KR20120088057A - 알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료용 상황버섯 열수추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료용 상황버섯 열수추출물을 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 상황버섯 (Phellinus linteus) 열수 추출물이 알코올에 의해 유발된 산화적 스트레스에 의한 사람의 신경모세포종 SK-N-SH 세포 사멸을 HO-1의 발현을 증가시키거나, 산소활성종의 생성을 감소시키거나 또는 카스파아제-3의 활성을 억제하여 세포계획사를 차단하는 방법으로 신경세포의 사멸을 억제 또는 차단하는 것을 알 수 있었고, 이런 결과를 근거하여 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료제 및 신경세포 보호제로서 상황버섯 열수추출물을 함유하는 약리적 조성물을 발명한 것이다.

Description

알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료용 상황버섯 열수추출물을 포함하는 조성물{Composition Comprising Phellinus linteus Water Extracts for the Prevention or Treatment of Alcohol-related Neurodegenerative Diseases by Inhibition of Ethanol-induced Neural Cell Death}
본 발명은 상황버섯에서 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제 또는 차단하는 알코올성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물 및 이를 함유하는 건강기능식품에 관한 것이다.
알코올은 신경 세포 증식 및 분화, 신경 발달, 세포-세포 간 상호작용 등의 장애와 신경세포의 손실을 초래하여 형태학적 변화를 유도하며, 더 나아가 신경세포의 사멸로 인해 뇌 신경계 질환을 유발한다(Goodlett et al. 2001; Guerri, 1998; Luo et al. 1998; Olney et al. 2000; West, 1994). 알코올에 의한 신경 독성은 다양한 기전(mechanism)을 가지고 있다. 하지만 많은 연구에도 정확한 기작에 대해서는 보고된 바 없다. 신경독성의 다양한 기전(mechanism) 중 가장 잘 알려진 원인은 산화적 스트레스이다 (Crews et al. 2009; Ramachandran et al. 2003).
알코올은 Catalase, Alcohol dehydrogenase 등의 효소에 의해 대사된다 (Haorah et al. 2008; Zakhari. 2006). 하지만 이 대사과정에서 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion, O2-), 과산화수소 (hydrogenperoxide, H2O2), 히드로젠 라디칼 (hydrogenradical,HO??) 등과 같은 활성산소종 (ROS)이 생성되며, 다양한 요인에 의해 생성된 과도한 활성산소종은 산화적 스트레스를 유발한다(Sagara et al. 1998). 산화적 스트레스를 받게 되면 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체를 과자극하여 glutamate를 통한 흥분독성을 유도하며, 지속적인 glutamate의 증가는 칼슘의 유입을 통한 신경독성을 일으킨다(Haper et al. 2005). 따라서 알코올에 의한 산화적 스트레스로 유발되는 신경독성과 관련한 질환을 예방 또는 치료할 필요가 있다.
현재, 현재 알코올성 뇌질환의 치료는 아세틸콜린에스터레이즈 억제제 (Cholinesterase inhibitor), NMDA 글루타메이트 (glutamate) 수용체 차단제 등이 사용되고 있으나, 치료보다는 증상을 경감시키는 효과가 있으나 (Kim et a1., 2008), 알코올성 뇌 질환에 대한 예방법과 치료법이 분명치 않고 결정적인 효과를 가진 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 다만, 대한민국공개특허 제10-2009-0066289호(특허문헌 1)에서는 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 효현제를 사용하여 만성 알코올 섭취에 의한 뇌 손상과 같은 알코올 유발성 뇌질환의 치료제로 사용될 수 있다고 개시하고 있다.
질병 치료로 개발되어 사용되고 있는 화학요법제는 장기 복용에 의한 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 있어 인체에 무해하면서도 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제를 천연물로부터 탐색하려는 연구에 관심이 집중되고 있다. 천연물로부터 분리, 정제된 물질은 비교적 독성이 적어 의약품에 비해 장기간 섭취하여도 안전하다는 점 때문에 최근 각종 질병 치료제 및 치료보조제로 각광 받고 있다 (Kwon et al. 2009).
