KR20170045053A - 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경세포 보호효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산화스트레스에 의해 유발되는 뇌신경 세포사멸을 억제하여 우수한 뇌신경세포 보호효과를 갖는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경세포 보호효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산화스트레스에 의해 유발되는 뇌신경 세포사멸을 억제하여 우수한 뇌신경세포 보호효과를 갖는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease)과 같은 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병은 산화스트레스로 인한 신경세포의 사멸과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 최근 연구들은 신경세포 내의 자유라디칼 (free radicals) 및 활성산소종 (ROS)이 급격히 생성되어 이로 인해 신경세포가 사멸되고, 궁극적으로 퇴행성 뇌신경계 질환을 발병한다고 보고되고 있다 (Jensen K. Oxidative stress and free radicals. J Mol Struct 2003;666:387-92. ; Benz CC, Yau C. Ageing, oxidative stress and cancer: paradigms in parallax. Nat Rev Cancer 2008;8(11):875-9).
따라서 신경세포 내의 산화스트레스를 유발하는 자유라디칼 및 활성산소종의 급격한 생성을 억제 또는 감소시킴으로써 산화스트레스에 의한 신경세포의 손상을 억제하고 이러한 퇴행성 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것이라 보고되고 있으며 (Uttara B, Singh AV, Zamboni P, Mahajan RT. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: A Review of Upstream and Downstream Antioxidant Therapeutic Options. Current Neuropharmacology 2009;7:65-74). 산화스트레스에 의해 유발되는 신경세포 사멸을 억제할 수 있는 항산화제에 대한 연구가 대두되고 있다(Kelsey NA, Wilkins HM, Linseman DA. Nutraceutical antioxidants as novel neuroprotective agents. Molecules 2010;15:7792-814).
세포내 항산화 방어 시스템은 크게 항산화 효소들에 의한 방어 시스템과 항산화물질들에 의한 방어 시스템으로 분류된다. 효소에 의한 방어 시스템은 주로 카탈라아제 (CAT), 글루타티온 과산화효소(GPx), 과산화물제거효소(SOD), 헴 옥시게나아제 (HO) 등의 항산화 효소들이 세포내 생성된 자유라디칼 및 활성산소종을 대사를 통해 물 또는 안전한 물질로 변환함으로써 자유라디칼 및 활성산소종을 소거한다 (Miao L, Clair DKS. Regulation of superoxide dismutase genes: implications in disease. Free Radic Biol Med 2009;47:344-56). 이러한 항산화 효소들 중에서도 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)은 다양한 산화스트레스 유발원에 의해 활성화되며, 이들에 대해 항산화 작용을 나타낸다고 알려져 있다(Keyse SM, Tyrrell RM. Heme oxygenase is the major 32-kDa stress protein induced in human skin fibroblasts by UVA radiation, hydrogen peroxide, and sodium arsenite. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:99-103. / Taketani S, Kohno H, Yoshinaga T, Tokunaga R. Induction of heme oxygenase in rat hepatoma cells by exposure to heavy metals and hyperthermia. Biochem Int. 1988;17(4):665-72). 또한 HO-1이 산화스트레스로 인한 신경세포의 사멸에 대한 신경보호작용에 중요한 역할을 한다고 보고되었다 (Kaizaki A, Tanaka S, Ishige K, Numazawa S, Yoshida T. The neuroprotective effect of heme oxygenase (HO) on oxidative stress in HO-1 siRNA-transfected HT22 cells. Brain Res 2006;1108:39-44).
미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPKs)는 세포의 생존, 증식, 분화 및 사멸 등 다양한 세포 반응 및 기능을 조절하는 신호전달 기전이다. 신경세포에서 MAPK 신호전달 기전은 자유라디칼의 생성 및 활성산소종에 의한 산화스트레스에 의해 활성화된다고 보고되었다(Kyriakis JM, Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol Rev. 2001;81(2):807-69). 또한 MAPK가 활성화되면 세포사멸에 관여하는 주요 효소인 카스파아제-3를 활성화시키며, 활성화된 카스파아제-3는 하위 신호전달 기전인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제 (PARP)를 활성화시키며 궁극적으로 세포내의 단백질, 막, DNA 등을 분해시켜 세포사멸 (apoptosis)이 진행되는 것으로 알려져 있다(Lu Z, Xu S. ERK1/2 MAP kinases in cell survival and apoptosis. IUBMB life 2006;58:621-31. ; Mandal C, Dutta A, Mallick A, Chandra S, Misra L, Sangwan RS, Mandal C. Withaferin A induces apoptosis by activating p38 mitogen-activated protein kinase signaling cascade in leukemic cells of lymphoid and myeloid origin through mitochondrial death cascade. Apoptosis. 2008;13(12):1450-64).
전세계적으로 고령화 인구가 급증함에 따라 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병 추세도 매년 증가하는 추세에 있으며, 아직까지 그 예방법과 치료법이 명확하지 않아, 이러한 질환을 치료하기 위한 효능이 뛰어난 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 또한 이러한 질환에 사용되고 있는 치료제와 치료법은 장기 복용에 따른 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 많으며, 완벽한 질환 치료보다는 증상의 경과를 늦추거나 증상의 정도를 일시적으로 경감시키는 효과만 있기 때문에 부작용 및 독성을 감소시키고 결정적인 치료효과가 있는 소재의 발굴 및 개발이 시급한 실정이다.
