KR101652959B1

KR101652959B1 - 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101652959B1
Application number: KR1020160019215A
Authority: KR
Inventors: 허호진; 박선경; 김종민; 이상재
Original assignee: 이상재
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2016-08-31

Abstract

본 발명의 천연 혼합추출물은 마우스의 혈중 알코올 및 아세트알데히드 함량을 감소시키며, 알코올에 의한 간세포 및 뇌신경 세포의 손상에 대한 보호 효과가 우수할 뿐만 아니라, 알코올 섭취로 인해 증가된 마우스 뇌의 AChE(Acetylcholinesterase)의 활성 및 지질과산화물질인 MDA(malondialdehyde)의 생성을 저해하는 효과를 나타내었다. 또한, 상기 천연 혼합추출물은 항산화 효소인 SOD의 함량을 증가시킴으로써, 알코올로 인한 산화적 스트레스에 대한 마우스 뇌 조직 중의 항산화제로 작용할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 천연 혼합추출물은 알코올성 간질환 또는 알코올성 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving and treating alcoholic liver disease or brain injury comprising natural mixture extract as effective component}

본 발명은 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 사회의 다양화 및 경제성장과 더불어 현대인의 알코올 섭취량이 증가하고 과도한 알코올 섭취는 과음으로 인한 숙취나 알코올 중독 및 간 기능 저하, 간암 등과 같은 질병에 문제가 거두되고 있다. 구체적으로, 알코올의 섭취는 위나 장에서 흡수되어 간에서 알코올 가수분해효소(alcohol dehydrogenase, ADH), 카탈라아제(catalase) 또는 알코올 대사에 의해 유도되는 알데히드 산화효소(aldehyde oxidase) 등에 의하여 산화성 대사가 이루어져 아세트알데히드와 함께 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산하는데, 장기적으로 과도하게 알코올을 섭취하면 아세트알데히드와 ROS의 생성량이 증가하며, 대사 과정에서 세포막 지질의 과산화를 일으키고 DNA, 단백질 등의 손상이 유발되고, 결과적으로 간세포를 손상시켜 지방간, 알코올성 간염, 간경화 등 알코올성 간질환을 유발한다. 따라서, 알코올성 간질환 예방 및 치료와 관련하여, 항산화 효과를 가지고 산화적 스트레스에 의한 간 손상 또는 간세포를 보호할 수 있으며, 내성이나 안정성에 대한 문제가 되지 않는 천연물질 유래 알코올성 간질환 예방 및 치료용 조성물의 개발이 시급한 실정이다.

또한, 지금까지 알코올은 일차적으로 간에 악영향을 미치기 때문에 알코올과 간 손상에 관한 연구에 치우쳐 왔지만, 알코올은 간뿐만 아니라 뇌, 심장, 말초혈관 등 신체 전반에 질환을 야기한다. 특히, 알코올 의존 및 중독은 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome)의 발병률 증가와 다양한 장기의 기능저하를 야기할 뿐 아니라, 중추신경계 전반에 영향을 주어 소뇌퇴화, 뇌의 백색질 및 회색질의 용량감소와 더불어 코르사코프 증후군(Korsakoff's syndrome), 기억력 저하, 우울증 등의 정신질환을 일으킨다는 보고들이 발표되면서 알코올성 뇌 손상에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 알코올성 기억력 감퇴 및 기억장애는 알코올에 의해 기억과 학습에 관여하는 뇌의 신경세포가 손상을 받아 그 세포기능이 상실되어 나타나는 것으로 알려져 있으며 알코올에 의한 질환의 증가와 함께 알코올성 뇌 손상에 대한 관심이 높아지고 있기 때문에 이를 예방하고 치료할 수 있는 제제 연구가 필요한 실정이다.

