KR20190048028A - HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)를 유효성분으로 포함하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)를 유효성분으로 포함하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 조성물은 SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 과산솨수소(H2O2)에 의한 Caveolin-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 의 발현을 억제하여 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 조성물은 SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 과산솨수소(H2O2)에 의한 Caveolin-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 의 발현을 억제하여 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성에 관한 것이다.
Description
본 발명은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 과산화수소(H2O2)로 유도한 세포노화를 억제하는 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 조성물은 SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 과산솨수소(H2O2)에 의한 Caveolin-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 의 발현을 억제하여 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성에 관한 것이다.
세포노화(cellular senescence)는 세포의 형질 및 기능 퇴화와 그것에 이어지는 세포사 혹은 증식정지가 일어날 때까지의 과정을 말한다. 정상세포가 분열을 멈추고 노화기에 들어가면, 일반적으로 G1기에 정지되어 있다고 알려져 있다. 노화된 세포는 크기가 커지고 모양이 납작해지며, 세포의 방향성(polarity)이 상실되어 방사형을 보이는 등 매우 불규칙한 형태의 모양을 갖는다.
또한 pH 6.0에서 SA-β-galactosidase(SA-β-gal)의 활성이 증가하며, 이 외에도 유전자의 발현 양상이 변하고 세포고사 유발에 대해 저항성이 증가하고, 분열촉진물질(mitogen)을 처리해도 DNA 합성이 유도되지 않으며, 단백질의 탈인산화가 증가하고(예, pRb 등), CDKI(p21, p16 등)의 발현이 증가한다.
이러한 세포가 노화되면 조직과 장기가 퇴축되면서 기능의 활성이 감소하면서, 세포노화에 의해 개체의 노화에까지 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 따라서 세포노화의 현상을 이해하고 기전을 밝히기 위한 많은 연구가 수행되고 있으며, 세포 수준의 노화를 억제하기 위한 연구들이 이루어지고 있다.
특히 자유 라디칼에 의한 세포의 노화는 자신의 세포에서 생성한 자유 라디칼, 즉 대사를 통해 생성된 활성산소 종(reactive oxygen species)에 의해 산화적 스트레스가 발생하여 노화가 발생하는 것으로, 활성산소 종에는 수퍼옥사이드 이온(superoxide anion) 라디칼 외에 수산화라디칼, 과산화수소, 일산화질소(nitric oxide)가 존재한다.
또한 산화적 스트레스 및 DNA 손상으로부터 세포를 보호하는데 중요한 역할을 수행하는 SIRT(sirtuin) 1으로 보고된바, SIRT 1은 세포의 노화에 있어서 중요한 요소라고 할 수 있다.
SIRT(sirtuin) 1은 NAD-의존성 탈아세틸화 효소 활성이 있는데 이를 통하여, p53, FoxO, Ku70, NK-κB 및 PPARγ 등 다양한 단백질들을 탈아세틸화하여 세포성장, 노화, 죽음, 대사, DNA 손상의 수복과 같은 다양한 세포기능의 조절을 통하여 동물의 노화와 수명, 특히 노화기의 건강상태에 중요한 결정인자로 작용한다. 특히 SIRT 1에 의해 활성이 억제되는 p53은, 노화현상에서 가장 중요한 세포주기억제인자이며, 노화된 세포에서 발현이 증가된 것으로 알려져 있다.
최근 발명되는 항산화 성분의 경우, 산화(酸化)를 방지하는 물질로서, 각종 질환에 활성산소가 관여한다는 것이 알려져 주목을 받기 시작했다. 식품 중에는 폴리페놀, 비타민 C, 비타민 E, β-카로틴 등이 있는데, 경구적 섭취로 효과를 확인할 수 있다.
또한, 동맥경화나 뇌·심장혈관계 장애, 노화나 발암에 활성산소가 관여한다는 사실이 밝혀져, 기존의 산화방지제 외에 경구적으로 섭취하는 항산화물질의 효과·효능이 최근 주목을 받고 있다.