한편, 상황버섯은 한국, 중국, 일본과 같은 동북아시아에서 전통적으로 위 관련 질환, 암, 당뇨 등 다양한 질환에 치료용으로 이용된 약용버섯 중 하나로 잘 알려져 있다. 이러한 상황버섯은 다당체, 당단백, 퓨란 유도체, 노란색소성분인 히스피딘 유도체나 다양한 폴리페놀성 화합물을 함유한다(Huang GJ, Deng JS, Chiu CS, Liao JC, Hsieh WT, Sheu MJ, Wu CH. Hispolon protects against acute liver damage in the rat by inhibiting lipid peroxidation, proinflammatory cytokine, and oxidative stress and downregulating the expressions of iNOS, COX-2, and MMP-9. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, Article ID 480714, 12. / Hsieh PW, Wu JB, Wu YC. Chemistry and biology of Phellinus linteus. BioMedicine 2013;3:106-13).
상황버섯은 오래전부터 다양한 질환에 치료용으로 섭취하여 왔기에 비교적 안정성이 높고 부작용이 없으며, 천연물 유래의 의약품 소재로서 개발 가능성이 높다는 장점이 있다. 상황버섯으로부터 다양한 방법으로 추출된 추출물들의 항산화, 항염증, 항암, 항알러지 등 다양한 활성이 보고되었지만, 아직까지 산화스트레스로 인한 신경세포 사멸에 대한 상황버섯 자실체로부터 에틸 아세테이트 추출물의 신경보호활성 및 그 기작 연구에 대해서는 연구 보고된바 없다. H2O2에 의해 유발된 산화스트레스를 감소시켜줌으로써 신경세포 사멸을 억제함에 따른 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물은 개발되어 있지 못한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상황버섯 자실체를 이용하여 열수추출한 후, 이를 에탄올 (EtOH) 침전 및 에틸 아세테이트 분획을 통해 얻어진 에틸 아세테이트 추출물 (PLEA라 명명)의 신규한 생리효능을 평가 및 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 분획물 (PLEA)이 H2O2에 의해 유발된 산화스트레스로 인한 뇌신경세포 사멸에 대하여 신경세포 사멸을 억제하여 산화스트레스로부터 뇌신경세포를 보호하는 효능이 있음을 평가하였고, 그 작용기전을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯(Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 히스폴론(hispolon)을 활성물질로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 1~50 μg/ml의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환일 수 있다.
본 발명은 또한, 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 1~50 μg/ml의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환일 수 있다.
본 발명의 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 산화스트레스에 의해 유발된 신경세포 (SK-N-MC) 사멸에 대해 항산화 효소인 헴 옥시게나아제(HO-1)의 발현을 증가시켜 항산화 효능을 가지며, 신경세포 사멸 (apoptosis)에 관여하는 MAPK (ERK, JNK, P38) 신경전달경로의 활성을 억제하고, 최종적으로 카스파아제-3와 PARP의 활성을 억제함으로써 우수한 신경세포 사멸 억제 효과를 갖는다.
따라서 본 발명의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품에 적용가능하며, 천연물 소재인 상황버섯 자실체로부터 추출한 것이므로, 기존의 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제와 비교하여 독성 및 부작용이 적어 인체에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 상황버섯 자실체(Phellinus linteus fruiting bodies)로부터 에틸 아세테이트 추출물을 얻은 모식도를 나타낸 것으로, 상황버섯 자실체를 열수추출을 한 후, 이를 70% 에탄올 침전법과 에틸 아세테이트 분획을 통해 최종적으로 에틸 아세테이트 추출물 얻은 것을 나타낸 것이다.
도 2는 상황버섯 자실체 에틸 아세테이트 추출물(PLEA)에 함유된 주요 페놀릭 화합물을 규명하기 위해 HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 히스폴론의 HPLC 결과이고, 도 2의 (B)는 PLEA의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 H2O2에 의해 유도된 SK-N-MC 세포 사멸 및 세포 독성에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 생존율 증가 및 독성 저해효과를 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 신경세포를 2시간 동안 0.1-5 μg/ml 의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물로 전처리한 후 200 μM H2O2를 24시간 동안 처리하여, H2O2에 의해 유발된 신경세포 생존율 감소에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 생존율 증가 효과를 MTT 검정을 통해 알아본 결과이고, 도 2의 (B)는 H2O2에 의한 신경세포 독성 (cytotoxicity)에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 독성 감소 효과를 LDH 검정으로 알아본 결과이다.
도 4는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 2시간 동안 전처리한 후, H2O2를 24시간 동안 처리하고, 어넥신 V/프로피디움 요오드화물(Annexin V/propidium iodide; PI)을 이용하여 형광 염색 한 후, 유세포분석 (Flow cytometry)을 통해 신경세포 사멸을 분석한 결과이다.
