JPWO2018194161A1 - 振盪浮遊培養を用いた間葉系幹細胞の未分化性維持方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、MSCを振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したまま細胞塊でMSCを培養する方法を提供する。
本発明は、前述した本発明の培養方法により得られる細胞塊を提供する。本明細書において、細胞塊とは、接着培養等により培養容器内壁の底面及び/又は壁面にそって平面的に増殖した一群の細胞ではなく、3次元的な広がりを有する細胞の塊を意味する。細胞塊は、スフェア、スフェロイド等と言い換えることもできる。本発明の細胞塊は、長期間の培養を経ても未分化の状態でかつその分化能を失っていないという効果を示す。ここで、本発明においては、細胞塊を構成する全ての細胞が未分化性を維持していてもよいが、未分化性を保持した幹細胞を供給し続ける幹細胞プールとしての使用;再生医療への応用等の用途に用いることができる範囲で、未分化性が維持された細胞が細胞塊に含まれていればよい。
本発明は、分化誘導培地中で前述した本発明の細胞塊を培養する工程を含む、細胞分化方法を提供する。
本発明は、前述した本発明の分化誘導方法により所定の細胞に分化した細胞塊を提供する。
以下の方法に従い、実験を行った。
C57/BL6雄4週齢(CLEA JAPAN)5匹の大腿骨・脛骨を乳鉢乳棒にて砕き、2%FBS(Cat.#SH30910.03:Hyclone),10mM HEPES(Cat.#346−01373:Dojindo),及び1%Penicillin/Streptomycin(P/S:Cat.#168−23191,Wako)を添加したHBSS+(Cat.#14025134:Gibco)(以下HBSS+調整溶液とする)にて懸濁し、赤血球を除去した。粉々に砕いた骨を1時間37℃で0.2%collagenase(Cat.#034−10533:Wako)の10mM HEPES(Cat.#346−01373:Dojindo)及び1%P/S(Cat.#168−23191:Wako)含有DMEM(Cat.#08459−64:Nacalai tesque)溶液にて酵素処理した。酵素処理した骨を40μm径のcell strainer (Cat.#352340:Falcon) に通し、280Gで7分、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を回収した。標準的には1匹から1×107〜3×107個の細胞が回収できる。回収した細胞1×107個を1mlのHBSS+調整溶液に懸濁し、PE−conjugated CD45(30−F11:Cat.#12−0451−83, 0.2mg/ml, eBioscience),TER119 (TER−119:Cat.#12−5921−83,0.2mg/ml, eBioscience),APC−conjugated PDGFRα(APA5:Cat.#17−1401−81, 0.2mg/ml, eBioscience)及びFITC−conjugated Sca−1(Ly6A/E:Cat.#11−5981−85, 0.5mg/ml, eBioscience)抗体を各2μl加え、遮光、4℃の環境で30分間静置した。次に、280Gで7分、4℃で遠心分離し、1×107個/1mlの細胞懸濁液となるようHBSS+調整溶液で調整し、最終濃度1μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI:Cat.#169−26281,WAKO)染色により死細胞を標識後、Aria III flow−cytometer(BD Bioscience)を用いてPI-/CD45-/Ter119-/PDGFRα+/Sca−1+の細胞をソーティングした(図6−a)。
接着培養で継代培養した細胞試料:10cm培養皿(Cat.#664160−013:CELLSTAR)に接着培養した細胞を、2度PBSを用いて洗浄した後、1mlのCell dissociation Buffer(Cat.#13151014:Gibco)を用い細胞を剥がし、HBSS+調整溶液を加え、280Gで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、沈殿した細胞を回収した。
東京医科歯科大学より譲り受けたヒトMSCは、19歳男性大腿骨骨髄よりPE−conjugated CD271 (LNGFR:Cat.#130−091−885,Miltenyi Biotec)、FITC−conjugated CD90 (Thy−1:Cat.#328110,Biolegend)抗体を用いて、MoFlo(BECKMAN COULTER)でソーティングされたものである(非特許文献7)。死細胞の標識にはPIを用い、陰性分画を生細胞としてソーティング後、2度継代した細胞を供与された。