한편, 한국등록특허 제0573245호에는 '숙취해소 및 간기능 개선용 조성물'에 대해 개시하고 있으나, 본 발명의 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 아직 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 헛개자, 갈화, 백작약, 당귀, 건지황, 천궁, 황기, 계피, 감초, 생강, 대조, 벌꿀 및 홍삼으로 이루어진 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 천연 혼합추출물은 혈중 알코올 및 아세트알데히드의 함량을 감소시키며, 알코올에 의한 간세포 및 뇌신경 세포의 손상에 대한 우수한 보호 효과를 지니고 있다. 또한, 알코올 섭취로 인해 증가된 마우스 뇌의 AChE(acetylcholinesterase)의 활성 및 지질과산화물질인 MDA(malondialdehyde)의 생성을 저해하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 15~30중량%의 헛개자, 5~15%중량의 갈화, 3~13중량%의 백작약, 3~13중량%의 당귀, 3~13중량%의 건지황, 3~13중량%의 천궁, 3~13중량%의 황기, 2~10중량%의 계피, 2~10중량%의 감초, 2~10중량%의 생강, 2~10중량%의 대조, 2~10중량%의 벌꿀 및 1~7중량%의 홍삼의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸 결과이다. NC는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; EG는 에탄올 투여군(5g/kg body weight); HG는 에탄올 및 헛개나무 열매 추출물을 투여한 양성 대조군(200mg/kg body weight); HRG100 및 200은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군(100 및 200mg/kg body weight)을 나타낸 것이다.
도 2는 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 혈중 알코올 소거활성(A) 및 아세트알데히드 소거활성(B)을 나타낸 결과이다. HRG은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군; M10은 에탄올 및 10종(지구자, 백작약, 천궁, 황기, 건지황, 당귀, 계피, 감초, 생강 및 대조)의 혼합추출물 투여군; <1>은 지구자 추출물 투여군; <2>는 갈화 추출물 투여군; <3>은 백작약 추출물 투여군; <4>는 천궁 추출물 투여군; <5>는 황기 추출물 투여군; <6>은 건지황 추출물 투여군; <7>은 당귀 추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 3은 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 알코올 독성에 대한 간세포 보호효과 및 생존율을 나타낸 결과이다. control은 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; HRG은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군; M3은 에탄올 및 3종(지구자, 갈화 및 홍삼)의 혼합추출물 투여군; <1>은 지구자 추출물 투여군; <2>는 갈화 추출물 투여군; <3>은 백작약 추출물 투여군; <4>는 천궁 추출물 투여군; <5>는 황기 추출물 투여군; <6>은 건지황 추출물 투여군; <7>은 당귀 추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 4는 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 아세트콜린 분해효소(AChE, acetylcholinesterase)의 활성을 저해하는 효과를 나타낸 결과이다. NC는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; EG는 에탄올 투여군; HG는 에탄올 및 헛개나무 열매 추출물을 투여한 양성 대조군; HRG100 및 200은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 5는 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 뇌(A) 및 간(B)에서의 지질과산화 중간생성물인 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA) 의 생성을 저해하는 효과를 나타낸 결과이다. NC는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; EG는 에탄올 투여군; HG는 에탄올 및 헛개나무 열매 추출물을 투여한 양성 대조군; HRG100 및 200은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 6은 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 알코올 독성에 대한 뇌신경 세포 보호효과 및 생존율을 나타낸 결과이다. control은 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; HRG은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군; M4는 에탄올 및 4종(지구자, 갈화, 천궁 및 감초)의 혼합추출물 투여군; <1>은 지구자 추출물 투여군; <2>는 갈화 추출물 투여군; <3>은 백작약 추출물 투여군; <4>는 천궁 추출물 투여군; <5>는 황기 추출물 투여군; <6>은 건지황 추출물 투여군; <7>은 당귀 추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 7은 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 뇌(A) 및 간(B)에서의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD)의 함량 증가를 나타낸 결과이다. NC는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; EG는 에탄올 투여군; HG는 에탄올 및 헛개나무 열매 추출물을 투여한 양성 대조군; HRG100 및 200은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군을 나타낸 것이다.
도 8은 알코올을 투여하였을 때, 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 뇌(A) 및 간(B)에서의 산화적 글루타치온(GSSH)/총 글루타치온(total glutathione)의 함량 감소를 나타낸 결과이다. NC는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군; EG는 에탄올 투여군; HG는 에탄올 및 헛개나무 열매 추출물을 투여한 양성 대조군; HRG100 및 200은 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물 투여군을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 천연 혼합추출물은 헛개자, 갈화, 백작약, 당귀, 건지황, 천궁,황기, 계피, 감초, 생강, 대조, 벌꿀 및 홍삼으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 천연 혼합추출물은 15~30중량%의 헛개자, 5~15%중량의 갈화, 3~13중량%의 백작약, 3~13중량%의 당귀, 3~13중량%의 건지황, 3~13중량%의 천궁, 3~13중량%의 황기, 2~10중량%의 계피, 2~10중량%의 감초, 2~10중량%의 생강, 2~10중량%의 대조, 2~10중량%의 벌꿀 및 1~7중량%의 홍삼으로 이루어질 수 있지만, 이에 한정하지 않는다.

상기 조성물은 혈중 알코올(alcohol) 및 아세트알데히드(acetaldehyde)의 함량을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 지질 과산화물의 생성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 천연 혼합추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.

상기 건강기능식품 조성물은 알코올성 간질환 또는 뇌 손상을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 15~30중량%의 헛개자, 5~15%중량의 갈화, 3~13중량%의 백작약, 3~13중량%의 당귀, 3~13중량%의 건지황, 3~13중량%의 천궁, 3~13중량%의 황기, 2~10중량%의 계피, 2~10중량%의 감초, 2~10중량%의 생강, 2~10중량%의 대조, 2~10중량%의 벌꿀 및 1~7중량%의 홍삼의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물 총 중량에 대하여 상기 천연 혼합추출물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 천연 혼합추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 천연 혼합추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 천연 혼합추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분인 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 천연 혼합추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 재료

본 발명의 13종의 천연 혼합추출물의 재료(헛개자, 백작약, 당귀, 홍삼, 건지황, 천궁, 황기, 계피, 감초, 갈화, 생강, 대조 및 벌꿀) 및 양성 대조군인 헛개나무 열매는 경상남도 합천군 삼가면에 위치한 2015년 4월 계림건강식품(주)으로부터 제공받아 사용하였으며, 본 실시예에 사용된 시약으로 TBA(thiobarbituric acid), PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride), TCA(thiochloroacetic acid), 트립톤 X-100을 사용하였고, SOD(superoxide dismutase) 분석 키트는 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., USA) 및 글루타치온(glutathione) 분석 키트는 엔조 진단사(Enzo Diagnostics, USA)에서 구입하였다. 인 비보( in vivo ) 실험에 사용된 ICR 마우스는 4주령 수컷을 구입하여 사용하였으며, 모든 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