도 5는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 전처리하였을 때, H2O2에 의해 유발되는 신경세포 DNA 단편화(fragmentation)의 변화를 보여주는 형광현미경 사진으로, PI/FITC-dUTP를 이용하여 세포내의 핵과 DNA를 형광 염색 한 후, 형광현미경을 이용해 DNA 단편화를 분석한 결과이다.
도 6은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 2시간 전처리한 후, H2O2를 24시간 처리하였을 때 생성되는 세포내 활성산소종 (ROS)의 변화를 CM-H2DCF-DA 염색을 통해 알아본 결과이다.
도 7은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 전처리한 후, H2O2를 처리하고 항산화 효소인 헴 옥시게나아제-1(HO-1)의 mRNA 수준과 단백질 수준l의 변화를 각각 RT PCR과 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과로, 도 6의 (A)는 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA 수준, 도 6의 (B)는 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 단백질 수준에 대해 알아본 결과이다.
도 8은 H2O2에 의해 유발된 산화스트레스에 의한 MAPK (ERK, JNK, P38)의 활성화에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 MAPK 활성화 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 7의 (A)는 ERK, JNK, P38의 인산화 (phosphorylation) 정도를 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과이고, 도 7의 (B)는 ERK, JNK, P38의 인산화 정도를 각각 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 9는 H2O2에 의해 유발된 신경세포 사멸에 관여하는 효소인 카스파아제-3와 PARP의 활성화에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 카스파아제-3와 PARP의 활성화 저해 효과를 나타낸 것으로, 도 8의 (A)는 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도를 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과이고, 도 8의 (B)는 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도를 각각 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 2는 상황버섯 자실체 에틸 아세테이트 추출물(PLEA)에 함유된 주요 페놀릭 화합물을 규명하기 위해 HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 히스폴론의 HPLC 결과이고, 도 2의 (B)는 PLEA의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 H2O2에 의해 유도된 SK-N-MC 세포 사멸 및 세포 독성에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 생존율 증가 및 독성 저해효과를 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 신경세포를 2시간 동안 0.1-5 μg/ml 의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물로 전처리한 후 200 μM H2O2를 24시간 동안 처리하여, H2O2에 의해 유발된 신경세포 생존율 감소에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 생존율 증가 효과를 MTT 검정을 통해 알아본 결과이고, 도 2의 (B)는 H2O2에 의한 신경세포 독성 (cytotoxicity)에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신경세포 독성 감소 효과를 LDH 검정으로 알아본 결과이다.
도 4는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 2시간 동안 전처리한 후, H2O2를 24시간 동안 처리하고, 어넥신 V/프로피디움 요오드화물(Annexin V/propidium iodide; PI)을 이용하여 형광 염색 한 후, 유세포분석 (Flow cytometry)을 통해 신경세포 사멸을 분석한 결과이다.
도 5는 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 전처리하였을 때, H2O2에 의해 유발되는 신경세포 DNA 단편화(fragmentation)의 변화를 보여주는 형광현미경 사진으로, PI/FITC-dUTP를 이용하여 세포내의 핵과 DNA를 형광 염색 한 후, 형광현미경을 이용해 DNA 단편화를 분석한 결과이다.
도 6은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 2시간 전처리한 후, H2O2를 24시간 처리하였을 때 생성되는 세포내 활성산소종 (ROS)의 변화를 CM-H2DCF-DA 염색을 통해 알아본 결과이다.
도 7은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 신경세포에 전처리한 후, H2O2를 처리하고 항산화 효소인 헴 옥시게나아제-1(HO-1)의 mRNA 수준과 단백질 수준l의 변화를 각각 RT PCR과 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과로, 도 6의 (A)는 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA 수준, 도 6의 (B)는 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 단백질 수준에 대해 알아본 결과이다.
도 8은 H2O2에 의해 유발된 산화스트레스에 의한 MAPK (ERK, JNK, P38)의 활성화에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 MAPK 활성화 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 7의 (A)는 ERK, JNK, P38의 인산화 (phosphorylation) 정도를 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과이고, 도 7의 (B)는 ERK, JNK, P38의 인산화 정도를 각각 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 9는 H2O2에 의해 유발된 신경세포 사멸에 관여하는 효소인 카스파아제-3와 PARP의 활성화에 대해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 카스파아제-3와 PARP의 활성화 저해 효과를 나타낸 것으로, 도 8의 (A)는 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도를 웨스턴 블랏을 통해 알아본 결과이고, 도 8의 (B)는 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도를 각각 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
상술한 바와 같이, 종래의 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제 및 치료법은 장기 복용에 따른 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 많으며, 완벽한 질환 치료보다는 증상의 경과를 늦추거나 증상의 정도를 일시적으로 경감시키는 효과만 있기 때문에 부작용 및 독성을 감소시키고 결정적인 치료효과가 있는 소재의 발굴 및 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명은 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 제공함으로써 상술한 분제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 산화스트레스에 의해 유발된 신경세포 (SK-N-MC) 사멸에 대해 항산화 효소인 헴 옥시게나아제(HO-1)의 발현을 증가시켜 항산화 효능을 가지며, 신경세포 사멸 (apoptosis)에 관여하는 MAPK (ERK, JNK, P38) 신경전달경로의 활성을 억제하고, 최종적으로 카스파아제-3와 PARP의 활성을 억제함으로써 우수한 신경세포 사멸 억제 효과를 갖기 때문에 퇴행성 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 천연물 소재인 상황버섯 자실체로부터 추출한 것이므로, 기존의 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제와 비교하여 독성 및 부작용이 적어 인체에 안전하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.