그러나 인체에는 활성산소를 제거하도록 된 복잡한 메카니즘적 구조가 존재한다. 따라서 이런 생체 구조들과의 관계와 더불어 천연물로서, 부작용없이 섭취할 수 있는 세포노화 예방, 개선 또는 치료 조성물에 대한 공급이 필요한 실정이다.
본 발명자는 이러한 항노화를 위한 천연물 제제 중 유효성분으로서 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)를 연구하여 본 발명을 완성하였다.
선행기술로는 대한민국 등록특허공보 제 10-0975499 호 : 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물에 대해 제시하고 있다. 청구항 1에 있어서, 강진향(Dalbergia odorifera) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물로 기재하고 있다.
그러나 본 발명의 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)에 대해 제시하고 있지 않으며, 상기 선행기술와 상이하다.
본 발명은 이러한 세포노화를 방지하기 위한 천연물 제제 중 유효성분 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)를 정제하여 세포노화 예방, 개선 또는 치료 효능을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 과산화수소(H2O2)로 유도한 세포노화를 억제하는 조성물로서 항노화 효능을 제공하는데 있다.
본 발명에 따른 조성물은 베타-갈락토시다아제(SA-β-galactosidase; SA-β-gal)를 감소시키고, p53, p16 pathway 및 P-AKT pathway 를 조절함으로써 세포노화를 억제하는 효능을 보유하며, 노화의 예방, 개선 또는 치료의 효능을 나타내며, 부작용 및 독성유발의 우려가 없는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
또한 본 발명은 노화를 예방, 개선 또는 치료의 효과를 가지면서 부작용 및 독성유발의 우려가 없는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 천연물 추출물을 이용하여 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 부작용 및 독성이 유발 되지 않으면서, 노화의 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어난 효능을 보유하고 있다.
더욱 상세하게는, SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 조성물은 SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 과산솨수소(H2O2)에 의한 Caveolin-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 의 발현을 억제하여 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성에 관한 것이다.
도 1은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)의 구조식을 나타낸 도면이다.
도 2는 과산화수소(H2O2)로 세포노화를 유도한 HDFs cell에서 HDDQ의 전처리를 통한, 세포노화 억제 효능을 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-gal 활성 염색 후 현미경을 통해 관찰한 사진이고, (B)는 SA-β-gal 활성 염색 결과.(C)는 과산화수소(H2O2)로 유도한 세포노화에서 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프 및 웨스턴 블롯이고, (D) 과산화수소(H2O2)에 의한 세포독성에서 HDDQ에 의한 세포재생율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A),(C)는 HDDQ의 농도에 따른 웨스턴 블롯 결과, (B),(D)는 HDDQ 처리 후 시간에 따른 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-galactosidase 염색 결과,(B)는 SA-β-galactosidase 염색 결과, (C)는 SIRT 1에 대한 siRNA를 처리하고 연관성, (D)는 SIRT1siRNA와 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 HDDQ의 과산화수소로 유도된 SA-β-gal의 활성 억제와 연관된 p-Akt and p-S6 의 연관성을 나타낸 그래프이다. (A)는 과산화수소로 유도된 p-Akt의 발현, (B)는 과산화수소로 유도된 p-S6의 발현, C) HDDQ 의 과산화수소로 유도된 HDFs cell의 SA-β-Gal 활성 억제, (D) 는 HDDQ 의 과산화수소로 유도되는 p-Akt, p-S6 의 발현을 억제하는 것을 나타내는 도면이다.
도 6은 HDDQ의 과산화수소로 유도되는 단백질 발현을 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 2는 과산화수소(H2O2)로 세포노화를 유도한 HDFs cell에서 HDDQ의 전처리를 통한, 세포노화 억제 효능을 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-gal 활성 염색 후 현미경을 통해 관찰한 사진이고, (B)는 SA-β-gal 활성 염색 결과.(C)는 과산화수소(H2O2)로 유도한 세포노화에서 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프 및 웨스턴 블롯이고, (D) 과산화수소(H2O2)에 의한 세포독성에서 HDDQ에 의한 세포재생율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A),(C)는 HDDQ의 농도에 따른 웨스턴 블롯 결과, (B),(D)는 HDDQ 처리 후 시간에 따른 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-galactosidase 염색 결과,(B)는 SA-β-galactosidase 염색 결과, (C)는 SIRT 1에 대한 siRNA를 처리하고 연관성, (D)는 SIRT1siRNA와 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 HDDQ의 과산화수소로 유도된 SA-β-gal의 활성 억제와 연관된 p-Akt and p-S6 의 연관성을 나타낸 그래프이다. (A)는 과산화수소로 유도된 p-Akt의 발현, (B)는 과산화수소로 유도된 p-S6의 발현, C) HDDQ 의 과산화수소로 유도된 HDFs cell의 SA-β-Gal 활성 억제, (D) 는 HDDQ 의 과산화수소로 유도되는 p-Akt, p-S6 의 발현을 억제하는 것을 나타내는 도면이다.