뇌신경계 질환의 치료 또는 예방이 가능한 것으로 확인된 천연소재를 살펴보면, 제비꽃의 메탄올, 에탄올, 아세톤 추출물이 신경독소인 glutamate에 의한 세포내 산화적 손상을 억제하여 신경세포를 보호한다는 연구 결과(Lee MR et al. 2008. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 51(1): 79-83, 비특허문헌 1)나, 석창포 및 천마의 복합추출물이 뇌세포 사멸을 억제하여 뇌졸중, 파킨슨병, 노인성 치매 및 헌팅턴병의 치료를 위한 약학적 조성물 중에 함유될 수 있다는 결과도 개시되어 있다(대한민국공개특허 제10-2004-064240호, 특허문헌 2)
한편, 버섯류는 오랫동안 인간에 의해 식용 또는 민간요법으로 섭취하여 왔기에 비교적 안전성이 높아, 천연물 유래 신규 의약품으로의 개발 가능성이 높은 장점이 있다. 많은 버섯류로부터 분리된 다당류가 면역 증강 및 항암활성 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Bohn et al. 1995).
특히, 상황버섯(Phellinus linteus)은 민주름버섯목 (Aphyllophrales) 소나무비늘버섯과 (Hymenochaetacae) 진흙버섯속 (Phellinus sp.)에 속하는 버섯으로, 자실체 유래 추출물의 항암활성 (Nakamura et al. 2004), 항염증 (Matsuba et al. 2007)은 물론이고, 간세포에서의 철의 과다에 의한 질환을 예방, 방지할 수 있다는 약리 효과(Ye et al. 2007. Phytother. Res. 21: 94-953, 비특허문헌 2)에 대한 연구가 보고되었다.
또한, 대한민국등록특허 제10-759467호(특허문헌 3)에서는 상황버섯에서 분리된 화합물이 요산 형성에 관여하는 산틴 옥시다제의 활성 억제 또는 통풍성관절염 환자에게 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현 억제에 의하여 통풍을 예방할 수 있다고 개시하고 있다.
이와 같이 상황버섯 추출물은 항암효과, 면역증강 효과 등 다양한 생리활성을 나타냄에도 불구하고, 알코올 유발성 산화 스트레스를 감소시킴으로써 신경세포 사멸 억제에 의한 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물은 개발되어 있지 못한 실정이다.
1. 대한민국공개특허 제10-2009-0066289호 2. 대한민국공개특허 제10-2004-064240호 3. 대한민국등록특허 제10-759467호
1. Lee MR et al. 2008. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 51(1): 79-83 2. Ye et al. 2007. Phytother. Res. 21: 94-953.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 기본적인 목적은 알코올에 의해 유도된 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 상황버섯 열수추출물을 유효 성분으로 함유하는 약리적 및/또는 식품공학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 알코올에 의해 유도된 뇌신경세포의 사멸을 억제함으로써, 알코올성 뇌질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약리적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 예를 들어 다른 숙취 해소제의 활성 성분과 함께 상황버섯 열수추출물을 유효 성분으로 함유하는 건강기능식품, 예를 들어 숙취 해소용의 건강기능식품을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부하는 도면을 참조하면 더욱 분명해질 것이다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명에서는 상황버섯 열수추출물이 알코올에 의해 유발된 뇌질환을 효율적으로 억제할 수 있다는 점에 근거한다.
즉, 본 발명은 알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 상황버섯(Phellinus linteus) 열수추출물을 유효 성분으로 함유하는 알코올성 뇌질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
이때, 상황버섯 열수추출물은 알코올에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포 내의 헴-옥시게나아제 1(Heme oxygenase-1, HO1)의 발현을 증가시키거나, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 발현을 억제하는 방법으로 뇌신경세포의 사멸을 억제한다.
본 발명의 실시예에서 확인된 바에 따르면, 상황버섯 열수추출물은 알코올에 의해 유도된 산화적 스트레스로 인하여 활성화된 카스파아제-3(caspase-3)의 활성을 억제하여 뇌신경세포의 세포계획사(apoptosis)를 억제한다.
바람직하게는 상기 상황버섯 열수추출물은 10 ~ 300 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있으며, 알코올은 예를 들어 에탄올이다.
