JP2005278910A - 組織または器官再生用材料 - Google Patents

Abstract

【課題】従来の組織または器官再生用材料よりも細胞増殖能に優れ、取り扱いやすい組織または器官再生用材料の開発が求められている。
【解決手段】本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料を提供する。本発明の組織または器官再生用材料は、流動性を有しているため、注射器などを使用した注入が容易である。
【選択図】なし

Description

本発明は、生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料に関する。好ましくは、幹細胞培養後に多血小板血漿（ＰＲＰ）を混合してなる組織または器官再生用材料に関する。

近年、再生医療分野において、様々な組織または器官に誘導する幹細胞が注目されている。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄などに存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する幹細胞として知られており、骨、軟骨、神経、腱または歯周組織など多くの組織の再生のために注目を浴びている。

しかしながら、これらの幹細胞を再生医療分野に実用化させるためには、組織から十分な量の細胞を回収する技術、希少な細胞をより効率よく培養させる技術および細胞を生体内に埋植可能な基材に組み込んだ組織または器官の再生のための材料を作成する技術の開発が必要である。例えば、特許文献１には、幹細胞を効率よく培養する方法が提案されている。

一方で、細胞を生体内に埋植可能な基材に組み込んだ組織または器官の再生のための材料を作成する技術としては、細胞を培養する基材に幹細胞を播種し、培養して増殖させたものが開示されている（特許文献２、３）。
特許文献２は、ラットのタイプIコラーゲン溶液、ウサギのタイプIIコラーゲン溶液および軟骨細胞を混合し、培養することで、軟骨移植片を作成する技術が開示されている。
特許文献３には、中央部に細胞が侵入可能な貫通穴を有した材料を、細胞を含有した培養液に浸漬させて培養することで骨移植材を作成する方法の技術思想が開示されている。

つまり、これらの技術により作成された材料は有形であり、個体によって様々な大きさおよび形状を有する損傷した組織または器官に適応させることが困難な場合が多かった。

特開２００３−０５２３６０号公報 特開２００３−２７５２９５号公報 特開２００４−００８４３６号公報

したがって、従来の組織または器官再生用材料よりも細胞増殖能に優れ、取り扱いが容易である組織または器官再生用材料の開発が求められている。

本発明は、
（１） 生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料、
（２） さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）とを混合してなる（１）に記載の組織または器官再生用材料、
（３） 幹細胞が、間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞である（１）に記載の組織または器官再生用材料、
（４） 生分解性高分子物質が、コラーゲン、ポリペプチド、ポリサッカライドまたはポリエステルである（１）に記載の組織または器官再生用材料、
（５） 細胞支持体が、糸状物の束、織布、不織布、シートまたはスポンジからなる（１）に記載の組織または器官再生用材料、
（６） 細胞支持体が、織布、不織布、シートまたはスポンジの積層体である（１）に記載の組織または器官再生用材料、
（７） 積層体が、生分解性高分子物質で成型された糸状物によって縫製された（６）に記載の組織または器官再生用材料、
（８） コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料、
（９） 振盪培養後に、さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）を混合して調製することを特徴とする（８）に記載の組織または器官再生用材料、
（１０） 生分解性高分子物質からなる細胞支持体に幹細胞を播種し、振盪培養することを特徴とする組織または器官再生用材料の製造方法、
（１１） さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）を混合して調製することを特徴とする請求項９に記載の組織または器官再生用材料の製造方法、および、
（１２） コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料を、歯周組織、骨、軟骨、脂肪、神経または腱の再生に使用する組織または器官再生用材料の使用方法に関する。

本発明の組織または器官再生用材料は、従来の組織または器官再生用材料よりも細胞増殖能に優れ、流動性に富んだ材料であるために、注射器などを使用した注入が容易である。

本発明の組織または器官再生材料は、生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなることを特徴としている。組織または器官とは、歯周組織、骨、軟骨、脂肪、神経または腱などが挙げられる。