도 6은 HDDQ의 과산화수소로 유도되는 단백질 발현을 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 명세서에서 사용된 축약어는 다음과 같이 정의된다.
4E-BP1: 4E-binding protein 1, Ac-p53: Acetylated p53, BSA : Bovine serum albumin, EMEM: Eagle's Minimum Essential Medium, FBS : Fetal bovine serum, H2O2: Hydrogen peroxide, HDFs: Human dermal fibroblasts, mTOR: Mammalian target of rapamycin, O2- : Superoxide anion, OH: Hydroxyl radical, PBS: Phosphate buffered saline, PI3K: Phosphatidylinositol-3 kinase, P-Rb: Phosphorylated-retinoblastoma protein, P-S6: Phosphorylated-S6, ROS: Reactive oxygen species, SA-β-gal: Senescence-associated β-galactosidase, SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, siRNA: Small interfering RNA, SIRT1: Sirtuin 1, Tris: Hydroxymethyl aminomethane
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. 추출물의 제조
본 발명에 따른 세포노화를 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 추출물을 유효성분으로 함유하는바, 본 실시예를 통해 추출물의 제조에 대해 서술하고자 한다.
어떠한 가공도 하지 않은 것을 사용할 수 있으며, 건조, 냉동, 세절 또는 분쇄 등 가공된 것을 사용할 수도 있다. 또한 줄기, 열매, 꽃 등 다양한 부위를 조건에 따라 선택적으로 사용할 수 있다.
추출 방법에는 열수 추출법, 용매 추출법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 진공추출법, 감압추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법 및 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 조건에 따라 적절한 추출방법을 사용할 수 있다. 또한 2가지 이상의 추출방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.
추출한 추출물은 여과, 농축 및 건조 등의 과정이 더 수행될 수 있다. 각 공정의 순서는 유동적이며, 반복되어 수행될 수 있다.
실시예 2. HDDQ의 세포노화 예방, 개선 또는 치료 효능
1. 시약(Reagent)
FISETIN, H2O2, and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside(X-Gal)은 Sigma-aldrich (St. louis, MO, USA)에서 구입하였다. Caveolin-1, Cyclin D1, p21 and β-actin antibodies는 Santa Cruz Biotechonology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Anti-SIRT1 antibodies는 Merck Millipore(Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. Anti-acetylated-p53 (Ac-p53), p16, phosphorylated-Rb (P-Rb), phosphorylated-S6 (P-S6), phosphorylated-Akt (P-Akt) antibodies는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 그외 다른 물질들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
2. 세포배양 (Cell Culture)
HDFs 세포들(Human diploid fibroblasts (HDFs))은 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum(ATTC), and 100 μg/ml streptomycin in a humidified incubator at 37˚C and 5% CO2 조건에서 배양되었다.
노화를 유도하기 위하여,HDFs cells(at about 50% confluence)는 짧게 200μM 과산화수소 (diluted in DMEM supplemented with 10% FBS) for 2 h 조건에서 노출되었다. 세포들은 두 번 PBS로 세척하여 H2O2를 제거하였고, fresh complete medium for 72 h조건에서 재배양되었으며, 그 후에 다양한 기간동안 계대배양되어 이용되었다.
3. HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol) 분리방법
HDDQ (9-Hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)는 D. odorifera에서 분류된 Standardized Material Bank for New Botanical Drugs, Wonkwang University (Republic of Korea) (No. NNMBP028). HDDQ (N98.78%)으로 연구하였다.