또한, 본 발명은 전술한 조성물을 함유하는, 알코올 숙취 해소용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 사용된 상황버섯 열수 추출물은 알코올성 뇌질환세포모델 (사람의 신경모세포종)에서 헴 옥시게나아제(HO-1)의 발현양을 증가시키거나, 활성산소종의 생성을 감소시키거나 또는 카스파아제-3(caspase-3)의 활성을 억제하여 세포계획사를 차단함으로써 세포 사멸의 원인이 되는 산화적 스트레스를 감소하여 신경세포 사멸을 억제하여 알코올성 뇌질환을 예방 및 보호할 수 있고, 상황버섯 열수 추출물을 함유하는 약리적 조성물로 주목 받을 수 있을 것으로 예상되는 발명이다.
상황버섯은 예로부터 식용되었기 때문에 안전성 평가 없이 기능성 식품 소재, 생약제제, 치료제 등으로 이용 가능할 것이고, 또한 다양한 분야에 기능성 소재로 활용할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명에 따라 확인된 상황버섯 추출물은 알코올에 의해 뇌신경세포가 사멸되는 것을 억제하기 때문에 기존의 숙취해소제로 사용되었던 헛개나무 추출물 등과 혼합하여 사용하면 숙취해소, 간기능 보호를 해소하기 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있으며, 알코올성 치매와 같이 술에 의한 뇌신경세포 사멸에 의한 인지능력 저하를 동시에 예방하거나 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
결국, 상황버섯은 오래 전부터 식용으로 사용되어 왔기 때문에 안전성 평가 없이 생리활성이 규명되었을 때 다양한 기능성 소재로의 개발이 가능하다. 알코올 중독, 정신분열증, 알코올성 치매 등 알코올성 뇌질환을 예방 및 보호할 수 있고, 이를 유효성분으로 포함하는 기능성 식품제, 건강보조식품 및 의약품 소재로의 이용은 상황버섯의 활용을 더욱 확대시킬 것이다.
현재 알코올성 뇌질환 치료용 의약품으로 사용되고 있는 화학적 약품은 다양한 부작용을 가지고 있지만 천연 소재인 상황버섯 열수 추출물은 이들 부작용을 최소화할 수 있는 소재로서 대체될 수 있다. 본 발명은 식품, 의약 산업에 매우 유용한 것이다. 알코올 소비 증가에 따른 알코올성 뇌질환의 치료 및 개선용 의약 산업이 점차 확대됨에 따라 상황버섯 열수추출물은 의약, 식품산업 등 다양한 산업에 광범위하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물에 의한 뇌신경세포의 보호적 효과를 측정한 것으로, 도 1a는 뇌신경세포 모델인 SK-N-SH 세포에 에탄올 0 ~ 500 mM를 처리한 후 세포의 생존율을 측정한 그래프이고, 도 1b는 신경세포에 2시간 동안 1 ~ 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 전처리한 후 400 mM 에탄올을 3시간 동안 처리한 상태에서, 에탄올에 의해 유발된 신경세포 사멸을 상황버섯 열수추출물이 어느 정도 억제하였는지를 MTT assay 측정을 통해 알아본 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 에탄올에 의해 SK-N-SH 세포 내에서 Heme Oxygenase-1(HO-1)의 발현에 대한 상황버섯 열수추출물의 효과를 나타낸 것으로, A는 신경세포에 2시간 동안 10, 50, 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 전처리한 후 400 mM 에탄올로 3시간 동안 처리한 상태에서 HO-1의 RT-PCR에 따른 웨스턴 블랏 결과를 도시한 밴드이고, B는 A의 결과에 나타낸 밴드의 밀도를 그래프로 표시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 에탄올에 의해 유도된 SK-N-SH 세포 내의 활성산소종(ROS)의 생성에 대한 상황버섯 열수추출물의 억제 정도를 나타낸 것으로, 세포에 2시간 동안 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 전처리한 후 400 mM의 에탄올로 3시간 동안 처리한 상태에서, DCF-DA 방법을 사용하여 세포내의 유리 라디칼 생성량을 검출한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 에탄올에 의해 유도된 SK-N-SH 세포 내의 카스파아제-3(caspase-3) 활성에 대한 상황버섯 열수추출물의 억제 정도를 나타낸 것으로, 세포에 2시간 동안 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 전처리한 후 400 mM의 에탄올로 3시간 동안 처리하여, Caspase-3 activity assay를 통해서 caspase-3 활성 저해 효과를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
본 발명자들은 상황버섯 추출물의 생리적 활성을 연구하여 특히 산화적 스트레스로 인한 대표적인 뇌신경세포 질환인 알츠하이머 질환의 예방 및 또는 치료 효과가 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명을 위한 연구에서는 알코올성 뇌질환 세포 모델로서 사람의 콜린성 신경모세포종인 SK-N-SH 세포에 알코올을 처리하여 산화적 스트레스를 유발하였고, 상황버섯 열수 추출물이 알코올 유발성 산화적 스트레스에 대항하여 신경세포를 보호함으로써 알코올성 뇌질환 예방 및 개선할 수 있는가를 알아보았다. 산화적 스트레스를 감소시키는 기작으로써 HO-1의 발현양을 측정하였고, 결과적으로 세포의 사멸 억제 효과에 대해서 측정하였다. 이와 같은 기전에 의해 알코올성 뇌질환 예방이 가능한 상황버섯 열수 추출물을 함유한 조성물을 발명하였다.