2. 추출물의 제조

본 발명의 천연 혼합추출물은 22중량%의 헛개자, 10%중량의 갈화, 8중량%의 백작약, 8량%의 당귀, 8중량%의 건지황, 8중량%의 천궁, 8중량%의 황기, 5중량%의 계피, 5중량%의 감초, 5중량%의 생강, 5중량%의 대조, 5중량%의 벌꿀 및 3중량%의 홍삼을 포함하여 제조된 것으로, 먼저 12종(헛개자, 갈화, 백작약,당귀, 건지황, 천궁, 황기, 계피, 감초, 생강, 대조 및 홍삼)의 재료를 한방조제의 군신자사 조제원칙에 따라 혼합하여 추출기에 넣어서 8시간을 달여서 1단계로 농축하며, 2단계로 상기 1단계의 혼합추출물에 국산벌꿀을 첨가하여 1시간 혼합하였으며, 이를 '활력간(HRG)'이라 명명하였다. 양성 대조군인 헛개나무 열매(25g)는 80%(v/v) 에탄올 500mL에 환류 냉각하여 2시간 동안 추출한 뒤, 이 추출액을 No. 2 여과지(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하여 진공 농축기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)로 농축하였다. 그 후 농축한 추출액을 동결건조기(Operon, Gimpo, korea)를 이용하여 동결건조한 후 -70℃에서 보관하면서 하기 실시예의 양성 대조군(positive control)으로 사용하였다.

3. 실험동물의 사육

본 실험에 사용된 동물은 4주령의 ICR 수컷 마우스(25~30g)를 실험동물 공급업체(Samtako, Korea)로부터 구입하여, 한 개의 사육케이스에 3마리씩 난괴법으로 선별하여 7일간 환경 적응기간을 거친 후 하기 실시예에 사용하였다. 실험실 환경은 항온(20±2℃) 및 습도(50~55%)를 유지하며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 일정한 환경에서 사육하였다. 이들 마우스들은 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군 그룹(NC, n=9), 에탄올(25% ethanol, 5g/kg body weight) 투여 그룹(EG, n=9), 양성 대조군(positive control)으로 사용한 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매 추출물(200mg/kg body weight + 25% ethanol, 5g/kg body weight) 투여 그룹(HG), 본 발명의 13종의 천연 혼합추출물(100, 200mg/kg body weight + 25% ethanol, 5g/kg body weight) 투여 그룹(HRG100, HRG200, n=9)으로 나누었으며, 6주간 시료들을 경구 투여시킨 30분 후에 에탄올을 경구 투여하였다.

4. 체중과 장기 무게 및 혈당 측정

마우스의 체중 변화는 1주일 간격으로 동일한 시간에 측정하였고, 식이가 끝난 후 12시간 절식시킨 뒤 복부대정맥에서 혈액을 채취하였으며, 뇌, 간장, 비장,고환 및 신장을 적출하여 무게를 체중과의 백분율로 나타내었다. 혈당 농도는 채취한 혈액을 혈당측정기(glucose meter, Roche, Australia)를 이용하여 측정하였다.

5. 혈중 알코올 및 아세트알데히드 함량 측정

마우스 혈중의 알코올 및 아세트알데히드를 측정하기 위하여, 복부대정맥으로부터 적출한 혈액을 10,000g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청 중의 알코올 및 아세트알데히드는 에탄올 분석 키트(K-ETOH, Megazyme, Bray, Wicklow, Ireland) 및 알데하이드 분석 키트(K-ACHYD, Megazyme, Bray, Wicklow, Ireland)를 사용하여 UV-분광광도계(UV-1201, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 340nm 흡광도에서 측정하였다.

6. 세포 생존율( cell viability ) 측정

HepG2 간세포 및 MC-ⅨC 뇌신경 세포는 96-웰 플레이트에 24시간 배양한 후, 상기 각각의 세포에 본 발명의 천연 혼합추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포에 MTT(5μg/mL) 용액을 첨가하여 3시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 세포에 DMSO를 처리하여 20분 동안 배양시켰으며, 마이크로플레이트 리더(microplatereader, Bio-Rad)를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

7. 혈청의 바이오케미칼 ( biochemical ) 농도 측정

혈청 중에 존재하는 GPT(glutamine pyruvic transaminase), GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), BUN(blood urea nitrogen), CRE(creatine), TCHO(total cholesterol), TG(triglyceride), HDL(high density lipoprotein cholesterol) 농도는 혈청자동분석기(Fuji dri-chem 4000, Japan)를 이용하여 측정하였으며, LDL(low density lipoprotein cholesterol) 농도는 하기와 같은 식을 이용하여 계산하였다.

LDL (mg/dl) = total cholesterol - (HDL + TG/5)

8. 아세틸콜린 분해효소( AChE , Acetylcholinesterase ) 활성 측정

AChE 활성 측정은 요오드화 아세틸티오콜린(acetylthiocholine iodide)을 기질로 사용한 비색법을 이용하여 측정하였으며, 뇌 조직에 대하여 10배 부피에 해당하는 PBS(phosphate buffered saline)에 불릿 블렌더(bullet blender, Nextadvance Inc., USA)로 균질화 시킨 후 12,000rpm에서 30분간 원심 분리하였고 이 상등액을 이용하여 하기 실시예에 사용하였다. 상등액 5㎕을 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.4)와 혼합하여 37℃에서 15분 동안 배양한 뒤 엘만 반응 혼합액(50mM 소듐 포스페이트 완충(pH 7.4) 중의 0.5mM 아세틸티오콜린 및 1mM 5,5-디티오스 2-니트로벤존산)과 혼합하여 20분간 37℃에서 배양하였다. 이를 마이크로 리더(microplate reader, Bio-Rad, Japan)를 이용하여 2분 간격으로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군의 활성을 100%로 두고 비교하여 분석하였다.