도 1은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)의 구조식을 나타낸 도면이다.
HDDQ를 분해하기 위해 medium 용매로 제조한 dimethyl sulfoxide 0.05% 로 용해하여 연구에 사용하였다.
4. SA-β-gal 염색(staining)
SA-β-gal 염색이 pH 6.0에서 수행되었다. 세포들은 PBS로 세척하고 3% formaldehyde for 5 min에서 고정된 후, 37 °C 조건의 용액(1 mg/ml X-gal, 40 mM citric acid/sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM sodium chloride and 2 mM magnesium chloride)에서 염색되었다. 24 h후에 염색된 세포들을 사진찍었고 카운트했다.
5. Western Blot Analysis
세포들을 ice-cold PBS로 두 번 세척하고, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)(a protease inhibitor mixture comprised of 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin A, and 1 μg/mL chymostatin)에서 리서스펜션하였다. 단백질 농도는 Lowry protein assay kit를 이용하여 결정되었다. Lysates는 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis로 분리되었고, 분리된 단백질은 전기영동으로 nitrocellulose membrane로 이동시켰다. 각 멤브레인은 2 h in primary antibody, followed by 1 h in secondary antibody 조건에서 인큐베이션되었다. 단백질 밴드는 chemiluminescent reagents(Supersignal Substrate; Pierce, USA)를 이용하여 가시화했다. 밀도(는 imagej program(the U.S. National Institutes of Health and available on the Internet at http://rsb.info.nih.gov/nih-image)을 이용하여 측정하였다.
6. SIRT1 activity assay
SIRT1 activity assay는 a SIRT1 fluorometric Drug Discovery kit (Enzo Life Sciences International, Inc. Plymouth Meeting, USA)를 이용하였다. 제조사 지침에 따라, 5 μL of 10× Sir2 assay buffer, 1 μL of Fluoro-substrate peptide (1 mmol/L), 5 μL of NAD+, 5 μL of dH2O, and 5 μL of diluted recombinant SIR2 or 5 μL of unknown sample이 각 웰에 추가되었다. 그 후에, 2.5 μL of lysyl endpeptidase (5 mAU/ml)이 추가되었고, 샘플들은 믹스되었다.
nuclei prepared from control or test sample were incubated in 40 mM Tris-Cl (pH 7.4) containing human recombinant SIRT1 (0.2 U / uL) and 100 uM Flour de Lys-SIRT1 substrate for 30 min at 37℃. 인큐베이션(10 min at room temperature) 후에, 50 μL of Stop solution 이 각 웰에 추가되었다. 형광 인텐시티가 Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo, Rockford, USA)(excitation at 360 nm and emission at 460 nm)를 이용하여 측정되었다.
7. 형질주입(Transfection with siRNAs)
SIRT1 siRNA를 이용하는 지침은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz)에 의해 제시된 것을 따랐다. 세포들은 siRNAs로 트랜스펙트되었는데 다음의 조건을 이용하였다: for 18 h in Opti-MEM®Reduced Serum Medium (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) using Lipofectamine reagent according to the manufacturer’s protocol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 18 h 트랜스펙션 후에, 세포들은 fresh DMEM에서 리커버되었고, 그 후에 H2O2 를 처치하였다.
8. 통계 분석(Statistical Analysis)
결과는 mean ± SD로 표현되었다. One-way analysis of variance (ANOVA) 가 이용되었다. 두 개 샘플 이상의 비교에 있어서는, Student’s t-test 가 이용되었다.(P < 0.05.)
9. 결과
(1) HDDQ의 과산화수소 유도 노화세포의 노화 억제
HDDQ의 human diploid fibroblasts (HDFs) 내 MTS assay에 의한 독성평가 결과, HDFs 세포에서 HDDQ (10-80 ㎛)의 농도에서 독성을 나타내지 않았으며, 본 발명에서는 10-40 ㎛ HDDQ를 바탕으로 실시예를 진행하였다.
