乙酰壳多糖衍生物处理的人皮肤成纤维细胞的存活分析结果
    5ng/ml    50ng/ml   500ng/ml
脱乙酰壳多糖低聚体     0.629     0.618     0.733
    CM-壳多糖     0.603     0.630     0.603
    3,6-S-壳多糖     0.608     0.727     0.595
    对比物                0.677
如上所示，用脱乙酰壳多糖衍生物处理的成纤维细胞的存活率在对比物的87.9～108.2％的范围内。因此，脱乙酰壳多糖衍生物确实具有很小的体外细胞毒性。由于本发明的中和脱乙酰壳多糖海绵和中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵被降解成这样的脱乙酰壳多糖衍生物，所以，预计它们基本上是体内非毒性的。
因此，本发明的皮肤支架因构成适合环绕创伤的成纤维细胞和血管细胞迁移和增殖的微环境而具有优异的创伤愈合效果，它特别适用作创伤愈合敷料，而且，包含所述皮肤支架和人成纤维细胞的生物人造真皮尤其适用于愈合宽创伤部位，例如烧伤(其中，周围细胞的迁移困难)。

Claims (12)

1．一种包含中和脱乙酰壳多糖海绵的皮肤支架。
2．权利要求1的皮肤支架，其特征在于，所述中和脱乙酰壳多糖海绵是通过用碱性溶液中和脱乙酰壳多糖溶液、接着冻干中和后的脱乙酰壳多糖溶液而制备的。
3．权利要求1的皮肤支架，其特征在于，它进一步包含一种或多种选自下组的物质：纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子-β。
4．一种包含中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵的皮肤支架。
5．权利要求4的皮肤支架，其特征在于，所述中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵是通过包括如下步骤的方法制备的：
a)用碱性溶液中和脱乙酰壳多糖溶液，
b)用碱性溶液中和胶原溶液，
c)将步骤a)中制备的中和脱乙酰壳多糖溶液与步骤b)中制备的中和胶原溶液混合，以及
d)将步骤c)中制备的混合溶液冻干。
6．权利要求4的皮肤支架，其特征在于，它进一步包含一种或多种选自下组的物质：纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子-β。
7．一种皮肤支架，它包含中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵，该海绵含有脱乙酰壳多糖织物。
8．权利要求7的皮肤支架，其特征在于，所述含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖/胶原混合海绵是通过包括如下步骤的方法制备的：
a)将脱乙酰壳多糖纤维织成织物，
b)用碱性溶液中和脱乙酰壳多糖溶液，
c)将步骤b)中制备的中和脱乙酰壳多糖溶液涂到步骤a)中制备的脱乙酰壳多糖织物上，
d)用碱性溶液中和胶原溶液，以及
e)用步骤d)中制备的中和胶原溶液涂布步骤c)中制备的含脱乙酰壳多糖织物的中和脱乙酰壳多糖海绵。
9．权利要求7的皮肤支架，其特征在于，它进一步包含一种或多种选自下组的物质：纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子-β。
10．一种生物人造真皮，其特征在于，将人成纤维细胞附着在权利要求1～3任一项定义的皮肤支架中。
11．一种生物人造真皮，其特征在于，将人成纤维细胞附着在权利要求4～6任一项定义的皮肤支架中。
12．一种生物人造真皮，其特征在于，将人成纤维细胞附着在权利要求7～9任一项定义的皮肤支架中。
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