용어 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물에 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들을 혼합한 혼합물을 의미한다.
용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
용어 “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화(palliating)”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 제공한다.
본 발명에 사용된 상황버섯의 학명은 Phellinus linteus으로, 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라는 이름으로 탕액편에 기록되어 있다. 갓은 지름 6∼12cm, 두께 2∼10cm로, 반원 모양, 편평한 모양, 둥근 산 모양, 말굽 모양 등 여러 가지 모양을 하고 있다. 표면에는 어두운 갈색의 털이 짧고 촘촘하게 나 있다가 자라면서 없어지고 각피화한다. 검은빛을 띤 갈색의 고리 홈이 나 있으며 가로와 세로로 등이 갈라진다. 가장자리는 선명한 노란색이고 아랫면은 황갈색이며 살도 황갈색이다. 자루가 없고 포자는 연한 황갈색으로 공 모양이다. 다년생으로 뽕나무 등에 겹쳐서 나는 목재부후균이며, 초기에는 진흙 덩어리가 뭉쳐진 것처럼 보이다가 다 자란 후에는 나무 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 항암 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 귀중한 약재로서 한국에서는 대량으로 재배하고 있다. 약용하기 위해 달이면 노란색이거나 연한 노란색으로 맑게 나타나며, 맛과 향이 없는 것이 특징이다. 맛이 순하고 담백하여 먹기에도 좋다. 한국·일본·오스트레일리아·북아메리카 등에 자생한다.
상기 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 도 1에 나타난 바와 같이, 상황버섯 자실체를 열수추출을 한 후, 이를 70% 에탄올 침전법과 에틸 아세테이트 분획을 통해 최종적으로 수득할 수 있다.
상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 히스폴론(hispolon)을 활성물질로 포함할 수 있다.
상기 히스폴론은 상황버섯 자실체에 함유된 황색(노랑색) 색소물질로 주요 페놀릭 화합물들 중 하나이다.
PLEA에 대해 HPLC 분석을 수행한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 PLEA에 함유된 주요 페놀릭 화합물은 히스폴론이며, 히스폴론은 PLEA가 항산화 활성을 통해 뇌신경세포를 산화스트레스로부터 보호하는 효과를 나타내는데 있어서 주요 활성 물질인 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물의 신규한 생리활성을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 H2O2에 의한 유발된 산화 스트레스에 의한 신경세포의 사멸 억제 효능을 확인하였고, 항산화 효소인 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 발현 증가를 통해 산화 스트레스를 감소시키는 것을 확인하였으며, 신경세포 사멸에 관여하는 MAPK 신호전달 기전(ERK, JNK, P38)의 활성화를 억제함으로써 신경세포를 보호함을 규명하였다.
본 발명의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 산화 스트레스로 인한 신경세포 사멸 억제활성에 의한 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 및 개선 효과가 있음을 확인하였다.
보다 구체적으로, SK-N-MC 세포에 대해 H2O2에 의해 산화 스트레스를 유발한 후 신경세포 생존율 (Cell viability)을 측정하였을 때, 도 3의 (A)에 나타난 바와 같이 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 신경세포 생존율을 증가시켰고, 또한 도 3의 (B)에 나타난 바와 같이 LDH 검정을 통해 신경세포 독성 (Cytotoxicity)이 감소됨을 확인하였다.
신경세포 사멸 (apoptosis)을 확인하기 위해 Annexin V-FITC/PI 형광염색을 한 후 FACs를 이용하여 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 세포 사멸을 억제한다는 것을 알 수 있었고, 또한 신경세포 사멸 (apoptosis)시 특징적인 현상인 DNA 단편화를 확인하기 위해 TUNEL 검정을 실시하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 DNA 단편화를 억제함으로써 세포 사멸 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.
나아가, 도 6에 나타난 바와 같이 H2O2에 의해 유도된 활성산소종 (ROS) 생성 억제 또는 소거 평가 실험에서 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 활성산소종의 생성을 억제 또는 소거한다는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이 산화스트레스로부터 신경 세포 보호 기작연구 실험에서 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 항산화 효소인 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA 수준과 단백질 수준을 모두 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 신경세포 사멸에 관여하는 기전으로 알려져 있는 MAPK 신호전달 기전(ERK, JNK, P38)을 활성화하는 정도를 측정한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 MAPK 신호전달 기전(ERK, JNK, P38)의 활성화를 억제함을 알 수 있었다. 신경세포 사멸에 관여하는 효소인 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도를 측정한 결과 도 9에 나타난 바와 같이 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 카스파아제-3와 PARP의 활성을 억제함을 확인하였다.