구체적으로 본 발명에서는 알코올에 의한 세포내 산화스트레스를 인간 신경모세포종인 SK-N-SH 내에 유발시키고, 상황버섯 열수추출물이 산화적 스트레스에 의한 신경세포의 사멸 억제를 확인하기 위해서 세포의 생존율은 물론이고, HO-1 발현, 세포내 활성산소종(ROS)의 생성 및 카사파아제-3의 활성에 대하여 상황버섯 열수추출물의 효과를 검토한 끝에, 상황버섯 열수추출물이 알코올에 의한 세포사멸을 억제하는 방법으로 신경세포를 보호한다는 사실을 확인하고, 상황버섯 열수추출물이 알코올성 뇌질환, 예컨대 알코올 중독, 알코올성 치매를 예방 및 개선할 수 있는지 알아보았다.
이하, 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.
알코올성 뇌질환은 알코올 섭취에 따른 학습, 기억, 인지 기능을 관장하고 있는 뇌신경계 이상을 유발시켜 나타나는 다양한 장애와 질병을 총칭하는 것을 의미한다. 알코올을 만성적 및 과다 섭취하게 되면 알코올을 분해하는 과정에서 활성 산소종이 생성되며 이로 인한 산화적 스트레스를 유발하게 된다. 이러한 산화에 의한 손상이 알코올성 뇌질환인 알코올 중독, 정신분열증, 알코올성 치매 등의 발병과 관련이 있다고 보고되어 있다.
산화적 스트레스와 관련해서 구체적으로 살펴보면, 활성산소종이 생성되면 이를 조절하기 위해 생체 시스템에서 세포의 Redox를 조절하는 SOD, HO 등과 같은 효소를 합성하게 된다. 그 중 Heme oxygenase-1 (HO-1)은 산화적 스트레스를 유발하는 다양한 유발원에 반응하는 것으로 알려져 있다. HO-1의 발현증가는 신경세포에서 산화적 스트레스로부터 보호한다는 선행 연구도 있다. 산화적 스트레스를 감소시키기 위해 HO-1의 발현을 증가시켜 활성산소종을 감소 및 소거하는 것이 중요하다.
한편, 헴 옥시게나아제(Heme oxygenase, HO)는 헴(heme)의 대사과정에서 heme을 절단하여 빌리버딘(billiverdin)으로의 변환을 촉매하는 효소로서, 헴 옥시게나아제-1(HO-1), 헴 옥시게나아제-2(HO-2), 헴 옥시게나아제-3(HO-3)의 세 가지 아형으로 존재하는데 이들은 각기 다른 유전자의 산물이어서 heme binding domain을 제외하고는 그 구조나 조절 기전에 있어 유사성이 거의 없다. Heat shock protein 32라고 알려진 HO-1은 산화적 스트레스, 사이토카인 등의 자극에 의해 유도되는 효소이며(Bang et al. 2006. Korean J Anesthesiol. 50(6): 706-716), HO-1의 발현증가는 신경세포에서 산화적 스트레스로부터 보호한다는 선행 연구도 있다 (Maines, 1988; Chen et al. 2000; McCoubrey et al. 1997).