도 2는 과산화수소(H2O2)로 세포노화를 유도한 HDFs cell에서 HDDQ의 전처리를 통한, 세포노화 억제 효능을 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-gal 활성 염색 후 현미경을 통해 관찰한 사진이고, (B)는 SA-β-gal 활성 염색 결과를 나타낸 그래프이다.(C)는 과산화수소(H2O2)로 유도된 세포노화에서 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프 및 웨스턴 블롯이고, (D) 과산화수소(H2O2)에 의한 세포독성에서 HDDQ에 의한 세포재생율을 나타낸 그래프이다.
그결과, HDFs cell에서 HDDQ를 전처리한 경우, SA-β-Gal 염색, 평평한 세포 형태 및 노화 세포 크기를 포함한 노화 표현형을 억제한다. SA-β-gal 활성은 과산화수소 처리 된 세포와 비교하여 HDDQ 처리 된 세포에서 현저하게 감소한다.
따라서 HDDQ로 전처리 한 결과 SA-β-Gal 염색 및 활성이 용량 의존적으로 감소한다는 것을 확인하였다.
과산화수소(H2O2)로 유도된 세포노화에서 HDFs cell는 p53 활성화 및 p21Waf1 발현의 증가를 나타내었고, Caveolin-1은 조기 노화에서 p53 활성화를 매개한다.
따라서 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a를 포함하는 과산화수소(H2O2)로 유도 된 초기 신호 전달 경로와 관련된 신호 분자가 HDFs cell에서 HDDQ에 의한 노화 억제에 관여 하는지 확인하기 위해 실시예 2를 진행하였다.
도 2 (C)에 도시 된 바와 같이, 과산화수소(H2O2)로 유도된 세포 노화에 대한 HDDQ의 보호 효과는 농도 의존적으로 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 발현을 억제 하였다. 또한, HDDQ는 Cyclin D1과 phosphorylated-Rb (p-Rb) 단백질 발현을 용량 의존적으로 증가시킵니다.
이러한 결과는 HDDQ가 HDF에서 p16Ink4a 경로 및 p53 / p21Waf1 의존 경로를 통해 과산화수소에 의해 유도되는 세포 노화를 방지한다는 것을 나타냅니다. 도 2(D)에 도시 된 바와 같이, 세포 증식을 40 μM HDDQ 및 200 μM 과산화수소(H2O2)에서 72 시간 동안 배양 하였다. H2O2 처리 된 세포의 성장 속도는 대조군 및 HDDQ 처리 된 세포보다 느리게 진행되었다. HDDQ와 대조군 세포의 세포 성장률은 비슷했다.
(2) HDDQ는 HDFs 세포에서 SIRT1의 발현을 증가
SIRT1이 세포 노화의 주요 인자이기 때문에 SIRT1의 과발현이 p53 매개 조기 노화를 차단한다.
세포를 0, 10, 20 및 40 μM HDDQ와 함께 12 시간 배양 하였다. 그리고 세포를 0, 3, 6, 12 및 24 시간 동안 40 μM HDDQ로 배양 하였다.
도 3은 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A),(C)는 HDDQ의 농도에 따른 웨스턴 블롯 결과, (B),(D)는 HDDQ 처리 후 시간에 따른 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 그래프이다.
SIRT1과 β-actin의 분자 발현은 Western blotting으로 확인 하였다. 도 3 (A) 및 3(B)에 나타낸 바와 같이, HDDQ는 용량 및 시간 의존 방식으로 SIRT1의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
그리고 용량 및 시간 의존적 방식으로 SIRT1 활성을 증가시켰다 (도 3C 및 3D). 도 3에 나타낸 바와 같이, SIRT1 발현 및 SIRT 활성의 최대 유도는 40 μM, 12 시간에서 달성되었다.
따라서, 이러한 발견에 근거하여 HDFs 세포에서 12 시간 동안 40 μM HDDQ의 용량을 사용하기로 결정했다. 이러한 결과에서 HDDQ의 항 노화 방지 효과가 HDFs에서의 SIRT1 발현의 상향 조절과 연관되어 있음을 확인합니다.