따라서 전술한 다양한 실험결과를 통해 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 H2O2에 의한 산화 스트레스로부터 항산화 효능에 의한 신경세포 사멸 억제활성을 통해 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 및 개선에 유용함을 알 수 있다.
이러한 실험 결과를 토대로 할 때, 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물이 산화스트레스로 인한 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
이때, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 예를 들어, 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 0.1 ~ 200 ㎍/㎖의 농도, 더욱 바람직하게는 1 ~ 50 ㎍/㎖의 농도로 본 발명의 약학적 조성물에 포함되며, 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도는 전술한 생리적 효과를 달성할 수 있는 농도 범위이다.
만약, 0.01 ㎍/㎖의 농도 미만으로 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 포함하는 경우, 약학적 조성물의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료효과가 떨어져 약제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 500 ㎍/㎖의 농도를 초과하는 경우, 과도한 양의 상황버섯 자실체가 요구되어 경제적인 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 퇴행성 뇌신경계 질환은 산화스트레스로 인해 유발되는 질환일 수 있으며, 이로 한정되는 것은 아니지만, 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환일 수 있다.
본 발명은 상황버섯 자실체 (Phellinus linteus fruiting bodies) 유래 열수추출물로부터 분리된 에틸 아세테이트 추출물이 산화스트레스로 인한 신경독성을 감소시킴으로써 DNA 손상과 포스파티딜세린(PS)의 세포 외 노출을 감소시켰으며, 신경세포 사멸을 억제하여 신경세포 보호 효과를 나타냈고, 그 보호 기작으로서 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA와 단백질의 발현을 증가시켜 세포내 활성산소종 (ROS)을 소거시키며, MAPK의 신호전달 기전의 활성을 억제함으로써 세포사멸 (apoptosis) 관련 효소들인 카스파아제-3, PARP의 활성을 억제하여 궁극적으로 산화스트레스에 의한 신경세포의 세포사멸 (apoptosis)을 억제하여 신경세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용한 천연 소재이며, 이를 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오즈 (sucrose) 또는 락토오즈 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 함유하는 약리학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
특히, 임의의 의학적으로 적합한 방법, 예를 들면, 정상적인 정맥내 투여 또는 동맥내 투여, 뇌척수액으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 피내(intradermal) 투여, 강내(intracavity) 투여, 경막내(intrathecal) 투여, 종양 또는 상기 종양에 공급하는 동맥으로의 직접 투여가 유리하다. 종양 또는 그의 일부가 이전에 외과수술에 의해 제거된 경우, 치료제는 직접 주사 또는 미리 이식된 저장부(reservoir)를 통해 종양 부위(및 특히, 종양 부위에 있는 포위된 강(enclosed cavity) 또는 "절제 강(resection cavity)")로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 0.01∼250mg/kg, 바람직하게는 0.1∼100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 0.1 ~ 200 ㎍/㎖의 농도, 더욱 바람직하게는 1 ~ 50 ㎍/㎖의 농도로 본 발명의 약학적 조성물에 포함되며, 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도는 전술한 생리적 효과를 달성할 수 있는 농도 범위이다.
만약, 0.01 ㎍/㎖의 농도 미만으로 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 포함하는 경우, 건강기능식품의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선효과가 떨어지는 문제가 발생할 수 있으며, 500 ㎍/㎖의 농도를 초과하는 경우, 과도한 양의 상황버섯 자실체가 요구되어 경제적인 문제가 발생할 수 있다.
상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 이에 한정되는 것은 아니지만, 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병, 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환일 수 있다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품첨가물공전”에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 항암활성 증진용 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 상기 건강기능식품에 포함된 항암활성 증진용 조성물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있고, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
상황버섯 자실체 추출 및 분획
상황버섯 자실체
열수
추출
상황버섯 자실체 20 g을 증류수 500 ml에 녹인 후 100℃에서 3 시간 교반하면서 추출하였다. 이를 nylon socks를 통해 1차로 여과 한 후, 여과지 (Whatman No.4)를 이용하여 2차로 여과한다. 이를 동결 건조하여 열수 추출물 약 0.94 g을 얻었다. 이를 75% 에탄올 침전을 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 30 min)하여 상등액을 분리하여 감압 농축한 후 동결건조를 하였다. 이를 증류수에 녹인 후 에틸 아세테이트 (1:1 v/v)로 분획하고 감압 농축하여 동결건조 한 후 에틸 아세테이트 추출물 (PLEA, 0.018 g)을 얻었고 이를 하기의 실시예에 사용하였다 (도 1).
상황버섯 에틸 아세테이트 추출물에 대한
HPLC
(high-performance liquid chromatography) 분석
상황버섯 에칠아세테이트 추출물 (PLEA)에 함유된 주요 페놀릭 화합물을 규명하기 위해, HPLC (high-performance liquid chromatography) 분석을 수행하였다. 컬럼은 Gemini 5u C18 110A (250 ⅹ 4.60 mm) 컬럼 (Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였고, Waters 2998 photodiode array detector system (Waters, Milford, MA, USA)이 장착된 워터스사의 HPLC (Waters 2695 separation modules) 시스템을 사용하여 분석하였다.