本発明の細胞支持体は、生分解性高分子物質からなる。生分解高分子物質とは生体内に埋殖した際に、生体適合性がよく、一定期間後に分解、吸収される高分子物質である。具体的には、コラーゲン、ポリペプチド、ポリサッカライドまたはポリエステルなどが挙げられ、好ましくは細胞接着、増殖性に優れ、架橋処理が可能なコラーゲンである。

コラーゲンは、例えば酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンまたは中性可溶化コラーゲンなどが挙げられる。これらの可溶化コラーゲンとは、溶媒に溶解できるよう処理が施されたコラーゲンである。例えば、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲンもしくは中性可溶化コラーゲンなどの可溶化コラーゲンが挙げられる。特に可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプチドの除去処理が施されているアテロコラーゲンが好適である。また、コラーゲンの由来については、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミまたはヒトなどの動物種の皮膚、腱、骨、軟骨もしくは臓器などから抽出されるものである。コラーゲンのタイプとしてはＩ型またはIII型などの分類可能なタイプのうちいずれかに限定されるものではない。

本発明の細胞支持体の形状としては、糸状物の束、織布、不織布またはスポンジなどが好適に使用されるが、同様の効果が得られる形状であれば、これらに限定されるものではない。

細胞支持体として糸状物の束、織布または不織布を用いる場合、これらの形状を構成する糸状物を製造する。糸状物の外径は、培養対象となる細胞の大きさに合わせ、その細胞と同等以上の外径を持つことが、細胞を増殖させる上では好ましく、約０．０１〜１０００μｍ、好ましくは約０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは約０．１〜２００μｍである。長さは、シャーレなどの培養容器の大きさや、上記糸状物から織布または不織布を作製する場合は、作製する織布または不織布の大きさに応じて種々選択される。

上記糸状物の製造方法は常法に従って成型することができる。例えば、コラーゲン糸状物は、コラーゲン水溶液から連続紡糸して製造することができる。コラーゲン水溶液の濃度は、使用するコラーゲンの種類により任意であり、紡糸可能であればどの様な濃度でも構わないが、通常は約０．１〜２０重量％、このうち湿式紡糸では約１〜１０重量％程度が特に好適である。また、紡糸時のコラーゲンの吐出速度は、紡糸可能である範囲であれば任意である。紡糸の際、コラーゲン溶液の吐出に用いる装置は、汎用のギアポンプ、ディスペンサー、各種押し出し装置など、何を用いても良いが、均一な紡糸を行うためには脈動が少なく安定してコラーゲン溶液を定量吐出できる装置が良い。また、紡糸を行う際の口金の孔径サイズは紡糸さえ可能であれば、特に限定はされないが、通常、約１０〜１０００μｍ、好ましくは約５０〜７００μｍの範囲が用いられる。さらに口金の孔数は単数でも複数でも良い。口金の形状も特に限定はされず、紡糸可能であれば、例えばスリット状、各種形状などの物を用いても良い。

湿式紡糸で用いられる凝固浴としては、一般的にコラーゲンを凝固させうる溶媒、懸濁液、乳濁液もしくは溶液であれば特に限定はされないが、無機塩類水溶液、無機塩類含有有機溶媒、アルコール類、ケトン類またはこれらの任意の組み合わせが用いられる。無機塩類水溶液としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどの水溶液、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどの水溶液が好ましい。これらの無機塩類をアルコールまたはアセトンに溶解もしくは分散させた無機塩類含有有機溶媒などを用いてもよく、この場合特に塩化ナトリウムのエタノール溶解もしくは分散溶液が好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、ペンタノールもしくはヘキサノールなどの炭素数１から６のアルコール類またはエチレングリコールなどのグリコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。ケトン類としてはアセトンまたはメチルエチルケトンなどが挙げられる。

上記凝固浴はコラーゲンの凝固のためだけではなく、後述する各種架橋剤との組み合わせにより、コラーゲンの凝固と架橋処理を同時に実施できる加工方法も有効である。たとえば、エタノールとグルタルアルデヒドを混和した溶液を、凝固処理と架橋処理を兼ね備えた凝固浴として使用した場合、両者の工程を一度に行うことができ、紡糸されたコラーゲン糸はそのまま架橋処理される。これらの同時処理は、工程の合理化だけではなく、希薄なコラーゲン溶液による紡糸や細径の糸を紡糸する際に非常に有効である。