マウス細胞の解析と同様、接着細胞は10cm培養皿(Cat.#664160−013:CELLSTAR)で培養した細胞を2度PBSで洗浄し、1mlのCell dissociation Buffer(Cat.#13151014:Gibco)を用いて細胞を剥がし、9mlのHBSS+調整溶液を加え、280Gで5分、4℃で遠心分離し上清を除去し、細胞を回収した。細胞塊の解析では、平均10個の細胞塊を10cm培養皿(Cat.#664160−013:CELLSTAR)に7日間静置し、培養皿に接着した細胞塊から遊走した細胞を2度PBSで洗浄し、1mlのCell dissociation Buffer(Cat.#13151014:Gibco)を用いて細胞を剥がし、9mlのHBSS+調整溶液を加え、280Gで5分、4℃で遠心分離し上清を除去し、細胞を回収した。なお、細胞塊由来細胞の解析では継代培養は1度も行わず、細胞塊から遊走した細胞を直接解析に用いた。接着培養した場合、及び細胞塊由来の接着培養の場合共に、10cm培養皿1枚から7×106〜1×107個の細胞が回収可能であった。回収した細胞1×107個を1mlのHBSS+調整溶液に懸濁し、(PE−conjugated LNGFR:Cat.#130−091−885,5.5μg/ml,Miltenyi Biotec),FITC−conjugated Thy−1:Cat.#328110, 0.2mg/ml, Biolegend)、及びAPC−conjugated CD106(VCAM−1):Cat.#305810,0.5mg/ml, Biolegend)抗体を各2μl加え、遮光、4℃の環境で30分間静置した。次に、280Gで5分、4℃で遠心分離し、1×107個/1mlの細胞懸濁液となるようHBSS+調整溶液で調整し、Aria III(BD Bioscience)を用いて解析した。
OriCellTM Strain C57BL/6 マウスMSCs(MUBMX-01001:CYAGEN)およびマウス純化MSCは、増殖維持培地として10%FBS(Cat.#SH30910.03:Hyclone),1%P/S(Cat.#168-23191:Wako)及び10mM HEPES(Cat.#346-01373:Dojindo)を含むMEM−α+GlutaMAX−I(Cat.#32561-102:Gibco)を用いて培養した。
振盪培養にはTAITEC BR−40LF bio−shakerを用いた。125ml erlenmeyerフラスコ(Cat.#431405:Corning)の中に、20mlの増殖維持培地で調整したマウスあるいはヒトMSCの細胞懸濁液を用意した。マウスMSC(OriCellTM マウスMSC及び純化したマウスMSC)の振盪培養時には、増殖維持培地に20ng/ml βFGF(Cat.#064-05384:WAKO)を添加した。振盪培養開始時のフラスコあたりの細胞数は、OriCellTM マウスMSCで1.0×107個、純化したマウスMSCで5.0×105個、ヒトMSCで1.0×106個あるいは1.0×107個になるように調整した。振盪培養は37℃,5%CO2,85〜95r/min,振幅40mmで旋回しながら行い、3〜4日に1度培地交換を行った。培地交換は、まず細胞を含む全培地を50ml遠沈管(Cat.#TR2004:True Line)に移し、280Gで5分、4℃で遠心分離した。上清を除去後、25mlピペット(Cat.#760180:greiner bio−one)を用いて新たな培地を20ml加え、2〜3回ピペッティングを行いフラスコに移した。振盪培養を開始して10〜14日後には肉眼による細胞塊の形成が確認できた。
神経幹細胞用培地(非特許文献4、非特許文献11、非特許文献12参照)には、1%P/S(Cat.#168−23191:Wako)及び10mM HEPES(Cat.#346−01373:Dojindo)、1×N2(Cat.#17502−048:Gibco)、20ng/ml EGF(Cat.#059−07873:WAKO)、20ng/ml FGF(Cat.#064−05384:WAKO)、1×B27(Cat.#17504−044:Gibco)を含むAdvanced DMEM/F12(Cat.12491015:Gibco)を用いた。
マウスMSC(OricellTM マウスMSC:1.0×107個)の細胞懸濁液を20mlの神経幹細胞用培地で調整し、125ml erlenmeyerフラスコ(Cat.#431405:Corning)の中に用意した。これら細胞懸濁液を、TAITEC BR−40LF bio−shakerを用いて37℃,5%CO2,85〜95r/min,振幅40mmで旋回しながら振盪培養を行った。培地交換は3〜4日に1度行った。培地交換は、まず細胞を含む全培地を50ml遠沈管(Cat.#TR2004:True Line)に移し、280Gで5分、4℃で細胞を遠心分離した。上清を除去後、25mlピペット(Cat.#760180:Greiner bio−one)を用いて新たな培地を20ml加え、2〜3回ピペッティングを行いフラスコに移した。振盪培養を開始して10〜14日後には肉眼による細胞塊の形成が確認された。