9. 지질과산화물( MDA , malondialdehyde ) 함량 측정

지질 과산화물 생성 억제 효과는 마우스의 뇌와 간을 이용하여 확인하였다. 상기 뇌와 간 조직에 대하여 10배 부피에 해당하는 PBS(phosphate buffered saline)에 불릿 블렌더(bullet blender, Nextadvance Inc., USA)로 균질화 시킨 후 5,000g에서 10분간 원심 분리하였고 이 상등액을 이용하여 하기 실시예에 사용하였다. 상등액 160㎕를 1%(v/v) 인산(phosphoric acid) 960㎕와 0.67%(w/v) TBA(thiobarbituric acid) 320㎕를 반응시켜 워터배스(water bath)에서 95℃로 가열하여 반응시켰다. 반응물을 식힌 뒤 5,000rpm에서 1분간 원심 분리시켜 상등액을 얻은 뒤 이를 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 계산하여 MDA(nmol/mg of protein) 생성량을 나타내었고, 단백질 함량은 브래드퍼드법(Bradford MM, 1976)을 이용하여 570nm에서 측정하였으며, BSA(bovine serum albumin)을 이용하여 작성된 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구하였다.

10. 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 ( SOD , superoxide dismutase ) 함량 측정

적출한 마우스의 뇌와 간에 대하여 10배 부피에 해당하는 PBS(phosphate buffered saline)에 넣고 균질화 시킨 후 400g에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 펠릿(pellet)을 취하였다. 1×세포 추출 버퍼[10×SOD buffer 1mL, 20%(v/v) triton X-100 0.2mL, 증류수 8.8mL, 200mM phenylmethanesulfonyl fluoride 10㎕]를 넣고 30분간 5분 단위로 볼텍스(vortex) 해준 뒤 10,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 하기 실시예에 사용하였다. SOD 활성을 측정하기 위하여 SOD determination kit(Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며 측정된 흡광도 값을 계산하여 SOD(U/mg of protein) 생성량을 나타내었고 단백질 함량은 브래드퍼드법(Bradford MM, 1976)을 이용하여 570nm에서 측정하였고 BSA(bovine serum albumin)을 이용하여 작성된 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구하였다.

11. 산화된 글루타치온 /총 글루타치온( Oxidized glutathione / total glutathione) 비율 측정

적출한 마우스의 뇌와 간에 대하여 10배 부피에 해당하는 5% 메타인산(metaphosphoric acid)에 넣고 균질화시킨 뒤 14,000g에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 취하여 총 글루타치온(total glutathione) 측정에 사용하였으며, 상등액과 2M 4-비닐피리딘(vinylpyridine) 10㎕를 반응시켜 산화된 글루타치온(oxidized glutathione)을 측정하였다. 글루타치온(GSH, glutathione)의 함량을 측정하기 위하여, 산화된 글루타치온(oxidized glutathione/GSH) 감지 키트(Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY, USA)를 사용하였고, 측정된 값을 글루타치온 표준곡선에 대입하여 산화된 GSH/총 GSH(%)로 나타내었고 단백질 함량은 브래드퍼드법(Bradford MM, 1976)을 이용하여 570nm에서 측정하였고 BSA(bovine serum albumin)을 이용하여 작성된 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구하였다.

12. 통계 처리

모든 실험은 3회 반복하였으며, 동물실험의 경우는 8회 반복실험을 실시하여 평균 및 표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 실험군 간 차이의 통계적 유의성 검증은 SAS version 9.11(SAS institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하고, 던캔스 다중범위검증(Duncans multiple range test)으로 각 시료 간의 유의한 차이를 5% 수준에서 검증하였다.

실시예 1. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 마우스의 체중 변화 측정

알코올 섭취에 의한 마우스의 체중 변화를 살펴 본 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 에탄올 투여 전에 측정한 모든 그룹의 마우스의 무게는 평균 28.29g으로 거의 유사한 무게를 나타내었다. 반면, 6주간 식이를 마친 후의 체중을 측정한 결과, 정상 대조군인 NC그룹(37.66g) 대비 에탄올 투여 그룹인 EG(34.08g)에서 약 9.51%의 체중 감소를 나타내었고, 양성 대조군(positive control)으로 사용된 HG그룹(35.20g)은 EG 대비 체중 감소를 억제시켰다. 본 발명의 천연 혼합추출물을 식이한 HRG100 및 HRG200 그룹의 경우, 각각 34.28g 및 35.64g으로 에탄올로 인한 체중감소를 억제시켰고, 특히 HRG200는 양성 대조군과 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과에 따라 본 발명의 천연 혼합추출물은 알코올 섭취에 의한 체중 감소를 억제하는데 효과적으로 작용할 수 있을 것이라고 판단된다.