細胞培養基材が上記糸状物を収束して糸状物の束とする場合、前記糸状物が約２〜５００本集合した束が好ましく、さらに好ましくは約２〜１００本の糸状物が集合した束である。これらの糸状物の束は、細胞を培養する容器内で蛇行またはらせん状などに変形させて収納される形態で設置することが好ましいが、これに限定されるものではない。

細胞支持体として織布を選択した場合は、細胞を培養する容器の大きさに合わせて作製することが好ましい。上記織布は、上記糸状物で形成される。ここで糸状物の間隔は約０．０１〜５００μｍ、好ましくは約０．１〜２００μｍである。織布を構成する糸状物間は均等であることが好ましい。

上記織布の製造方法は常法に従って成型することができる。例えば、コラーゲン織布の場合、市販されている織り機で製造することができる。ここで、織り機を使用する際に、糸状物が切断されることを防止するために、上記糸状物を縒糸にして使用してもよい。上記縒糸は市販されている縒糸機などで製造することができる。織り機で作製されたコラーゲン織布は、再度エタノールで洗浄し、減圧乾燥する事により、さらに良好なものを得ることができる。

また、細胞支持体として不織布を選択した場合は、細胞を培養する容器の大きさに合わせて作製することが好ましい。上記不織布は、上記糸状物で形成される。ここで糸状物の間隔は約０．０１〜５００μｍ、好ましくは約０．１〜２００μｍである。不織布を構成する糸状物間は均等であることが好ましいが、部分的に接触していてもよい。

上記不織布の例として例えば、糸状物を複数本平行に配列されてなる第１の層と、糸状物を複数本平行に配列されてなる第２の層との糸状物の配列方向のなす鋭角の角度が、約７０°〜９０°である層状体を含む。さらに、第２の層の上に、糸状物が複数本平行に配列された第３の層を、該第２の層の糸状物の配列方向と、第３の層の糸状物の配列方向との糸状物の配列方向のなす鋭角の角度が約７０°〜９０°である層状体も含まれる。つまり、本発明における層状体とは、不織布における一構造を意味するものであり、糸状物を複数本平行に配列されてなる奇数の層（２ｎ＋１層、ｎは０以上の整数）の糸状物の配列方向と、該奇数の層と接触した糸状物を複数本平行に配列されてなる偶数の層（２ｎ＋２層、ｎは０以上の整数）の糸状物とのなす鋭角の角度が、約７０°〜９０°であるものを意味する。これらの層状体の総数は、約２〜２０層、好ましくは約４〜１６層である。このようにして作成された不織布を、本発明では以下層状不織布と呼ぶ。

また、細胞支持体としてシートを選択した場合は、円形、楕円形、正方形または長方形など形状は特にとらわれないが、細胞を培養する容器の形、大きさに合わせて、該細胞を培養する容器内に収まる形状で作製することが好ましい。

上記シートは常法に従って成型することができる。例えば、コラーゲンシートは、特開平９−４７５０３号公報に記載の方法またはこれに準ずる方法に従って作製することができる。具体的には、可溶化処理されたコラーゲン溶液をポリスチレン製またはポリ−４−フッ化エチレン製などのような撥水性の容器に流し込み、乾燥機の中で乾燥することで得ることができる。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％である。

さらに、細胞支持体としてスポンジの形態を選択することができる。本発明におけるスポンジとは、目視判定あるいは顕微鏡下に観察して、均一または不均一な大きさの多数の間隙を有する区画が連続または不連続に分散した多孔質を構成した状態をいう。ここで、スポンジの大きさは、細胞を培養する容器の大きさに合わせて作製することが好ましい。