(3) siRNA에 의한 SIRT1의 조절은 과산화수소에 의해 유도 된 조기 노화를 증가 시켰으나, 전처리 된 HDDQ는 과산화수소에 의한 노화 억제
세포 노화에서 내인성 SIRT1의 역할을 결정하기 위해, 세포를 40 nM SIRT1 siRNA 또는 대조군 siRNA로 처리 하였다. 12 시간 동안 40 μM HDDQ로 전처리되었다. 배지를 제거하고 37 ℃에서 72 시간 동안 200 μM 과산화수소를 함유 한 10 % FBS가 함유 된 신선한 배지에서 세포를 처리하였다.
SA-β-Gal 활성은 상기 기재된 바와 같이 측정 하였다. 과산화수소 처리는 HDFs의 조기 노화 상태를 유도하였고, 노화 특징과 같은 형태학적 변화에 의한 노화 특성 및 복제 노화 세포와 유사한 노화 관련 표식자 SA-β-gel 활성의 현저한 증가를 유도 하였다.
도 4는 HDDQ의 세포노화 억제 효과에 있어서 SIRT 1에 미치는 영향에 대해 나타낸 것으로, (A)는 SA-β-galactosidase 염색 결과,(B)는 SA-β-galactosidase 염색 결과, (C)는 SIRT 1에 대한 siRNA를 처리하고 연관성, (D)는 SIRT1siRNA와 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, Cyclin D1, P-Rb 및 β-actin의 연관성을 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 처리 된 과산화수소는 SA-β-Gal 염색, 평평한 세포 형태 및 노화 세포 크기를 포함하는 노화 표현형이 증가되었다.
SA-β-gal 양성 세포의 비율은 대조군에 비해 과산화수소 처리된 세포에서 현저하게 증가 하였다. 그러나 전처리 된 HDDQ는 SA-β-Gal 염색, 평평한 세포 형태 및 노화 세포 크기를 포함한 노화 표현형을 억제한다.
SA-β-gal 양성 세포의 비율은 과산화수소 처리된 세포에 비해 HDDQ 처리 된 세포에서 현저히 감소되었다. 또한, 세포를 SIRT1siRNA로 트랜스펙 션하고, HDDQ를 전처리 한 다음 과산화수소로 처리 하였다.
그 결과 SA-β-gal 염색이 증가하고 SA-β-gal 양성 세포의 비율이 증가하였으나 전처리 된 HDDQ는 노화 관련 마커 SA-β-galactosidase 활성을 억제 하였다.
도 4C에서, SIRT1 활성은 대조군과 비교하여 과산화수소 처리 된 세포에서 현저하게 감소되었다. 그러나 전처리 된 HDDQ는 SIRT1 활성을 증가시켜 노화를 억제 하였다.
또한, 세포를 SIRT1siRNA로 트랜 스펙 션하고, HDDQ를 전처리 한 다음 과산화수소로 처리 하였다. 그 결과 SA-β-Gal 염색이 증가하고 SA-β-gal 양성 세포의 비율이 증가 되었으나 전처리 된 HDDQ에 의한 노화 관련 마커 SA-β-galactosidase 염색 및 활성은 억제되었다.
도 4D에서 세포를 SIRT1siRNA로 형질 감염 시켰고, Cav-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a를 포함하는 과산화수소 유도 된 초기 신호 전달 경로와 관련된 신호 분자를 조사하여 이들이 HDDQ에 의한 노화 억제에 관여하는지 여부를 결정 하였다.
siRNA에 의한 SIRT1의 조절은 과산화수소에 의해 유도 된 조기 노화를 HDFs 세포에서 증가 시켰으나 노화 관련 단백질 수준의 감소는 과산화수소에 의해 유도 된 세포 노화에 의한 노화 관련 단백질 억제에 대한 HDDQ의 보호 효과였다.
이러한 결과는 HDDQ에 의한 SIRT1 발현이 HDF에서 과산화수소에 의해 유도되는 세포 노화를 억제하는데 중요한 역할을한다는 것을 입증했다.
(4) siRNA에 의한 SIRT1의 조절은 과산화수소에 의해 유도된 노화를 증가하였으며, 전처리 된 HDDQ는 과산화수소에 의한 노화를 억제
본 연구에서는 과산화수소에 의해 유도 된 p-Akt 및 p-S6의 발현 시간을 조사 하였다. 과산화수소에 의해 유도 된 p-Akt의 발현에서 시간을 조사하기 위해, 세포를 0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240 분 동안 200μM 과산화수소로 배양 하였다.