실시예 2. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 장기 무게 및 혈당 농도 측정

단위 체중에 따른 뇌, 간, 고환, 비장, 신장의 무게와 혈당 농도를 측정한 결과, 하기 표 1에 개시한 바와 같이 에탄올을 투여하지 않은 정상 대조군 그룹 NC 및 에탄올 투여 그룹 EG의 뇌, 간 및 비장의 무게를 비교하였을 때, 뇌는 NC(1.45g)에 비해 EG(1.32g)에서 감소하였고, 간은 NC(4.61g)에 비해 EG(3.99g)에서 감소하였으며, 비장은 NC(0.33g)에 비해 EG(0.29g)에서 무게 감소가 나타난 것을 보아 에탄올은 뇌와 간, 비장의 무게에 영향을 주는 것으로 나타났으며, 본 발명의 천연 혼합추출물을 투여한 HRG100 및 HRG200 그룹의 뇌에서는 1.40g 및 1.42g으로 나타났고 간에서는 4.07g 및 4.17g으로 나타났으며 비장에서는 0.32g 및 0.34g으로 나타나, 뇌와 간에서의 무게 감소를 억제해준 것으로 나타났다. 고환과 신장에서의 무게 변화는 NC와 EG 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 마우스의 혈당 농도를 측정한 결과, NC에서는 119.43mg/dl로 나타났으며 EG에서는 305.25mg/dl로 혈당이 유의적으로 상승하였다. HG에서는 258mg/dl로 혈당이 낮아진 것을 보였고 HRG100(272.76mg/dl) 및 HRG200(234.60mg/dl)에서도 역시 유의적으로 혈당이 감소한 것을 확인하였다.

본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 장기 무게 및 혈당 농도 감소 효과

	뇌(%)	간(%)	고환(%)	비장(%)	신장(%)	혈당 (mg/dl)
NC⁽¹⁾	1.45±0.13^a	4.61±0.07^a	0.71±0.06^a	0.33±0.01^a	1.65±0.14^a	119.43 ±32.27^d
EG⁽²⁾	1.32±0.09^c	3.99±0.13^c	0.68±0.06^a	0.29±0.02^c	1.61±0.04^a	305.25 ±114.97^a
HG⁽³⁾	1.41±0.07^b	4.34±0.17^b	0.71±0.05^a	0.31±0.12^bc	1.55±0.1^a	258.00 ±67.13^bc
HRG100⁽⁴⁾	1.40±0.07^b	4.07±0.16^b	0.71±0.09^a	0.32±0.02^ab	1.48±0.06^a	272.67 ±34.65^ab
HRG200⁽⁵⁾	1.42±0.03^b	4.16±0.18^b	0.71±0.04^a	0.34±0.01^a	1.66±0.03^a	234.60 ±44.79^c

위의 결과는 평균±표준편차를 나타내며, 데이터는 통계적으로 p < 0.05에서 간주되며, 상이한 소문자는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

NC⁽¹⁾ : 정상 대조군(Normal control).

EG⁽²⁾ : 에탄올 투여그룹(5g/kg of body weight).

HG⁽³⁾ : 에탄올 + 헛개나무 열매 추출물 투여그룹(200mg/kg of body weight)

HRG100⁽⁴⁾ : 에탄올 + 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹(100mg/kg of body weight)

HRG200⁽⁵⁾ : 에탄올 + 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹(200mg/kg of body weight)

실시예 3. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 혈중 알코올 및 아세트알데히드 소거활성 측정

마우스의 혈중 에탄올 소거활성을 측정한 결과, 도 2(A)에 개시된 바와 같이 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG, 90.76%)이 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종의 단독 추출물(지구자 52.76%, 갈화 16.78%, 백작약 44.94%, 천궁 14.48%, 황기 28.00%, 건지황 18.44%, 당귀 15.11%)보다 에탄올 소거활성이 우수하였으며, 특히 기존에 알코올 소거능이 있다고 알려진 10종의 혼합추출물(M10; 지구자, 백작약, 천궁, 황기, 건지황, 당귀, 계피, 감초, 생강 및 대조, 84.21%, 한국등록특허 제1040721호)보다 알코올 소거 활성이 현저하게 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 같은 기간 측정한 혈중 아세트알데히드 소거활성을 측정한 결과, 도 2(B)에 개시된 바와 같이 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG, 1.52%)이 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종의 단독 추출물(지구자 1.11%, 갈화 1.11%, 백작약 0.79%, 천궁 1.11%, 황기 0.48%, 건지황 1.23%, 당귀 0.40%)보다 아세트알데히드 소거활성이 우수하였으며, 특히 기존에 아세트알데히드 소거능이 있다고 알려진 10종의 혼합추출물(M10, 1.23%, 한국등록특허 제1040721호)보다 아세트알데히드 소거 활성이 현저하게 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 알코올 독성에 대한 간세포 보호효과 및 생존율 측정