上記スポンジは常法によって設計することができる。例えば、コラーゲンスポンジは、細胞を培養する容器の大きさに合わせて作成した型に、コラーゲン溶液を注入し、自然乾燥、真空乾燥、凍結真空乾燥などの方法により形成させる。コラーゲン溶液を充填後に凍結し、真空にて乾燥する凍結真空乾燥法で形成することが、スポンジを均一に形成する上で好ましい。該コラーゲン溶液の濃度は約０．０５〜３０重量％である。充填するコラーゲン溶液の濃度を調節することにより、充填率が異なるスポンジをえることができる。また、乾燥条件は、コラーゲン溶液が凍結した後、約０．０８Ｔｏｒｒ以下の真空に保つことが好ましい。凍結乾燥後、型から取り出すことにより、コラーゲンスポンジを得ることができる。さらに、上記スポンジをプレスなどの圧縮によって平面状に成型してもよい。

さらに細胞培養基材は、強度を向上させるためにさらにコラーゲン溶液に浸漬、風乾してもよい。このような処理をバインダー処理という。バインダー処理を行う際のコラーゲン溶液の濃度は、約０．０５〜３０重量％、好ましくは、約０．１〜１０重量％である。

さらに、本発明の細胞培養基材は、上記織布、不織布、シートまたはスポンジを積層することにより作製される積層体よりなることを特徴としている。ここで積層とは、上記不織布の一構造である層状不織布とは異なり、織布、不織布（層状不織布）、シートまたはスポンジのいずれかの同種または異種の組み合わせを積層したものである。大きさは各層において同じにすることが好ましいが、これに限定されるものではない。積層する層数は約２〜１０層、好ましくは約３〜６層である。

さらに、上記積層体は糸状物で縫製されることを特徴としている。糸状物は上記で作製したものでよいが、これに限定されるものではない。例えば、縫製の間隔は約１〜２０ｍｍ、好ましくは約２〜１０ｍｍであり、ミシンピッチの間隔は約１〜２０ｍｍ、好ましくは２〜１０ｍｍである。

また、細胞支持体は必要によりさらに架橋処理を施してもよい。この架橋処理により、細胞支持体の分解時間を適時制御することができる。架橋方法には、大別して物理的架橋方法と化学的架橋方法が存在する。物理的架橋処理法としては、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射または熱脱水架橋処理などがあげられる。特に細胞支持体がコラーゲンから成型された場合は、熱脱水架橋処理が好ましい。熱脱水架橋処理では、コラーゲン単繊維が巻き取られた状態で減圧下加熱処理することにより物理的に架橋処理される。この架橋処理では、架橋温度と架橋時間により生体適合性と分解吸収性をコントロールすることが可能である。物理的架橋と化学的架橋はそれぞれ単独で行ってもよいし、併用してもよく、また併用する場合にはその順番は問わない。

化学的架橋反応に用いる架橋剤としては、細胞支持体との架橋反応が可能であれば如何なる架橋剤でも使用可能である。例えば細胞支持体がコラーゲンで成型された場合、アルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類またはイソシアネート類などが挙げられる。アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサルまたはジアルデヒドデンプンなど、エポキシ類としてはグリセロールジグリシジルエーテルなど、カルボジイミド類としては水溶性カルボジイミドなど、イソシアネート類としてはヘキサメチレンジイソシアネートなどが挙げられ、好ましくはグルタルアルデヒドである。コラーゲン単糸の架橋は、通常、架橋剤の溶液中にコラーゲン単糸を浸漬することにより行われる。架橋剤溶液の溶媒は特に限定されないが、水やエタノールなどが好適であり、特にエタノールが最適である。架橋剤溶液の濃度と浸漬時間により、分解吸収性と生体適合性をコントロールすることが可能である。架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、溶液の濃度は、通常約０.００１容量％〜２５容量％、好ましくは約０．０１〜１．０容量％である。

上記の方法によって作製された細胞培養基材は、幹細胞の培養に使用する。特に、中間層にバインダー処理を施したコラーゲン膜状物（約３〜９層）の両面を、外層としてバインダー処理を施していないコラーゲン層状不織布（約６〜２０層）で挟み、コラーゲン糸状物で縫製し、熱脱水架橋を施した細胞培養基材は、細胞が十分増殖するまで分解されることなく足場が十分に確保され、強度に優れるため、非常に有用である。