또한, 카스파아제 3(Caspase-3, CASP3)은 카스파아제 8 및 카스파아제 9과 상호작용하여 세포계획사(apoptosis)에 관여한다. 특히, 알코올에 의한 신경세포의 사멸은 산화적 스트레스를 받아 최종적으로 caspase-3이 활성화되어 apoptotic cell death가 일어나는 것으로 알려져 있다. 신경세포에 apoptosis가 유발되면 세포체 응축, 신경돌기 소실, DNA 응축 및 분절, 세포막수포현상 등의 세포사멸형태가 나타난다(Goodlett et al. 2001). Caspase라 불리는 death-promoting enzymes의 활성이 apoptosis를 유발하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Bredensen, 1996 a,b), Caspase 효소가 activation 되면 세포내의 중요한 기능을 하는 단백질들을 분해하여 세포의 사멸이 유발된다(Cohen, 1997).
따라서 본 발명에서는 알코올에 의한 신경세포의 손상 또는 사멸에 의한 알코올성 뇌질환인 알코올 중독, 정신분열증, 알코올성 치매와 같은 질환을 예방, 치료할 수 있는 상황버섯 열수추출물을 함유하는 약리적 및/또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
이를 위하여, 본 발명에서는 대표적인 신경모세포 모델인 SK-N-SH 세포주를 사용하여(Lee HJ et al. 2008. Korean J. Phys. Anthropol. 21(1): 31~40; Chae HS et al. 2002. Korean J. Anat. 35(6): 509-516) 알코올에 의한 뇌신경세포의 사멸 억제 정도를 확인하였다. 상황버섯 열수추출물은 일반적인 방법에 따라, 예를 들어 상황버섯의 자실체를 절단하고 증류수를 가하는 방법으로 얻을 수 있다.
구체적으로 상황버섯 열수추출물을 SK-N-SH 세포주에 처리한 경우, 알코올에 의해 유발된 세포의 생존율(Cell viability)이 증가되어(도 1b 참조), 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물의 약품 또는 식품으로의 활용 가능성을 확인하였다. 계속해서, 상황버섯 열수추출물로 처리한 신경세포주에서 산화적 스트레스를 조절하는 헴 옥시게나아제-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 발현 증가(도 2 참조) 및 활성산소종의 감소(도 3 참조)를 통해 알코올에 의한 산화적 스트레스를 감소시킨다는 점을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물은 세포계획사(apoptosis)에 관여하는 효소인 카스파아제-3(caspase-3)의 활성을 억제하여 알코올에 의해 유도되는 신경세포의 사멸을 억제한다는 점을 확인하였다(도 4 참조).
이러한 실험 결과를 토대로 할 때, 상황버섯 열수추출물이 알코올성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 활용될 수 있을 것으로 기대되었다. 이때, 바람직하게는 상황버섯 열수추출물은 예를 들어, 0.1 ~ 1000 ㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 1.0 ~ 500 ㎍/㎖의 농도, 더욱 바람직하게는 20.0 ~ 200 ㎍/㎖의 농도로 사용되면 전술한 생리적 효과를 달성할 수 있다.
결국 본 발명에서는 알코올에 의해 유발되는 산화적 스트레스로 인한 신경세포가 사멸될 수 있지만, 상황버섯 열수추출물이 신경세포의 사멸을 억제하며, HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스를 효율적으로 감소시키는 동시에 세포계획사에 관여하는 Caspase-3의 활성을 억제하는 방법으로 알코올에 의해 유도된 신경세포의 사멸을 차단 또는 억제하는 방법으로 신경세포를 보호한다는 점에 근거한 것이다. 따라서 상황버섯 열수추출물은 알코올성 뇌질환을 예방 또는 치료하기 위한 약리적 조성물로서는 물론이고 알코올 섭취에 따른 각종 부작용을 방지하기 위한 식품공학적 조성물(건강기능식품)에 활용될 수 있다.