과산화수소에 의해 유도 된 p-S6의 발현 (mTOR 활성)에서 시간을 조사하기 위해 Cell은 0, 3, 6, 12, 24, 48 및 72 시간 동안 200 μM 과산화수소를 배양했다. Western blotting으로 p-Akt, p-S6 및 β-actin의 발현을 확인 하였다. 웨스턴 블랏 분석은 상기 실시예에 따라 수행하였다.
도 5는 HDDQ의 과산화수소로 유도된 SA-β-gal의 활성 억제와 연관된 p-Akt and p-S6 의 연관성을 나타낸 그래프이다. (A)는 과산화수소로 유도된 p-Akt의 발현, (B)는 과산화수소로 유도된 p-S6의 발현, C) HDDQ 의 과산화수소로 유도된 HDFs cell의 SA-β-Gal 활성 억제, (D) 는 HDDQ 의 과산화수소로 유도되는 p-Akt, p-S6 의 발현을 억제하는 것을 나타내는 도면이다.
도 5a에서, p-Akt의 발현은 과산화수소에 의한 노화 유도가 5분 ~ 60 분에서 최대에 도달했다. 따라서, HDFs 세포에서 60 분 동안 과산화수소를 배양하기로 결정했다.
도 5b에서, p-S6의 발현은 과산화수소에 의한 유도가 6 시간 ~ 48 시간에서 최대에 도달했다. 따라서, HDFs 세포에서 48 시간 동안 과산화수소를 배양하기로 결정했다.
과산화수소 유발 성 노화 세포에서 Akt / mTOR 경로에 대한 HDDQ의 효과를 연구했다. 세포를 0, 2.5, 5 및 10 μM LY294002 (PI3Ks 억제제)로 18 시간 동안 또는 40 μM HDDQ로 12 시간 동안 전처리 하였다. 배지를 제거하고 37 ℃에서 200 μM 과산화수소를 함유 한 10 % FBS가 함유 된 신선한 배지에서 72 시간 동안 처리 하였다. SA-β-Gal 활성은 상기 실시예에 따라 수행하였다. Western blotting으로 p-Akt, p-S6 및 β-actin의 발현을 확인 하였다.
도 5C에서, 처리 된 과산화수소는 HDF의 조기 노화 상태를 유도하였고, SA-β-gal 양성 세포의 비율은 대조군과 비교하여 과산화수소 처리 된 세포에서 현저하게 증가 하였다. 그러나, LY294002 (PI3Ks 억제제)에 의한 전처리는 용량 의존적으로 SA-β-gal 양성 세포를 감소시켰다.
또한, SA-β-gal 양성 세포는 과산화수소 처리 된 세포와 비교하여 HDDQ 처리 된 세포에서 현저히 감소되었다. 이러한 결과에서, 전처리 된 HDDQ는 노화 관련 마커 SA-β- 갈 락토시다 아제 활성을 억제 하였다.
도 5d에서, 처리 된 과산화수소는 p-Akt 및 p-S6의 발현이 증가되었다. 그러나 전처리 된 HDDQ는 과산화수소에 의해 유발 된 세포 노화에 의한 p-Akt 및 p-S6 단백질 수준의 억제를 나타냈다. HDDQ는 siRNA에 의해 SIRT1의 발현을 증가시키고 SIRT1의 하향 조절은 과산화수소에 의해 유도 된 HDFs 세포의 노화를 증가시켰다. 이 결과는 HDDQ가 SIRT1을 통해 mTOR 신호를 억제한다는 것을 보여줍니다. 따라서, 우리는 HDDQ가 HDF에서 Akt / mTOR 경로의 억제임을 입증했다.
이를 통해 HDDQ의 노화 방지 효과를 매개하는데 SIRT1 발현의 중요한 역할에 대한 증거를 제시했다.
(10) 고찰
도 6은 HDDQ의 과산화수소로 유도되는 단백질 발현을 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
본 발명은 HDDQ에 의해 노화 과정의 생화학적 메커니즘에 초점을두고있다. 과산화수소에 의해 유도 된 HDFs 세포는 과산화수소에 의해 유도 된 산화 적 DNA 손상으로 인한 p53 활성화의 상승을 나타난다. 그리고 p53과 p21Waf1은 과산화수소에 의해 유도되는 세포의 노화를 조절하는 주된 조절 인자이다.