次に、上記方法によって製造された細胞支持体を用いて、幹細胞を播種し、培養する。用いる幹細胞は、間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞などが挙げられ、該幹細胞が分化しうる組織または器官に応じて選択することができる。

上記幹細胞は、常法に従って精製される。例えば、イヌ由来の間葉系幹細胞の場合下記の方法によって精製することが可能である。腸骨骨髄（約１０ｍｌ）を約１５〜２５ｋｇの任意のイヌより一般的な麻酔下で採取し、血液凝固を防ぐために約５０００〜１００００ｕｎｉｔのヘパリン約５〜２０ｍｌを充填したシリンジに、上記骨髄を吸い取り、ＤＭＥＭなどの培地に混合する。この培地には添加物として、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧ（濃度約７５〜１２５Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（濃度約７５〜１２５μｇ／ｍｌ）またはアンフォテリシンＢ（濃度約０．１０〜０．５０μｇ／ｍｌ）などの抗生物質を含んでもよい。上記骨髄の有核細胞画分を１．０６３ｇ／ｃｃのパーコール緩衝液を用いた密度勾配遠心により間葉系幹細胞を濃縮する。約５ｍｌの培地中の有核細胞を、約１０〜３０ｍｌのパーコール試薬上に注意深く層状に積み重ね、遠心分離を行う。遠心分離は約３００〜５００ｇで約２０分間行う。培地−パーコール試薬界面の細胞を回収・洗浄後に、培養皿に約５〜１０ｍｌの上記培地を用いて細胞濃度約１．０〜２．０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種する。上記手法により得た細胞を、３７℃、加湿雰囲気下、５％ＣＯ_２存在下で培養を行う。培養２日目において、培養容器に付着していない非接着細胞を培養培地とともに除去し、培養中は、一週間に２回の割合で培地交換を行い、培養約１０〜１３日の間で０．０５％トリプシン含有のＥＤＴＡ溶液（濃度約０．２５〜０．７５ｍＭ）に約５分間曝露することで、細胞を培養容器より剥離して回収する。その後の継代培養は、約１．０×１０^３〜２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で再播種することで行い、コンフルエントに近づいた細胞、標準的には播種してから約５〜７日後の細胞を回収する。

本発明の細胞培養方法は、細胞を培養する容器に設けた細胞支持体に細胞を播種させる。細胞を培養する容器は、シャーレ、フラスコ、バッグなどの振盪培養に適したものであることが好ましい。播種の方法は、細胞を懸濁した培地を細胞培養基材表面に直接塗布させる方法などが挙げられる。懸濁液中における細胞の量としては、細胞密度にして約０．１×１０³〜２．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／１００μｌ、好ましくは約０．１×１０^４〜２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μｌでる。これらの細胞懸濁液に用いる培地は、培養する細胞及び分化・増殖など、目的に応じて適当な培地を用いることが好ましく、例えば、αＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地またはＤＭＥＭ培地などが挙げられる。こうして細胞支持体上に滴下された液滴中の細胞は、細胞支持体の上で接着するまで約３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートする。

上記の方法などによって、細胞支持体に播種された幹細胞は、常法の手段によって振盪培養される。振盪の条件は約３〜３０ｒｐｍである。振盪の運動形態は回転、上下左右の振動などがあげられ、特に限定されるものではない。また、振盪培養の装置は市販の機械を使用すればよい。培養の条件として、例えば、室温約３７℃、加湿雰囲気下、５％ＣＯ_２存在下で培養することができる。さらに、培養する日数は、目視で細胞支持体が分解し流動性を有する状態になるまで培養すればよく、細胞死自体の分解性、浸透培養の条件に依存する。例えば、中間層にバインダー処理を施したコラーゲン層状不織布（約３〜９層）の両面を、外層としてバインダー処理を施していないコラーゲン層状不織布（約６〜２０層）で挟み、コラーゲン糸状物で縫製し、熱脱水架橋を施した細胞培養基材に、間葉系幹細胞を播種、ＤＭＥＭ培地、室温約３７℃、加湿雰囲気下、ＣＯ_２濃度５％の培養条件下で、約１５ｒｐｍで振盪培養した場合、約２１日で分解し、流動性を有する状態になる。この流動性を有した材料には、細胞が培養する際に生成される生理活性物質などを含んでいる。

