JP2011120763A - 再生治療用材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含み、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも1日間冷蔵保存された後に使用される、再生治療用材料を提供する。本発明の再生治療用材料は、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも30日間冷蔵保存された後に使用できる場合がある。前記固体支持体は、繊維製品、多孔性基材、粒状体及び発泡体からなるグループから選択される場合がある。前記固体支持体は、生分解性材料でできている場合がある。前記固体支持体は、前記多血小板血漿がコーティングされる前に、細胞−基質間接着レセプターのリガンドがコーティングされる場合がある
【選択図】なし
Description
ヒト由来の培養細胞、PRP及びラットを使用するにあたって、新潟大学医歯学総合病院の倫理規定に基づき作成した実験計画を新潟大学歯学部倫理委員会で承認を受けた。さらに、インフォームドコンセントにより、その都度、提供者に対して骨膜細胞及びPRPの採取と実験への供与について説明し、書面による同意を得た。
PRPの調製
患者から採血した新鮮な全血がクエン酸及びブドウ糖を含む抗凝固剤を添加した10mL遠心管に分注され、最短径約57mm、最長径約140mmのスウィングバケット型ロータで2,400rpm、10分間遠心された。遠心分離により赤血球が沈殿し、上清の血漿との間に血小板が集まった。前記血小板及び血漿が別の10mL遠心管に回収され、3,600rpm、15分間遠心された。沈殿した血小板は最少量の血漿中に懸濁して回収され、これが多血小板血漿として使用された。
5、mm×5mm及び5mm×10mmの生体吸収性織布(バイクリルメッシュ、カタログ番号:VICRYL WOVEN MESH (Polyglactin 910) VWMM、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社)が、それぞれ、前記PRP30μL及び60μLで室温、3−5分間コーティングされた。前記織布は、−80°Cのディープフリーザー内で約1時間予備凍結され、その後、凍結乾燥装置で−45°C、20Paで30ないし60分間処理された。(以下、それぞれ「PRP×1」及び「PRP×2」という。)。前記PRPコーティング織布は、使用まで冷蔵庫で貯蔵及び保存された。
患者から採取された骨膜片由来の培養細胞(以下、「ヒト骨膜由来培養細胞」という。)が用いられた。ウシ胎児血清が10%添加されたダルベッコ変法イーグル培地での継代6回目の前記ヒト骨膜由来培養細胞は、セルインサート(ベクトン・ディキンソン、#353090)付きの6ウェルプレート(ベクトン・ディキンソン、#353502又は#55467)にウェルあたり1×105個となるように播種された。培養は、ウシ胎児血清が1%添加されたダルベッコ変法イーグル培地(以下、「分化用培地」という。)をウェルに2mL、セルインサートに1mL添加して、37°C、5%CO2及び飽和水蒸気雰囲気下で2日間行なわれた。前記セルインサートには、前記骨膜片を採取したのと同一の患者由来のPRP×1又はPRP×2が1枚浸漬された。対照実験は、PRPをコーティングしない織布を使用した培養と、PRP×1及びPRP×2を使用せず分化用培地のみの培養とであった。
2日間の培養後、細胞は解離され、粒子数計測分析装置(CDA−100X、シスメックス社)で細胞数が測定された。
図1は、PRPコーティング織布のヒト骨膜由来培養細胞の増殖への影響を調べる実験結果の棒グラフである。図1に示すとおり、ウェルあたりの細胞数は、対照実験では1.0×105個、PRP×1を用いた場合には1.2×105個、PRP×2を用いた場合には1.4×105個であった。この結果は、PRPコーティングバイクリルメッシュのサイズが大きいほど、細胞増殖を促進する活性が高いことを示唆する。なお、PRPをコーティングしない生体吸収性織布は、細胞増殖促進活性を示さなかった(図示されない)。また、本実施例では冷蔵庫での貯蔵期間が1日のPRPコーティング織布を用いたが、貯蔵期間が30日のPRPコーティング織布でも、同様の細胞増殖促進活性が認められた。
創傷及び処置
局部麻酔されたラット(F334、オス、6週齢)背部の表皮が、10mm×10mm切開除去された。PRPをコーティングした10mm×10mmの生体吸収性織布(バイクリルメッシュ、カタログ番号:VICRYL WOVEN MESH (Polyglactin 910) VWMM、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社)が創傷部位に留置され、その上から外科用ポリウレタンフィルム(サージット、ニプロ)が貼付された。対照実験は、生体吸収性織布を留置せず外科用ポリウレタンフィルムだけを創傷部位に貼付したラットであった。