본 발명의 천연 혼합추출물의 알코올 독성에 대한 간세포 보호효과를 확인하기 위해, MTT 분석을 통하여 인간 간세포(Human hepatocyte) 유래의 HepG2 간세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 에탄올을 단독 처리한 군에서는 정상 대조군(control) 그룹 대비 76.56%의 세포 생존율을 나타내었고, 기존에 간세포 보호효과가 있다고 보고된 3종의 혼합추출물(M3; 지구자, 갈화 및 홍삼, 한국등록특허 제0573245호)은 72.07%, 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종인 지구자 추출물, 갈화 추출물, 백작약 추출물, 천궁 추출물, 황기 추출물, 건지황 추출물, 당귀 추출물을 처리한 그룹에서는 각각 74.45%, 39.93%, 71.98%, 65.63%, 50.65%, 47.43% 및 63.39%의 간세포 생존율을 나타내었다. 반면에, 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG)을 함께 처리한 군에서는 81.32%의 간세포 생존율을 나타내었다.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG)이 기존에 보고된 3종의 혼합추출물(M3, 한국등록특허 제0573245호) 및 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종의 단독 추출물보다 에탄올 독성에 대해 뛰어난 간세포 보호효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 혈청의 바이오케미칼( biochemical ) 농도 측정

본 실시예 5에서는 마우스에 에탄올, 헛개나무 열매 추출물 및 본 발명의 천연 혼합추출물을 투여하였을 때, 나타나는 혈청의 바이오케미칼(biochemical) 농도 변화를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 혈청 중의 간 손상 지표로 사용되는 혈중 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase) 함량은 정상 대조군 그룹 NC(67.75(U/l)와 에탄올 투여그룹 EG(69.00U/l)간에 차이를 나타내지 않았으나, 양성대조군 그룹 HG(50.75U/l)과 본 발명의 천연 혼합추출물 그룹 HRG100(52.33U/l)) 및 HRG200(49.56U/l)에서는 GOT 함량이 유의적으로 낮아진 결과를 보였다. GOT와 마찬가지로 간 손상 지표로서 사용되는 혈중 GPT(glutamine pyruvic transaminase) 함량은 NC(32.30U/l)에 비해 EG(39.00U/l)에서 증가한 것을 볼 수 있었으며 HG(28.60U/l)과 HRG100(28.38U/l) 및 HRG200(26.33U/l)에서는 GPT 함량이 NC에 비해 감소된 것을 확인할 수 있었다.

신장 손상을 나타내는 지표로 사용되는 CRE(creatine)을 측정한 결과, EG(0.19mg/dl)에서는 NC(0.11mg/dl)와 비교했을 때 유의적으로 증가하였다. HG(0.14mg/dl)에서는 EG와 비교하였을 때 다소 감소한 경향을 보였다. HRG100(0.17mg/dl)에서는 EG에 비해 낮아진 결과를 나타낸 반면, HRG200(0.2mg/dl)에서는 EG와 유사한 결과를 보여 CRE 생성 억제 효과는 고농도의 투여보다 저농도에서 효과적인 것으로 나타내는 것을 확인하였다. 또 다른 신장 손상 지표로 사용되는 BUN(Blood urea nitrogen) 함량은 NC(24.5mg/dl)와 EG(24.85mg/dl)간의 유의적인 차이는 없었지만 HG(19,43mg/dl)와 HRG100(19.84mg/dl) 및 HRG200(16.37mg/dl)에서는 NC와 비교하였을 때 유의적으로 낮아지는 것을 보였다.

혈중 TCHO(total cholesterol)의 함량은 NC(143.2mg/dl)와 EG(201.86mg/dl)에서 유의적인 차이를 나타내었다. HG에서는 166mg/dl로 EG에 비해 낮아진 것으로 나타났으며 HRG100에서는 175.5mg/dl로 HG와 유사하게 감소된 경향을 보였으며, 고농도 투여 그룹(HRG200)에서는 159.33mg/dl로 NC에 가까운 값을 나타내었다. 혈중 중성지질(TG)의 함량은 NC에서 147.5mg/dl로 나타났으며 EG에서는 195.17mg/dl로 유의적인 차이를 나타내었다. HG에서는 160.4mg/dl로 나타나 중성지질 함량이 낮아진 것으로 나타났으며 HRG100에서는 191mg/dl로 EG와 차이는 없었으나 HRG200에서는 163.13mg/dl로 HG와 비슷한 값을 나타내었다. 혈중 HDL(High density lipoprotein cholesterol)을 측정한 결과, NC에서는 154.6mg/dl로 나타났으며 EG에서는 106.75mg/dl로 낮아진 것을 보였다. HG에서는 121.75mg/dl로 나타났으며 HRG100 및 HRG200에서는 각각 117mg/dl와 118.67mg/dl로 EG와는 유의적인 차이는 없었다. LDL(Low density lipoprotein cholesterol)을 측정한 결과, NC에서 8.35mg/dl를 나타내었고 EG에서는 19.5mg/dl로 다소 함량이 높아졌으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. HG에서는 10.45mg/dl를 나타내었고 HRG100 및 HRG200에서는 각각 14.87mg/dl와 11.05mg/dl를 나타내었으나 이들 그룹간의 유의성은 나타나지 않았다.

본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 혈청의 GOT, GPT, BON 및 CRE 농도 측정

	GOT (U/l)	GPT (U/l)	BUN (mg/dl)	CRE (mg/dl)
NC⁽¹⁾	67.75±8.85^a	32.50±1.29^b	24.5±3.36^a	0.11±0.04^c
EG⁽²⁾	69.00±14.71^a	39.00±2.55^a	24.85±0.21^a	0.19±0.04^a
HG⁽³⁾	50.75±8.88^b	28.60±6.47^c	19.43±4.31^b	0.14±0.05^bc
HRG100⁽⁴⁾	52.33±4.59^b	28.38±3.70^c	19.84±2.80^b	0.17±0.05^ab
HRG200⁽⁵⁾	49.56±3.84^b	26.33±4.30^c	16.37±2.87^c	0.20±0.00^a

NC⁽¹⁾ : 정상 대조군(Normal control).