このようにして培養された幹細胞および原型を失った細胞支持体は、さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）を加え混合することが好ましい。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、無毒、非抗原性である上に、交換成長因子（ＴＧＦ−β）またはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの増殖因子を含んでおり、組織または器官の積極的な再生が期待できる。多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製は常法に従い、哺乳動物より採取された血液試料を遠心分離する方法によって作成される。採取する哺乳動物は、組織または器官を再生する哺乳動物の個体自身であれば、免疫拒絶を受けることが無いため好ましい。例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）１ｍｌに対し、培養後の幹細胞および細胞支持体約５×１０^６〜１×１０^８ｃｅｌｌｓを懸濁することにより混合する。

以上の方法によって作製された本発明の組織または器官再生用材料は、流動性を有しているため注射器などで注入することが可能である。従って、再生すべき組織または器官に応じ、その用途は多彩である。例えば、骨を再生する場合、骨の欠損部に直接注入すればよい。さらに、神経を再生する場合、神経の太さに合わせて作成されたチューブの中空部に本発明の組織または器官再生用材料を注入し、チューブの両端を神経の損傷部に縫合することで再生が可能である。この際、チューブの材料も生分解性高分子物質で成型されていることが好ましい。

以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：コラーゲン層状不織布（外層）の作成
ブタ由来Ｉ型、III型コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製、ＳＯＦＤタイプ、Ｌｏｔ Ｎｏ．０２０２１２）を注射用蒸留水（大塚製薬社製）に溶解し、７重量％に調製した。そして、この７重量％コラーゲン水溶液をシリンジ（ＥＦＤ社製 Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｂａｒｒｅｌｓ／Ｐｉｓｔｏｎｓ、５５ｍＬ）に充填し、シリンジに装着した針より該コラーゲン水溶液を空気圧によりエタノール槽中に吐出した。この際シリンジには、ＥＦＤ社製 Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ Ｔｉｐｓ（２７Ｇ、ＩＤ：Φ０.２１ｍｍ）の針を装着した。吐出した７重量％コラーゲン水溶液は脱水され糸状になったのち、エタノール槽から引き上げられた。引き上げられたコラーゲン糸状物を、前記エタノール槽とは完全に分離独立した第２のエタノール槽に室温で約３０秒間浸漬し、さらに凝固を施した。続いて、第２のエタノール槽から引き上げたコラーゲン糸状物を図１に示す如く１５ｒｐｍで回転している１辺１２ｃｍ、厚さ５ｍｍの板状部材に巻き取った。板状部材の直前には、板状部材に均等にコラーゲン糸状物を巻き取っていくためにコラーゲン糸状物の水平位置を周期的に移動させる往復機構が備え付けられており、その往復速度は１.５ｍｍ／秒とした（糸状物は約６ｍｍの間隔で巻き取られる）。巻き取り装置は、５００回巻き取るたびに板状部材の回転軸を９０度方向転換させるようにし、５００回の巻き取りを９回繰り返し（合計巻き取り数４５００回、９層の層状体）、板状部材の両面にコラーゲン糸状物の層を有するコラーゲン巻き取り物を得た。次にこのコラーゲン巻き取り物を、常温で４時間自然乾燥した後、巻き取り物の端部に沿って裁断し、２枚のコラーゲン層状不織布を得た。そして、得られたコラーゲン不織布をバキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製：ＶＯＳ−３００ＶＤ型）と油回転真空ポンプ（ＵＬＶＡＣ社製：ＧＣＤ１３５−ＸＡ型）を用いて１３５℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応を行い、外層に使用するコラーゲン層状不織布を得た。なお、厚みは約３ｍｍであった。