상황버섯 자실체에는 황색 (노랑색) 색소물질로 알려진 히스폴론(hispolon)이 주요 페놀릭 화합물들 중 하나로 보고되어 있어서 [Toopmuang P, Khamchum C, Punsuvon V. Detection and confirmation of hispolon in the mushroom Phellinus linteus. Science Asia 2014;40:141-4], 히스폴론을 Enzo Life Sciences 사 (Farmingdale, New York)로부터 구매하여 본 실험의 표준물질로 사용하였다. 컬럼은 30°C 챔버에 두면서 10 ul의 샘플용액을 주입하고 분당 0.8 ml (0.8 ml/min)의 속도로하여 용출용매로는 물:아세토니트릴 20:80 혼합용매 (20% water: 80% acetonitrile)를 사용하여 등용매 방식(isocratic mode)으로 용출하면서 300 nm의 파장대에서 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 보이는 바와 같이 PLEA에는 크게 2가지 물질 (Peak 1과 Peak 2)이 주요 물질로 나타났으며, 이중에 가장 많이 함유된 물질인 Peak 1 물질의 용출 위치가 표준물질인 히스폴론(Rt 값이 4.007 min)의 위치와 동일하게 나타나 PLEA에 함유된 주요 페놀릭 화합물이 히스폴론임을 확인하였다.
이는 PLEA가 항산화 활성을 통해 뇌신경세포를 산화스트레스로부터 보호하는 효과를 나타내는데 있어서 PLEA에 함유된 주요 물질인 히스폴론이 주요 활성물질인 것으로 나타났다.
세포 생존율 및 세포 독성 측정
MTT 검정을 통한 세포 생존율 측정
H2O2 처리에 의한 신경세포 사멸에 대해 상황버섯 유래 에틸 아세테이트 추출물 (PLEA)의 전처리에 따른 세포생존율의 변화를 MTT 검정에 의해 측정하였다. 사람의 신경모세포종인 SK-N-MC 세포는 96-웰 플레이트에 1×105 cells/ml의 밀도로 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다. 0.1-5 μg/ml PLEA를 2시간 동안 전처리 한 후, 200 μM H2O2를 24시간 동안 처리하였다. 반응이 끝난 후, 1 ㎎/㎖ 농도의 3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후, 200 ㎕의 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가하여 Microplate reader (Molecular devices, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군을 100%로 하여 각 처리군의 상대적인 세포 생존율을 구하였다. H2O2만 처리한 군에서는 53.6 %까지 세포 생존율이 감소하였고, PLEA를 농도 의존적으로 전처리했을 경우, 세포생존율이 유의적으로 증가하였다. 특히, 최고농도인 5 μg/ml 농도의 PLEA를 전처리한 후 H2O2를 처리하였을 경우, H2O2만 처리한 군에 비해 약 70.69 %의 세포 생존율 증가를 나타내었다 (도 3의 (A)).
LDH 검정을 통한 세포 독성 측정
PLEA를 전처리 한 후, H2O2 처리하였을 때 신경세포의 독성 (cytotoxicity)을 LDH assay를 통해 측정하였다. SK-N-MC 세포를 6-well plate에 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 배양한 후, 0.1-5 μg/ml PLEA를 2시간 동안 전처리하였고, 200 μM H2O2를 24시간 동안 처리하였다. 세포 배양액을 취한 후 250 × g, 10 min, 4℃ 조건으로 원심분리하여 상층액을 취한 후, LDH 세포독성 검출 키트(Takara bio inc, Tokyo, Japan)를 이용하여 LDH 활성을 측정하였다. 최종적으로 Microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 시료를 첨가하지 않은 대조군을 1-fold로 하여 각 처리군의 상대적인 세포 독성을 fold increase로 구하였다. H2O2만 처리한 군에서는 세포 독성이 약 4.2-fold로 증가하였고, 최고 농도인 5 μg/ml 농도의 PLEA를 전처리한 후 H2O2를 처리하였을 경우, H2O2만 처리한 군과 비교하였을 때 약 65.36 %의 세포 독성 감소를 나타내었다. (도 3의 (B)).
신경세포 사멸 분석
H2O2 처리에 따른 세포사멸 분석은 Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트(Bio Vision, USA)를 사용하여 측정하였다. 신경세포 (SK-N-MC)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 0.1-5 μg/ml의 PLEA를 신경세포에 2시간 동안 전처리한 후, H2O2를 24시간 동안 처리하였다. Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 모은 후, 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 각각 500 ㎕의 binding buffer로 부유시킨 후, 5 ㎕의 Annexin V-FITC 및 5 ㎕의 PI (propidium iodide)를 첨가하여 실온에서 빛을 차단한 상태로 5분 동안 반응시켰다. Annexin V-FITC 및 PI 반응시킨 세포는 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
H2O2만 처리한 군에서는 세포고사(apoptotic) 세포사멸이 약 22.1 % 증가하였고, PLEA를 전처리한 후 H2O2를 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포고사(apoptotic) 세포사멸이 감소하는 것을 확인하였으며, 최고 농도인 5 μg/ml PLEA를 전처리한 경우 세포사멸 (apoptosis)이 약 4.7 %까지 감소되는 것을 확인하였다 (도 4).