일예로, 본 발명에 따른 열수추출물을 유효 성분으로 함유하는 약리학적 조성물에 활용되는 경우, 약리학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이때, 상황버섯 열수추출물은, 알코올성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약리학적 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 약리학적 조성물에는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상황버섯 열수추출물을 포함하는 약리적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상황버섯 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 약리학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물이 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 활성을 가지고 있기 때문에 전술한 약리적 조성물 외에도 식품공학적 조성물에 함유될 수 있다. 예를 들어, 아스파라거스/양파/녹차/매실 추출물로 이루어진 숙취제(특허 제10-0496524호 참조), 헛개나무 추출물을 함유하는 숙취 해소용 음료(특허 10-0385844호, 제10-0608456호, 특허 제10-0403721호 참조), 녹차/갈근/홍삼/복분자 추출물을 함유하는 숙취해소용 식품(특허 제10-0500521호 참조) 등에 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 이때, 식품 또는 음료 중에 본 발명의 상황버섯 열수추출물의 함량은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
예를 들어 건강기능식품으로 활용되는 경우에 본 발명의 상황버섯 열수추출물 외에 여러 가지 향미제 도는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제를 사용할 수 있다. 사용가능한 천연 탄수화물로에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 그 외에도 건강기능식품에 활용될 수 있는 성분으로 상황버섯 열수추출물 외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 상황버섯 열수추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
반면, 본 발명에 따른 상황버섯 열수추출물을 함유하는 건강 기능성 음료 조성물에 포함될 수 있는 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
결국, HO-1의 발현을 증가시키고 caspase-3의 활성을 억제하는 것으로 확인된 상황버섯 열수추출물은 알코올성 뇌질환의 예방과 치료에 도움을 줄 수 있을 것이다. 모든 결과들을 종합하면 본 발명은 알코올성 뇌질환을 예방 및 치료할 수 있는 활성을 갖는 상황버섯 열수추출물 및 이 상황버섯 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 약리적 또는 식품공학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 예시적인 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 상황버섯 열수 추출물 제조
본 발명에 사용한 상황버섯(Phellinus linteus) 자실체를 작은 절편으로 절단한 후 분쇄기로 파쇄한 조분쇄물 150 g에 4 ℓ의 증류수를 가하여 100℃에서 4시간 동안 교반하면서 추출하였고, Filter paper (Whatman #2, UK)로 여과한 여액을 -80℃에서 동결 건조(Ilshin Lab. Co., Ltd., Yangju, Korea)하여 얻어진 건조 분말 상태의 열수추출물 분말을 본 발명을 위한 시료로 사용하였다.
실시예 2: 세포 배양
본 실시예에 사용된 사람의 신경모세포종인 SK-N-SH는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)로부터 분양받은 세포주인 neuroblastoma에 10% fetal bovine serum(GIbco-BRL, CA, USA)와 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM (Gibco-BRL) 배양액으로 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다. 상황버섯 열수 추출물을 처리하기 전에 혈청이 없는 배양액 (Serum Free Medium) 으로 교체하여 2시간 동안 배양하였다.
실시예 3: 세포 생존율 측정
실시예2의 SK-N-SH 세포는 96-well plates에 1 x 105 cells/㎖의 밀도로 깔아주고 24시간동안 배양하였다. 1 ~ 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 2시간동안 전처리한 후 400 mM 알코올을 3시간동안 처리하였다. 20 ㎕의 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Roth, Germany)를 각 well에 첨가하여 4시간 동안 배양 한 후 MTT의 환원에 의해서 형성된 formazan precipitate를 100 ㎕ 의 유기용매 (DMSO) 에 녹인 후 ELISA reader (Molecular devices, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조구 세포수를 100%로 하여 각 처리군의 상대적인 세포 생존율을 구하였다.
알코올에 의해 유도된 신경 세포 사멸에 대항하는 상황버섯 열수 추출물의 세포 사멸 억제 효과를 알아본 결과, 400 mM 알코올을 처리하였을 때 50%의 세포 사멸이 유도 되었다 (도 1a). 400 mM 알코올을 유효 적정 농도로 세포에 처리하였고, 상황버섯 열수추출물이 알코올에 의한 신경세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 1 ~ 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 20 ㎍/㎖ 이상 농도의 상황버섯 열수추출물 전처리는 83% 이상으로 세포 생존율을 높였다 (도 1b).
실시예 4: 상황버섯 열수 추출물의 항산화 유전자 발현량 측정
SK-N-SH 세포를 60 ㎜ 배양접시에 2 x 105 cells/㎖ 밀도로 깔아주고 24시간 동안 배양한다. 10, 50, 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 2시간동안 전처리한 후 400 mM 알코올을 3시간동안 처리하였다. HO-1의 발현양 변화를 RT-PCR로 측정하여 알아보았다.