実施例２：コラーゲン層状不織布（中間層）の作製
まず、実施例１に記載する内容と同様の製法に従いコラーゲン層状不織布を作製した。ただし、合計巻き取り数３０００回、６層とした。次いで１重量％に調製したコラーゲン溶液に含浸させ、膜状に成型した後、常温で十分に自然乾燥した。その後、バキュームドライオーブンを用いて１３５℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で１２時間熱脱水架橋反応を行い、バインダー処理を行ったコラーゲン層状不織布を得た。

実施例３：コラーゲン糸状物の製造
紡糸環境全域の相対湿度を３８％以下に保持した後、この７重量％コラーゲン水溶液を充填したシリンジに、空気圧をかけてシリンジに装着した針より該コラーゲン水溶液を吐出した。吐出した７重量％コラーゲン水溶液は、９９.５容量％エタノール３Ｌを収容したエタノール槽で直ちに糸状に脱水・凝固した。エタノール槽から引き上げられた糸状コラーゲンを、９９.５容量％エタノール３Ｌを収容し前記エタノール槽とは完全に分離独立した第２のエタノール槽に室温で約３０秒間浸漬し、さらに脱水・凝固を施した。続いて、第２のエタノール槽から引き上げられた糸状コラーゲンを、その周囲にドライエアーが送り込まれる送風乾燥機を約３秒間で通過させた後、糸が弛まないようにテンションプーリーで張力を保ちつつ、直径７８ｍｍ、全長２００ｍｍのステンレス製ロール状巻き取り具を３５ｒｐｍで回転させ、巻き取った。このロール状巻き取り具への巻き取りの際、ロール状巻き取り具をロール状巻き取り具の軸方向に１.５ｍｍ／ｓの速度で往復させつつ巻き取り、シリンジに充填した７重量％コラーゲン水溶液が尽きるまで連続紡糸を行った。次いで、ステンレス製ロール状巻き取り具に巻き取られたままの状態で前記と同じバキュームドライオーブンを用いて１３５℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応処理を行い、熱架橋処理が施されたコラーゲン糸状物を得た。

実施例４：縫製されたコラーゲン層状不織布の製造
実施例２で作成されたバインダー処理を行った層状不織布（６層）を、実施例１にて作製されたコラーゲン層状不織布（９層）で挟んだ３層の積層体を、実施例３にて作製されたコラーゲン糸状物を２本撚った撚り糸で縫製することで、細胞培養基材を得た。縫製にはミシン（ジャガー株式会社製、Ｍｏｄｅｌ ＫＭ-５７０）が使用された。縫い模様はピッチが２〜３ｍｍである直線縫いで、コラーゲン不織布の周囲及び不織布の全面に縦横（約１ｃｍ間隔）に縫製した。

実施例５：間葉系幹細胞の培養
実施例４にて得られたコラーゲン製細胞培養基材上で、イヌ由来間葉系幹細胞（以下ｄＭＳＣｓと略記する）の培養を行った。培養にはＤＭＥＭ基礎培地５００ｍＬ及び間葉系幹細胞成長因子、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン混合物５０ｍＬを混合した混合培地を用いた。まず、コラーゲン製細胞培養基材をシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製、６ウェル）に静置し、基材表面上に細胞濃度４.０×１０⁵個／ｍＬとなるように細胞を懸濁した上記の混合培地１ｍＬを塗布した。その後、シャーレに培地３ｍＬを静かに注入し、その後、３７℃、加湿雰囲気下，５％ＣＯ_２存在下で振盪培養を行った。振盪培養の条件は、約１５ｒｐｍで行った。培養開始２１日後には、間葉系幹細胞は十分に増殖し、分解・吸収の進んだコラーゲン製細胞培養基材は流動性を有する物質になっていた。

実施例６：多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製
約５０ｍｌの全血をイヌから採血し、約２５０Ｕ／ｍｌの防腐剤の入っていないヘパリンを含んだ１０ｍｌの培地に混ぜた。血液は標準的な研究用遠心器にて約１１００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。その後黄色血漿（バフィーコートを含む。これは、血小板と白血球を含むものである。）を長針を用いて吸い上げた。その後、２回目の遠心分離を約２５００ｒｐｍ、５分間の条件で行い、血小板を単一のペレットに集めるとともに、血漿上清（これは血小板希薄血漿（ＰＰＰ）であり、比較的にわずかな細胞を含んでいる。）を取り除いた。上記操作により得られた血小板のペレット、バフィーコート／血漿画分（ＰＲＰ）を５ｍｌの血漿残渣に再懸濁し、移植物として用いた。