신경세포 DNA 단편화(fragmentation) 변화 확인
H2O2에 의해 유발된 신경세포 사멸에 대한 PLEA의 사멸 억제 효능을 좀 더 확인하고자 세포 사멸시 특징 중의 하나인 DNA 단편화에 대해 PLEA의 억제 활성을 확인하였다. 신경세포 (SK-N-MC)를 커버 글라스에서 24시간 동안 배양하고 PLEA를 0.1, 5 μg/ml의 농도로 2시간 동안 전처리한 후, H2O2를 24시간 동안 처리하였다. poDIRECT In Situ DNA 단편화 검정 키트(Biovision Research Products, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 형광 염색한 후, 형광현미경(×200)으로 신경세포 DNA의 형태변화를 관찰하였다.
PLEA를 0.1, 5 μg/ml의 농도로 전처리한 후 H2O2를 처리한 경우, H2O2만 처리한 대조군과 비교했을 때, 0.1 ug/ml의 PLEA를 전처리한 군에서는 DNA의 단편화에 차이가 없었지만, 5 ug/ml의 PLEA를 전처리한 군에서는 DNA의 단편화가 현저하게 감소함을 볼 수 있었고, 이는 신경세포의 DNA 단편화를 저해시켜줌으로써 세포사멸이 감소됨을 확인 할 수 있었다 (도 5).
세포 내 활성
산소종
(
ROS
)의 측정
H2O2 처리에 의해 유발된 SK-N-MC 세포내 생성된 활성 산소종 (ROS)의 양은 형광 probe인 2′7′-dichlorofluorescin diacetate (CM-H2DCF-DA, Molecular Probes Inc., OR)를 사용하여 측정하였다. SK-N-MC 세포를 96-웰 플레이트에 1 × 105 cells/ml 밀도로 깔아주고 24시간 동안 배양한다. 0.1~5 μg/ml의 PLEA를 2시간 동안 전처리한 후 200 μM H2O2를 24시간 동안 처리하였다. 반응이 끝난 후 1× PBS로 2회 세척한 후, CM-H2DCF-DA (10 mM in DMSO)를 최종 농도가 10 uM이 되도록 각 웰에 100㎕씩 처리하여 37℃에서 45분 동안 반응 시킨 후, 여기(excitation) 파장 485 nm, 방출(emission) 파장 530 nm에서 형광발광을 측정하였다.
그 결과 H2O2을 처리하지 않은 대조군에 비해 H2O2를 24시간 동안 처리한 세포에서는 활성 산소종이 약 1.46 배 증가함을 관찰하였다. PLEA를 0.1-5 μg/ml 농도로 2시간 동안 전 처리 한 후 H2O2를 처리한 군은 농도별로 유의하게 세포내 활성산소종의 양이 감소하였으며, 특히, 5 μg/ml 농도에서 H2O2만 처리한 군과 비교하여 약 26.91 %의 활성 산소종이 감소된 것을 확인하였다 (도 6).
헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA 발현 변화 관찰
PLEA의 헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 mRNA 수준 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 신경세포 (SK-N-MC)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 PLEA를 0.1-5 μg/ml의 농도로 2시간 동안 처리한 후, 6시간 동안 H2O2를 처리하였다.
Total RNA의 분리
TRIzol 시약(Invitrogen, USA)으로 세포를 용해시킨 후 클로로포름 (Sigma, USA)을 첨가하고 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. Total RNA 추출 키트(Intron, Korea)를 이용하여 RNA를 분리한다. 분리된 RNA에 결합 버퍼(binding buffer)를 400 ㎕씩 첨가하여 반응 시킨 후 세척 버퍼(washing buffer) A, B를 이용하여 세척해준다. 최종적으로 용출 버퍼(elution buffer)로 50㎕ 씩 RNA를 용출시킨다. 분리된 total RNA는 Spectrophotometer로 정량한 후 농도가 1 μg이 되도록 하였다.
1st strand cDNA의 합성
분리한 total RNA를 Power cDNA Synthesis Kit (Intron, Korea)를 이용하여 first strand complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 1 μg 의 total RNA에 Oligo (dT) 15primer 1㎕ 를 첨가한 후 75℃에서 5분간 반응시킨 후, 4℃에서 1분간 반응시켜주었다. RNase 저해제, 5X RT 버퍼, dNTP, DTT, AMV RT 효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨다. 75℃에서 5분간 반응시켜 획득한 cDNA를 RT-PCR에 사용하였다.
cDNA를 이용한 RT-PCR
합성한 각 cDNA 1 μl, 프라이머 1 μl (HO-1, Hs01110250_m1; and 18s rRNA, Hs99999901_s1, Applied Biosystems), 2X 마스터 믹스 솔루션 (Master mix Solution) (Applied Biosystems, Foster City, CA) 10 μl, DEPC Water 8 μl를 넣은 다음 StepOnePlus™ 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 RT-PCR을 하였다.