1. RT-PCR
(1) total RNA의 분리
SK-N-SH 세포를 60 ㎜ 배양접시에 2 x 105 cells/㎖ 밀도로 24시간 동안 배양한 후, 세포에 에탄올을 일정 농도 처리하고 일정 시간 반응시킨 후 TRIzol reagent (invitrogen, USA) 로 용해시킨 후 Chloroform (Sigma, USA)을 첨가하고 4℃, 13,000 rpm 에서 10분간 원심분리하였다. Total RNA Extraction kit (intron, Korea)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA에 Binding buffer를 400 ㎕ 씩 첨가하여 반응 시킨 후 washing buffer A, B를 이용하여 washing하였다. 최종적으로 Elution buffer로 50㎕ 씩 RNA를 용출시키고, 분리된 total RNA는 Spectrophotometer로 정량한 후 농도가 2 ㎍/㎖ 되도록 하였다.
(2) 1st strand cDNA의 합성
분리한 total RNA를 Power cDNA Synthesis Kit (intron, Korea)를 이용하여 first strand complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 2 ㎍/㎖ 의 total RNA에 Oligo (dT) 15primer 1㎕를 첨가한 후 75℃에서 5분간 반응시킨 후, 4℃에서 1분간 반응시켜주었다. RNase inhibitor, 5X RT buffer, dNTP, DTT, AMV RT enzyme 를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시키고, 75℃에서 5분간 반응시켜 획득한 cDNA 를 RT-PCR에 사용하였다.
(3) cDNA를 이용한 RT-PCR(Reverse Transcrption-Polymerase Chain Reaction)
합성한 각 cDNA 1㎕, sense-antisense primer 2㎕, 2X PCR Master mix Solution(intron, Korea) 10 ㎕, DEPC Water 7 ㎕를 넣은 다음 Thermal cycler (Biorad, USA)에서 PCR하였다. PCR조건은 94℃에서 2분 반응시킨 후 94℃에서 20초, 50-65℃에서 20초, 75℃에서 1분을 35 cycle 반복하였다. 본 실시예에 사용한 HO-1, H-18s 유전자 발현 연구를 위해 PCR에 사용된 primers의 염기서열과, PCR 조건을 표 1에 나타낸다.
프라이머 서열(5 → 3 방향임)
유전자 프라이머 서열 Cycle annealing temp (℃)
HO-1 정방향
역방향		 TGCGGTGCAGCTCTTCTG(서열1)
GCAACCCGACAGCATGC(서열2)		 35 53
18s rRNA 정방향
역방향		 CGGCTACCACACCAAGGAA(서열3)
GCTGGAATTACCGCGGCTGC(서열4)		 35 53
PCR 산물은 0.008% ethidium bromide가 첨가된 2% agarose gel에 100 V 에서 약 20 분 전기영동 한 후 자외선광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 Image Station 4000MM (Kodak, NY, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였고, 내부 표준물로써 H-18s rRNA를 사용하였다.
상황버섯 열수 추출물 처리에 의해 알코올에 의한 산화적 스트레스와 관련하여 HO-1의 발현에 변화가 있는지 알아보기 위하여, RT-PCR 방법을 통해 확인하였다. 알코올을 400 mM 처리하였을 때 무처리군과 비교하여 HO-1의 발현이 60% 증가하였다. 상황버섯 열수 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 2시간 동안 전 처리 한 후 에탄올을 처리한 결과를 에탄올만 단독으로 처리한 대조군과 비교했을 때 약 2.2배의 HO-1 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 2).
실시예 5: 세포 내 활성산소종 (ROS)의 측정
SK-N-SH 세포내 생성된 활성산소종 (ROS)의 양은 형광 probe인 2′7′-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA, Sigma, USA)를 사용하여 측정하였다. SK-N-SH 세포를 60 ㎜ 배양접시에 2 x 105 cells/㎖ 밀도로 깔아주고 24시간 동안 배양한다. 100 ㎍/㎖의 상황버섯 열수추출물을 2시간동안 전처리한 후 400 mM 알코올을 3시간동안 처리하였다. 3시간 후에 세포를 cell scraper로 배양접시 바닥을 긁어 얻은 후, cell counting 하여 1 x 104 cells/㎖ 밀도로 100㎕ 씩 96-well plates에 넣은 후, DCF-DA (50 mM in DMSO)를 최종 농도가 50 uM이 되도록 각 well에 100㎕ 씩 처리하여 30분간 반응 시킨 후, excitation 파장 485 ㎚, emission 파장 530 ㎚에서 fluorescence를 측정하였다.