EG⁽²⁾ : 에탄올 투여그룹(5g/kg of body weight).

본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 혈청의 TCHO, TG, HDL 및 LDL 농도 측정

	TCHO (mg/dl)	TG (mg/dl)	HDL (mg/dl)	LDL (mg/dl)
NC⁽¹⁾	143.2±12.19^c	147.50±26.49^b	154.60±26.78^a	8.35±7.32^a
EG⁽²⁾	210.86±16.54^a	195.17±16.64^a	106.75±17.58^b	19.50±5.38^a
HG⁽³⁾	166.00±19.68^b	160.40±16.10^b	121.75±1.71^b	10.45±9.24^a
HRG100⁽⁴⁾	175.86±16.54^b	191.00±12.57^a	117.00±10.79^b	14.87±5.22^a
HRG200⁽⁵⁾	159.3±19.94^bc	163.13±9.54^b	118.67±4.93^b	11.05±4.42^a

NC⁽¹⁾ : 정상 대조군(Normal control).

EG⁽²⁾ : 에탄올 투여그룹(5g/kg of body weight).

실시예 6. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 AChE ( Acetylcholinesterase ) 활성 측정

마우스의 뇌를 적출하여 AChE 활성을 측정한 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 정상 대조군 그룹 NC의 활성(100%) 대비 에탄올 투여그룹 EG는 116.10%로 나타나 에탄올로 인해 뇌의 AChE의 활성이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 양성 대조군 그룹 HG에서의 활성은 109.01%로 EG에 비해 줄어든 결과를 보였고 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹 HRG100 및 HRG200은 각각 108.47%와 104.30%로 유의적으로 감소하는 것을 볼 수 있었다. 따라서, 본 실시예의 결과를 통하여 본 발명의 천연 혼합추출물은 에탄올로 유도된 AChE의 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 판단된다.

실시예 7. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 MDA ( malondialdehyde ) 생성량 측정

마우스의 뇌와 간에 존재하는 지질과산화물의 중간생성물인 MDA의 생성량을 측정한 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 뇌에서의 정상 대조군 그룹 NC의 MDA 함량은 1.53nmole/mg 단백질로 나타났으며, 에탄올 투여그룹 EG는 NC와 비교했을 때 4.04nmole/mg 단백질로 높게 나타났다. 양성 대조군 그룹 HG에서는 2.26nmole/mg 단백질로 EG와 비교하였을 때 MDA 생성을 억제하는 것으로 나타났으며 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹 HRG100 및 HRG200에서는 각각 2.83nmole/mg 단백질 및 1.89nmole/mg 단백질로 HRG100에서는 HG에 비해 MDA 생성 억제 효과가 낮았으나 HRG200에서는 HG보다 소거 활성이 높은 것으로 나타났다. 간에서의 MDA의 생성 억제 효과를 측정해본 결과, NC에서의 MDA 함량은 1.11nmole/mg 단백질로 나타났으며 EG에서는 1.17nmole/mg 단백질으로 NC에 비해서 높게 나타났다. HG에서는 1.25nmole/mg 단백질로 EG와 비교하였을 때 MDA 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, HRG100 및 HRG200에서는 각각 1.17nmole/mg 단백질 및 1.11nmole/mg 단백질로 HG와는 유의적인 차이는 나지 않았으나 EG에 비해 낮아진 결과를 나타내었다. 이러한 결과에 따라 HRG100 및 200에서 에탄올에 의해 생성된 뇌와 간 조직의 지질과산화를 예방해 줄 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 8. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 알코올 독성에 대한 뇌신경 세포 보호효과 및 생존율 측정

본 발명의 천연 혼합추출물의 알코올 독성에 대한 뇌신경 세포 보호효과를 확인하기 위해, 생존율을 MTT 분석을 통하여 인간 뇌(Human brain)에서 유래한 MC-ⅨC 신경세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 에탄올을 단독 처리한 군에서는 정상 대조군(control) 그룹 대비 48.18%의 세포 생존율을 나타내었고, 기존에 뇌신경 세포 보호효과가 있다고 보고된 4종의 혼합추출물(M4; 지구자, 갈화, 천궁 및 감초, 한국등록특허 제1310285호)은 80.03%, 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종인 지구자 추출물, 갈화 추출물, 백작약 추출물, 천궁 추출물, 황기 추출물, 건지황 추출물, 당귀 추출물을 처리한 그룹에서는 각각 66.70%, 38.04%, 75.39%, 70.59%, 60.69%, 28.34% 및 35.57%의 신경세포 생존율을 나타내었다. 반면에, 에탄올 및 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG)을 함께 처리한 군에서는 87.59%의 뇌신경 세포 생존율을 나타내었다.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 천연 혼합추출물(HRG)이 기존에 보고된 4종의 혼합추출물(M4, 한국등록특허 제1310285호) 및 본 발명의 주성분 중 72%를 차지하는 7종의 단독 추출물보다 에탄올 독성에 대해 뛰어난 신경세포 보호효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 SOD ( Superoxide Dismutase ) 함량 측정