創傷処置の5日後に創傷組織が摘出され、光学顕微鏡観察用組織標本が作製された。薄切切片の作製及びヘマトキシリン・エオジン染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。
図2は、生体吸収性織布を用いないで処置された対照実験のラットの創傷組織(A)と、PRPがコーティングされた生体吸収性織布を用いて処置されたラットの創傷組織(B)とのヘマトキシリン・エオジン染色された組織の光学顕微鏡写真である。図2(A)のアステリク(*)で示される部分は、皮下に形成された肉芽組織である。対照実験の創傷組織(A)では、創傷部分の皮下の一部にしか肉芽組織が形成されなかったのに対し、PRPがコーティングされた生体吸収性織布で処置された創傷組織(B)では、創傷部分の皮下全体に肉芽組織が形成された。この結果は、PRPをコーティングした生体吸収性織布に創傷治癒促進作用があることを示す。また、本実施例では冷蔵庫での貯蔵期間が1日のPRPコーティング織布を用いたが、貯蔵期間が30日のPRPコーティング織布でも、同様の創傷治癒促進作用が認められた。
ヒト骨膜片培養用PRPコーティング織布の調製
実施例1で用いた生体吸収性織布(バイクリルメッシュ)は、予めステアリン酸カルシウムでコーティングされており、PRPをコーティングしただけではヒト細胞が付着し難いので、ヒト骨膜片細胞の培養基材としては適さない。そこで、本実施例のヒト骨膜片の初代培養のための生体吸収性織布は、PRPのコーティングに先立って、アテロコラーゲンでコーティングされた。具体的には、7−10mm×7−10mmの生体吸収性織布(バイクリルメッシュ、カタログ番号:VICRYL WOVEN MESH (Polyglactin 910) VWMM、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社)が、3mg/mLのウシ真皮由来アテロコラーゲン(高研、IPC−30)溶液50μLで15−30分間コーティングされてから、滅菌蒸留水で3回軽くリンスされ、ガーゼ上で乾燥された後、実施例1で調製されたPRP120μLで室温、3−5分間コーティングされた。
PRPを提供した患者から採取された骨膜片は、培地で湿したガーゼの上に戴せて無菌的に培養室に運ばれ、クリーンベンチ内で以下の作業に供された。前記骨膜片は、PBSで3回洗浄されてから、アテロコラーゲン及びPRPをコーティングした織布の上に中央に戴置された。前記織布上の骨膜片は、プラスチックディッシュ中で、25μg/mLビタミンC及び10%ウシ胎児血清が含まれるメディウム199培養液を用いて合計26日間培養された。
前記骨膜片の初代培養は、19日後に培地を、10nMのデキサメタゾン、10mMのβ−グリセロリン酸、25μg/mLビタミンC及び10%ウシ胎児血清が含まれるメディウム199培養液に切り替えて、さらに7日間培養された。
初代培養開始から26日後、前記織布上の骨膜片培養の組織標本が作製された。薄切切片の作製、ヘマトキシリン・エオジン染色及びフォン・コッサ染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。
Claims (6)
- 固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含み、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも1日間冷蔵保存された後に使用されることを特徴とする、再生治療用材料。
- 前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも30日間冷蔵保存された後に使用されることを特徴とする、請求項2に記載の再生治療用材料。
- 前記固体支持体は、繊維製品、多孔性基材、粒状体及び発泡体からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の再生治療用材料。
- 前記固体支持体は生分解性材料でできていることを特徴とする、請求項1ないし3のいずれか1つに記載の再生治療用材料。
- 前記固体支持体は、前記多血小板血漿がコーティングされる前に、細胞−基質間接着レセプターのリガンドがコーティングされることを特徴とする、請求項1ないし4のいずれか1つに記載の再生治療用材料。
- 前記リガンドはアテロコラーゲンであることを特徴とする、請求項5に記載の再生治療用材料。
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