接着培養したマウスあるいはヒトMSCを、3×106細胞(個)/mlの細胞懸濁濃度でKuraray三次元培養容器(Elplasia Cat.#RB 500 400 NA Plate:Kuraray)に播種した。培養には、上述のMSC振盪浮遊培養と同様の増殖維持培地を用い、3〜4日に1度の培地交換を行った。
マウスあるいはヒトMSCを振盪培養することで形成された細胞塊を、増殖維持培地の入ったプラスチック培養皿へ静置して接着させた。この際、ヒトMSCでは上述の増殖培地からβFGF除いた培地を用いた。その結果、マウスおよびヒトMSCの細胞増幅が可能であった。培養皿に接着した細胞塊の周囲からは多くの細胞が遊走し、増幅して培養皿の培養表面に広がった。細胞の遊走・増幅後、培養皿に接着した細胞塊の本体は、200μlピペットチップの先端を用いて、細胞塊の底面を剥ぎとることで容易に回収が可能であった。回収した細胞塊を別の培養皿へ再度静置すると同様の細胞遊走による細胞増幅が可能であった。10cm培養皿(Cat.#664160-013:CELLSTAR)あるいは12wellプレート(Cat.#665-180:CELLSTAR)に遊走・増幅させた細胞を、それぞれFrow−cytometory解析あるいは分化誘導解析に用いた。分化誘導解析では12wellプレートの各ウェルに2〜3個の細胞塊を播種した(分化誘導法参照)。10cm培養皿での培養では、直径200μmを超える8〜12個の細胞塊を、培養皿全体に均等な距離を保つ様静置した。
骨芽細胞及び脂肪細胞への分化誘導は、接着培養では細胞を12wellプレート(Cat.#665-180:CELLSTAR)へ1×105細胞(個)/wellの濃度で播種して行った。細胞塊由来遊走細胞では、同様の12wellプレートの各ウェルに2〜3個の細胞塊を播種し、細胞塊からから遊走・増幅した細胞を用いた。播種後細胞の接着状態を確認し、60−70%コンフルエントの状態(約7日培養)で骨芽細胞分化誘導培地(Cat.#PT3002:Lonza)及び脂肪細胞分化誘導培地(Cat.#PT3004:Lonza)に交換し、以降3〜4日に1度培地交換を行い、最大21日間の分化誘導を行った。誘導期間中約2週間で接着細胞及び形成された脂肪滴が浮遊し剥がれる場合があった。その場合は、その時点で培養を終了した。骨芽細胞分化の確認にはアルカリフォスファターゼ(ALP)染色を、脂肪細胞分化の確認にはオイルレッドO染色を用いた。どちらの染色法においても、ヘマトキシリン染色は行わなかった。
染色にはHistofine assay Kit(Cat.#415161:ニチレイ)を用いた。PFAをPBSで洗浄し、染色直前にkit中の試薬を混合調整し、孔径0.22μmのシリンジフィルター(Cat.#SLGP033RS:Merk Millipore)でろ過した染色液で30分染色し、水洗した。ネガティブコントロール(NC)は骨芽細胞分化誘導前のMSCを同時にALP染色したものを用いた。
PFAをPBSで洗浄後、60%イソプロピルアルコールで1分処理し、孔径0.22μmのシリンジフィルター(Cat.#SLGP033RS:Merk Millipore)でろ過したオイルレッドO染色液(Cat.#40492:Muto Pure Chemicals)にて30分染色した。染色後染色液を除去し、再び60%イソプロピルアルコールで1分処理した後、水洗した。
分化誘導後の細胞ペレットをパラフィン包埋し、スライドガラス上に切片を作製した。キシレンによる脱パラフィン、100%アルコールによる脱キシレンを行い、80%アルコールで処理した後、孔径0.22μmのシリンジフィルター(Cat.#SLGP033RS:Merk Millipore)でろ過したトルイジンブルー染色液(Cat.#209−14545: Wako)にて30分染色した。染色後、100%アルコールにて脱水し、キシレン処理後マリノール(Cat.#2009−3: Muto pure Chemicals)にて封入した。
神経幹細胞用培地で振盪培養した細胞塊を、神経幹細胞用培地中からEGF、FGF、1×B27を取り除き、10%FBS(Cat.#SH30910.03:Hyclone)を加えた培地に移し、ポリ−L−オルニチン(Cat.#163−27421:WAKO;37℃,12時間)処理後、フィブロネクチン(Cat.#062−05701:WAKO;37℃,12時間)処理したチャンバースライド(Cat.#SCS−NO8:MATSUNAMI)へ播種した(2〜3個の細胞塊/well)。播種7日後に細胞塊から遊走した細胞を4%PFA(Cat.#163−20145:WAKO)を用いて固定し、蛍光免疫染色観察に用いた。