본 발명에서 실시예를 통해 HDDQ가 HDF에서 과산화수소에 의해 유발된 노화를 강하게 예방한다는 것을 확인하였다. 과산화수소에 의한 형태학적 변화, SA-β-gal 활성, SIRT1 활성, 노화 관련 단백질 (Cav-1, Ac-p53, p21Waf1, p16Ink4a, P-Rb, Cyclin D1, p-Akt 및 p-S6) 발현 관련하여, HDDQ로 전처리 한 결과 SA-β-Gal 염색 및 활성이 감소함을 확인하였다. 그리고 과산화수소에 의해 유발된 세포 노화에 대한 HDDQ의 보호 효과는 용량 의존적으로 Cav-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 발현을 억제 하였다. SIRT1은 노화로 인한 산화 스트레스의 조절에 중요한 역할을 한다.
HDDQ는 용량 및 시간 의존적 방식으로 SIRT1의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그리고 SIRT1 발현과 SIRT 활성의 최대 유도는 40 μM, 12 시간에 달성되었다. siRNA에 의한 SIRT1의 조절은 과산화수소에 의해 유도된 노화를 HDFs 세포에서 증가 시켰으나 노화 관련 단백질 수준의 감소는 과산화수소에 의해 유발 된 세포 노화에 의한 노화 관련 단백질을 억제하는 HDDQ의 보호 효과였다.
이러한 결과는 HDDQ가 HDF에서 p53 / p21Waf1 경로 및 p16Ink4a 의존 경로의 저해를 통해 과산화수소에 의해 유도되는 세포 노화를 방지한다는 것을 나타낸다. HDDQ의 전처리가 과산화수소에 의해 유도 된 조기 노화 동안 p-Akt 및 p-S6 단백질 수준의 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, HDDQ는 HDF에서 Akt / mTOR 경로의 저해를 통해 과산화수소에 의해 유발 된 세포 노화를 예방한다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 HDDQ가 HDFs 세포에서 p53 / p21Waf1, p16Ink4a 및 mTOR 경로를 조절하는 SIRT1의 상향 조절을 통해 항 노화 효과를 나타냄을 보여 주었다. HDDQ에 의한 SIRT1 활성 조절함으로서, 산화적 스트레스에 의한 세포 노화에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 활용할 수 있다.
실시예 3. 제제 제조
본 발명은 노화를 예방, 개선 또는 치료의 효과를 가지면서 부작용 및 독성유발의 우려가 없는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
또한 본 발명은 SIRT1의 발현을 증가시키고 그것을 통해 p53/p21, p16/Rb, m-TOR 기전을 조절하여 노화를 억제하는 효능을 갖는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 유효성분을 포함하는 조성물을 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화 된 비만의 예방 및 치료제를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
또한 상기 유효성분을 포함하는 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.
상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.001~100 mg/kg(체중)으로 투여하는 것이 좋고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 상기 유효성분을 함유하는 조성물에 식품 보조 첨가제를 추가하여 비만의 예방 및 치료제의 건강기능식품 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 상기 추출물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외에 향미제로써 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
Claims (6)
- HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 베타-갈락토시다아제(SA-β-galactosidase; SA-β-gal)의 활성을 감소시키고, HDFs(Human diploid fibroblasts) 세포에서 p53, p21Waf1, p16Ink4a 및 mTOR pathway를 조절함으로써 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 SIRT1을 발현시키고 발현된 SIRT1은 과산솨수소(H2O2)에 의한 Caveolin-1, Ac-p53, p21Waf1 및 p16Ink4a 의 발현을 억제하여 세포노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)이 HDFs(Human diploid fibroblasts)세포 기준으로 10 ~ 40 μM 포함되는 것을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 세포노화는 과산화수소(H2O2)에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는, HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
- HDDQ(9-hydroxy-6,7-dimethoxydalbergiquinol)을 유효성분으로 함유하는 세포노화의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물.
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