알코올에 의해 생성된 활성산소종을 상황버섯 열수 추출물의 감소 효과를 알아보기 위해, 400 mM 알코올에 의해 활성산소종 (ROS)이 생성되어 세포 사멸이 유도 되는지 알아보았다. 그 결과 에탄올을 처리하지 않은 대조군에 비해 에탄올 400 mM을 3시간 동안 처리한 세포에서는 활성산소종이 약 80% 증가함을 관찰하였다. 상황버섯 열수 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 2시간 동안 전 처리 한 후 알코올을 처리한 군은 알코올 단독 처리군과 비교하여 약 2.5배 정도의 활성 산소종이 감소된 것을 확인하였다 (도 3).
실시예 6: 상황버섯 열수추출물의 알코올 유도 caspase-3 활성 억제에 미치는 영향 측정
SK-N-SH 세포에서 알코올에 의한 세포 사멸과정에서 상황버섯 열수추출물에 의해 caspase-3 의 활성이 억제되는지를 확인하기 위해서, SK-N-SH 세포를 6-well plates에 4 x 104 cells/㎖ 밀도로 24시간 동안 배양한 후, 세포에 알코올을 처리하여 배양한 세포를 caspase-3 activity assay kit (SIGMA, USA)을 이용하여 caspase-3의 활성을 측정하였다. 배양한 세포를 용해완충제 (50 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT)로 용해시켜 얻은 세포 용해체 5 ㎕ 에 assay buffer (20 mM HEPES, PH 7.4, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT, 2 mM EDTA) 85 ㎕를 넣고, caspase-3 기질인 2 mM Ac-DEVD-pNA 10 ㎕를 혼합하여 1시간 동안 실온 반응 시킨 후, caspase-3에 의해 기질이 잘려서 생성되는 정도를 ELISA Reader (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 405 ㎚ 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성화는 상대적인 값으로 표현하였다.
상황버섯 열수 추출물 처리에 의해 알코올에 의한 세포 사멸에 관여하는 효소인 caspase-3 활성 억제 효과를 알아본 결과, 400 mM 알코올 처리군은 무처리군인 대조군과 비교하여 caspase-3활성이 약 2 배 증가하였다. 에탄올 400 mM을 처리한 후 caspase-3 저해제인 Ac-DEVD-CHO를 20 uM 농도로 처리하였을 때의 결과를 보면 caspase-3 활성도가 약 55% 억제되었다. 상황버섯 열수 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 2시간 동안 전 처리 한 후 에탄올을 처리한 결과를 에탄올만 단독으로 처리한 대조군과 비교했을 때 약 35% 정도의 caspase-3 활성이 저해됨을 확인하였다 (도 4).
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 생각해 낼 수 있을 것이다. 하지만, 그러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은, 첨부하는 청구의 범위를 통해서 더욱 분명해질 것이다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition Comprising Phellinus linteus Water Extracts for the Prevention or Treatment of Alcohol-related Neurodegenerative Diseases by Inhibition of Ethanol-induced Neural Cell Death <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for HO-1 <400> 1 tgcggtgcag ctcttctg 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for HO-1 <400> 2 gcaacccgac agcatgc 17 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for 18S rRNA <400> 3 cggctaccac accaaggaa 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for 18S rRNA <400> 4 gctggaatta ccgcggctgc 20

Claims (6)

  1. 알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 상황버섯(Phellinus linteus) 열수추출물을 유효 성분으로 함유하는 알코올성 뇌질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상황버섯 열수추출물은 알코올에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포 내의 헴-옥시게나아제 1(Heme oxygenase-1, HO1)의 발현을 증가시키거나, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 발현을 억제하는 방법으로 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 상황버섯 열수추출물은 알코올에 의해 유도된 산화적 스트레스로 인하여 활성화된 카스파아제-3(caspase-3)의 활성을 억제하여 뇌신경세포의 세포계획사(apoptosis)를 억제하는 방법으로 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 상황버섯 열수추출물은 10 ~ 300 ㎍/㎖의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 기재되어 있는 조성물을 함유하는, 알코올 숙취 해소용 건강기능식품.
KR1020100113308A 2010-11-15 2010-11-15 알코올에 의한 뇌신경세포 사멸을 억제하는 알코올성 뇌질환 예방 또는 치료용 상황버섯 열수추출물을 포함하는 조성물 KR20120088057A (ko)

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