PFAで固定した試料を1×PBSで洗浄後、0.3%Triton−X100(Cat.#160−24751:WAKO)を用いて室温で5分間処理し、再度1×PBSで洗浄した。洗浄した細胞はブロッキングバッファー(0.01%Triton−X100(Cat.#160−24751:WAKO)、5%Bovine Serum Albumin(Cat.#23208:Thermoscientific)を添加した1×PBS)にて30分間処理後、500倍に希釈した抗βIII−Tublin抗体(Cat.#ab18207:abcom)を用いて一次染色(4℃,オーバーナイト)を行った。その後1×PBSにて洗浄し、1000倍に希釈したDonkey Anti−Rabbit IgG H&L(Alexa Flour(登録商標)488;Cat#ab150073:abcom)を用いて二次染色(室温1時間)を行った。細胞試料を1×PBSにて洗浄し、VECTASHIELD mounting medium with DAPI (Cat#H−1200:VECTOR)を用いて封入し、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM780:Zeiss)を用いて観察した。
Total RNA抽出にはTrizol(Cat.#15596108:Invitrogen)とRNeasy Mini Kit(Cat.#74106:Quiagen)を使用し(Quiagen Kitプロトコールに従い抽出)、DNase I (Cat.#AM2222:Ambion)にてgenomic DNAを除去した。逆転写反応にはReverse Transcription System(Cat.#A3500:Promega)を用い、プロトコール手順に従いランダムプライマー(Cat.#C118B:Promega)、AMVリバーストランスクリプターゼ(Cat.#M900B:Promega)及びMgCl2(Cat.#A351H:Promega)を使用した。PCR反応はcDNAをGo Taq Green Master Mix(Cat.#M7123:Promega)を用いて増幅した(Promega プロトコール手順に従った)。PCR productsは1.0〜1.5%アガロースゲルに泳動した:
マウス
PDGFRα;270bp,60℃,35サイクル
F: 5'-TACATCATCCCCCTGCCAGA-3'(配列番号1)
R: 5'-AAGGTTATCCCGAGGAGGCT-3'(配列番号2)
GAPDH;418bp,アニーリング67℃,26サイクル
F: 5'-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3'(配列番号3)
R: 5’−GACGGACACATTGGGGGTAG−3’(配列番号4)
OPN;437bp,62℃,35サイクル
F: 5’−TCACCATTCGGATGAGTCTG−3’(配列番号11)
R: 5’−ACTTGTGGCTCTGATGTTCC−3’ (配列番号12)
OCN;292bp,62℃,35サイクル
F: 5’−AAGCAGGAGGGCAATAAGGT−3’ (配列番号13)
R: 5’−AGCTGCTGTGACATCCATAC−3’ (配列番号14)
Adipsin;433bp,64℃,40サイクル
F: 5’−ACTCCCTGTCCGCCCCTGAACC−3’ (配列番号15)
R: 5’−CGAGAGCCCCACGTAACCACACCT−3’ (配列番号16)
PPARγ;460bp,56℃,35サイクル
F: 5’−GTGCGATCAAAGTAGAACCTGC−3’(配列番号17)
R: 5’−CCTATCATAAATAAGCTTCAATCG−3’(配列番号18)
Agrican;146bp,64℃,35サイクル
F: 5’−CGCCACTTTCATGACCGAGA−3’(配列番号19)
R: 5’−TCATTCAGACCGATCCACTGGTAG−3’(配列番号20)
Sox9;132bp,61℃,35サイクル
F: 5’−CCTTCAACCTTCCTCACTACAGC−3’ (配列番号21)
R: 5’−GGTGGAGTAGAGCCCTGAGC−3’(配列番号22)
Col2A1;121bp,61℃,35サイクル
F: 5’−CCTCCGTCTACTGTCCACTGA−3’(配列番号23)
R: 5’−ATTGGAGCCCTGGATGAGCA−3’(配列番号24)
Nestin;492bp,60℃,35サイクル
F: 5’−AATGGGAGGATGGAGAATGGAC−3’(配列番号25)
R: 5’−TAGACAGGCAGGGCTAGCAAG−3’(配列番号26)
Twist;225bp,64 ℃,35サイクル