그 결과 도 7의 (A)에 나타난 바와 같이 H2O2를 처리한 군에서는 HO-1의 mRNA 수준이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 2.36 배 증가하였으며, 0.1-5 μg/ml의 PLEA를 전처리했을 경우 HO-1의 mRNA 수준이 농도별로 증가하였으며, 특히, 5 ug/ml의 PLEA를 전처리한 군에서는 HO-1 mRNA 수준이 H2O2만 처리한 군과 비교하였을 때 2.95배 증가함을 확인하였다.
웨스턴 블랏을 통한 단백질 수준 변화 관찰
웨스턴 블랏
신경세포 (SK-N-MC)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 PLEA를 0.1-5 μg/ml의 농도로 2시간 동안 처리한 후, H2O2를 처리하였다. 프로테아제 저해제와 포스파타아제 저해제 (Roche, Germany)가 첨가된 용해 버퍼(lysis buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl)로 얼음에서 30 분 세포를 용해시킨 후, 원심분리 (13,000 rpm, 10 min, 4°C) 하여 상등액을 취한다.
이후 Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 시약을 이용해 단백질을 정량하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)를 통해 전체 단백질을 분리 하였고, 니트로섬유소막(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 단백질을 이동하였다. 이후 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1 시간 동안 막을 블로킹(blocking)하였으며, 1차 항체(primary antibody) HO-1, t-ERK, p-ERK, t-JNK, p-JNK, t-p38, p-p38, 절단된(cleaved)-카스파아제-3, 절단된-PARP, β-tubulin (1:1000, overnight, 4℃, Cell signaling)과 HRP-conjugated 2차 항체(1:2000, overnight, 4℃, Cell signaling)를 각각 반응시킨 후, 개선된 화학발광(enhanced chemiluminescent, ECL) 시스템(AbClon, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질을 검출 하였고, NIH (Bethesda, MA, USA)사의 Image J software를 이용하여 정량화하였다.
헴 옥시게나아제-1 (HO-1)의 단백질 수준 측정
PLEA의 HO-1의 단백질 수준 변화에 미치는 영향을 측정한 결과 H2O2를 처리한 군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 1.40 배 증가하였으며, 0.1-5 μg/ml의 PLEA를 전처리했을 경우 HO-1의 단백질 수준이 농도별로 증가하였으며, 특히, 5 ug/ml의 PLEA를 전처리한 군에서는 H2O2만 처리한 군과 비교하였을 때 HO-1 단백질 수준이 60.20% 증가함을 확인하였다 (도 7의 (B)).
MAPK (ERK, JNK, P38) 신호전달 기전의 인산화 (phosphorylation) 측정
PLEA 전처리에 따른 MAPK (ERK, JNK, P38) 신호전달 기전의 인산화 변화에 미치는 영향을 측정한 결과 H2O2를 처리한 군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 ERK, JNK, P38의 인산화 정도가 각각 1.37, 6.31, 1.87 배 증가하였다. 그러나 H2O2를 처리하기 전에 농도별로 (0.1, 0.5, 1, 5 μg/ml) PLEA를 전처리했을 경우 MAPK의 인산화 정도가 농도별로 감소하였으며, 최고 농도인 5 ug/ml의 PLEA를 전처리했을 경우, H2O2만 처리한 군과 비교하였을 때, ERK의 인산화 정도는 15.58%, JNK의 인산화 정도는 79.74%, P38의 인산화 정도는 30.4% 감소하는 것으로 나타나 PLEA에 의해 MAPK pathway의 인산화가 저해됨을 확인하였다 (도 8의 A 및 B).
카스파아제-3 및 PARP의 활성화 측정
PLEA 전처리에 따른 세포 사멸에 관련된 효소인 카스파아제-3 와 PARP의 활성화 변화에 미치는 영향을 측정한 결과 H2O2를 처리한 군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 카스파아제-3 와 PARP의 활성화 정도가 각각 1.61, 1.34 배 증가하였다. 그러나 H2O2를 처리하기 전에 0.1-5 μg/ml의 PLEA를 전처리했을 경우 카스파아제-3와 PARP의 활성화 정도가 농도별로 감소하였으며, 최고 농도인 5 ug/ml의 PLEA를 전처리했을 경우, H2O2만 처리한 군과 비교하였을 때, 카스파아제-3의 활성화 정도는 36.35% 감소하였고, PARP의 활성화 정도는 15.04% 감소함을 나타내었다 (도 9의 A 및 B).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 신경세포 보호 효과를 갖는 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물.
- 제1항에 있어서, 히스폴론(hispolon)을 활성물질로 포함함을 특징으로 하는 상황버섯 자실체 유래 에틸아세테이트 추출물.
- 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 포함됨을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 상황버섯( Phellinus linteus ) 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제6항에 있어서, 상기 상황버섯 자실체 유래 에틸 아세테이트 추출물은 0.01 ~ 500 ㎍/㎖의 농도로 포함됨을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 제6항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경계 질환은 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상의 질환임을 특징으로 하는 건강기능식품.
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2015
- 2015-10-16 KR KR1020150144969A patent/KR101808718B1/ko active IP Right Grant
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR101808718B1 (ko) | 2017-12-13 |
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