JP6956957B2 - 脱毛防止剤 - Google Patents
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Description
(I-1) 下記式(1)〜(5)で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする脱毛防止剤。
式(1)で表されるヒドロキシイソフラボンは、ダイゼインの誘導体であって、8位(A環の8位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物であり、以下では8-OHダイゼインと称することもある。
本発明の脱毛防止剤は、本発明のヒドロキシイソフラボンにより脱毛防止作用を発揮するため、脱毛防止用外用剤、脱毛防止用経口剤、頭髪用化粧料、飲食品、脱毛防止作用を付与する添加剤等として、好適に使用することができる。
・発酵イソフラボン(イソフラボン含有組成物の発酵物)の調製
(1)前培養
グルコース1質量%、イーストエキス0.5質量%、及び水98.5質量%を混合し、更にpHを5.4に調整し、前培養に用いる培地(前培養培地)を得た。この前培養培地50 mlを三角フラスコ(300 mL)に入れ、オートクレーブ内121℃の環境下で20分間滅菌を行った。その後、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi IAM2210)の胞子を保存用のPDA斜面培地から1白金耳取り出し、上記滅菌を行った前培養培地に植菌した。次いで、振とう培養装置を用いて、回転速度180rpm、温度30℃の環境下で24時間培養を行った。
スクロース1質量%、イーストエキス0.5質量%、イソフラボン素材(すなわち、イソフラボン含有組成物) 1.6質量%、消泡剤(信越化学工業株式会社製、KM72F) 0.04質量%、及び水96.86質量%を混合し、更にpHを5.1に調整し、本培養に用いる培地(本培養培地)を得た。この本培養培地2.5Lを5Lのジャーファメンターに入れ、オートクレーブ内121℃の環境下で20分間滅菌を行った。その後、上記(1)で培養した培養液50 mlを上記滅菌した本培養培地に植菌した。次いで、通気量0.5L/分、撹拌速度300rpm、温度30℃の環境下で72時間培養を行った。
上記(2)の培養を終えた後、ジャーファメンターから培養液約2.4Lを回収し、撹拌羽付きタンクへ投入した。その後、7.5Lのエタノールをこの撹拌羽付きタンクへ更に投入し、25℃の環境下で3時間撹拌し、抽出を行った。その後、得られた抽出液を、ブフナーロートを設置した吸引瓶を用い、5A濾紙を介して固液分離した。次いで、固液分離により得られた抽出液約10Lをエバポレーターで減圧濃縮し、約2Lにまで濃縮した。その後、凍結乾燥法により粉末化し、発酵イソフラボン24.5 gを得た。
市販試薬(和光純薬工業株式会社製)を使用した。
DPCsは8週齢、メスのC57BL/6マウスの髭から実体顕微鏡下で単離し、培養は抗生物質溶液(64μg/ml penicillin G (NACALAI TESQUE INC., Kyoto, Japan)、100μg/ml streptomycin (NACALAI TESQUE INC.))を含むPapilla Cell Growth Medium (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan)を用いて行った。
0.4 mmolグリオキシル酸、1.2 mmolシアノ水素化ホウ素ナトリウム、及び400 mgウシ血清アルブミン(bovine serum albumin; BSA)をそれぞれ8 mlのpH7.4のリン酸緩衝液に溶かし、37℃で24時間インキュベートした。PD-10カラム(GE Healthcare Ltd., Osaka, Japan)をスタンドに固定し、pH7.4リン酸緩衝液を2 ml流してカラムを共洗いした後、2.5 mlのCMLをカラムに通した。カラム精製した試料を、ナノドロップ2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Ltd. Tokyo, Japan)にてOD280の吸光度測定により、フラクションを精製した。さらに、Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Thermo Fisher Scientific Inc., Ltd)を使用して透析によりCMLを精製した。
精製したCML及びBSAを、SDS-10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって展開した。1次抗体としてAnti-Carboxymethyl Lysine antibody (Abcam CO., Ltd., Tokyo, Japan)、2次抗体としてgoat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)を用いた。ChemiLumi One Plus Reagent (NACALAI TESQUE INC.)で反応させ、LAS4000 system (FUJI film, Tokyo, Japan)で化学発光シグナルを捉え検出した。また、SDS-10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって展開したCML及びBSAをクマシーブリリアントブルー(CBB)染色により検出した。
レポーターアッセイは、ONE-Glo luciferase system (Promega Corporation, Tokyo, Japan)を用いて行った。NF-κB-luc (Agilent tech., Santa Clara, CA)を安定強発現するATDC5を樹立し、これを48ウェルマイクロプレートに1×104 cells/wellで播種し、24時間培養後BSA又はCMLを濃度が1μg/mlになるように培地に加えた。DMSO、20μg/mlの濃度の発酵又は未発酵イソフラボンも、対照群BSA又はCMLと同時に添加した。更に24時間培養後、Passive lysis bufferを各ウェルに20μlずつ滴下し、イエロ−チップで細胞を剥し取ってから細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液5μlを、ONE-Gloを20μl分注したエッペンチューブに加えてピペッティングし、TD20/20n Luninometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)を用いて発光強度を検出した。