実施例７：組織または器官再生用材料（移植物）の調製
常法によって得られた間葉系幹細胞を培養した流動性を有する物質約３ｇと、実施例６で得られた多血漿板血漿（ＰＲＰ）１ｍｌを混合することで、組織または器官再生用材料を調製した。

実験例１：組織または器官再生用材料を用いた骨再生試験
本研究における全ての動物実験は、研究動物保護委員会によって承認された厳密なプロトコールに従って行ったものである。
一定期間飼育した２歳の雑種犬４頭に対して、一般的な麻酔下で手術を行った。下顎骨領域にある第一前臼歯、第二前臼歯、第三前臼歯、第四前臼歯を摘出した。下顎骨両側の骨欠損は、直径１０ｍｍのトレフィンバーにより作製した。作製した骨欠損に対して
(i)コントロール（欠損のみ）
(ii)層状不織布＋ｄＭＳＣｓ
(iii)層状不織布＋ｄＭＳＣｓ＋ＰＲＰ
の３群を各々移植し骨形成についての調査を行った。骨治癒の過程で、移植物を埋め込んだ部位による骨形成の違いが出るのを防ぐために、３つの欠損部位を作製して上記６種の移植物をランダムに埋め込むことで、部位特異性を除外した。移植後２、４および８週後における組織染色の写真を図１〜３に示す。また、骨欠損部の耐性を１００％とした場合の移植後８週後の骨再生割合を組織形態計測的分析により評価を行った結果、(iv)１４．６７％、(vi)５０．９５％および(iii)６２．８６％であった。上記３群の中で、(iii)層状不織布＋ｄＭＳＣｓ＋ＰＲＰの群が最も良好な骨形成能を有していることが分かった。

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料を提供する。本発明の組織または器官再生用材料は、流動性に富み、注射器などを使用した注入が容易である。

移植後２週後の(i)〜(iii)の組織染色の写真である。 移植後４週後の(i)〜(iii)の組織染色の写真である。 移植後８週後の(i)〜(iii)の組織染色の写真である。

Claims (12)

1. 生分解性高分子物質からなる細胞支持体上で播種し、振盪培養された幹細胞からなる組織または器官再生用材料。
2. さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）とを混合してなる請求項１に記載の組織または器官再生用材料。
3. 幹細胞が、間葉系幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞または体性幹細胞である請求項１に記載の組織または器官再生用材料。
4. 生分解性高分子物質が、コラーゲン、ポリペプチド、ポリサッカライドまたはポリエステルである請求項１に記載の組織または器官再生用材料。
5. 細胞支持体が、糸状物の束、織布、不織布、シートまたはスポンジからなる請求項１に記載の組織または器官再生用材料。
6. 細胞支持体が、織布、不織布、シートまたはスポンジの積層体である請求項１に記載の組織または器官再生用材料。
7. 積層体が、生分解性高分子物質で成型された糸状物によって縫製された請求項６に記載の組織または器官再生用材料。
8. コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料。
9. 振盪培養後に、さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）を混合して調製することを特徴とする請求項８に記載の組織または器官再生用材料。
10. 生分解性高分子物質からなる細胞支持体に幹細胞を播種し、振盪培養することを特徴とする組織または器官再生用材料の製造方法。
11. さらに多血小板血漿（ＰＲＰ）を混合して調製することを特徴とする請求項９に記載の組織または器官再生用材料の製造方法。
12. コラーゲンからなる糸状物によって縫製された、コラーゲンからなる不織布の積層体上に播種し、振盪培養された間葉系幹細胞からなる組織または器官再生用材料を、歯周組織、骨、軟骨、脂肪、神経または腱の再生に使用する組織または器官再生用材料の使用方法。
    

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