F: 5’−GGAGGATGGAGGGGGCCTGG−3’(配列番号27)
R: 5’−TGTGCCCCACGCCCTGATTC−3’(配列番号28)
ヒト
Sox2;151bp,64℃,40サイクル
F: 5'-GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3'(配列番号5)
R: 5'-TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3'(配列番号6)
Oct3/4:144bp,68℃,40サイクル
F: 5'-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3'(配列番号7)
R: 5'-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3'(配列番号8)
GAPDH;613bp,56℃,35サイクル
F: 5'-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3'(配列番号9)
R: 5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3(配列番号10)
図1:振盪培養によるマウス及びヒトMSCの細胞塊形成
OriCellTM マウスMSC(MUBMX-01001:Cyagen)及びヒトMSC(19歳男性骨髄から純化したMSC)を接着培養にて継代培養を重ね、継代培養数の少ない細胞及び多い細胞を用意して振盪培養に供した。マウスMSCは購入後最大50回(出荷前からのカウントでは56回)まで接着培養による継代培養が可能であった。ヒトMSCは供与後20回(供与前からのカウントで22回)まで接着培養による継代培養が可能であった。
振盪培養がマウスMSCの分化能維持に及ぼす影響を検討した。接着培養においてOriCellTM マウスMSCは、継代培養数が11回という比較的少ない段階では、骨芽細胞への分化能(ALP染色陽性)及び軟骨細胞への分化能(トルイジンブルー染色陽性)を保っているが、すでに脂肪への分化能は喪失しており、オイルレッドO染色に対して陰性を示した(図2−a:上段)。
OricellTM マウスMSCを用い、接着培養継代数の少ない細胞(継代数9回)及び多い細胞(継代数30回)を用意し、振盪培養を1か月行った後に中胚葉系の細胞である骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞へ分化誘導した結果を図3に示す。
OricellTM マウスMSCを用い、接着継代数の少ない細胞(継代数8〜9回)及び多い細胞(継代数30回)を準備した。接着培養後すぐに分化誘導を行なった細胞と接着培養後に振盪培養し分化誘導を行なった細胞で、それぞれ骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に関連する遺伝子の発現をRT−PCRを用いて解析した。
骨芽細胞に21日間分化誘導した場合、接着培養継代数の少ない細胞(継代数8〜9)では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較して骨芽細胞マーカーであるOCN、OPNの発現が高かった。接着継代培養数の多い細胞(継代数30回)では、振盪培養細胞の方が接着培養細胞と比較してOPNの発現が高かった(図4−a)。
振盪培養がヒトMSCの分化能維持に及ぼす影響を検討した。接着培養においてヒトMSCは、継代培養を20回重ねると骨芽細胞への分化能(ALP染色陽性)は示すが、脂肪細胞への分化能は喪失していた(オイルレッドO染色陰性)(図5−a:上段)。
ヒトMSCを用い、接着継代培養数の少ない細胞(継代数9回)と多い細胞(継代数19回)を準備し、軟骨細胞への分化能解析を行なった。
MSCの細胞塊を形成する既存の方法に用いられている低接着性の三次元培養容器(Kuraray Elplasia RB 500 400 NA Plate)に、接着培養で維持培養したヒトMSC(継代培養数:9回)あるいはOriCellTM マウスMSC(継代培養数:25回および41回)を3×106個/mlで播種した。結果、ヒトMSCにおいては培養皿に接着してしまい、7日経っても細胞塊の形成は得られなかった(図7−a)。一方マウスMSCにおいては、Baraniakらの報告(非特許文献10)と同様、培養器中で培養7日後には細胞塊を形成した(図7−b)。この時点で回収した細胞塊を再度培養皿に移して接着培養環境下に静置した結果、細胞塊は培養皿に接着し周囲に細胞が遊走したが、細胞塊はその形態を保つことなく7日後には消失し、脂肪細胞への分化能は失われていた(オイルレッドO染色陰性かつ脂肪滴を認めず)(図7−b)。