SOD(Superoxide Dismutase)는 항산화 효소중 하나로 세포에 존재하는 슈퍼옥사이드(superoxide)를 과산화수소로 전환시켜주는 효소로 SOD에 의해 생성된 과산화수소는 카탈라아제(catalase)나 페록시다아제(peroxidase) 등에 의하여 산소와 물 분자로 분해시켜 독성을 없애주는 역할을 하여 생체를 보호하는 기능을 가지고 있다. 또한, SOD는 다른 항산화 효소보다 우수한 효과를 가지기 때문에 체내에서 자유 라디칼을 효과적으로 제거해 줄 수 있다. 따라서, 마우스의 뇌와 간을 적출하여 SOD의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 뇌에서의 정상 대조군 그룹 NC의 SOD 함량은 0.161U/mg 단백질로 나타났으며, 에탄올 투여그룹 EG는 NC에 비해 0.102U/mg 단백질로 낮게 나타났다. 정상 대조군 그룹 HG에서는 0.156U/mg 단백질로 나타났으며 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹 HRG100 및 HRG200에서는 각각 0.138U/mg 단백질 및 0.141U/mg 단백질로 EG에 비해 유의적으로 증가하였다. 간에서의 NC의 SOD 함량은 1.01U/mg 단백질로 나타났고 EG에서는 0.73U/mg 단백질로 NC에 비해 낮은 함량을 나타냈다. HG에서는 0.84U/mg 단백질을 나타내어 EG에 비해 SOD 함량이 높아진 것을 볼 수 있으며 HRG100과 HRG200에서는 각각 0.88U/mg 단백질 및 0.94U/mg 단백질에서는 HG와 비슷한 결과를 보였으나 고농도에서의 SOD 함량은 NC의 함량과 비슷한 것으로 나타났다. 이러한 결과에 따라 에탄올 투여에 의한 뇌와 간 조직의 SOD의 활성감소를 HRG100 및 HRG200이 일정 수준 회복시켜 주는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 본 발명의 천연 혼합추출물에 따른 산화된 GSH /총 GSH( Oxidized GSH/total GSH ) 비율 측정

글루타치온(GSH, glutathione)은 조직에서의 산화적 스트레스에 대한 방어 작용을 나타내는 효소인 GSH-페옥시다아제(peroxidase) 및 GST(GSH-S-transferase)의 기질로 사용되는 물질로 활성산소, 과산화지질 등을 산소와 물 분자로 분해시켜 독성을 없애주며, 세포내 지질과산화물과 아미노산 수송 및 저장, 간 해독 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 마우스의 뇌와 간을 적출하여 산화된 GSH/총 GSH(Oxidized GSH/total GSH)의 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 뇌에서 정상 대조군 그룹 NC의 산화된 GSH/총 GSH의 비율은 69.98%였고 에탄올 투여그룹 EG에서는 98.97%로 산화된 GSH의 함량이 NC에 비해 증가하였다. 정상 대조군 그룹 HG에서는 산화된 GSH의 함량이 94.36%로 나타났고 본 발명의 천연 혼합추출물 투여그룹 HRG100 및 HRG200에서는 각각 92.22% 및 90.40%로 EG와 비교하였을 때 통계적 유의성은 없었으나 다소 낮아진 결과를 볼 수 있었다. 간에서의 정상 대조군(NC)의 산화된 GSH/총 GSH의 비율은 66.85%로 나타났고, EG에서는 74.66%로 산화된 GSH의 함량이 NC에 비해 높아져 GSH의 많은 양이 산화된 것으로 보였다. HG에서는 71.22%로 산화된 GSH의 함량이 감소된 것을 확인하였고, HRG100에서는 71.47%로 감소된 것을 확인할 수 있었으나 HRG200에서는 산화된 GSH의 함량이 EG와 유사한 것으로 나타나, 고농도 투여 그룹에서는 본 발명의 천연 혼합추출물에 의한 GSH의 산화 억제 작용이 있는 것으로 확인되었다. 더불어 SOD의 활성을 동시에 돕는 것으로 보아 조직 내의 항산화 체계를 효과적으로 유지하는 역할을 하는 것으로 판단된다.

Claims

15~30중량%의 헛개자, 5~15%중량의 갈화, 3~13중량%의 백작약, 3~13중량%의 당귀, 3~13중량%의 건지황, 3~13중량%의 천궁, 3~13중량%의 황기, 2~10중량%의 계피, 2~10중량%의 감초, 2~10중량%의 생강, 2~10중량%의 대조, 2~10중량%의 벌꿀 및 1~7중량%의 홍삼으로 이루어진 천연 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

삭제

제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈중 알코올(alcohol) 및 아세트알데히드(acetaldehyde)의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 지질 과산화물의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.

15~30중량%의 헛개자, 5~15%중량의 갈화, 3~13중량%의 백작약, 3~13중량%의 당귀, 3~13중량%의 건지황, 3~13중량%의 천궁, 3~13중량%의 황기, 2~10중량%의 계피, 2~10중량%의 감초, 2~10중량%의 생강, 2~10중량%의 대조, 2~10중량%의 벌꿀 및 1~7중량%의 홍삼의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간질환 또는 뇌 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

제8항에 있어서, 상기 혼합추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

제8항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.