10週齢、オスのddYマウスを使用し、腹腔内投与法により、発酵イソフラボン又は未発酵イソフラボンの急性毒性作用を評価した。それぞれの素材は、エタノールを溶媒として用いて調製し、1 mg/100μl (10 mg/ml)を腹腔内に投与し、24時間後に開腹、剖検した(対照としてエタノールを使用した)。
8週齢、メスのC57BL/6マウスの背中の毛をセメダインバスコークN (セメダイン株式会社, Tokyo, Japan)を適量塗布し、24時間経過させ乾燥後に強制抜毛を行った。抜毛部位に27G×1/2注射針(NIPRO, Osaka, Japan)を用いて、コントロールとして1 mg/ml BSA 200μl、対照試験として1 mg/ml CML 200μlを皮内に10か所程度注射し、注射箇所のマーキングのために墨汁を同時に注射した。2日後にマウスを安楽死させ、背部皮膚を摘出し試料とした。試料を4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan)で組織固定を行い、パラフィン包埋を行い、5μmの薄切によりパラフィン切片を得た。パラフィンは組織観察のためにヘマトキシリン-エオジン(HE)染色を行い、封入剤としてSoftmount (Wako Pure Chemical Industries Ltd.)を用いた。
上記と同様に、抜毛処理、BSA、CML又はCELの皮内注射、及びエタノール、発酵又は未発酵イソフラボンの外用塗布を行った。2日後にEvans blue (NACALAI TESQUE INC.)を生理食塩水に溶かし、1% Evans blue溶液を調製した。マウスの尻尾を40℃のウォーターバスで温めて血管を拡張させた上で27G×1/2注射針を用いて1% Evans blue溶液を100μl尾静注した。血管透過性は10分後に背中の皮膚がEvans blueによって青く染まることにより確認した。
上記と同様に、抜毛処理、BSA又はCMLの皮内注射、及びエタノール、発酵又は未発酵イソフラボンの外用塗布を行った。脱毛活性は脱毛テープEpilat (Kracie, Tokyo, Japan)を使用し、Leica実体顕微鏡システム(Leica microsystems, Tokyo, Japan)により可視化した。また、試料は、Keyence VE-8800走査型電子顕微鏡(Keyence Co., Osaka, Japan)を使用して観察した。
HeLa細胞(Riken Cell Bank, Ibaraki, Japan)には、エストロゲンレセプター(ER)が発現しており、この細胞に3X ERE TATA luc (Addgene)とEGFP-1 (Takara clonetch, Shiga, Japan)をエレクトロポレーション法を用いて、遺伝子を導入した。Neomycinによる薬剤選別を行った後、60クローンを独立して培養し、5つの3X ERE TATA luc安定強発現細胞を得た。得られた細胞を用いて、各イソフラボン素材のレポーター活性をEstradiol: E2 (NACALAI TESQUE INC.)と比較し、測定した。各イソフラボン素材は20μg/mlで、E2は1 nMにて処置した。なお、E2 1μMでは約100万倍以上の活性を認めたが、グラフでは比較し難いため、1 nM E2のデータとの対比を示した
有意差の検定はstudent's unpaird t-testを用いて行い、多検体比較はDunnett-testを行った。p<0.05の場合は有意に異なるものと判定した。
・CMLの精製
グリオキサールとBSAとを反応させると、糖化タンパクであるCMLが作製できる。まず、作製したCML及びネガティブコントロールとしてグリオキサールを含まない条件で作製したBSAをSDS-PAGEを行って展開し、CBB染色を行った。結果を図1に示す。
Wound assayにより発酵イソフラボンの毛乳頭細胞のwound healingに対する影響を調べた。12ウェルマイクロプレートに髭由来毛乳頭細胞を播種し、ウェルに縦に傷を付けた上で1μg/mlのCML、又は1μg/mlのCMLと発酵イソフラボン若しくは未発酵イソフラボンとを含む培地に交換し、Wound assayを行った(対照としてDMSOを使用した)。結果を図2に示す。
レポーターアッセイにより発酵イソフラボンのNF-κBの活性に及ぼす影響を調べた。結果を図3に示す。
1 mgの素材を腹腔内投与24時間後、解剖した。結果を図4に示す。
マウス背部皮内にBSA又はCMLを注射することで、皮膚におけるCMLによる毛包形成への影響を調べた。背部の毛を強制脱毛することで毛包形成周期をリセットし、成長期に強制的に移行させることで、毛包の形成初期におけるCMLの影響を組織学的に観察した。結果を図5に示す。
上記で得られた結果をもとに、画像解析ソフトImage Jを用いて、毛球部における核の凝集を定量した。Image JによってDAPI染色画像(図6A、B)を2値化し(図6C、D)、毛包の核の凝集に対する効果を数値化した。結果を図7に示す。
エバンスブルーを用いた血管透過性評価を行った。結果を図8に示す。
抜毛後14日目に行った脱毛試験の結果を図9に示す。
上記と同様の方法で、レポーターアッセイによりダイジン、ダイゼイン、ゲニステイン、ゲニスチン、8-OHダイゼイン、8-OHゲニステイン、8-OHグリシテイン、発酵又は未発酵イソフラボンのNF-κBの活性に及ぼす影響を調べた。結果を図13に示す。
HeLa細胞を用いた性ホルモン作用の評価を行った。結果を図14に示す。
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