低接着性の三次元浮遊培養容器(Kuraray Elplasia RB 500 400 NA Plate)に、接着培養で維持培養したOricellTM マウスMSC(継代培養数:25回および41回)を3×106個/mlで播種した。7日後に形成された細胞塊を12well plate(Cat.#665−180:CELLSTAR,greiner bio−one)に播種することで接着培養へ移行し、接着した細胞塊から遊走した細胞の骨芽細胞および脂肪細胞への分化を検証した。
接着培養にて7回継代培養したヒトMSCを2ヵ月間振盪培養して形成した細胞塊を培養皿に静置した結果、翌日には細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、7日後には細胞は培養皿を満たすように増殖した(図9−a:上段)。また、再接着した細胞塊は7日後にもその形態を保持しており、細胞塊を機械的に剥がして新たな培養皿に静置することが可能であった(再接着1回目)。再度細胞塊を静置した翌日には、先述同様に細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、10日以内に細胞は培養皿を満たすように増殖し、細胞塊はその形態を保持していた(図9−a:中段左2枚の写真)。この細胞塊を機械的に剥がして新たな培養皿に静置することをさらに4回繰り返しても(再接着2〜5回目)、同様に細胞塊周囲への細胞の遊走を認め、14日以内に細胞は培養皿を満たすように増殖し、細胞塊はその形態を保持していた(図9−a:中段右3枚の写真〜下段)。
純化したマウスMSCにおいても振盪培養に供することによってOriCellTM マウスMSCの場合と同様の細胞塊を形成するか否かを検討した。ソーティング後のマウス純化MSCは、細胞数を確保するため、接着培養にて2回継代培養を行った。この2回継代したマウス純化MSC(5.0×105個/フラスコ)を2ヶ月間振盪培養した結果、OriCellTM マウスMSCの場合と同様の細胞塊を形成した(図示せず)。形成した細胞塊を新たな培養皿に静置した結果、翌日には細胞塊周囲への細胞の遊走を認め(図10−b:左図)、遊走した細胞は10日以内に培養皿を満たすように増殖した。なお、この際も細胞塊は形を崩すことはなくその形態を保持していた。また、遊走・増殖した細胞は、脂肪細胞へ分化誘導すると14日後には脂肪滴を産生したことから(図10−c)、脂肪細胞への分化能を保持していることが明らかとなった。
OricellTMマウスMSCを用い、神経幹細胞用培地中で同様の振盪培養を行った場合にも細胞塊が形成されるか否かを検証した。また、得られた細胞塊における中胚葉系細胞(骨、脂肪、軟骨)および神経細胞への分化能について検証した。さらに、RT−PCRにて神経堤幹細胞マーカーであるNestin、Twistの発現および間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRαの発現を解析した。
この細胞塊を用いて骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞へ分化誘導した結果、ALP陽性の骨芽細胞、オイルレッドO陽性の脂肪滴を示す脂肪細胞、トルイジンブルー陽性細胞による軟骨ペレットの形成を認めた(図11−b)。また、この細胞塊を用いて神経細胞へ分化誘導した結果、βIII−Tublin陽性の神経細胞を認めた(図11−c)。
上記結果から明らかなように、振盪培養を用いることにより、未分化性を失ったMSCを再び高い未分化性MSC集団の細胞塊へと回復させることができた。また、振盪培養にて形成されたMSC細胞塊は未分化性を保持すると同時に、強靭な形態保持能力を有しており、新たな培養皿に再度接着させることで未分化なMSCを供給することができる。
また再生医療への応用の観点では、この細胞塊はそれ自体がスキャホールドとして欠損部位のスペースメーキングし、幹細胞の組織再生を促すことが期待される。
Claims (8)
- 間葉系幹細胞を振盪培養することを特徴とする、未分化性を維持したまま間葉系幹細胞を培養する方法。
- 前記振盪培養が回転数20〜200rpmで行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記振盪培養が振幅10〜40mmで行われる、請求項1に記載の方法。
- 2回以上、継代培養を行う、請求項1に記載の方法。
- 振盪培養に供する前記間葉系幹細胞が所定の細胞への分化能を喪失している細胞であり、かつ該所定の細胞への分化能が振盪培養により回復する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により得られる細胞塊。
- 分化誘導培地中で請求項6に記載の細胞塊を培養する工程を含む、細胞分化方法。
- 請求項7に記載の方法により所定の細胞に分化した細胞塊。
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